KR20030034087A - 고온 냉동을 이용한 생물학적 활물질의 극저온 보존 - Google Patents

Abstract

냉동하기 위해 물질을 처리하고, 냉각유체 탱크에 물질을 담그고, 물질을 냉동시키기 위해 일정한 속력과 온도로 물질을 지나가는 냉각유체를 순환하여 살아있는 생물학적 물질을 저온보존한다. 본 발명을 따르는 방법으로 세포 구조(유리화) 내에 얼음 결정이 형성되지 않도록 빠르게 생물학적 물질을 냉동시킨다. 냉각유체의 온도는 선호적으로 -20℃ 및 -30℃ 사이가 되는데, 열적인 변화로 인하여 세포막에 응력분열이 발생되는 것을 최소화할 만큼이다. 본 발명을 따르는 방법을 이용하여 냉동된 세포는 80% 정도의 생존력을 나타내는데, 다른 저온보존 방법보다 훨씩 높은 비율이다.

Description

고온 냉동을 이용한 생물학적 활물질의 극저온 보존{CRYOGENIC PRESERVATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MATERIAL USING HIGH TEMPERATURE FREEZING}

극저온 보존(저온보존-cryopreservation)은 생존 가능한 상태로 미리 냉동된 물질을 저장하고 나중에 회복시키기 위해 냉동점이나 그 이하로 살아있는 조직이나 생화학 분자의 온도를 낮추는 것으로 정의된다. 1700년대에 단일 세포가 냉동된 다음 해동되고, 적은양의 세포가 정상적인 생리학적인 기능을 하도록 회복되는 것이 개의 정액으로 처음 실험되었다. 그 후에 1900년대에 개선 동결방지제인 합성물을 이용한 냉동과정을 화학적으로 견딜 수 세포의 경우 세포의 재생율이 개선될 수 있는 것이 밝혀졌다. 그러나 동결방지제를 사용하더라도 저온보존에서 재생되는 비율은 보통 50% 이하이다.

저온보존에서 재생되는 비율을 개선하려는 노력은 냉동하기 전에 생물학적 물질을 처리하기 위한 새로운 동결방지제 및 최대한 저속 혹은 고속으로 냉동하는 기술에 그 초점이 맞추어져 있다. 이러한 기술은 세포 안에 있는 물이 냉동과정에서 얼음결정을 만들어 팽창할 때 세포에 손상되지 않도록 하는데 관련된다. 이론상으로 극도로 저속 혹은 고속으로 냉동하면 세포 내에 얼음결정이 형성되는 것을 줄이거나 방지할 수 있다. 매우 저속 혹은 고속의 냉동에 대한 메카니즘은 기체질소를 액화질소로 제어된 상태로 강하는 것을 포함하거나 액화질소로 급강한 다음 과냉각된 알콜 혼합물을 통해 시료를 이동시키는 것을 포함한다. 이러한 방식의 냉동은 냉동하는 동안 얼음 결정의 크기를 더 이상 크게 만들지 않지만 여전히 얼음결정이 형성된다.

또 다른 기술은 유리화기술이라고 하는데 얼음 결정이 형성되지 않도록 빠르게 세포 안에 있는 수분을 냉동시키기 위해 시료를 액화질소에 직접 집어넣는 것이다. 유리화기술은 실내온도에서 세포를 액화질소 온도인 -196℃까지 빠르게 냉각시킨다. 이렇게 온도를 짧은 시간에 급강하시킴으로 세포막 안에 응력분열(stress fracture)이 발생하게 된다. 냉동방지제는 유리화기술 및 여러 가지 다른 기술과 함께 이용된다.

본 발명은 극저온 보존에 관련되는데, 특히 유리화기술(vitrification technique)을 이용하여 생물학적 활물질(biologically active material)을 극저온으로 보존하는데 관련된다.

도 1은 본 발명의 한가지 실시예를 따르는 방법을 구현하기에 적합한 냉동장치에 대한 측면도.

도 2는 도 1에 도시된 냉동장치의 횡단면도.

도 3은 본 발명의 한가지 실시예를 따르는 방법에 대한 흐름도.

도 4는 본 발명의 선호적인 실시예를 따르는 냉동방법 및 여러 가지 종래의 냉동기(모두 저온보존 및 저장을 위해 사용된 것은 아님) 사이에서 화학적으로 처리하지 않고 전체 냉동된 씨없는 포도의 횡단면에서 세포의 손상을 실험적으로 비교한 막대 그래프.

도 5는 본 발명의 선호적인 실시예를 따르는 냉동방법 및 종래의 냉동방법 사이에서 사람의 정자가 후에 해동되어 세포가 살아나는 것을 실험적으로 비교한 막대 그래프.

도 6은 본 발명의 선호되는 실시예를 따르는 냉동법과 종래의 냉동법 사이에서 돼지 근율세포가 해동되어 세포의 생존을 실험적으로 비교한 막대 그래프.

도 7은 본 발명의 선호적인 실시예를 따르는 냉동법 및 종래의 냉동법 사이에서 쥐 태아의 세포생존을 실험적으로 비교한 막대 그래프.

* 부호 설명 *

100 : 냉각유닛110 : 탱크

120 : 열교환 코일130 : 모터

132 : 임펠러140 : 냉각유체

150 : 순환기155 : 트레이

그러므로 현재의 방법의 문제점들을 없애는 단세포, 조직, 기관, 핵산 혹은 생물학적 활분자를 저온으로 보종하기 위한 개선된 방법이 필요하다. 따라서 본 발명의 한가지 실시예는 생물학적 활물질을 냉각유체에 담그고 냉각제를 순환시키는 저온보존 방법을 제공한다. 물질은 저온보존되는 종류에 따라 침수되기 전에 화학적으로 처리되거나 그렇지 않게 될 수 있다. 냉각유체는 물질이 유리화되고 세포막에서 응력분열이 최소화되도록 일정한 온도 및 속력으로 재료에 순환된다. 하나의실시예에서, 냉각유체는 -20℃에서 -30℃ 사이로 유지되고, 물질을 지나가는 속력은 폭이 24인치, 깊이가 48인차 보다 크지 않은 영역을 통해 냉각유체의 단위 피트에 대해 분당 35리터가 된다. 또한 본 발명의 한가지 실시예는 -30℃ 이상의 온도까지 물질을 냉동시킨다. 또 다른 실시예는 이러한 저온공정을 필요로 하는 생물학적 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 실시예에 대한 목적은 얼음결정이 형성되고 응력분열되는 것을 막기 위해 생물학적 재료를 냉각시키는 것이다.

본 발명의 이점은 저온보존 재생율이 현격히 증가하는데 생물학적 물질이 냉동되는 중에 유리화되기 때문이다.

본 발명의 또 다른 이점은 저온보존 재생율이 개선되는 것인데 생물학적 물질이 세로막 내에 응력분열이 발생되지 않도록 하기에 충분히 높은 온도에서 유리화되기 때문이다.

본 발명의 또 다른 이점은 일단 냉동되면 현재의 저온보존 저장설비 및 장치가 냉동된 생물학적 물질을 저장하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 목적, 이점, 특징과 구조적 요소에 관련된 방법 및 기능, 그리고 제조상의 경제성이 첨부된 도면을 참소로 상세설명 및 청구항을 고려하려 명확해질 것이다.

도 1,2에 도시된 바와 같이 본 발명의 한가지 실시예를 따르는 방법을 구현하기에 적합한 냉동장치가 나오는데 냉각유닛(100)으로 표시된다. 냉각유닛(100)은 선호적으로 냉각유체(140)를 담고 있는 탱크(110)로 구성된다. 임펠러(impeller)(132)를 갖는 모터(130) 같은 순환기(150), 열교환 코일(120), 랙(rack)(150)은 냉각유체(140)에 잠기고, 하나의 실시예에서는 냉동될 생물학적 물질을 지지하기 위한 트레이(155)가 포함된다. 생물학적 물질은 살아있는 단세포, 조직, 기관, 핵산 및 다른 생물학적인 활물질을 포함할 수 있지만 이것들에 국한되지는 않는다. 냉장유닛(190)은 탱크(110) 외부에 있고 열교환 코일(120)에 연결되어 있다.

탱크(110)는 냉동될 생물학적 물질을 냉각유치(140)에 담그기 위해 필요한 치수를 갖을 수 있는데, 12인치, 24인치, 48인치 등이 될 수 있다. 전술된 기술과 일치하는 다른 크기를 갖는 탱크가 사용될 수 있다. 예를 들어, 한가지 실시예에서(도시 않됨), 탱크(110)는 냉각유체(140)를 담을 수 있는 크기로 되어 있어서, 유리병, 실험용 튜브, 비이커, 눈금 실린더 같은 저장용기가 생물학적 물질 및 동결방지제를 포함하여 서스펜션(suspension)을 빠르게 생각하기 위한 탱크(110)에 놓일 수 있다. 다른 실시예에서 탱크(110)의 크기는 급속냉동을 위해 기관 전체를 완전히 담글 수 있을 만큼 충분하다. 탱크(110)는 냉동될 생물학 물질의 다양한 크기 및 양을 수용하는데 필요한 만큼 크거나 작게 만들어질 수 있다. 전술된 바와 같이 생물학적 물질은 탱크(110)에 담궈지기 전에 동결방지제로 처리된다.

탱크(110)는 냉각유체(140)를 담고 있다. 한가지 실시예에서 냉각유체는 냉각유체는 식품수준의 용질이다. 식품수준의 유체의 좋은 예로써 프로필렌 글리콜(propylene glycol),염화나트륨 용제이다. 또 다른 실시예에서 냉각유체는 디메틸솔포사이드(dimethylsulfoxide-DMSO), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 같은 동결방지제이다. 어떤 경우에서는 동결방지제 자체가 식품수준의 유체이다. 다른 실시예에서 다른 유체, 선호적으로 용질은 냉각유체로 사용된다. 여러 가지 용기가 생물학적 물질을 저장하기 위해 사용될 수 있으며, 본 발명의 몇몇 실시예들은 빠르고 효율적으로 냉각하기 위해 냉각유체에 생물학적 물질을 담그도록 한다. 이렇게 직접 담금으로 인해서 조직 및 기관의 저온보존을 단순화한다.

얼음결정이 형성되지 않게 하고 생물학적 물질을 냉동시키기 위해서 본 발명의 한가지 실시예는 깊이가 48인치, 폭이 24인치 이하인 영역에 담겨진 냉각유체 1피트에 대해서 분당 35리터의 일정한 비율로 생물학적 물질에 냉각유체(140)를 순환시킨다. 모터(130) 같은 여러개의 순환기(134)로 순환이 이루어지게 된다. 본 발명의 최소한 한가지의 실시예에서, 물에 잠긴 모터(130)는 냉동될 생물학적 물질에 냉각유체(140)를 순환시키기 위해 임펠러(132)를 구동시킨다. 여러 가지 펌프(도시 안됨)를 포함하여 다른 순환기(134)들이 본 발명의 목적과 부합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 한가지 실시예에서 모터(130)터 외에도 최소한 하나의 순환기(134)를 이용하여 냉각유체가 순환되는 영역 및 체적이 증가하게 된다. 다중 순환기(134)를 이용하는 실시예에서, 냉각유체 순환 영역 및 체적은 사용되는 추가되는 순환기에 정비례하게 증가하게 된다. 예를 들어 선호되는 실시예에서 폭이 24인치, 깊이가 48인치 이상이 되지 않는 영역 통해 순환되는 냉각유체의 1 피트당 하나의 순환기가 추가된다.

선호적으로 모터(130)는 생물학적 물질을 지나는 냉각유체 유동속력을 일정하게 유지하도록 제어될 수 있으며, 동시에 탱크(110) 내부의 모든 지점에서 +/-.5℃ 범위 내에서 냉각유체 온도를 고르게 분배되도록 한다. 생물학적 물질을 순환하는 냉각유체의 일정한 속력으로 인해 냉동되는 동안 생물학적 물질을 유리화되도록 열을 일정한 양으로 제거한다. 한가지 실시예에서, 점성계수, 온도 등의 냉각유체의 특성이 측정 및 처리되며, 제어신호가 모터(130)로 보내져서 필요한 만큼 임펠러(132)의 회전속도 및 토크를 증가 혹은 감소시킨다. 다른 실시예에서, 모터(130)는 유체 범위에 대해 주어진 회전속도를 유지하도록 구성된다. 이러한 경우, 모터(130)에 의해 전달되는 임펠러(132)의 토크 혹은 회전속도는 외부에서 제어되지 않는다. 본 발명의 선호적인 실시예를 구현하기 위해 외부펌프, 샤프트나 풀리(pulley)가 필요하지 않다. 모터(130) 혹은 다른 순환기(140)들은 냉각유체(140)에 직접 잠긴다. 그 결과 냉각유체(140)는 탱크(110)에 있는 생물학적 물질을 냉동할 뿐만 아니라 모터(130)를 냉각시키기도 한다.

열교환 코일(120)은 선호적으로 "다중경로 코일(multi-path coil)"이다. 냉각제가 한 개나 두 개의 연속적인 경로에 제한되는 종래의 냉각코일과는 반대로 냉각제가 다중경로(세 개 이상의 경로)를 이동할 수 있도록 한다. 또한 코일의 크기는 적당량의 냉각유체(140)를 갖는 횡단면과 직접적으로 관련이 있다. 예를 들어, 선호되는 실시예에서, 탱크(110)는 길이가 1피트, 깊이가 2피트, 넓이가 4피트이며, 2피트당 1피트인 열교환 코일(120)을 이용한다. 만약 탱크(110)의 길이가 20 피트로 늘어난다면, 열교환 코일(120) 길이 또한 20 피트로 늘어나게 된다. 그 결과 열교환 코일(120)은 동일한 열부하를 처리하는데 필요한 종래의 코일 크기에 1/2로 만들어질 수 있다. 모터(130) 같은 순환기(134)는 냉동될 생물학적 물질에 대해서 차가운 냉각유체(140)를 순환시키고 냉각유체(140)에 잠겨있는 열 교환코일(120)에 따뜻한 냉각유체를 전달시킨다. 최소한 한가지 실시예에서, 열교환 코일(120)은 냉동될 생물학 물질에서 제거된 열과 동일한 양의 냉각유체(140)에서 제거된 열보다 많은 양을 제거하여 냉각유체(140)의 온도를 정해진 범위에서 유지한다. 열교환 코일(120)은 냉각유닛(190)에 연결되어 열교환코일(120) 및 시스템으로부터 열을 제거한다.

선호되는 실시예에서, 냉장유닛(190)은 열교환코일(120)의 하중조건과 일치하도록 설계되어 균형있고 효율적인 방법으로 시스템으로부터 열을 제거하여 재료가 빨리 제어된 방법으로 냉동된다. 냉동유닛(190)의 효율은 열교환 코일(120)의 효율적인 공급과 냉장유닛(190)에 이용된 압축기의 효율적인 출력으로 인해 흡입력을 제거하기 위해 이용되는 방법에 직접 관련된다.

이러한 방법론은 냉장 및 냉각유치(140) 온도 사이에서 유지되고 응축온도 및 대기온도 사이에서 유지되는 매우 근접한 허용도를 필요로 한다. 열교환기 코일(120)의 설계와 함께 이러한 온도 기준으로 열교환 코일(120)이 좀더 효율적으로 공급되며, 응축기는 제조 평균등급 보다 25% 좋은 성능을 얻기 위해 균형잡히고 철저히 제어된 방식으로 공급된다.

도 1에 도시된 바와 같이 냉장유닛(190)은 외부에 먼 곳에 위치한 냉장 시스템이다. 그러나 또 다른 실시예에서(도시 않됨), 냉장유닛(190)은 탱크(110)의 또다른 영역과 일체형으로 통합된다. 냉장유닛(190)의 여러 가지 형태가 특정한 형태의 냉각유닛(00)에 다소간 적합할 수 있다. 예를 들어, 만약 탱크(110)가 굉장히 크다면, 독립된 냉장유닛(190)이 바람직하며, 휴대용은 통합형 냉장유닛(190)으로부터 이점을 얻을 수 있다. 전술된 원리, 특히 크기가 줄어든 열교환 코일을 이용하여 발생된 효율에 의해 이렇게 통합되는 것이다.

냉장유닛(190) 및 열교환코일(120)의 덕택으로 선호되는 실시예에서 냉각유체는 -20℃ 내지 -30℃ 사이의 온도까지 냉각되고, +/-.5℃ 이하의 냉각유체에 대한 온도차이를 갖는다. 다른 실시예에서, 냉각유체는 내용물이 냉동되는 비율을 제어하기 위해 -20℃ 내지 -30℃ 범위의 외부 온도로 냉각된다. 다른 실시예에서 원하는 냉동비율을 얻기 위해 냉각유체의 순환비율이 제거된다. 선택적으로, 냉각유체의 체적은 특정한 냉동비율을 쉽게 얻기 위해 변할 수 있다. 냉각유체, 순환비율, 냉각유체 체적, 냉각유체 온도의 여러 가지 조합이 이용되어 원하는 냉동비율을 얻을 수 있다.

도 2에 많은 양의 생물학적 물질을 냉동시키기에 적합한 냉동시스템(100)의 실시예가 도시되었다. 도 2에 도시된 참조번호들은 도 1에 도시된 것과 동일하거나 비슷하다. 탱크(110)는 냉각유체(140)를 저장하고 있는데, 랙(rack)(150)의 높이는 낮아질 수 있다. 랙(150)은 랙 지지부(210)에 움직일 수 있도록 연결되어 있어서 랙(150)은 탱크(110)안에 물질을 쉽게 집어넣을 수 있도록 높이가 높아지거나 낮아질 수 있다.

사용시 냉동될 생물학적 물질은 랙(150)의 트레이(155)에 놓인다. 선호적으로 트레이(155)는 와이어나 망사 같은 것으로 구성되어 있어서 냉각유체(140)가 그 위에 놓여진 물품 주변을 자유롭게 순환할 수 있게 된다. 선호적으로 일단 냉각유체가 원하는 온도로 냉각되면, 랙 지지부(210)는 냉각유체(140)에 트레이(155)가 잠기도록 하기 위해 탱크(110) 안까지 랙(150)을 낮춘다. 여러가지 기어, 체인, 풀리나 수동으로 랙(150)을 아래로 내릴 수가 있다. 순환기(134)는 빠르고 원하는 대로 조절하여 냉동시키기 위해 트레이(155)에 놓은 내용물 주변으로 냉각유체(140)를 순환시킨다. 생물학적 물질을 탱크(110) 안에 담그기 위한 다른 장치가 사용될 수 있는데, 자동 하강 시스템은 모든 환경에 사용할 수 있는 것은 아니다.

도 3에 본 발명의 한가지 실시예를 따르는 방법이 도시되었으며, 참조번호 (300)로 표시되었다. 전술된 방법은 단계(310), 즉 냉각유체가 열교환코일을 순환하는 단계에서 시작한다. 열교환 코일은 전술된 바와 같이 냉장 시스템에 연결되어 작동하고, 냉각유체가 열교환코일을 순환함에 따라서 냉각유체의 온도를 감소시키는데 사용된다. 단계(320)에서 냉각유체의 온도가 측정되고, 냉각유체의 온도가 최적의 온도범위 내에 있는지가 결정되는 단계(300)를 수행하기 위해 상기 방법이 이용된다. 그러나 이러한 최적의 냉각유체 온도범위는 각각의 상황에 따라 다르고, 여러 상황에 대한 선호되는 최적의 온도 범위는 -20℃ 내지 -30℃ 사이가 된다.

만약 냉각유체 온도가 최적의 미리 정해진 온도 범위 내에서 결정되지 않는다면 단계(355)가 수행된다. 단계(355)에서 열교환코일은 냉장유닛에 의해 냉각되고 방법은 단계(310)로 되돌아가서 냉각유체의 온도를 낮추기 위해 냉각유체가 열교환코일을 순환하게 된다. 선호적으로 단계(310,320,330,335)는 냉각유체가 최적의 온도 범위에 도달할 때까지 계속적으로 수행된다.

생물학적 물질을 냉동시키기 위해 사용된 냉각유체의 온도는 본 발명의 최소한 한가지 실시예에서 중요한 요소가 된다. 종래의 공정을 이용하여 유리화를 구현하기 위해 생물학적 물질은 -196℃의 온도에서 액화질소에 담궈진다. 이러한 짧은 시간 내에 온도의 급작스런 변화는 세포구조 내의 물을 빠르게 냉동시켜서 얼음결정이 형성될 기회를 주지 않는다. 그러나 액화질소에 담궈 생물학적 물질을 냉동시켜서 세포막에 응력분열을 일으키게 되고, 저온보존을 위해 액화질소에 담그는데에 따른 유익한 요소들을 제한하게 된다. 본 발명의 선호되는 실시예에 사용된 온도는 -20℃ 내지 -30℃ 사이에 있게 되고, 온도변화에 따른 응력분열은 최소화되며, 세포막에 손상을 적게 주소 유리화가 진행될 수 있다.

냉각유체는 적합한 온도로 냉각되고 냉동될 생물학적 물질은 단계(305)에서 냉동되기 위해 준비된다. 전술된 바와 같이 생물학적 물질은 생명력이 있는 단세포, 조직, 기관, 핵산 및 다른 생물학적 활물질을 포함하지만, 이것들에 국한되지는 않는다. 적절할 때에 냉동되기 전에 이러한 물질들은 화학적으로 처리된다. 화학적으로 생물학적 물질을 준비하는 것은 세포가 성장하거나 죽는 동안 세포에 의해 분비되는 치명적인 물질을 제거하여 세포의 생존능력을 증가시키는 약품(안정제)으로 생물학적 물질을 예비처리하는 것을 포함한다. 유용한 안정제는 화학물질과 화학 합성물을 포함하며, 산소 레디칼(oxygen radical) 같은 고활성 손상된 분자를 제외한다.

화학적으로 미리 처리된 생물학적 물질은 환경순화(acclimation) 단계(도시 않됨)를 포함한다. 미리 처리된 후 얼마동안 보존될 생물학적 물질은 배양온도 이하이지만 냉동온도 보다 높은 온도로 환경순화된다. 그러므로 세포 물질대사 및 빠른 온도변화에 대한 쇼크를 지연시켜 저온보존을 위해 생물학적 물질을 미리 처리하는데 도움이 된다. 그러나 환경순화 단계가 본 발명을 실행하기 위해 항상 필요한 것인 아니다.

선호되는 실시예에서, 냉동하기 위해 화학적으로 미리 처리된 생물학적 물질은 동결 방지제를 생물학적 물질로 채워 넣는 것을 포함한다. 이럴 때 사용된 내용물은 충전재(loading agent)라고 한다. 유용한 충전재는 여러개의 탈수재(dehydrating), 침투재(permeating agent), 비침투재, 삼투재(osmotic agent)를 포함한다. DMSO와 에칠렌 글리콜 같은 침투재 및 과당(fructose), 자당(sucrose) 혹은 포도당, 소르비톨(sorbitol), 마니톨(mannitol) 혹은 글리세롤 같은 비침투재와 침투재가 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 목적에 부합하는 다른 종류의 적합한 동결 방지재가 사용될 수 있다.

냉각유체가 적합한 온도에 도달한 후에 단계(315)가 수행되며, 화학적으로 미리 처리된 생물학적 물질은 냉각유체에 잠긴다. 전술된 바와 같이, 생물학적 물질은 용기에 저장되거나 냉각유체에 직접 놓이게 된다. 그런다음 단계(337)가 수행되는데 담궈져 있는 모터, 임펠러 조립체 혹은 펌프 같은 순환기가 전술된 속력으로 냉각유체를 순환하도록 사용되며, 담궈진 생물학적 물질에 순환된다. 냉각유체가 생물학적 물질을 통과함에 따라, 냉각유체 온도 보다 높은 온도에서 물질로부터 열을 제거하며, 그 열은 냉각유체로 전달되고, 냉동될 생물학적 물질로부터 열을 제거한다. 본 발명의 한가지 실시예를 따라 미리 처리된 물질이 유리화되도록 미리 처리된 생물학적 물질을 냉동시키기 위해 냉동될 생물학적 물질을 지나가는 냉각유체의 순환이 일정하게 유지되어야 한다.

냉각유체가 냉동될 생물학적 물질에 순환된 후에, 단계(339)가 수행된다. 단계(339)는 냉각유체 점성, 온도 같은 변화 대응하기 위해 냉각유체의 속력을 조절한다. 선호적으로 냉각유체의 속력은 여러개의 순환기로 제공되는 힘을 조절하여 일정하게 유지된다.

도 3에 도시된 단계가 순차적으로 도시되었다. 그러나 설명된 방법에서 모든 단계 혹은 몇몇 단계는 연속적으로 수행되지만 다른 순서로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 최소한 한가지 실시예는 냉각유체를 순환시키기 위한 단일형 순환모터를 이용한다. 이러한 실시예에서 냉각유체는 단계(310)에서 열교환 코일을 지나 순환되고 동시에 단계(337)에서 보존될 생물학적 물질을 지나간다. 또한 본 발명의 한가지 실시예는 냉각유체 온도, 점성 및 다른 유체특성을 시스템 내의 여러 위치에서 연속적으로 측정한다.

또 다른 실시예에서, 냉각유체의 몇가지 특성은 직접 측정되지 않는다. 오히려 냉각유체 특성의 변화는 순환모터의 회전속도로부터 알 수 있다. 만일 모터가 느린 속도로 회전하게 되면 모터를 원하는 회전속도로 되돌리기 위해 힘이 더 필요하게 되고 냉각유체 특성에서 이러한 변화를 보정하기 된다. 한가지 실시예에서,모터는 일정한 회전비율 유지하도록 되어 있다. 이러한 일정한 모터 회전율로 인해서 냉각유체 순환 비율이 일정하게 될 것이다.

본 발명의 한가지 실시예에 대한 실험이 5ml의 물을 눈금이 그려진 용기에 냉동시키는 것으로 수행되었다. 냉동할 때 총 체적이 1% 이하로 증가되었으며, 종래의 냉동할 때 보다 훨씬 적은 양이다. 또 다른 실험에서, 본 발명의 선호되는 방법을 따르는 냉각 시스템에서 종래의 냉동기에서 얇은 판으로 얼음이 얼었다. 냉동된 후에, 얼음을 암시야 현미경(dark microscope)으로 관찰하였다. 예상대로 종래의 얼음은 결정성 패턴을 나타냈고, 본 발명의 원리를 따라 얼려진 얼음은 빛의 변화를 보이지 않아 얼음결정이 형성되지 않았음이 나타났다.

도 4에 여러 가지 냉동방법을 이용하여 미리 처리되지 않은 식물조직(씨없는 포도)를 냉동한 다음 세포의 손상을 비교한 실험 결과가 나와 있다. 막대 그래프(400)는 대조군(A)에 대해서 방법(B,C,D,E)을 이용하여 손상된 개개의 세포들의 수를 비교한다. 방법(A)은 냉동되지 않은 상태이고, 방법(B)은 -20℃로 냉각하기 위해 종래의 냉동기를 사용했으며, 방법(C)은 -80℃로 세포를 냉동시키기 위해 초저온 냉동기를 이용하였고, 방법(D)은 -196℃로 냉동시키기 위해 액화질소를 사용하었으며, 방법(E)은 -25℃로 냉동시키기 위해 본 발명의 선호되는 실시예를 이용하였다.

실험은 막대 그래프(400)에 결과가 나와있는 대로 미리 처리되지 않고 동결방지체로 처리되지 않은 식물조직에서 나온 데이터를 이용하였다. 도 4에 도시된 바와 같이 그 결과는 본 발명의 선호적일 실시예를 따라 수행된 방법의 월등하다는것을 보여준다. 방법(A)에서 볼 수 있듯이 어떠한 세포도 손상을 입지 않았으며 다른 방법에서 드러난 손상은 냉동법에 의한 것임을 알 수 있다. 실험을 따르면 방법(B)(종래의 냉동법)을 이용하여 냉동의 세포의 40%가 해동 후에 손상되었으며, 액 50%의 세포는 냉동 후 방법(C)으로 해동했을 때 손상되었고, 세포의 약 60%가 냉동 후에 방법(D)(액화 질소)으로 해동했을 때 손상되었다. 방법(E)(본 발명의 선호되는 실시예)으로 냉동된 20%의 세포들만 해동시 손상되었다. 손상은 식물 세포벽을 확대하여 관찰되었다.

도 5에 본 발명의 선호되는 실시예를 따르는 냉동법 및 종래의 냉동법을 비교하여 화학적으로처리된 사람의 정자가 냉동된 후에 세포의 운동을 측정하여 세포의 생존 및 기능을 실험한 결과에 나와 있다. 상기 두 가지 방법에 대해서 세포는 산업 표준 기술을 이용하여 냉동하기 위해 화학적으로 미리 처리되었다. 막대 그래프(500)는 이러한 두 가지 방법을 이용하여 세포가 냉동된 후에 생존능력 및 운동성을 비교한 것이다. 방법(A)은 세포를 질소안개(nitrogen mist)에 30 분동안 있게한 다음 액화질소에 집어넣는 종래의 방법을 이용하였다. 방법(B)은 본 발명의 선호되는 실시예를 이용하여 세포를 -25℃까지 냉동한다.

막대 그래프(500)에 도시된 바와 같이 실험은 화학적으로 처리된 사람의 정자를 이용하였다. 막대 그래프(500)로 나타난 결과는 본 발명의 선호되는 실시예를 따라 수행되는 방법이 탁월함을 보여준다. 실험에서 방법(A)(종래의 방법)을 이용하여 냉동된 세포 중 40%는 해동시 살아날 수 있으며, 약 20%는 그 활동성을 유지한다. 그러나 방법(B)을 이용하여 냉동된 세포의 75%가 해동시 살아날 수 있고, 약45%가 그 운동성을 유지하고 있다. 세포의 생존능력은 해동시 생사 착색(live-dead stain)을 이용하여 알 수 있고 운동성은 세포를 확대 관찰하여 알 수 있다.

도 6에 본 발명의 선호되는 실시예를 따르는 냉동방법과 종래의 냉동방법을 비교하여 화학적으로 처리된 돼지 근육세포를 냉동한 다음 셀의 생존능력을 실험한 결과가 나타나있다. 상기 두 가지 방법에 대해서 세포는 두 가지 농도의 동결방지제를 이용하여 냉동하기 위해 화학적으로 처리되었다. 막대그래프(600)는 각각의 방법으로 냉동한 후에 세포의 생존능력을 비교한 것이다. 방법(A)은 세포를 액화질소에 넣는 종래의 방법과 함께 10% 농도의 동결 방지제를 이용하며, 방법(B)은 세포를 액화질소에 넣는 종래의 방법으로 1% 농도의 동결방지제를 이용한다. 방법(C)은 세포를 -25℃로 냉동시키기 위해 본 발명의 선호되는 실시예를 이용하여 10% 농도의 동결 방지제를 이용하며, 방법(D)은 세포를 -25℃로 냉동시키기 위해 본 발명의 선호되는 실시예로 1% 농도의 동결 방지제를 이용한다.

막대 그래프(600)에 도시된 바와 같이 실험에서 화학적으로 처리된 돼지 근육세포가 사용되었다. 도 6의 실험결과에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 선호되는 실시예를 따라 수행된 방법의 월등히 좋다는 것을 알 수 있다. 실험을 따르면 방법(A)(10% 동결 방지제를 사용하는 종래의 방법) 혹은 방법(B)(1%의 동결 방지제를 사용하는 종래의 방법)을 이용하여 냉동된 세포들 중 40%는 해동시 생존하게 된다. 그러나 방법(C)(10% 동결 방지제를 사용한 본 발명의 선호되는 실시예) 혹은 방법(D)(1%의 동결 방지를 사용한 본 발명의 선호되는 실시예)를 이용하여 냉동된 세포중 80%가 해동시 생존하게 된다. 세포의 생존능력은 해동시 생사 착색(live-dead stain)을 이용하여 밝혀진다.

도 7은 본 발명의 선호되는 실시예를 따르는 냉동법 및 종래의 냉동법을 비교하여 화학적으로 처리된 주의 태아를 냉동한 다음 세포의 생존에 대한 결과를 나타낸다. 상기 두 가지 방법에 대해서 세포들은 산업 표준기술을 이용하여 냉동하기 위해 화학적으로 미리 처리된다. 막대그래프(700)는 두 가지 방법을 이용하여 냉동후의 태아 생존능력을 비교한다. 방법(A)은 태아를 액화질소에 넣은 다음 질소 안개에서 제어된 비율로 냉동하는 종래의 방법을 사용하였다. 방법(B)은 액화질소에 넣은 다음 세포들을 -25℃까지 냉동시키는 본 발명의 선호적인 실시예를 사용하였다.

막대 그래프(700)에 나타난 결과는 화학적으로 처리된 쥐의 태아로부터 나온 데이터를 이용하여 실험한 것이다. 도 7에서 볼 수 있는 것과 같이 본 발명의 선호되는 실시예를 따라 수행된 방법이 더욱 우수하다는 것을 알 수 있다. 실험에서 약 50%의 냉동된 태아가 방법(A)(종래의 방법)을 이용하여 해동시 생존했다. 그러나 90%의 태아는 방법(B)을 사용하여 해동시 생존했다. 태아의 생존능력은 생사 착색(live-dead stain)을 이용하여 밝혀진다.

본 발명은 물질이 유리화되고 세포막에서 응력분열의 형성을 최소화시키도록생물학적 물질을 냉동시킬 수 있기 때문에, 본 발명의 여러 가지 실시예는 피부이식, 각막보관, 순환기 저장, 식물조직 냉동, 불임치료, 분자재생 병(암) 같은 의학분야에 관련된다. 선택적으로 본 발명은 정액, 난모세포, 태아를 저온보존하기 위한 축산업에 이용될 수 있다.

전술된 바와 같이 도면을 참고로 설명되었으며, 특정한 실시예를 예로 들어 설명되었다. 본 발명의 범위 내에서 여러 가지 변형이 가능하다. 전술된 상세설명은 본 발명을 제한하고자 함이 아니며 본 발명의 범위는 청구항을 따른다.

Claims (54)

1. 저온보존 방법은

   냉각유체에 생물학적 활물질을 담그고,

   생물학적 활물질이 유리화되고, 세포막에서 응력분열 형성이 최소화되도록 생물학적 활물질을 냉동하기 위한 일정한 온도 및 속력으로 냉각유체를 생물학적 활물질을 지나도록 순환시키는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 냉각유체는 -20℃ 및 -30℃ 사이의 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 생물학적 활물질을 지나가는 냉각유체의 속도는 폭이 24인치, 깊이가 48인치 보다 크지 않는 영역을 통해 냉각유체 1피트당 1분에 35리터가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 냉동하기 위해 생물학적 활물질을 화학적으로 처리하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 냉동하기 위해 생물학적 활물질을 화학적으로 처리하는 것은 동결 방지제로 물질을 처리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 냉각유체는 냉각유체에 담궈진 순환기에 의해 순환되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 순환기는 모터, 임펠러가 냉각유체를 순환시키도록 모터에 회전 가능하게 연결된 임펠로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 냉각유체에 잠긴 열교환 코일을 지나도록 냉각유체를 순환시키는 것으로 구성되는데, 열교환 코일은 냉각유체가 생물학적 활물질로부터 제거됨에 따라 냉각유체으로부터 동일한 양의 열을 제거할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 열교환 코일은 다중경로 코일인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 열교환 코일의 크기는 냉각유체가 순환되는 영역에 직접 관련되며, 상기 영역은 폭이 24인치, 깊이가 48인치인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 8 항에 있어서, 열교환 코일의 부하조건에 맞는 냉장유닛으로 열교환 코일을 냉각시키는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항에 있어서, 생물학적 활물질은 생존한 단세포로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 조직으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 기관으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 핵산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 리보핵산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 1 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 아미노산 합성물로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 1 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 리피드(lipid) 합성물로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 저온보존 방법은

    냉각유체에 생물학적 활물질을 담그고,

    생물학적 활 물질이 유리화되도록 일정한 속력 및 온도로 생물학적 활물질에 냉각유체를 순환시켜서 -30℃ 이상의 온도로 생물학적 활 물질을 냉동시키는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 냉각유체는 -20℃ 및 -30℃ 사이의 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 19 항에 있어서, 생물학적 활물질을 지나가는 냉각유체의 속도는 폭이 24인치, 깊이가 48인치 보다 크지 않는 영역을 통해 냉각유체 1피트당 1분에 35리터가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 19 항에 있어서, 냉동하기 위해 생물학적 활물질을 화학적으로 처리하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 냉동하기 위해 생물학적 활물질을 화학적으로 처리하는 것은 동결 방지제로 생물학적 활물질을 처리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 19 항에 있어서, 냉각유체는 냉각유체에 담궈진 순환기에 의해 순환되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 순환기는 모터, 임펠러가 냉각유체를 순환시키도록 모터에 회전 가능하게 연결된 임펠러로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 19 항에 있어서, 냉각유체에 잠긴 열교환 코일을 지나도록 냉각유체를 순환시키는 것으로 구성되는데, 열교환 코일은 냉각유체가 생물학적 활물질로부터 제거됨에 따라 냉각유체로부터 동일한 양의 열을 제거할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 열교환 코일은 다중경로 코일인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 26 항에 있어서, 열교환 코일의 크기는 냉각유체가 순환되는 영역에 직접 관련되며, 상기 영역은 폭이 24인치, 깊이가 48인치인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 26 항에 있어서, 열교환 코일의 부하조건에 맞는 냉장유닛으로 열교환 코일을 냉각시키는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 19 항에 있어서, 생물학적 활물질은 생존한 단세포로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 19 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 조직으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 19 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 기관으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 19 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 핵산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 19 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 리보핵산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 19 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 아미노산 합성물로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 19 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 리피드(lipid) 합성물로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 저온보존될 생물학적 물질에 있어서, 저온보존 과정은

    냉각유체에 생물학적 물질을 담그고,

    생물학적 물질이 유리화되고, 세포막에서 응력분열 형성이 최소화되도록 생물학적 물질을 냉동하기 위한 일정한 온도 및 속력으로 냉각유체를 생물학적 물질을 지나도록 순환시키는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
38. 제 37 항에 있어서, 냉각유체는 -20℃ 및 -30℃ 사이의 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
39. 제 37 항에 있어서, 미리 처리된 물질을 지나가는 냉각유체의 속도는 폭이 24인치, 깊이가 48인치 보다 크지 않는 영역을 통해 냉각유체 1피트당 1분에 35리터가 되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
40. 제 37 항에 있어서, 상기 저온보존 공정은 또한 냉동하기 위해 생물학적 물질을 화학적으로 처리하는 것으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
41. 제 40 항에 있어서, 냉동하기 위해 생물학적 물질을 화학적으로 처리하는 것은 동결 방지제로 물질을 처리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
42. 제 37 항에 있어서, 냉각유체는 냉각유체에 담궈진 순환기에 의해 순환되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
43. 제 42 항에 있어서, 순환기는 모터 및 임펠러가 냉각유체를 순환시키도록 모터에 회전 가능하게 연결된 임펠러로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
44. 제 37 항에 있어서, 저온보존 공정은 냉각유체에 잠겨 있는 열교환 코일을 지나는 냉각유체를 순환시키는 것으로 구성되며, 상기 열교환 코일은 냉각유체가 생물학적 물질로부터 제거됨에 따라 냉각유체에서 동일한 양의 열을 제거할 수 있는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
45. 제 44 항에 있어서, 열교환 코일은 다중경로 코일인 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
46. 제 44 항에 있어서, 열교환 코일의 크기는 냉각유체가 순환되는 영역에 직접 관련되며, 상기 영역은 폭이 24인치, 깊이가 48인치인 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
47. 제 44 항에 있어서, 열교환 코일의 부하조건에 일치하는 냉장유닛으로 열교환 코일을 냉각시키는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
48. 제 37 항에 있어서, 생물학적 활물질은 생존한 단세포로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
49. 제 37 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 조직으로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
50. 제 37 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 기관으로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
51. 제 37 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 핵산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
52. 제 37 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 리보핵산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
53. 제 37 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 아미노산 합성물로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.
54. 제 37 항에 있어서, 생물학적 활물질은 살아있는 리피드(lipid) 합성물로 구성되는 것을 특징으로 하는 생물학적 물질.