JP2023554658A - 生物学的材料の保存方法および装置 - Google Patents

Abstract

生物学的材料を保存するための装置は、外側断熱タンク内に配置されるように構成されたインサートを含み、該インサートは、生物学的材料を受容するためのコンパートメントを画定し、作動中、該コンパートメント内の生物学的材料が熱交換流体中に浸漬され、該生物学的材料を凍結させるために該熱交換流体と熱交換し、該装置は、該コンパートメント内の生物学的材料上の熱交換流体の流れを調節するように作動可能なポンプをさらに含み、該ポンプは、１つ以上の異なる冷却段階で該生物学的材料を冷却するように作動可能である。

Description

本発明は、生物学的材料を保存する方法および生物学的材料を保存するための装置に関する。

精子凍結保存（凍結）は、４０年以上にわたって不妊治療と組み合わせて成功裏に使用されており、その結果、何千もの出産がもたらされている。精液の質が非常に悪い場合、凍結された提供精子を利用することにより、妊娠するためのメカニズムを提供することができる。提供精子の凍結は、患者が同じ生物学的父親との家庭を築くために繰り返し利用しやすいという利点もあり、また、この限られた資源を必要とする患者の集団に利用可能な物質の利用効率を最大化することもできる。男性のがん治療開始前の精子凍結は、多くの場合、妊孕性を維持するための唯一の選択肢となる。

精子の凍結は、凍結保護物質グリセロールを用いて１９５３年に初めて報告された。この方法は、わずかな改良を加えただけで、今日も使用されている。凍結の３つの方法がルーチンで使用され、すなわち、ａ）バイアルまたはストローを液体窒素蒸気中に懸濁する方法、ｂ）推定凍結速度１０℃／分で冷却する方法、またはｃ）コントロールレート凍結機を用いて１．５℃／分で凍結する方法である。これらの方法には明らかに大きなばらつきがあり、最適化研究はほとんど行われていない。凍結中およびその後の融解中に、浸透圧ストレスや酸化ストレス、凍結保護物質による毒性、細胞内氷晶の形成などのダメージが生じ、融解後に正常に機能する精子の数が減少する可能性がある。したがって、凍結保存の効率は、精子へのダメージのリスクを最小限に抑えるために非常に重要である。浸透圧の変化や酸化ストレスの影響を軽減するために、凍結前や凍結中にタンパク質や抗酸化物質を添加し、ダメージを軽減することが行われてきた。しかし、これらのアプローチは、不十分な凍結・融解プロトコルを補う手段に過ぎないことが多い。

胚凍結保存のような生殖補助医療（ＡＲＴ）における多くの状況では、非常に少数の細胞のみが凍結され、高い細胞生存率が成功の結果にとって重要である。これとは対照的に、通常凍結可能な精子は数が多いため、生存率が低くても臨床的に大きな影響を与えることなく許容されることが多い。そのため、精子の凍結成績を向上させる研究はほとんど行われていない。しかし、精子を回収するために精巣生検を受ける多くの不妊症男性のように、精子の初期数や質が劇的に低下している状況においては、これは重大な意味を持つ可能性がある。運動率が本質的に低下している精子サンプルは、新鮮な精子と比較して凍結した場合の受精率が低くなり、同様の現象は凍結前の特性が正常な精子についても報告されており、子宮内人工授精に凍結精子を使用することを消極的にしている。子宮内人工授精（ＩＵＩ）を受けた１０００人以上の若い女性から得た我々のデータも、凍結精子の妊娠率が自然妊娠の半分（１６％）しか達成できないという概念を支持している。このような数値は、ＩＵＩを試みる代わりに、より侵襲的で高価な体外受精を第一選択治療として用いるという臨床判断にしばしば影響を与える。

癌の長期生存率は、細胞毒性療法の改善により、ここ数十年で著しく上昇した。小児や青年の８０％以上が癌から生還しており、１６～４５歳の成人の９００人に１人が癌からの生還者ということになる。従って、増え続ける生還人口のために、生殖を含むあらゆる通常の生活が期待できるＱＯＬを向上させることは、健康上の大きな優先事項である。しかし、細胞毒性によるがん治療の結果、卵巣卵胞が破壊され、早発閉経となるため、女性では妊娠可能な時期が短くなるか、根絶されてしまう。治療の種類や投与量、治療時の年齢にもよるが、３０歳までに女性生存者の４０～９７％が不妊症になる可能性がある。これは一般に卵巣卵胞集団に反映される。

妊孕性を失う可能性によって引き起こされる患者の苦痛、および治療前に妊孕性を保護する措置が提供されなかった場合の後悔の大きさは、十分に記録されてきた。がん治療が妊孕性に及ぼす影響や妊孕性を温存するための潜在的な方法について話し合うことは、今や国際的な標準治療となっている。卵子（成熟卵）や未成熟の始原卵胞を含む卵巣組織（腹腔鏡で採取し、後日体内に移植するために凍結保存する）の凍結保存による妊孕性の温存は、がん生存後に自身の遺伝物質で生殖する選択肢を提供するために、小児や女性において現在では確立された処置である。その後の移植が成功すれば、内分泌機能が回復し、成熟した卵子が何年にもわたって生産される可能性がある。私たちのグループによる、卵巣以外の部位に移植された凍結保存卵巣組織からの卵子採取後の双子の誕生は、原始卵胞の保存が成功したという明白な証拠を示している。凍結保存した卵巣組織を移植元の女性に戻して出産した例は、世界中で１４０例しか報告されていない。

赤血球（ＲＢＣ）を体外に保存する能力は、長年にわたって救命のための実践とみなされてきた。より最近では、輸血医療における冷凍保存赤血球の使用法が広く評価されている。冷凍保存中の赤血球は徐々に劣化し、長期保存赤血球の点滴は、術後感染症、入院期間、死亡率などの点で不利な臨床結果と関連している。

保存された赤血球の点滴に関する懸念は依然として残っており、現在では輸血制限戦略が支持されている。このため、凍結保存への関心が再び高まっている。赤血球を超低温で保存すると、細胞代謝が停止し、その結果、不利な臨床結果に関係してきた細胞の劣化の進行を防ぐことができる。

当初、凍結保存は、赤血球を長期間生存可能に維持するための有望なアプローチと考えられていた。しかし、凍結保存された赤血球（一般に「凍結赤血球」として知られている）の臨床応用は、この保存法の高価で、時間がかかり、非効率的な性質によって妨げられていた。

冷凍保存赤血球の要件
現在、赤血球は、生存赤血球の保持状態にもよるが、最大５～６週間、２～６℃で日常的に保存されている。一方、凍結保存は、赤血球を数年間保存することを可能にする。凍結保存は現在、希少血液型のドナーからの赤血球の長期保存や軍事配備のための貴重なアプローチである。しかし、凍結保存赤血球の備蓄は、需要が赤血球の供給を上回るような緊急時や臨床状況においても有益である。現在の方法による凍結保存赤血球の保存期間は最長１０年である。

国際的なガイドラインでは、冷凍赤血球保存装置での溶血が許容レベル（すなわち、ヨーロッパでは０．８％、米国では１％）以下に保たれ、点滴後２４時間経過しても点滴赤血球の少なくとも７５％が循環していなければならないとされている。

しかし、このガイドラインは、点滴後の赤血球の機能を具体的に反映していない。

保存赤血球の品質
４℃での保存は赤血球の生化学的プロセスを遅らせるが、細胞代謝はこの温度で完全に抑制されるわけではない。冷凍保存中に、点滴後の赤血球の機能を損なう可能性のある様々な変化が観察されている。これらの変化には、２，３－ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および膜シアル酸含量の減少が含まれる。その他の変化としては、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の細胞表面への移行、膜脂質やタンパク質の酸化傷害、球状赤血球への形状変化、膜の滲出、赤血球貯蔵ユニットにおけるカリウム、遊離ヘモグロビン（Ｈｂ）、サイトカイン、生理活性脂質、（凝固促進）マイクロベシクルの蓄積などがある。

赤血球のレオロジー特性も冷凍保存中に損なわれる。冷凍保存された赤血球は、凝集傾向の増大と内皮細胞（ＥＣ）への接着を示し、さらに保存２週間目からは変形性が低下する。このような変化は、赤血球が微小循環において適切に機能することを妨げる可能性がある。

超低温での赤血球の保存は、赤血球の生物学的活性を停止させ、長期間の保存を可能にする。一般に、細胞の損傷を防ぐには、高濃度の凍結保護添加剤か急速な凍結速度が必要である。冷却速度が遅いと、細胞外に氷が形成される。氷が形成されると、未凍結画分の溶質含量が濃縮される。その結果、浸透圧の不均衡が生じ、赤血球から体液が流出し、細胞内脱水が起こる。一方、急速な冷却速度では、赤血球の細胞質が過冷却状態になり、細胞内に氷が形成される。

凍結損傷を最小限に抑えるためには、凍結保護添加剤が重要であると考えられてきた。長年にわたり、赤血球の凍結保存のためのさまざまな非透過性添加剤および透過性添加剤が研究されてきた。ヒドロキシエチルデンプンやポリビニルピロリドンなどの非透過性添加剤や、さまざまなグリコールや糖類が有望視されたのは、輸血前に融解赤血球から除去する必要がないと提唱されたからである。

逆に、浸透性添加剤のグリセロールは、超低温で赤血球を保護する能力で知られている。赤血球を保護するのに必要なグリセロールの濃度は、冷却速度と保存温度に依存する。グリセロールは、凍結中の細胞脱水と溶質の影響を最小限に抑えながら、氷の形成速度と程度を遅くすることで赤血球を保護する。

凍結保存赤血球の要件
超低温の氷点下で赤血球を保存することにより、赤血球を何年も保存することが可能になるが、いったん解凍された赤血球の保存可能期間は限られている。脱グリセロール化赤血球は、主に生理食塩水－アデニングルコースマンニトール（ＳＡＧＭ）保存液で４８時間まで、またはＡＳ－３保存液で１４日間まで保存される。凍結保存された赤血球は、残存グリセロール含量を１％以下にするために脱グリセロール化する必要がある。さらに、赤血球は、赤血球単位の溶血が許容レベル（欧州では０．８％、米国では１％）以下であること、および脱グリセロール後の赤血球の解凍後の回復率（凍結解凍洗浄回復率）が８０％以上であることを要求する上記の国際的ガイドラインの対象となる。また、凍結保存された赤血球の少なくとも７５％は、点滴後２４時間経っても循環していなければならない。

グリセロールを用いた凍結法
現在、グリセロールによる赤血球の保存には２つの凍結法が認められている。
１．赤血球は、－１４０℃以下の温度で、最終濃度約２０％グリセロール（ｗｔ／ｖｏｌ）の低グリセロール法（ＬＧＭ）を用いて液体窒素中で急速凍結することができる。
２．赤血球は、高グリセロール法（ＨＧＭ）を用いてゆっくりと凍結することができ、赤血球ユニットを－６５℃～－８０℃で最終濃度約４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグリセロールで保存することができる。
３．赤血球は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の標準製剤を用いて急速凍結することができる。

凍結保存赤血球は、処理手順の間に生じる細胞損失のために効率が悪い。この細胞損失は、ＨＧＭ凍結保存赤血球ではより顕著である（約１０－２０％）。しかし、ＬＧＭの方が赤血球の収量が多いにもかかわらず、一般にＨＧＭ凍結保存赤血球は凍結中の温度変動に耐え、融解後の保存中により安定であると考えられている。さらに、ＨＧＭ凍結保存赤血球は液体窒素を必要としないため、保存や輸送の条件が緩和される。その結果、ＨＧＭは現在欧米で最も適用されている赤血球凍結法である。

凍結保存のＨＧＭに関連する保存法は、高いグリセロール含量と保存温度範囲により細胞内脱水が生じる。さらに、ＨＧＭ法は、多くの応用において、保存された細胞およびその周囲の物質が流体状態から固体状態へ、またはその逆へゆっくりと移行するため、浸透圧ショック障害につながり、細胞死が増加する。

対照的に、ＬＧＭは溶質濃度の影響を最小化し、それによって浸透圧ショックの影響を最小化するが、急速冷却速度が細胞から水が移動するのに十分な時間を与えなければ、細胞内氷の形成が問題になる可能性がある。

本発明の好ましい実施形態は、より低いグリセロール含量を利用することで、凍結保存赤血球の保存期間を延長しながら、細胞の脱水および溶質効果を最小限に抑えようとするものである。

他の好ましい実施形態は、細胞の生存率を維持しながら、凍結保護物質の使用を減らすか、または排除しようとするものである。

上記の背景は赤血球に関するものであるが、本発明の実施形態は、幹細胞（例えば骨髄、臍帯血、羊水由来など）、他の血液製剤（例えば白血球、血漿、血小板、血清など）、細菌、真菌などの微生物、生殖細胞、および精液などの関連物質、腫瘍細胞、初乳、ワクチン、植物細胞などの他の生物学的材料にも適用できることが理解されよう。

本明細書で使用される場合、「生物学的材料」には、以下の材料、すなわち、血液、血漿、血小板、細菌、臓器、精液、卵、初乳、皮膚、血清、ワクチン、幹細胞、臍帯、骨髄、および上記の他の材料の非網羅的リストが含まれる。

本発明の第１の態様によれば、生物学的物質を保存するための装置が提供され、当該装置は、外側断熱タンク内に配置されるように構成されたインサートを備え、このインサートは、生物学的材料を受容するためのコンパートメントを画定し、作動中、コンパートメント内の生物学的材料が熱交換流体中に浸漬されて、生物学的材料の凍結のために熱交換流体と熱交換する。当該装置は、コンパートメント内の生物学的材料上の熱交換流体の流れを調節するように操作可能なポンプをさらに含み、このポンプは、１つ以上の異なる冷却段階で生物学的材料を冷却するように操作可能である。

１つ以上の異なる段階は、生物学的材料の熱伝達応答に基づいてもよい。好ましくは、熱伝達応答は、生物学的材料の熱力学的モデリングに基づく。

ポンプは、好ましくは少なくとも５０Ｌ／分、好ましくは少なくとも６０Ｌ／分、好ましくは少なくとも７０Ｌ／分、さらに好ましくは少なくとも約８０Ｌ／分のポンピング能力を有する。付加的または代替的に、ポンプは、好ましくは最大約１００Ｌ／分、好ましくは最大約１２０Ｌ／分、より好ましくは最大約１５０Ｌ／分のポンピング能力を有する。

装置は、好ましくは、ポンプからコンパートメントに熱伝達流体を搬送するための管配置をさらに含み、管配置は、コンパートメントに通じる実質的に直線状の細長い管部分（または直線状の管部分）を含み、少なくとも約０．２ｍ、好ましくは少なくとも約０．４ｍ、さらに好ましくは少なくとも約０．５ｍの長さを有する。直線状の細長い管は、好ましくはコンパートメントの直前に配置される。細長い管部分は、好ましくは約１インチ、約０．５インチ、または最大約１．５インチの直径を有する。

好ましい実施形態では、外側断熱タンクからコンパートメントへの熱交換流体の流入は、インサートの一方の面で又はそれに隣接して生じ、コンパートメントから外側断熱タンクへの熱交換流体の流出は、インサートの前記面で又はそれに隣接して生じる。

本発明の別の態様は、生物学的材料を保存する方法を提供し、当該方法は、
ａ．１つ以上の生物学的材料の特性に基づいて、浸透圧ショックに対するサンプルの感受性を推定する工程であって、該１つ以上の生物学的材料の特性は、細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢のうちの少なくとも１つを含む、工程と、
ｂ．浸透圧ショックに対するサンプルの推定感受性に基づき、サンプルの液－固相転移の開始を概算する工程と、
ｃ．相転移の開始までの所定のサンプル表面温度におけるサンプルのコアの平均温度低下率と、所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｄ．相転移の開始時点から所定のサンプル表面温度におけるサンプルのコアの平均温度低下率、および所定の急速冷却速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｅ．上述した装置の前記コンパートメント内のサンプルを、相転移の開始付近まで前記徐冷速度で冷却する工程と、
ｆ．前記コンパートメント内のサンプルを、相転移の開始付近から最終目標温度まで急冷速度で冷却する工程とを含む。

この方法は、好ましくは、冷却されたサンプルをコンパートメントから直ちに保管することをさらに含む。

好ましくは、この方法によれば、サンプルは凍結保護物質を含まない。

本発明のさらなる態様は、保存前に生物学的材料に添加されるべき凍結保護物質の量を決定する方法が提供され、当該方法は、
ａ．１つ以上の生物学的材料の特性に基づいて、浸透圧ショックに対するサンプルの感受性を推定する工程であって、１つ以上の生物学的材料の特性は、細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢のうちの少なくとも１つを含む、工程と、
ｂ．浸透圧ショックに対するサンプルの推定感受性に基づいて、サンプルの液－固相転移の開始を概算する工程と、
ｃ．相転移の開始までの所定のサンプル表面温度におけるサンプルのコアの平均温度低下率と、所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｄ．相転移の開始付近から所定のサンプル表面温度におけるサンプルのコアの平均温度低下率、および所定の急速冷却速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｅ．工程（ｃ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超える装置のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、初期量よりも所定量多い凍結保護物質の量を選択して新たな初期量を定義するか、または、工程（ｃ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、凍結保護物質の初期量を、保存前に生物学的材料に添加される前記凍結保護物質の量として選択する工程と、
ｆ．工程（ｃ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超えるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、工程（ｃ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応するまで、工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程とを含む。

好ましくは、この方法によれば、工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す前の凍結保護物質の初期量はゼロである。

徐冷速度は、毎分最大約１０℃であってよい。好ましくは、徐冷速度は毎分約０．１℃から約１０℃の間である。

急冷速度は、毎分約１００℃より大きくてもよい。好ましくは、急冷速度は毎分約２００℃より大きい。

好ましくは、液－固相転移の開始は、一定の冷却速度で凍結中のサンプルの冷却曲線から近似される。凍結中のサンプルの冷却曲線は、サンプルの前記計算流体力学解析から得られてよい。

本発明の別の態様は、凍結保存された生物学的材料を解凍する方法を提供し、該方法は、
ａ．生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料および任意の包装がサンプルを画定する、工程と、
ｂ．サンプルの熱特性を推定する工程と、
ｃ．１つ以上の生物学的材料の特性に基づいて、浸透圧ショックに対するサンプルの感受性を推定する工程であって、該１つ以上の生物学的材料の特性は、凍結開始温度、細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢のうちの少なくとも１つを含む、工程と、
ｄ．サンプルの近似された形状、サンプルの熱特性、装置の形状、装置内のサンプルの所定の配置、解凍流体の所定の入口温度、および入口から出口への解凍流体の所定の温度低下のいずれか１つ以上を含む流動制約に基づいて、解凍装置の前記タンク内のサンプルに対して計算流体力学解析を実行する工程と、
ｅ．サンプルの固－液相転移の開始を概算する工程と、
ｆ．工程（ｄ）で決定された固－液相転移の開始までの期間、凍結保存生物学的製品を解凍する工程とを含む。

解凍液の入口温度は、約２℃から１００℃の間、好ましくは約３７℃である。

固－液相転移の開始は、一定の冷却速度で凍結するサンプルの冷却曲線から近似される。

凍結中のサンプルの融解曲線は、好ましくは、サンプルに関する前記計算流体力学解析から得られる。

本明細書には、生物学的材料を保存するための装置が記載され、当該装置は、外側断熱タンク内に配置されるように構成されたインサートを含み、該インサートは、生物学的材料を受容するためのコンパートメントを画定し、該外側断熱タンクから該コンパートメントへの熱交換流体の流入は、該インサートの一方の面でまたはそれに隣接して生じ、該コンパートメントから該外側断熱タンクへの熱交換流体の流出は、該インサートの前記面でまたはそれに隣接して生じ、前記コンパートメントは、作動中、前記コンパートメント内の生物学的材料が熱交換流体中に浸漬され、前記生物学的材料の凍結のために熱交換流体と熱交換するように、装置を通る連続的な熱交換流体の流れを収容するための一連の開口を有する壁を含む。当該装置は、前記コンパートメント内の生物学的材料上の熱交換流体の流れを調節するように作動可能なポンプをさらに含み、前記ポンプは、１つ以上の異なる冷却段階で生物学的材料を冷却するように作動可能である。

本明細書にはさらに、生物学的材料を保存する方法が記載され、当該方法は、
ａ．生物学的材料のサンプルの近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料および任意の包装は、サンプルを画定する、工程と、
ｂ．サンプルの熱特性を推定する工程と、
ｃ．１つ以上の生物学的材料の特性に基づいて、浸透圧ショックに対するサンプルの感受性を推定する工程であって、該１つ以上の生物学的材料の特性は、細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢のうちの少なくとも１つを含む、工程と、
ｄ．サンプルの近似形状、サンプルの熱特性、装置の形状、装置内のサンプルの所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇のいずれか１つ以上を含む流れの制約に基づいて、上記の態様の装置の前記コンパートメント内のサンプルに対して計算流体力学解析を行う工程と、
ｅ．浸透圧ショックに対するサンプルの推定感受性に基づいて、サンプルの液－固相転移の開始を概算する工程と、
ｆ．相転移の開始までの所定のサンプル表面温度におけるサンプルのコアの平均温度低下率と、所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｇ．相転移の開始付近から所定のサンプル表面温度におけるサンプルのコアの平均温度低下率、および所定の急速冷却速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｈ．上記の態様の装置の前記コンパートメント内のサンプルを、相転移の開始付近まで前記徐冷速度で冷却する工程と、
ｉ．前記コンパートメント内のサンプルを、相転移の開始時点から最終目標温度まで急速冷却速度で冷却する工程と、
ｊ．サンプルを保存する工程とを含む。

本明細書にはまた、保存前に生物学的材料に添加されるべき凍結保護物質の量を決定する方法が記載され、当該方法は、
ａ．凍結保護物質の初期量を含む、保存されるべき生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的製品、凍結保護物質および任意の包装がサンプルを画定する、工程と、
ｂ．サンプルの熱特性を推定する工程と、
ｃ．サンプルの近似形状、サンプルの熱的特性、装置の形状、装置内のサンプルの所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇のいずれか１つ以上を含む流れ制約に基づいて、上記の態様の装置の前記コンパートメント内のサンプルに対して計算流体力学解析を実行する工程と、
ｄ．１つ以上の生物学的材料の特性に基づいて、浸透圧ショックに対するサンプルの感受性を推定する工程と、
ｅ．浸透圧ショックに対するサンプルの推定感受性に基づいて、サンプルの液固相転移の開始を概算する工程と、
ｆ．相転移の開始までの所定のサンプル表面温度におけるサンプルのコアの平均温度低下率、および所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｇ．相転移の開始付近からの所定のサンプル表面温度におけるサンプルのコアの平均温度低下率、および所定の急冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
ｈ．工程（ｆ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超える装置のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、初期量よりも所定量多い凍結保護物質の量を選択して、新たな初期量を定義する工程、または、工程（ｆ）で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、凍結保護物質の初期量を、保存前に生物学的材料に添加される凍結保護物質の前記量として選択する工程と、
ｉ．工程（ｆ）において計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超えるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、工程（ｆ）において計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応するまで、工程（ａ）～（ｇ）を繰り返す工程とを含む。

本明細書にはさらに、凍結保存された生物学的材料を解凍するための装置が記載され、当該装置は、生物学的材料を受容するための解凍槽を含み、前記生物学的材料は、トレイ、ラックおよびバスケット、解凍流体が槽内に導入される槽入口と、解凍流体が槽から除去される槽出口のうちの１つ以上を含む構造において槽内に保持され、該タンクは、該装置を通る連続的な解凍流体流を収容するように構成され、作動中、該タンク内の生物学的材料は、該解凍流体中に浸漬され、該生物学的材料の解凍のために該解凍流体と熱交換する。

また、本明細書には、凍結保存された生物学的材料を解凍する方法が記載され、当該方法は、
ａ．生物学的材料の近似された形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料および任意の包装は、サンプルを画定する、工程と、
ｂ．サンプルの熱特性を推定する工程と、
ｃ．１つ以上の生物学的材料の特性に基づいて、浸透圧ショックに対するサンプルの感受性を推定する工程であって、該１つ以上の生物学的材料の特性は、凍結開始温度、細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢のうちの少なくとも１つを含む、工程と、
ｄ．サンプルの近似形状、サンプルの熱特性、装置の形状、装置内のサンプルの所定の配置、解凍流体の所定の入口温度、および入口から出口への解凍流体の所定の温度低下のいずれか１つ以上を含む流動制約に基づいて、上記の態様の解凍装置の前記タンク内のサンプルに対して計算流体力学解析を行う工程と、
ｅ．サンプルの固－液相転移の開始を概算する工程と、
ｆ．工程（ｄ）で決定された固－液相転移の開始までの期間、凍結保存生物学的製品を解凍する工程とを含む。

以下、本発明の実施形態を、非限定的な例として、添付図面を参照して説明する。

図１Ａは、一実施形態による生物学的材料を保存するための装置の図である。 図１Ｂは、一実施形態による生物学的材料を保存するための装置の他の図である。 図１Ｃは、一実施形態による生物学的材料を保存するための装置の他の図である。 図２Ａは、一実施形態による図１の装置のタンクの斜視図である。 図２Ｂは、一実施形態による図１の装置のタンクの側面図である。 図３Ａは、一実施形態による装置の配管および計装図である。 図３Ｂは、図３Ａの図中の構成要素のＰＩＤ凡例である。 図４Ａは、約６５秒以内に約－８０℃まで凍結した、一実施形態によるタンク内の中央凍結保存バイアルの温度－時間プロットである。 図４Ｂは、約８０秒以内に約－５１℃まで凍結した、一実施形態によるタンク内の中央凍結保存バイアルの温度－時間プロットである。 図４Ｃは、図４Ａのシミュレーションと同じ速度で凍結させた、一実施形態によるタンク内の中央凍結保存バイアルの温度－時間プロットであるが、バッフルはインサートから取り外されている。

Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃｓ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｐｔｙ Ｅｔｄ名義の国際出願ＰＣＴ／ＡＵ２０１９／０５１２７９（２０２０年５月２８日にＷＯ２０２０／１０２８５４として公開済み）の明細書の詳細な説明に記載の装置および方法は、参照により本明細書に組み込まれる。

図１～図３は、一実施形態による生物学的物質を保存するための装置１００を示しており、挿入物（インサート）１４０を受け入れるように構成された断熱タンク（または浸漬タンク）１２０を含んでいる。インサート１４０は、生物学的材料を受容するためのコンパートメントを画定し、外側の断熱タンク１２０からコンパートメントへの熱交換流体の流入口を通しての流入は、インサート１４０の一方の面でまたはそれに隣接して生じ、コンパートメントから外側の断熱タンクへの熱交換流体の流出口を通しての流出は、インサート１４０の前記面でまたはそれに隣接して生じる。

装置は、コンパートメント内の生物学的材料上の熱伝達流体の流れを調節するように操作可能なポンプ１８０を含む。特に、ポンプは、１つ以上の異なる冷却段階で生物学的物質を冷却するように操作可能である。１つ以上の異なる段階は、生物学的材料の熱伝達応答に基づいてもよい。熱伝達応答は、生物学的材料の熱力学的モデリングに基づく。ポンプ１８０は、少なくとも５０Ｌ／分のポンピング能力を有する。他の例では、ポンプは少なくとも６０Ｌ／分、好ましくは少なくとも７０Ｌ／分、さらに好ましくは少なくとも約８０Ｌ／分のポンピング能力を有する。付加的または代替的に、ポンプは５０Ｌ／分以上のポンピング能力を有することができる。さらに付加的または代替的に、ポンプは、最大約１００Ｌ／分、または最大約１２０Ｌ／分、または最大約１５０Ｌ／分のポンピング能力を有することができる。本装置は高温コンプレッサーを備えており、生物学的材料の温度引き下げ時間をより速くし、コンパートメントを通る温度と流量の一貫性をより高めることができる。

装置１００は、ポンプ１８０からインサート１４０へ熱伝達流体を搬送するための管配置１６０を備える。流量計は、管配置を通る伝熱流体の流れを監視するために管配置に連結されている。流量計は、伝熱流体の流れを制御するためにポンプにフィードバックを提供し、管配置を通過してコンパートメントに入る。フローコンディショナーは、インサートに送られる前に熱伝達流体を均等に分配するために管配置に設けられている。管配置１６０は、インサート１４０に通じる、間隔をおいて平行に配置された２つの実質的に直線状の細長い入口管部分（または実質的に直線状の入口管部分）１６２を有する。入口管部分はそれぞれ少なくとも約０．２ｍの長さを有する。他の例では、入口管部分は少なくとも約０．４ｍ、または少なくとも約０．５ｍの長さを有することができる。直線状の細長い管は、コンパートメントの直前に配置される。このようにして、伝熱流体は、実質的に乱流のない状態で、または実質的に圧力ヘッドのない状態で、コンパートメントに入ることができる。特に、本設計では、ポンプからコンパートメントまでの管配置の屈曲を最小限に抑え、コンパートメントへの伝熱流体の流れをスムーズかつ途切れなくする。管配置１６０の管部分は約１インチの直径を有する。他の実施例では、管配置の管部分は、約０．５インチまたは最大約１．５インチの直径を有する。

インサート１４０は、作動中、コンパートメント内の生物学的材料が、生物学的材料の凍結のために熱交換流体と熱交換するために熱交換流体中に浸漬されるように、装置を通る連続的な熱交換流体の流れを収容するための一連の開口を有する壁からなる。各開口部の直径または幅は約５ｍｍ～２０ｍｍ、好ましくは約１０ｍｍである。

インサート１４０は、コンパートメントを通る熱交換流体の流れを１つ以上の特定の経路に沿って導くように構成されたバッフルを備える。図示された実施形態では、熱交換流体の流れは、インサートの前側に隣接する入口から、コンパートメントを通って中間出口から出て、次にインサートの前側に戻って出口から出るように方向付けられている。バッフルによって導かれる特定の流路は、コンパートメントを通る熱交換流体の循環を改善し、ホットスポットを減少させる。さらに、インサート１４０の共通の面でまたはそれに隣接する場所での熱交換流体の流入と流出の特定の構成によって、流体がインサート１４０の反対側の面から跳ね返されながら、コンパートメント全体を通して循環するように強制され、循環が改善される。

コンパートメントは、生物学的材料を保持するための構造体を受容するように構成され、該構造物は、トレイ、ラックおよびバスケットのうちの１つ以上である。コンパートメントは、複数のサブコンパートメントを画定する複数の内部仕切板を備え、各サブコンパートメントは、該構造物の１つを受容するように構成される。

インサート１４０がタンク１２０内に配置される場合、インサート１４０の面に隣接するタンク１２０の一方の面は、少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口を構成する。本発明の好ましい実施形態によるタンクは、２つの入口と１つの出口を有する。入口は、使用時に外側断熱タンク１２０の外側からコンパートメントに連通し、出口は、使用時にコンパートメントから外側断熱タンクの外側に（ドレイン管１４２を介して）連通し、運転時に、熱交換流体が少なくとも１つの入口を介してタンク１２０に（ひいてはコンパートメントに）導入され、少なくとも１つの出口を介してコンパートメントおよびタンク１２０から除去されるようになっている。

タンク１２０の側壁は、インサート１４０の面から間隔をあけて配置されているため、空隙（図示せず）が画定される。タンク１２０は、ＡＳＴＭ Ａ２４０に準拠した鋼鉄製であることが好ましい。

使用時、タンク１２０は、－８０℃以上では凍結しない熱交換流体で満たされる。熱交換流体は、管配置１６０およびタンク１２０の熱交換流体入口を介してタンク１２０内に所定の体積流量で空隙にポンピングされる。熱交換流体が開口部の制限された領域を通って強制的に送り込まれるため、空隙内に圧力が発生し、体積流量は減少するが、コンパートメント内に流入する流体の速度は増加する。開口部とバッフルは、コンパートメント内のすべての部分への冷えた流体の分配を改善し、そうでなければ入口領域から離れて発生しやすいホットスポットの発生を最小限に抑える。熱交換流体がタンク１２０およびコンパートメント内を連続的に流れるにつれて、コンパートメント内にある生物学的物質から熱が除去され、コンパートメントおよびタンク１２０から出る加熱された熱交換流体は、熱交換流体を連続的に冷却する装置の冷凍システムと交換される。熱交換流体自体は、冷凍システム内の冷媒と熱交換する。

図３Ａは、熱交換流体を連続的に冷却する一実施形態による装置１００の冷凍システムの配管および計装図である。冷凍システムは、熱交換流体と冷媒との間で熱交換するための熱交換器を含む。熱交換器は、ろう付けプレート式熱交換器とコイル式熱交換器とを含む。冷凍システムは、図３ＢのＰＩＤ凡例に概説されている構成要素を含む。

二相冷却保存法
本発明者らは、凍結の特定の段階における冷却速度を上げることにより、凍結保護物質の使用量を減らし、場合によっては凍結保護物質を使用しなくても生物学的製品を保存できることを見出した。具体的には、液－固相転移が始まるまでは徐冷し、液－固相転移が始まる頃から急冷するという二相冷却を行う。核生成は、相転移の開始時から始まり、固体凍結段階まで続く。本発明者らは、核生成の時間を短縮することにより、サンプル中の氷結晶の生成を抑え、液体窒素凍結と同様の急速凍結効果が得られるが、従来の液体窒素法と比較して浸透圧ダメージが低減されることを見出した。具体的には、本方法では、液－固相転移の開始時点から冷却速度を上げて（すなわち、サンプルの急速凍結を開始して）、生物材料の核形成期間を短縮する。場合によっては、凍結ダメージの減少が非常に大きいため、凍結保護物質は必要ない。

一実施形態において、生物学的材料を保存する方法は、まず、生物学的材料および任意の包装がサンプルを規定するところの生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程と、１つ以上の生物学的材料特性（細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢を含む）に基づいて、浸透圧ショックに対する生物学的材料の感受性を推定する工程と、サンプルの熱特性を推定する工程と、および保存システムの様々な入力パラメータの影響を調査するために、装置２内（より具体的には、コンパートメント６内）で凍結されるサンプルのシミュレーションを介してサンプルに対して計算流体力学解析を実行する工程とを含む。調査され得るシミュレーションの入力／制約には、包装の特性および利用されるラッキングシステムの特性、サンプルの近似形状、サンプルの熱特性、装置の形状、装置内のサンプルの所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇が含まれる。

一実施形態による計算流体力学的解析は、生物学的材料を幾何学的な増分（例えば、ボトルまたは試験管用の円筒形のシェル）に分割する工程を含む。これらの増分ごとに、エネルギー保存方程式が解かれる。すなわち、所与の時間工程において、ある量のエネルギーがシェルから除去され、その結果、そのシェルの温度が低下する。除去されるエネルギー量は、隣接するシェルの温度とシェル間の熱流抵抗の関数である。これには、温度の関数として生物学的材料の熱特性を考慮する必要がある。

分析は、サンプルが２℃の開始温度を有する固体塊として扱われ、当業者に周知の方法を用いて同定、推定または計算できる熱特性を有すると仮定して実行される。

製品の総表面積、タンク内の製品の負荷量、熱交換流体の予め選択された入口温度、熱交換流体の予め選択された許容可能な出口温度（例えば入口温度より３℃大きい）、製品（凍結保護物質を含む）および包装の熱特性、およびタンクを通る流体の予め選択された速度などに基づいて、製品の温度低下速度を上述したようにシミュレーションすることができる。図４Ａおよび図４Ｂの温度－時間プロットは、約６５秒以内に約－８０℃および約８０秒以内に約－５１℃にそれぞれ凍結された、コンパートメント内の中央に位置する０．５ｍｌ凍結保存バイアルの分析に対応する。これらの２つの図から、本発明の好ましい実施形態によれば、約－５１℃に凍結された凍結保存バイアルは、約－８０℃に凍結された凍結保存バイアルと比較して、より良好な保存結果を達成している。グラフは、凍結保存バイアルの外側（「ＰＧ温度２．９９ｍｍ ＰＰｏｕｔｓｉｄｅ」）から中心部（「ＰＧ温度０ｍｍ」）まで、凍結保存バイアルを貫通する様々なシェルにおける温度をプロットしたものである。図４Ｃは、図８のシミュレーションと同じ速度で凍結させた中央凍結保存バイアルの温度－時間プロットであるが、バッフルをインサートから取り外したものであり、コンパートメントを通る伝熱流体の循環を改善するバッフルの有効性を示している。

サンプルの液－固相転移の開始は近似される。一実施形態では、液－固相転移の開始は、一定の冷却速度で凍結中の材料のサンプルの１つ以上の試験結果から得られた冷却曲線から、および浸透圧ショックに対する生物学的材料の推定感受性に基づいて概算される。液－固相転移の開始は、付加的または代替的に、上述の計算流体力学解析によって得られたサンプルの冷却曲線から決定／確認することができる。

所定の徐冷速度の場合、相転移が始まるまでの所定のサンプル表面温度におけるサンプルの中心部の平均温度低下速度が（計算流体力学モデルから）決定される。その後、徐冷速度を達成するために必要な浸漬タンクへの熱交換流体流量を決定することができる。

所定の急速冷却速度を達成するために必要な熱交換流体流量は、同様に、相転移の開始付近から所定のサンプル表面温度におけるサンプルのコアの平均温度低下速度の分析によって決定される。

分析が完了すると、サンプルは次に、上述のように装置１００のコンパートメント内で、まず相転移の開始付近までは徐冷速度で、次に相転移の開始付近からは急冷速度で冷却することができる。サンプルは、所定の終了温度に達するまで、少なくとも毎分約１００℃で冷却される。

急速冷却に必要な熱交換流体流量を達成するために、熱交換流体をタンク１２０に投入する装置１００のポンプのポンプデューティを増加させる。

いくつかの実施形態において、上述の方法は、凍結保護物質を使用せずに生物学的材料を効果的に保存するために使用され得ることが想定される。

保存工程に必要な凍結保護物質の量を決定する方法
場合によっては、保存処理中の細胞損傷を最小化するために凍結保護物質が必要とされることがある。従って、別の態様において、保存前に生物学的材料に添加すべき凍結保護物質の量を決定する方法が提供される。本方法は、まず、凍結保護物質の初期量を含む、保存すべき生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料、凍結保護物質および任意の包装がサンプルを画定する工程と、サンプルの熱特性を推定する工程と、保存システムの入力パラメータを変化させた場合の影響を調べるために、装置内（より具体的には、コンパートメント６内）でサンプルに対して計算流体力学解析を実行する工程とを含む。調査され得るシミュレーションの入力／制約には、包装の特性および利用されるラッキングシステムの特性、サンプルの近似形状、サンプルの熱特性、装置の形状、装置内のサンプルの所定の配置、熱交換流体の所定の入口温度、および入口から出口への熱交換流体の所定の温度上昇が含まれる。

本方法は、１つ以上の生物学的材料特性に基づいて浸透圧ショックに対するサンプルの感受性を推定する工程をさらに含み、１つ以上の生物学的材料特性は、細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢のうちの少なくとも１つを含む。

サンプルの液－固相転移の開始が近似される。一実施形態では、液－固相転移の開始は、一定の冷却速度で凍結を受ける材料のサンプルの１つ以上の試験結果から得られる冷却曲線から概算される。液－固相転移の開始は、追加的または代替的に、上述の計算流体力学解析によって得られたサンプルの冷却曲線から決定／確認することができる。好ましい実施形態では、浸透圧ショックに対する生物学的材料の推定感受性に基づいて、開始が概算される。

所定の徐冷速度の場合、相転移の開始付近までの所定のサンプル表面温度におけるサンプルの中心部の平均温度低下速度が（上述の計算流体力学モデルから）決定される。次に、徐冷速度を達成するために必要な浸漬タンク２への熱交換流体流量を決定することができる。

所定の急速冷却速度を達成するために必要な熱交換流体流量も同様に、相転移の開始付近から所定のサンプル表面温度におけるサンプルのコアの平均温度低下速度の分析によって決定される。この工程で算出された熱交換流体流量が、装置のポンプデューティまたはエバポレータデューティがそれぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超える場合に、初期量よりも所定量多い量の凍結保護物質が選択され、新たな初期量が定義される。一方、この工程で計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合（すなわち、熱交換流体流量が実用的な観点から許容される場合、例えば、ポンプデューティが所定のエバポレータデューティに基づいて許容される場合で、例えば、選択された温度における熱交換流体の粘度に基づいてポンプデューティが許容可能である場合、または必要な熱除去に基づいてエバポレータデューティが許容可能である場合）、その凍結保護物質の初期量が保存前に生物学的材料に添加される凍結保護物質の量として選択される。

計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超えるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、計算された熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応するまで、方法の工程が繰り返される。

一実施形態では、凍結保護物質の初期量はゼロである。計算工程が繰り返される場合、初期量より多い凍結保護物質の所定量は、各繰り返しにおいて１％多いなど、規則的な増分で増加させることができる。

一旦、適切な量の凍結保護物質が上記の方法を用いて決定されると、次に、生物学的物質のサンプルは、上記のように、装置１０を用いて保存するために、計算された量の凍結保護物質を用いて調製され得る。

所定の徐冷速度および／または急速冷却速度は、従来のプロトコルに基づいて、または生物学的材料の特定のサンプルに対して実施された試験もしくは分析に基づいて同定することができる。一実施形態では、徐冷速度は毎分約１０℃までである。徐冷速度は、毎分約０．１℃と約１０℃との間であってもよい。

一実施形態において、急速冷却速度は、毎分約１００℃より大きい。急冷速度は毎分約２００℃より大きくてもよい。

生物学的製品の浸透圧ショック感受性を決定する方法
浸透圧ショックまたは浸透圧ストレスは、細胞周囲の溶質濃度の急激な変化によって引き起こされる生理的機能障害であり、細胞膜を横切る水の移動に急激な変化を引き起こす。上清中の塩、基質、あるいはあらゆる溶質の濃度が高い条件下では、水は浸透圧を通して細胞から引き出される。これはまた、細胞内への基質や補酵素の輸送を阻害するため、細胞にショックを与える。あるいは、溶質の濃度が低いと、水が大量に細胞内に入り、膨張して破裂するかアポトーシスを起こす。

すべての生物は浸透圧ショックに応答するメカニズムを持っており、センサーとシグナル伝達ネットワークが、周囲の浸透圧に関する情報を細胞に提供する。単細胞生物は環境に直接さらされているため、浸透圧ショックに対してより脆弱であるが、哺乳類の細胞もある条件下ではやはりこのようなストレスを受ける。

すべての生物は、異なる細胞構造を持っている。細胞の大きさ、膜の感受性、生物の年齢、細胞の密度などのパラメータは、生物の浸透圧ストレスに対する感受性に影響する。

当業者であれば、上記のパラメータを理解するであろう。すべての生物は、上記の分析に基づく感受性スケール上にプロットすることができる。

温度および凍結保護物質を含む保存パラメータは、生物の浸透圧感受性に影響される可能性がある。上述した分析は、ポンプのデューティーと処理温度のパラメータに情報を与える。

高い浸透圧感受性は、－５０℃を超える処理温度の上昇を必要とする。

低浸透圧感受性には、－５０℃以下の処理温度の低下が必要である。

浸透圧感受性が高いと、同じ熱伝達率を低温の比較対象で達成するためには、ポンプのデューティーを上げる必要がある。

解凍装置および方法
一実施形態において、凍結保存された生物学的材料を解凍する方法は、まず、生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、生物学的材料および任意の包装がサンプルを画定する工程と、サンプルの熱的特性を推定する工程と、解凍システムの入力パラメータを変化させた場合の影響を調査するために、解凍槽内で解凍されるサンプルのシミュレーションを介してサンプルに対して計算流体力学解析を実行する工程とを含む。調査されるシミュレーションの入力／制約には、包装の特性および利用されるラッキングシステムの特性、サンプルの近似形状、サンプルの熱特性、装置の形状、装置内のサンプルの所定の配置、解凍液の所定の入口温度、および入口から出口までの解凍液の所定の温度低下が含まれる。

本方法は、１つ以上の生物学的材料特性に基づいて浸透圧ショックに対するサンプルの感受性を推定する工程をさらに含み、１つ以上の生物学的材料特性は、開始凍結温度、細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢のうちの少なくとも１つを含む。

サンプルの固－液相転移の開始は近似される。一実施形態では、固－液相転移の開始は、一定の冷却速度で凍結中の材料のサンプルの１つ以上の試験結果から得られた冷却曲線から概算される。固－液相転移の開始は、追加的または代替的に、上述の計算流体力学解析によって得られたサンプルの融解曲線から決定／確認することができる。好ましい実施形態では、固－液相転移の開始は、浸透圧ショックに対するサンプルの推定感受性に基づいて概算される。

次に、固－液相転移が始まるまでの期間、サンプルを解凍する。凍結したサンプルを転移の開始まで解凍すると、細胞の生存率が高まることが分かっている。解凍後、サンプルは約２℃に保たれる。

いくつかの実施形態では、解凍液は３７℃の温度で投入される水である。

以上、本発明の様々な実施形態について説明したが、これらは例示のために提示されたに過ぎず、限定するために提示されたものではないことを理解されたい。本発明の思想および態様から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更を行うことができることは、関連技術の当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、上述した例示的な実施形態のいずれかによって限定されるべきではない。

本明細書において、先行刊行物（またはそれに由来する情報）、または公知事項への言及は、その先行刊行物（またはそれに由来する情報）または公知事項が、本明細書が関連する技術分野における一般的な知識の一部を形成していることを認めるものでも、示唆するものでもない。

本明細書およびそれに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という語、および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、記載された整数もしくは工程または整数もしくは工程の集合を含むことを意味するが、他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の集合を排除することを意味しないと理解される。

Claims (24)

1. 生物材料を保存するための装置であって、
   外側断熱タンク内に配置されるように構成されたインサートであって、前記インサートは、生物学的材料を受容するためのコンパートメントを画定し、作動中、前記コンパートメント内の生物学的材料が前記熱交換流体中に浸漬され、前記生物学的材料を凍結させるために前記熱交換流体と熱交換する、インサートを備え、
   前記装置は、前記コンパートメント内の前記生物学的材料上の熱交換流体の流れを調節するように操作可能なポンプをさらに備え、前記ポンプは、前記生物学的材料を１つ以上の異なる冷却段階で冷却するように操作可能である、装置。
2. 前記ポンプが、少なくとも５０Ｌ／分、少なくとも６０Ｌ／分、少なくとも７０Ｌ／分、少なくとも約８０Ｌ／分、および／または好ましくは最大約１００Ｌ／分、好ましくは最大約１２０Ｌ／分、好ましくは最大約１５０Ｌ／分のポンピング能力を有する、請求項１に記載の装置。
3. 前記熱伝達流体を前記ポンプから前記コンパートメントに搬送するための管配置をさらに備え、前記管配置は、前記コンパートメントに通じる実質的に直線状の細長い管部分を含み、少なくとも約０．２ｍ、好ましくは少なくとも約０．４ｍ、さらに好ましくは少なくとも約０．５ｍの長さを有する、請求項１または２に記載の装置。
4. 前記細長い管部分が、約１インチ、約０．５インチ、または最大約１．５インチの直径を有する、請求項３に記載の装置。
5. 前記外側断熱タンクから前記コンパートメントへの熱交換流体の流入は、前記インサートの１つの面で又はそれに隣接して生じ、前記コンパートメントから前記外側断熱タンクへの前記熱交換流体の流出は、前記インサートの前記面で又はそれに隣接して生じる、請求項１に記載の装置。
6. 前記インサートは、前記コンパートメントを通る前記熱交換流体の流れを１つ以上の特定の経路に沿って誘導するように構成されたバッフルを有する、請求項１に記載の装置。
7. 前記生物学的材料を保持するための前記コンパートメント内に受容可能な構造体を備え、前記構造体がトレイ、ラックおよびバスケットのうちの１つ以上である、請求項１から６のいずれか一項に記載の装置。
8. 前記コンパートメントが、複数のサブコンパートメントを画定する複数の内部仕切りを有し、各サブコンパートメントが、前記構造体のうちの１つを受容するように構成されている、請求項７に記載の装置。
9. 前記外側断熱タンクは、
   前記インサートが前記外側断熱タンク内に配置されたときに、前記インサートの前記面に隣接する１つの側面であって、前記側面は、少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口とを有し、前記入口は、使用時に前記外側断熱タンクの外側から前記コンパートメント内と連通し、前記出口は、使用時に前記コンパートメントから前記外側断熱タンクの外側と連通する、側面を有し、
   動作中、前記熱交換流体は、前記少なくとも１つの入口を介して前記タンクに導入され、前記少なくとも１つの出口を介して前記タンクから除去される、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
10. 生物学的材料を保存する方法であって、
    ａ．１つ以上の生物学的材料の特性に基づいて、浸透圧ショックに対する前記サンプルの感受性を推定する工程であって、前記１つ以上の生物学的材料の特性は、細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢のうちの少なくとも１つを含む、工程と、
    ｂ．浸透圧ショックに対する前記サンプルの推定した感受性に基づき、前記サンプルの液－固相転移の開始を概算する工程と、
    ｃ．相転移の開始付近までの所定のサンプル表面温度における前記サンプルの前記コアの平均温度低下率、および所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
    ｄ．相転移の開始付近から所定のサンプル表面温度における前記サンプルの前記コアの平均温度低下率、および所定の急速冷却速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
    ｅ．請求項１から９のいずれか一項に記載の装置の前記コンパートメント内の前記サンプルを、相転移の開始付近まで前記徐冷速度で冷却する工程と、
    ｆ．相転移の開始付近から最終目標温度まで、前記コンパートメント内の前記サンプルを前記急速冷却速度で冷却する工程と
    を備える方法。
11. 前記コンパートメントから冷却されたサンプルを直ちに保管することをさらに備える、請求項１０に記載の方法。
12. 前記サンプルが凍結保護物質を含まない、請求項１０または１１に記載の方法。
13. 保存前に生物学的材料に添加すべき凍結保護物質の量を決定する方法であって、
    ａ．１つ以上の生物学的材料の特性に基づいて、浸透圧ショックに対する前記サンプルの感受性を推定する工程であって、前記１つ以上の生物学的材料の特性は、細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢のうちの少なくとも１つを含む、工程と、
    ｂ．浸透圧ショックに対する前記サンプルの推定した感受性に基づいて、前記サンプルの液－固相転移の開始を概算する工程と、
    ｃ．相転移の開始付近までの所定のサンプル表面温度における前記サンプルの前記コアの平均温度低下率、および所定の徐冷速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
    ｄ．相転移の開始付近から所定のサンプル表面温度における前記サンプルの前記コアの平均温度低下率、および所定の急速冷却速度を得るために必要な対応する熱交換流体流量を決定する工程と、
    ｅ．工程（ｃ）で計算された前記熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超える装置のポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、初期量よりも多い所定量の凍結保護物質の量を選択し、新たな初期量を定義するか、または、工程（ｃ）で計算された前記熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下であるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、保存前に生物学的材料に添加されるべき凍結保護物質の量として凍結保護物質の初期量を選択する工程と、
    ｆ．工程（ｃ）で計算された前記熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティを超えるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応する場合、工程（ｃ）で計算された前記熱交換流体流量が、それぞれ所定のポンプデューティまたは所定のエバポレータデューティ以下であるポンプデューティまたはエバポレータデューティに対応するまで、工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程と
    を備える方法。
14. 工程（ａ）～（ｄ）のいずれかの繰り返しの前の凍結保護物質の前記初期量がゼロである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記徐冷速度が毎分最大約１０℃である、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記徐冷速度が毎分約０．１℃と毎分約１０℃との間である、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記急速冷却速度が毎分約１００℃より大きい、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記急速冷却速度が毎分約２００℃より大きい、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 液－固相転移の前記開始が、一定の冷却速度で凍結中の前記サンプルの冷却曲線から近似される、請求項１０から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 凍結中の前記サンプルの前記冷却曲線が、前記サンプルに関する前記計算流体力学的解析から得られる、請求項１９に記載の方法。
21. 凍結保存された生物学的材料を解凍する方法であって、
    ａ．前記生物学的材料の近似形状の総表面積を決定する工程であって、前記生物学的材料および任意の包装がサンプルを画定する、工程と、
    ｂ．前記サンプルの熱特性を推定する工程と、
    ｃ．１つ以上の生物学的材料の特性に基づいて、浸透圧ショックに対する前記サンプルの感受性を推定する工程であって、前記１つ以上の生物学的材料の特性は、凍結開始温度、細胞構造、細胞サイズ、膜感受性、密度、およびドナーの年齢のうちの少なくとも１つを含む、工程と、
    ｄ．前記サンプルの近似形状、前記サンプルの熱特性、前記装置の形状、前記装置内でのサンプルの所定の配置、解凍流体の所定の入口温度、および入口から出口への解凍流体の所定の温度低下のいずれか１つ以上を含む流動制約に基づいて、解凍装置の前記タンク内の前記サンプルに対して計算流体力学解析を実行する工程と、
    ｅ．前記サンプルの固－液相転移の開始を概算する工程と、
    ｆ．工程（ｄ）で決定された固－液相転移の前記開始までの期間に、凍結保存した生物学的製品を解凍する工程と
    を備える方法。
22. 前記解凍流体の前記入口温度が約２℃から１００℃、好ましくは約３７℃であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 固－液相転移の開始が、一定の冷却速度で凍結中の前記サンプルの冷却曲線から近似される、請求項２１または２２に記載の方法。
24. 凍結中の前記サンプルの前記融解曲線が、前記サンプルに関する前記計算流体力学的解析から得られる、請求項２３に記載の方法。

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