SU1076054A1 - Способ криоконсервировани живых одноклеточных организмов - Google Patents

Abstract

СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЖИВЫХ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМОВ, включающий извлечение консервируемых объектов из среды культивировани , предварительную инкубацию их при 2-3°С в течение 1,5-2 ч, замораживание с использованием жидкого азота, отличающийс  тем, что, с целью повыщени  жизнеспособности одноклеточных организмов , объекты, подлежащие консервированию , обезвоживают путем повышени  концентрации хлористого натри  в среде культивировани  до 1 -1,2% и инкубации в этой среде в течение 5-30 мин, а замораживание осуществл ют в течение 0,1 - 0,2 с со скоростью

Description

vl

О5

СП 4 Изобретение относитс  к криобиологии и может быть использовано дл  криоконсервировани  различных биологических объектов , в частности свободноживущих одноклеточных животных, при проведении научных исследований, а также в микробиологии и медицине. Известен способ консервировани  биологических объектов путем замораживани  их в различных хладагентах. При этом объект предварительно обрабатывают крио протекторами, повышающими в зкость их цитоплазмы, а замораживание производ т в хладагенте, например жидком азоте. Замораживание чаще всего провод т путем ступенчатого охлаждени  объектов с широким .диапазоном градиента понижени  температур от 0,2 град/мин до 1000 град/с 1J. Этот способ позвол ет криоконсервировать только клетки организмов либо низшие организмы, например, соматические клетки, спермии, цисты, бактерии, водоросли и паразитические простейшие. Однако этот способ не пригоден дл  консервировани  свободноживущих одноклеточных животных, например амеб и инфузорий, так как при его осуществлении животные погибают. Наиболее близким к предлагаемому  вл етс  способ криоконсервировани  амеб, согласно которому живые одноклеточные организмы извлекают из среды культивировани  и в течение 0,5-1 ч обрабатывают криопротектором. Затем объекты размещают на подложке, алюминиевой фольге , и подвергают медленному ступенчатому замораживанию в жидком азоте со средним градиентом 1 град/мин либо быстрому замораживанию с градиентом 500 град/ мин 2. Однако после размораживани , т. е. извлечени  из хладагента и помещени  в среду культивировани  при 20°С все амебы погибают в течение 10-20 мин. Гибель консервируемых организмов при осуществлении известных способов вызвана повреждением их структуры в результате внутриклеточной кристаллизации воды, а также большой токсичностью криопротекторов. При этом сокращение продолжительности обработки объектов криопротектором (менее 0,5 ч) ускор ет кристаллообразование при замораживании. Увеличение продолжительности обработки криопротектором. свыше I ч, наоборот, усиливает токсическое действие последнего. Цель изобретени  - повышение жизнеспособности одноклеточных организмов. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу криоконсервировани  живых одноклеточных организмов, включающему извлечение консервируемых объектов из среды культивировани , предварительную инкубацию их при 2-3°С в течение 1,5-2 ч, замораживание с использованием жидкого азота, объекты, подлежащие консервированию обезвоживают путем повыщени  концентрации хлористого натри  в среде культивировани  до 1 -1,2% и инкубируют в этой среде в течение 5-30 мин, а замораживание осуществл ют в течение 0,1-0,2 ссо скоростью (3-10) 1 О град/с в смеси жидкого и твердого азота. Пример 1. Предварительна  инактиваци  объектов путем понижени  температуры среды культивировани  до 2-3°С и выдерживани  их в этих услови х в течение 1,5- 2 ч  вл етс  наиболее оптимальной дл  достижени  максимальной выживаемости их, что установлено опытным путем. Повышение концентрации NaCl в среде культивировани  и выдерживание в ней объектов необходимо дл  обезвоживани  и повыщени  в зкости их цитоплазмы. Это принципиально сходно с действием криопротектора , но исключает побочный токсический эффект последнего. Режимы повыщени  концентрации NaCl (1,0-1,2%) оптимальны . Такое воздействие в течение 5-30 мин, обеспечивает м гкое частичное обезвоживание объектов без гипертонических повреждений. Последующее сверхбыстрое замораживание объектов осуществл ют путем быстрого помещени  их в шугообразный азот. Установлено, что оптимальный эффект замораживани  достигаетс  при скорости помещени  объектов в щугообразный азот в пределах 0,1-0,2 с. При этом режиме помещени  объектов градиент скорости замораживани  составл ет (3-10) 10 град/с. Такой сверхвысокий градиент замораживани  обеспечиваетс  низкой температурой щугообразного азота (смеси твердой и жидкой его фаз), равной -215°С, котора  значительно ниже температуры жидкого азота, равной - 196°С, а также консистенций щугообразного азота. Опытным путем установлено, что оптимальный эффект соохранени  жизнеспособности объектов достигаетс  только в химически чистом шугообразном азоте при оопределенной его плотности . Дл  достижени  этого состо ни  шугообразного азота давление воздуха в сосуде с жидким азотом понижают до режимов разрежени  1,0-0,1 Па. Разрежение воздуха в сосуде ниже 1,0 Па приводит к затвердению смеси, а выше 0,1. Па - к преобладанию в ней жидкого азота. Необходима  плотность щугообразного азота достигаетс  при содержании в .смеси твердой фазы азота в пределах 55-60%. При разжижении смеси (менее 55% твердой фазы) происходит вскипание азота вокруг объекта, а при ее уплотнении (свыше 60%) возможны механические повреждени  объектов.

После сверхбыстрого замораживани  объектов консервирование их в течение необходимых сроков осуществл ют как в шугообразном, так и в жидком азоте.. При хранении шугообразный азот переходит в жидкое состо ние, при этом повышение температур криоконсервировани  до -196°С не вли ет на выживаемость объектов.

По истечении необходимых сроков консервировани  объекты быстро перенос т во влажную камеру. Скорость переноса дл  достижени  требуемого градиента размораживани  (3-10)- 10 град/с сохран етс  равной 0,1-0,2 с. Эти режимы переноса , такие же, как и при замораживании объектов, необходимы дл  преодолени  процесса рекристаллизации внутриклеточной жидкости при ее переходе в жидкое состо ние.

Опытным путем установлено, что наилучша  выживаемость объектов достигаетс  при температуре воздуха в камере (25- 27°С), близкой к пределу температурного оптимума их содержани . При таком диапазоне температур и повышенной влажности воздуха в камере (близкой к ) скорость размораживани  объектов и услови  их перевода в активное состо ние оптимальHfe , чем в обычных комнатных услови х при 18-20°С.

Окончательный перевод объектов в среду культивировани  осушествл етс  в течение 5-10 с после размораживани . Режим перевода 5-10 с оптимален, так как выдерживание объектов в камере не менее 5 с необходимо дл  их температурной акклиматизации к услови м активной жизнеде тельности . Превышение этого срока более 10 с приводит к осушению объектов.

Наиболее удобно осуществл ть перевод объектов в среду культивировани  путем добавлени  последней в виде капли к объекту , что установлено опытным путем. При этом превышение объема среды культивировани  в 2-3 раза по сравнению с объектом  вл етс  оптимальным дл  взаимной стабилизации температур, а также дл  достижени  минимально .необходимых условий активации объектов в этой среде.

Теоретической основой использовани  эффекта витрификации объектов при исполнении нового способа их сверхбыстрого замораживани   вл етс  следующее.

При быстром погружении объекта в шугоообразный азот выдел емое им тепло расходуетс  в основном на плавление твердой фазы смеси. Жидкий азот, получаемый в результате такого расплавлени , в свою очередь охлаждаетс  окружающей его шугой . Поэтому он не успевает достичь точки кипени  (-196°С) и, соответственно, не образует газового пузыр  вокруг объекта. При замораживании объекта в жидком

азоте газовый пузырь, преп тству  теплоотдаче , снижает скорость охлаждени  объекта по меньшей мере до 1000- 1500 град/с. При погружении объекта в шугообразный азот скорость его охлаждени  максимальна и более посто нна по сравнению с ранее достигнутой. Скорость охлаждени  зависит только от величины объекта, наход сь в обратной пропорции от нее. Поэтому градиент замораживани  (и размораживани ) объекта в шугообразном азоте находитс  в пределах (3-10) X X 10 град/с. Этот градиент установлен с помощью установки - комплекса микротермопары , подключенной к осциллографу

5 с фотоприставкой. Сходную величину градиента , близкую к 6- 10 град/с, удалось получить и теплофизичесйими проверочными расчетами. Такие сверхвысокие скорости изменени  температуры объекта превышают верхние пределы скорости кристалло0 образовани  внутриклеточной воды при прохождении его порога кристаллообразовани , равного -(50-70) °С. Поэтому кристаллообразовани  не происходит и вс  внутриклеточна  жидкость объекта переходит в гелевое состо ние, т. е. происхо5 дит, витрификаци  объекта (переход в стекловидное тело). Сходный механизм сверхбыстрого перехода внутриклеточной жидкости из гелевого состо ни  в жидкое имеет место и при размораживании объQ екта. Обычного в таких услови х процесса рекристаллизации воды при -(50-70) °С не происходит. Указанные сверхвысокие скорости криоконсервировани  могут бцть обеспечены только совокупностью перечисленных операций, производимых в указан5 ной последовательности.

Пример 2. Способ криоконсервировани  живых одноклеточных организмов испытывают на лабораторных одноклеточных животных - амебах (Amoeba Proteus) и двух

видах инфузорий (Те1гасЬутепа и Вигsaria ). Массова  культура этих животных содержит несколько тыс ч особей и находитс  в среде культивировани  объемом 25 мл. Часть особей (около 100 штук амеб, бурсарий либо несколько тыс ч тетрахимен) вмес5 те со средой культивировани  общим объемом 2 мл отдел ют пипеткой Пастера от массовой культуры и помещают в отдельную емкость, например, бюкс, который помещают в холодильник с температурой 2- 3°С на 1,5-2 ч. В- пределах указанных сроков к среде культивировани  с объектами добавл ют охлажденный до -этой же температуры раствор поваренной соли исходной концентрации 2,2-2,5% и объемом 2 мл. Концентрацию поваренной соли

5 в среде культивировани  устанавливают в пределах 1,0-1,. В этих услови х объекты выдерживают в течение 5-30 мин в разных сери х опытов. После этого объ

Claims (1)

1. СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЖИВЫХ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМОВ, включающий извлечение консервируемых объектов из среды культивирования, предварительную инкубацию их при 2—3°С в течение 1,5—2 ч, замораживание с использованием жидкого азота, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности одноклеточных организмов, объекты, подлежащие консервированию, обезвоживают путем повышения концентрации хлористого натрия в среде культивирования до 1 —1,2% и инкубации в этой среде в течение 5—30 мин, а замораживание осуществляют в течение 0,1 — 0,2 с со скоростью (3—10) · 10³ град/с в смеси жидкого и твердого азота.

   >