FI113833B - Viljeltyjen kudosjäljitelmien kylmäsäilytys - Google Patents

Description

113833

Viljeltyjen kudosjäljitelmien kylmäsäilytys Tämä keksintö kohdistuu in vitro -tekniikalla valmistettujen viljeltyjen kudosjäljitelmien kylmäsäilytykseen.

5 Kylmäsäilöttyä viljeltyä kudosta voidaan säilyttää määräämättömiä aikoja ennen käyttöä. Viljelty kudos on in vitro -malli ihmisen vastaavasta kudoksesta, jota varastosta ottamisen jälkeen voidaan käyttää transplantaatioon tai implantaatioon in vivo tai yhdisteiden seulontaan in 10 vitro.

Kudosviljelmätekniikoita käytetään kehitettäessä kudos-ja elinjäljitelmiä. Tällaisia tekniikoita ovat kolla-geenimatriksirakenteet, joita voidaan muovata uudelleen 15 funktionaalisiksi kudoksiksi ja elimiksi eläviä soluja, ravintoaineita ja viljelyolosuhteita oikein yhdistämällä.

Nykyisin viljeltyjen kudosjäljitelmien käyttö on rajoittunutta, koska näillä jäljitelmillä on rajallinen säily-20 vyys. Siten tällä hetkellä on mahdotonta pitää yllä kunnon varastoa minkään pituista aikaa. Lisäksi jäljitelmien rajoitetun säilyvyyden vuoksi syntyy paljon jätettä. Si-··· ten on toivottavaa, että voitaisiin kehittää onnistunut .·. : kylmäsäilöntämenetelmä, joka pidentäisi viljeltyjen ku- « · 25 dosten varastointiaikaa, jolloin voitaisiin ylläpitää kunnon varastoa, ja jätteen määrä vähenisi huomattavasti.

. Sellainen kylmäsäilöntämenetelmä tekisi mahdolliseksi mainittujen jäljitelmien kaupallisen käytön, koska voi-·1 täisiin ylläpitää suurempaa varastoa ja valvoa laatua.

30 Nykyään USP-standardit vaativat steriilisyystestauksen, joka kestää 14 päivää. Lisäetu onnistuneen kylmäsäilöntä-··' : menetelmän kehittämisellä on se, että sen avulla voitai- siin ehkäistä viljellyn kudos jäljitelmän kasvu tietyissä kasvuvaiheissa, jotta sitä voidaan testata ja analysoida.

35 !,: · Nykyään biologisten materiaalien varastointiaikaa piden- netään jäädyttämällä. Nesteen kiinteytyminen jäätymällä voi tapahtua kiteytymisenä, jolloin tapahtuu molekyylien 2 113833 täsmällinen järjestyminen. Vaihtoehtoisesti jäätyminen voi tapahtua amorfoitumisena tai lasiintumisena (vitrification), joka on kiinteytymistä ilman täsmällistä järjestymistä.

5

Kun eläviä soluja jäädytetään kiteyttämällä, ongelmana on se, että muodostuu solunsisäisiä jääkiteitä. Nämä jääki-teet ovat vahingollisia solun elävyyden kannalta soluja sulatettaessa. Solut pysyisivät kuitenkin elävinä kiin-10 teytettäessä ja sulatettaessa, jos ne kylmäsäilöttäisiin lasiinnuttamalla. Lasiinnuttaminen käsittää solujen jäähdyttämisen ja lämmittämisen säädetyillä nopeuksilla samalla kun solut ovat upotettuina jäätymisen estoainee-seen.

15

Fahy ym., "Vitrification as an approach to cryopreserva-tion", Cryobiology 21:407-426 (1984), kehittivät jäätymisen estoaineliuoksen, joka sisälsi dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja polymeeriä, jotka lasiinnuttivat 1 ilmakehän 20 paineessa. Tätä jäätymisen estoaineliuosta muunnettiin ihmisen monosyyttien lasiinnuttamiseksi. Takahashi et ai., "Vitrification of human monocytes", Cryobiology 23:103-115 (1986).

» * < t * · · 25 Solujen ja kudosten lasiinnuttaminen käyttäen jäätymisen , .·. estoaineita on ongelmallista sen vuoksi että solujen elä- vyys on alhainen sulatettaessa, koska ne eivät kestä käytettyjä väkeviä jäätymisen estoaineliuoksia, suuria jäähdytys- ja lämmitysnopeuksia, lämpöshokkia eivätkä jään 30 muodostumista lämmittämisen tai lasiintumisen palautumi-.* ' sen aikana (devitrification). Kun käytetään tunnetun tek- niikan mukaisia menetelmiä, ei ole mahdollista kylmäsäi-löä viljeltyä kudosjäljitelmää, osittain siksi että se on suhteellisen paksu ja hyvin heterogeeninen. Tämän keksi-'· 35 jät ovat havainneet, että samaa kylmäsäilöntätapaa ei * * voida soveltaa kaikkiin kudoksiin. Siten tällä hetkellä on olemassa voimakas tarve tehokkaalle ja kaupallisesti 3 113833 käytännölliselle menetelmälle viljeltyjen kudosjäijutelmien kylmäsäilömiseksi.

Tämä keksintö koskee menetelmää viljeltyjen kudosjälji-5 telmien onnistuneeksi säilömiseksi hyvin alhaisissa lämpötiloissa, mikä ehkäisee jääkiteiden muodostumisen, minimoi mahdollisesti haitallisten kemikaalien tehokkaan pitoisuuden, ja tekee mahdolliseksi jäätymisen estoainei-den lisäämisen ja poistamisen järkevissä lämpötiloissa 10 ilman että on tarpeen kehittää laitteistoja täsmällisten konsentraatio- ja lämpötilaolosuhteiden valvomiseksi.

Keksijät ovat keksineet menetelmän in vitro -menetelmällä valmistettujen viljeltyjen kudosjäljitelmien kylmäsäilö-15 miseksi siten, että kudokset säilyttävät elävyytensä ja käyttökelpoisuutensa ihmisen kudoksia vastaavina jäljitelminä. Keksinnössä käytetään sekoitusta jäätymisen es-toaineen tehokkaan määrän tunkeutumisen edistämiseksi.

Tämän menetelmän avulla voidaan viljeltyjä kudosjäljitel-20 miä kylmäsäilöä tavalla, joka suojaa rakenteen yhtenäisyyttä ja solun elävyyttä.

·.: Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on seuraavat vai- ; · · · heet: -•j 25 1) viljellyt kudosjäljitelmät upotetaan jäähdytettyyn jäätymisen estoaineliuokseen, jäätymisen estoaineliuosta ja siihen upotettua viljeltyä kudosta sekoitetaan, jotta jäätymisen estoaine tunkeutuisi tehokkaasti viljeltyyn . kudosjäljitelmään ja 2) viljelty kudos jäädytetään suu- 30 rella jäätymisnopeudella lämpötilaan, joka on ainakin '·* ’ noin -110 °C tai alle sen, mieluummin -140 °C tai alle sen ja mieluiten -196 °C.

, \ Kun viljelty kudosekvivalentti on kerran jäätynyt, sitä ’*· ’· 35 voidaan säilyttää määräämättömiä aikoja -196 °C:n lämpö- * ' tilassa, joka on nestetypen lämpötila.

4 113833

Kylmäsäilötyn kudosjäljitelmän sulattaminen suoritetaan lämmittämällä jäätynyt kudos siten, että sen lämpötila nousee nopeasti, tämä tehdään 1-3 sekunnissa. Jäätynyt kudosjäljitelmä voidaan sulattaa 37 eC:n vesihauteessa 5 tai muulla nopealla lämmitysmekanismilla.

Ennen käyttöä ihmisen kudosta vastaavana kudoksena sulatettu viljelty kudosjäljitelmä huuhdellaan jäätymisen estoaineliuoksen poistamiseksi. Jäätymisen estoaineliuos 10 voidaan poistaa huuhtelemalla esimerkiksi isotonisella puskuriliuoksella fysiologisessa pH:ssa. Viljeltyjä kudos jäljitelmiä voidaan sitten säilyttää väliaikaisesti kyseisessä puskuriliuoksessa ennen käyttöä.

15 Lyhyt kuvaus piirustuksista

Kuva 1 (A) on poikkileikkaus elävästä ihojäljitelmästä (Living Skin Equivalent, LSE) tässä kuvatun kylmäsäily-tyksen jälkeen verrattuna (B) jäädyttämättömän LSE-verro-20 kin poikkileikkaukseen.

”· Kuva 2 on graafinen kuvaus kylmäsäilytetyn viljellyn ku- ;\j doksen elävyystestauksesta käyttäen MTT-määritystä. Ku- vassa 2(A) on esitetty LSE:t, joita oli kylmäsäilytetty 25 0,5 - 1,0 tuntia ja sulatettu sitten nopeasti ja inkuboi- . tu 24 tuntia 10%:isessa C02:ssa, 37 °C:n inkubaattorissa.

”1 Elävyys mitattiin MTT-analyysillä kolmesta 0,5 cm2:n pa- lasesta, jotka oli otettu 44 cm2:n näytteestä. Kuvassa 2(B) esitetään LSE:n dermaalinen osa, josta on poistettu 30 epidermaalinen kerros kylmäsäilytyksen jälkeen fibroblas-V : tien elävyyden määrittämiseksi. Elävyys määritettiin MTT- analyysillä kolmesta 0,5 cm2:n palasesta, jotka oli otet-···. tu 44 cm2:n näytteestä.

: 35 Kuva 3 esittää eläimille siirrettyjä kylmäsäilytettyjä *eläviä ihojäljitelmiä (LSE). Kuvat 3(A), 3(B) ja 3(C) esittävät ajan vaikutuksen LSE:hen ennen kudoksen siirtä- 5 113833 mistä ja sen jälkeen. Kudos siirrettiin sellaisten hiirien syviin haavoihin (full-thickness wounds) (2 x 2 cm), joilta oli poistettu kateenkorva (athymic). Kuvat esittävät elävästä kudoksesta otettuja valomikroskooppinäyttei-5 tä (H&E). LSE-siirteet pakastettiin ja säilytettiin 72 tuntia ennen sulatusta ja käyttöä samana päivänä. Kuvassa 3(A) on pakastamaton, siirtämätön kontrolli-LSE (suurennos 135x), kuvassa 3(B) on kylmäsäilytetty LSE kuuden päivän kuluttua siirtämisestä (suurennos 175x), kuvassa 10 3(C) on kylmäsäilytetty LSE 30 päivän kuluttua siirtämi sestä (suurennos 130x).

Kudostekniikka on kehittyvä ala, jossa käytetään viljeltyjä kudossoluja kudosjäljitelmien konstruoimiseksi, joi-15 ta voidaan käyttää tutkittaessa kemiallisten aineiden tai farmaseuttisten yhdisteiden aiheuttamien vaurioiden vastetta. Viljeltyjä kudoksia voidaan käyttää myös muodostettaessa siirteenä käytettäviä ihmiskudoksia.

20 Kudosjäljitelmiä on kuvattu laajalti monissa patenteissa, mm. US-patenteissa n:o 4,485,096, 4,485,097, 4,539,716, ··· 4,546,500, 4,604,346 ja 4,837,379, jotka kaikki liitetään : tähän viitteeksi. Eräs onnistunut sovellus kudosjäljitel- mistä on nk. elävä ihojäljitelmä, "Living Skin Equiva-t>>.: 25 lent", jonka morfologia on samanlainen kuin oikean ihmi sen ihon morfologia. Elävä ihojäljitelmä (LSE) koostuu * · · ;;; kahdesta kerroksesta: ylempi osa koostuu erilaistuneista i : : ja kerrostuneista ihmisen orvaskeden keratinosyyteistä, jotka ovat alemman kerroksen päällä, joka koostuu ihmisen 30 ihon fibroblasteista kollageenimatriisissa. Parenteau et V · ai., "Epidermis Generated In Vitro: Practical Considera- tions and Applications", J. of Cellular Biochemistry, 45:245-251 (1991); Parenteau et al., The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to ac-·'· : 35 hieve form and function" Cytotechnology, 9:163-171 (1992) ja Bell et al., "The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties and Its Responses to 6 113833

Irritants", Toxic, in Vitro, 5:591-596 (1991). LSErtä tutkitaan nykyään kliinisissä kokeissa kolmeen eri tarkoitukseen: laskimohaavaumat, ihokirurgia ja palovammat.

LSE on täyspaksu, kaksikerroksinen in vitro valmistettu 5 ihokudos.

Silmän sarveiskalvon in vitro valmistettu elinjäljitelmä on kehitetty, kuten US-patenttihakemuksessa n:o 07/974,740 kuvataan, joka liitetään tähän viitteeksi.

10 Sarveiskalvo-kudosjäljitelmässä on kolme selvää soluker-rosta, ulkokerros, joka on kerrostunut suomuinen epiteeli, kollageenikuiduista ja peruskudossoluista muodostunut keskikerros ja sisäkerros, joka on yksinkertainen suomuinen epiteeli, jota myös kutsutaan sarveiskalvon endotee-15 liksi. Sarveiskalvon in vitro -jäljitelmää voidaan käyttää in vitro -toksisuusmäärityksissä, joissa ne toimivat tarkkoina ja hinnaltaan edullisina ennakoivina ei-eläin-malleina in vivo tutkittaessa silmän tai ihon ärsytysmah-dollisuuksia monentyyppisillä tuotteilla ja raaka-aineil-20 la.

Kylmäsäilytyksen tarkoitus on saada biologisen materiaa-·’/·· Iin rakenteellinen yhtenäisyys ja elävyys säilymään mää- :··: räämättömän ajan siten, että tämä materiaali on saatavis- ;··· 25 sa ja tarvittaessa käytettävissä. Monimutkainen kudos, ; jolla on äärellinen elinaika, tarvitsee kylmäsäilytystä *:·. tuotteen saatavuuden ja käyttökelpoisuuden parantamisek si. Biologisen materiaalin kylmäsäilytyksen historia on . kuitenkin osoittanut, että kylmäsäilytysmenetelmän opti- ;;; 30 mointi tietylle solulle ei välttämättä anna hyviä tulok- ’·’ ’ siä, kun sitä käytetään toisentyyppisille soluille tai tietyn kudoksen eri soluille. Kaksikerroksinen LSE vaati i"‘: erikoistuneempien menetelmien kehittämistä, mikä johtui . eroista solutiheydessä, vesipitoisuudessa ja täyspaksun ' · ; 35 LSE:n rakenteellisen järjestyneisyyden määrässä. Tämän keksinnön mukaiset kylmäsäilöntämenetelmät ovat myös sovellettavissa kolmikerroksiseen sarveiskalvojäljitelmään 7 113833 ja muihin samalla tavalla rakenteellisesti monimutkaisiin viljeltyihin kudosjäljitelmiin.

1 Määritelmät 5 Tässä käytettynä ilmaisu "viljellyt kudosjäljitelmät" tarkoittaa nisäkkäiden kudosten kudosjäljitelmiä (tissue equivalents), jotka on tehty in vitro -tekniikoilla ja joiden on tarkoitus sisältää kaksikerroksisia ihojäljΙ-ΙΟ telmiä, erityisesti LSE:tä, ja kolmikerroksisia sarveiskalvo jäljitelmiä. Viljeltyjen kudosjäljitelmien morfologia on samanlainen kuin nisäkkään, tyypillisesti ihmisen elimillä in vivo. Kuvaavasti LSE:n morfologialla on useita yhtäläisyyksiä ihmisen ihon kanssa. Joka puolella ra-15 kenteen dermaalikerroksessa on metabolisesti ja mitootti-sesti aktiivisia ihmisen ihon fibroblasteja (HDF), ja niiden on osoitettu erittävän verkkorakenteeseen kollageenia ja muita matriisin komponentteja. Epidermis koostuu perussolukerroksesta, jonka on osoitettu jakaantuvan 20 samalla mitoosinopeudella kuin ihmisen iho. Tyvisolujen yläpuolisella orvaskedellä on samanlaiset kerrokset ‘j* (strata) kuin iholla in vivo, hyvin muodostuneet, kera- tohyaliinia ja lamellaarisia rakeita sisältävät okamaiset :··· ja rakeiset kerrokset, joiden päällä on sarveiskerros.

25 Immunohistokemiallinen tutkimus osoittaa, että siinä on tavallisesti normaalin ihmisihon iho-orvaskesi-liitoskoh-dassa (dermo-epidermal junction) esiintyviä solunulkoisia matriisikomponentteja, kuten laminiinia, tyypin IV kollageenia ja kalaniinia (GB3).

30 ’·' ’ Ilmaisulla "sekoittaminen" tarkoitetaan mitä tahansa me- kaanista sekoittamistapaa, jolla voidaan edistää jäätymi-, ··. sen estoaineen perfuusiota kudosjäljitelmään, mm. sentri- fugaatiota ja ravistelua.

Termillä "jäätymisen estoaineliuos" tarkoitetaan mitä tahansa liuosta, jollaisia ovat "soluun tunkeutuvat la- ··: : 35 8 113833 sinmuodostusaineet" ja "lasinmuodostusaineet, jotka eivät tunkeudu soluun". Lasinmuodostusaineita, jotka eivät tunkeudu soluun, ovat mm. suurimolekyylipainoiset kompleksiset hiilihydraatit, kuten kondroitiinisulfaatti, poly-5 vinyylipyrrolidoni, polyeteeniglykoli tai "hetastarch", kuten hydroksietyylitärkkelys. Soluun tunkeutuva lasin-muodostusaine on edullisesti glyseroli, mutta se voi olla myös propyleeniglykoli, eteeniglykoli, dimetyylisulfoksidi, tai jokin muu soluun tunkeutuva lasinmuodostusaine.

10

Sopivia jäätymisen estoaineliuoksia tässä keksinnössä käytettäväksi ovat sekä soluun tunkeutuvat lasinmuodostusaineet että lasinmuodostusaineet, jotka eivät tunkeudu soluun. Suositeltava jäätymisen estoaine sisältää 65 % 15 glyserolia perusliuoksessa, jossa on DMEM-alustaa (Dul-becco's Modified Eagle's Medium) + 0,3 % vastasyntyneen vasikan seerumia (NCS). Toinen sopiva jäätymisen esto-aineliuos tässä keksinnössä käytettäväksi on liuos, jossa on 20,5 % dimetyylisulfoksidia (DMSO), 15,5 % asetamidia, 20 10,0 % propyleeniglykolia, 6,0 % polyeteeniglykolia (PEG) perusliuoksessa, jossa on 0,3 % vastasyntyneen vasikan ··· seerumia (NCS) DMEM-alustassa (Dulbecco's Modified Eag- • *.J le's Medium). Näitä liuoksia voi alan asiantuntija muun- taa ja optimoida käyttäen tunnettuja jäätymisen estoai-25 neita ja pakastus-, säilytys-, sulatus- ja huuhtelu- menetelmiä, jotka ovat yhteensopivia maksimaalisen elä- \ : : ;;; vyyden ylläpitämiseksi, riippuen erityisestä sovellukses- i : : • ta.

30 II Kylmäsäilytys • * · Tässä kylmäsäilytysmenetelmässä viljelty kudosjäljitelmä on upotettava jäätymisen estoaineliuokseen tietyksi ajaksi sellaisissa olosuhteissa, joissa solut pääsevät tasa-: 35 painoon jäätymisen estoaineen kanssa.

9 113833

Viljelty kudosekvivalentti upotetaan peräkkäin sarjaan jäätymisen estoaineliuoksia, joiden konsentraatiot kasvavat ja lämpötila laskee. Voimakkain jäätymisen esto-aineliuos (100% konsentraatio) laimennetaan perusliuok-5 sella, jolloin saadaan sarja liuoksia, joilla on alhaisemmat konsentraatiot. Sopivia perusliuoksia ovat mitkä tahansa alan asiantuntijoiden käyttämät tunnetut soluvil-jelyalustat, ja niitä ovat mm. Dulbeccon muunnettu Eaglen alusta (DMEM). Ennen upotusvaihetta jäätymisen esto-10 aineliuosten sarja esijäähdytetään. Viljelty kudosjälji-telmä upotetaan edullisesti ensin 15%-35%:iseen jäätymisen estoaineliuokseen, vielä edullisemmin 25%:iseen, 22 -25 °C:ssa, vielä edullisemmin huoneenlämmössä. Seuraavak-si viljelty kudosjäljitelmä upotetaan 40%-60%:iseen jää-15 tymisen estoaineliuokseen, vielä edullisemmin 50%:iseen, 10 - -2 °C:ssa, vielä edullisemmin 4 °C:ssa. Lopuksi viljelty kudosjäljitelmä upotetaan 100%:iseen jäätymisen estoaineliuokseen -10 - -30 °C:ssa, edullisemmin -20 °C:ssa. Kussakin tapauksessa viljelty kudosjäljitelmä 20 upotetaan kulloiseenkin liuokseen noin 10 - noin 20 minuutiksi, edullisemmin noin 15 minuutiksi. Ylimääräinen jäätymisen estoaineliuos kustakin upotusvaiheesta poiste-: taan ennen kuin kylmempi, suuremman konsentraation omaava f j jäätymisen estoaine lisätään.

! 25

> t t I I

Minkä tahansa tai useamman upotusvaiheen aikana, edulli- i sesti viimeisen upotusvaiheen aikana, jossa käytetään ’ 100%:ista jäätymisen estoainetta, viljeltyä kudosjälji- telmää jäätymisen estoaineessa sekoitetaan sellaisen 30 ajan, joka on riittävä saamaan aikaan jäätymisen estoai-: neen tehokkaan tunkeutumisen viljeltyyn kudos jäi jitel- mään. Alan asiantuntija voi helposti määrittää sopivan sekoitusajan, joka tarvitaan saamaan aikaan tunkeutuminen i : *” viljeltyyn kudokseen, määrityksen perustuessa sellaisiin :,· I 35 tekijöihin kuin esim. viljellyn kudosjäljitelmän tyyppi, jäätymisen estoaineen määrä ja koostumus ja sekoituksen voimakkuus. Edullisesti sekoitetaan noin 10 - 20 minuut 10 113833 tia. Edelleen, sekoittaminen suoritetaan käyttäen tavanomaista tasoravistelijaa.

Viimeisen upotuksen jälkeen viljelty kudosjäljitelmä ja 5 jäätymisen estoaineliuos jäähdytetään ainakin noin -140 °C - noin -180 °C:seen. Jäähdytysnopeus on edullisesti noin -10 °C minuutissa - noin -30 °C minuutissa, vielä edullisemmin noin -15 °C minuutissa - noin -20 °C minuutissa. Jäähdyttäminen voidaan suorittaa käyttäen jäähdy-10 tyslaitetta, jollainen on esimerkiksi kaupallinen ohjelmoitava solupakastin, joka voidaan ohjelmoida -110 °C --196 °C:n lämpötilaan, edullisemmin -140 °C - -180 ° C: seen.

15 Saatua kylmäsäilöttyä viljeltyä kudosjäljitelmää varastoidaan sitten esimerkiksi pussissa tai muovitarjottimella, lasinsiirtymälämpötilassa -110 °C:ssa tai sen alapuolella. Edullisesti perfusoitu viljelty kudosjäljitelmä tyhjiöpakataan muovipussiin ennen pakastamista. Kudosjäl-20 jitelmän tyhjiöpakkaaminen on toivottavaa, koska tämä menettelytapa tekee mahdolliseksi materiaalin nopean su-lattamisen, kun se on upotettu 37 °C:iseen vesihautee-seen. Edelleen tyhjiöpakkaamisen avulla viljelty kudos-jäljitelmä voidaan säilyttää ja sulattaa steriileissä 25 olosuhteissa ja se edistää nopeata lämmönsiirtoa jäädyttämisen ja sulattamisen aikana. Kylmäsäilytetty viljelty ! kudosjäljitelmä voidaan tyhjiöpakata käyttäen tavanomai- V · siä laitteita ja sopivia muovipusseja, joita kumpiakin on helposti saatavilla.

: 30 « · · III Pakastetun kylmäsäilötyn viljellyn kudosjäijitel-män sulattaminen • · » * » » · *;·* Pakastettu viljelty kudosjäljitelmä sulatetaan lämmittä- , 35 mällä se siten, että nostetaan lämpötilaa nopeasti niin ·:··· että kudos sulaa noin 1-3 sekunnissa. Sopivia menetelmiä pakastetun kudosjäljitelmän sulattamiseksi erittäin no- 11 113833 peasti ovat lämmittäminen käyttäen vesihaudetta tai lämmittäminen käyttäen induktiokuumennusta. Edullisesti pakastettu viljelty kudosjäljitelmä sulatetaan upottamalla tyhjiöpakattu viljelty kudosjäljitelmä vesihauteeseen 37 5 °C lämpötilassa.

Koska jäätymisen estoaineet ovat luonteeltaan myrkyllisiä, jäätymisen estoaineliuos poistetaan sulatetusta viljellystä kudoksesta 15 minuutin kuluessa sulattamisen 10 jälkeen, edullisesti mahdollisimman pian sulattamisen jälkeen, jotta viljellyn kudoksen elävyys ei kärsisi. Kun viljelty kdos on sulatettu, jäätymisen estoaineliuos korvataan isotonisella puskuriliuoksella fysiologisessa pH:ssa (noin pH 6,8 - 7,4), jolloin liuos sisältää edul-15 lisesti 0,5 - 2,0 M sakkaroosia.

Yllä esitetyllä tavalla valmistettua viljeltyä kudosjäl-jitelmää voidaan käyttää transplantaatioon tai implantaa-tioon in vivo tai yhdisteiden seulontaan in vitro.

20

Seuraavissa esimerkeissä kuvataan edelleen keksinnön to-• |· teuttamisessa käytettyjä materiaaleja ja menetelmiä. Esi- : merkkien ei ole tarkoitus rajoittaa keksintöä millään ta- valla.

! 25 ' < » · · , Esimerkit t · * * i · ♦ I · ·* ’ Kun oli kokeiltu lukuisia tavanomaisia tunnetun tekniikan mukaisia menettelytapoja viljellyn kudosjäljitelmän, elä-30 vän ihoj älj itelmän (LSE) kylmäsäilömiseksi ilman onnis-·' · : tunutta elävyyden palautumista, päädyttiin siihen, että «·,·, LSE:n voimakas epidermaalinen järjestyneisyys rajoitti 4 · mahdollisuuksia aikaansaada kylmäsäilytystä käyttäen ta-‘i' vanomaisia menetelmiä. Näytti siltä, että kylmäsäilytyk- : · 35 sessä LSE käyttäytyi enemmän kudoksen kuin solususpension kaltaisesti. Siten keksijät tutkivat tunnetun tekniikan 12 113833 mukaiseen lasiintumiskäsitteeseen perustuvia kylmäsäily-tystapoj a.

1 LSE:n pakastaminen klassisella lasiinnuttamisella 5

Lasiintuminen on kylmäsäilytysmenetelmä, jossa käytetään hyväksi nesteen jäähdyttämisen aikana lisääntyvää viskositeettia, jotta kiinteytymisessä saavutetaan lasinmuo-dostusfaasi mieluummin kuin kiteiden muodostuminen. La-10 sointuminen voidaan saada aikaan laskemalla lämpötila sellaisella nopeudella, että jääkiteitä ei muodostu, käyttäen tavanomaisia pakastusliuoksia, tai lisäämällä jäätymisen estoaineiden määrää niin, että se on riittävä estämään jääköteiden muodostumisen tavanomaisilla jääty-15 misnopeuksilla.

Uskotaan, että hitailla jäädyttämismenetelmillä, joissa tyypillisesti käytetään jäähtymisnopeutta 1 °C/minuutti ja jäätymisen estoaineen konsentraatiota 5% - 20 %, saa- 20 vutetaan solunsisäinen lasiintuminen, siten että yk- sisolususpensiot kestävät kontrolloidun solunulkoisen .j. jääkiteiden muodostumisen. (Hubel et ai., "Intracellular • » · * : Ice Formation During the Freezing of Hepatocytes Cultured ’ ! in a Double Collagen Gel", Biotechnol. Prog., 7:554-559 . 25 (1991). Nyt on osoitettu, että kompleksiset, monikerrok- i » siset kudokset, joilla on heterogeeniset fysikaaliset ominaisuudet ja erilaisia solutyyppejä kerroksissaan, * * vahingoittuvat hitaasti jäädytettäessä jään muodostumisen takia. Viljellyn kudosjäljitelmän kolmidimensionaalinen 30 rakenne, niin kuin tässä on määritelty, tekee sen herkäk-Γ: si solunsisäiselle jäänmuodostukselle ja solunulkoiselle jäänmuodostumiselle.

t » i * ·;' Ensimmäinen testattu lasiinnuttamisliuos oli epäonnistu isi 35 nut ja se aiheutti hyvin voimakasta vaihtelua. Tämä liuos oli modifioitu VS1 (Fahy, et ai., supra). Näissä testeissä käytetty modifioitu VSl-liuos sisälsi 20,5 % dimetyy- 13 113833 lisulfoksidia (DMSO), 15,5 % asetamidia, 10,0 % propy-leenlglykolia, 6,0 % polyeteeniglykolia (PEG) perusliuok-sessa, jossa oli vastasyntyneen vasikan seerumia (NCS) DMEM:ssä. VSl:a modifioitiin siten, että siinä käytettiin 5 DMEM:iä perusliuoksena ja NCS:ää seerumialbumiinin sijasta.

Laimennokset väkevästä muunnetusta VS1-liuoksesta tehtiin perusliuoksella, jolloin saatiin 50%:iset ja 25%:iset li-10 uokset. Vaiheittainen lisäysmenettely oli seuraavanlainen: LSE upotettiin 25%:iseen VSl:een huoneenlämmössä 15 minuutin ajaksi, korvattiin sitten 50%:isella VSl:llä 4,0 °C:ssa 15 minuutin ajaksi, ja korvattiin sitten 100 Soisella VSl:llä -20 °C:ssa 15-20 minuutin ajaksi. LSE pan-15 tiin sitten -180 °C:iseen säilytyskammioon nestemäisen typen höyryfaasissa, kunnes se oli saavuttanut tämän lämpötilan (noin 15 minuuttia). LSE:tä säilytettiin sitten noin -130 °C:ssa 30 minuutin ja usean päivän välisiä aikoja.

20

Sulatusmenettely koostui upottamalla lasiintunut LSE ,:. 50%:iseen VS1-liuokseen, joka oli 1-molaarinen (M) sakka- .·, ; roosin suhteen, 4,0 °C:ssa, 15 minuutiksi, sitten liuos > * korvattiin 25%:isella VSlrllä, joka oli IM sakkaroosin »t»»* w , 25 suhteen, huoneenlämmössä 15 minuutin ajaksi, sitten liuos * · t korvattiin DMEM:llä, joka oli IM sakkaroosin suhteen, * · !·' huoneenlämmössä 15 minuutin ajaksi ja sen jälkeen DMEM:- I · , · llä huoneenlämmössä 15 minuutin ajaksi.

: : : 30 Tällä menettelytavalla saatiin elävyys (määritettynä his- :: tologisella tutkimuksella) vain LSE:n kulmissa, ja kes- , kellä oli suurempi ala, jossa oli kuolleita epidermaali- sia soluja. Osoitettiin, että elävyyden puuttuminen joh-tui siitä, että jäätymisen estoaineet eivät tehokkaasti 35 tunkeutuneet LSE:hen. Tämä jäätymisen estoaineen per-, ; fuusion puuttuminen johtui jäätymisen estoaineliuoksen lisääntyneestä viskositeetista lämpötilan laskiessa. -20 14 113833 °C:ssa jäätymisen estoaine on vielä neste, mutta se on varsin viskoosi.

II LSE:n jäädyttäminen kylmäsäilytysmenetelmällä 5 A. Elävyyden lisäämiseksi edellä esitetty toistettiin käyttäen tämän keksinnön mukaista menetelmää, jossa LSE:-tä sentrifugoitiin 5-15 minuuttia lopullisen perfuusio-vaiheen aikana, jolloin siis käytettiin 100%:ista VSl:a.

10 Tällä lähestymistavalla saatiin hämmästyttävä parannus, elävyyden ollessa lähes 100%:inen, mikä mitattiin MTT-konversiolla. Gay et ai., "The Living Skin Equivalent as a Model In Vitro for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants", Toxic, in Vitro, 6:303-315 (1992).

15 Jäätyneessä ja jäädyttämättömässä LSE:ssä havaittiin mor-fologisesti vain vähän tai ei yhtään eroa. Vaikka näytteiden välillä näytti olevan jonkinlaista vaihtelevuutta, havaittiin, että kun näyte ei ollut kunnolla lasiintunut, 20 sen morfologisessa ulkomuodossa sulattamisen jälkeen esiintyi täysin kuolleita soluja. Sentrifugoinnin epäkäy-tännöllisestä scale-up-luonteesta johtuen seuraavaksi : kokeiltiin sekoitusta tasoravistelijalla -20 eC:n pakas- * · · timessa per fuusion lisäämiseksi. Tämäntyypppinen sekoit-. 25 taminen antoi samankaltaisia tuloksia kuin ne, jotka saa- . tiin sentrifugointia sekoitustapana käytettäessä.

'<* * B. Tässä kokeessa käytettiin lasiintumisliuosta, joka ei sisältänyt potentiaalisesti karsinogeenista yhdistettä, : 30 asetamidia (W.F. Rail, Cryobiology, 24:387-404 (1987)).

: Kehitettiin uusi lasiintumisliuos, joka sisälsi 65 % gly- serolia DMEM:ssä + 0,3 % NCS:ää (täysi voimakkuus). Sekä vaiheittainen lisäysmenettely että sulatusmenetelmä oli-1 vat samat kuin yllä on kuvattu modifioidulle VSl:lle.

:,·· 35 Täysvahvan liuoksen laimennokset tehtiin perusalustoilla, *:·: jolloin saatiin 50%:inen ja 25%:inen liuos. Vaiheittainen lisäysmenettely oli seuraavanlainen: LSE upotettiin 15 113833 25%:iseen liuokseen huoneenlämmössä 15 minuutin ajaksi, sitten se korvattiin 50%:isella liuoksella 4,0 °C:ssa 15 minuutin ajaksi, sitten se korvattiin 100%:isella liuoksella -20 °C:ssa 15-20 minuutin ajaksi. LSE pantiin sit-5 ten -180 °C:iseen säilytyskammioon nestemäisen typen höy-ryfaasissa kunnes se oli saavuttanut tämän lämpötilan (noin 15 minuuttia). LSE:tä säilytettiin noin -130 °C:ssa 30 minuutin - usean päivän ajan. Sulattamista varten la-siintunut LSE upotettiin 4,0 °C:ssa 15 minuutiksi 50%:-10 iseen liuokseen, joka oli 1-molaarinen (M) sakkaroosin suhteen, sitten liuos korvattiin 25%:isella liuoksella + IM sakkaroosia huoneenlämmössä 15 minuutin ajaksi, sitten tämä liuos korvattiin DMEMillä + IM sakkaroosia huoneenlämmössä 15 minuutin ajaksi, ja sen jälkeen DMEM:llä huo-15 neenlämmössä 15 minuutin ajaksi.

Tämä menettelytapa antoi jatkuvasti suurempia elävyysar-voja kuin modifioitua VSl:ä käytettäessä. Tämä liuos myös vähensi vaihtelun määrää; kylmäsäilytetyt LSE:t olivat 20 johdonmukaisesti elävämpiä. Morfologisesti jäädytetyn ja jäädyttämättömän LSE:n ulkomuodon välillä ei esiintynyt näkyvää eroa, kuten nähdään kuvasta 1. Elävyyden arvioi-tiin lähenevän 100%:ia histologisen tutkimuksen perus-‘ * teella ja kuvassa 2 esitettyjen MTT-määritysten perus- 25 teella. Glyserolia sisältävän jäätymisen estoaineen myrkyllisyys sekoittamisen aikana testattiin käyttäen 5-40 minuutin pituisia altistusaikoja, jolloin edullinen aika-: väli minimi toksisuudelle oli 10-15 minuuttia.

: 30 C. Tässä kokeessa arvioitiin isompia LSE:itä. Havaittiin, että elävyyden vaihtelua voitiin vähentää lisäämällä LSE:n sitä pinta-alaa, joka on lähikosketuksessa lämmit-·’ ·' tävään liuokseen sulatuksen aikana. Tämä saatiin aikaan *>··' vetämällä tyhjiö perfusoitua LSE:tä sisältävään suojaa- • 35 vaan pussiin ennen lopullista pakastusvaihetta, jolloin minimoitiin ilman eristävä vaikutus LSE:n ja sitä ympäröivän suojaavan pussin välissä. Tämä menettelytapa johti 16 113833 kudoksen paljon suurempaan lämpiämisnopeuteen, ja LSE:n solujen, erityisesti fibroblastien elävyyden lisääntymiseen. Fibroblastit näyttivät olevan herkempiä lasin de-vitrifikaatiolle (jään muodostumiselle lämmittämisen ai-5 kana) kuin epidermaaliset solut.

Sulatettua LSE:tä inkuboitiin yhden päivän ajan alustassa 37 °C:ssa ennen kuin kunkin kerroksen elävyys määritettiin käyttäen MTT-elävyysmääritystä ja rutiinihistologi-10 aa. LSE:llä, joka oli jäädytetty nopeasti tässä esitetyllä menetelmällä käyttäen 65%:ista glyserolia, oli hyvä elävyys vuorokauden kuluttua sulatuksesta, kuten voidaan nähdä kuvasta 2(A). Koska solutiheydet epidermaalisten ja dermaalisten kerrosten välillä olivat hyvin erilaiset, 15 jäädytetyn LSE:n dermaaliset kerrokset (DE) mitattiin myös erikseen (Kuva 2(B)). Molemmilla kerroksilla oli hyvä elävyys ja morfologian pysyvyys, kuten esitetään kuvassa 3.

20 Solun elävyys mitattiin käyttäen MTT-määritystä, kolori-metristä MTT-konversiomääritystä, joka on kehitetty mit-. taamaan solujen kasvua ja elävyyttä. Tämä määritys on kuvattu yksityiskohtaisesti artikkelissa Gay et ai., "The ‘ ; Living Skin Equivalent as a Model In Vitro for Ranking 25 the Toxic Potential of Dermal Irritants", Toxic, in Vitro, 6:303-315 (1992). Liukoisen tetratsoliumsuolan meta-bolinen pelkistyminen siniseksi formatsaanisakaksi riip-V ·' puu siitä, miten paljon on läsnä eläviä soluja, joilla on häiriintymätön mitokondriaalinen toiminta. Tätä määritys-; 30 tä käytetään mittaamaan sytotoksisuuden määrä eri solu- ; tyypeissä, mm. ihmisen viljellyissä keratinosyyteissä.

Kuhunkin kaivoon lisättiin 1,5 ml LSE-määritysalustaa, • ·’ joka sisälsi 0,33 mg MTT/ml (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO). LSE:tä inkuboitiin MTT:tä sisältävässä :'· 35 määritysalustassa 3-4 tuntia. Konversiovaiheen lopussa paljastettu LSE:n osa leikattiin pois käyttäen ihon näyt-teenottovälinettä, jonka halkaisija oli 8 mm, ja uutet- 17 113833 tiin 2-24 tuntia huoneenlämmössä 0,3 ml:ssa isopropanolia, hapotettiin 0,04 N HCl:llä. Uuttovaiheen lopussa 0,2 ml kutakin uutetta siirrettiin 96-kaivoisen levyn kaivoon ja absorbanssi 570 nm:ssä luettiin levynlukijalla 5 (Dynatech), nollakokeena käytettiin isopropanoli-uutto-alustaa. LSE:lle raportoitu MTT-kokonaiskonversio on fib-roblastien ja keratinosyyttien yhdistetty metabolinen aktiivisuus LSErssä. Kuorimalla epidermis erilleen der-miksestä MTT-värjäyksen jälkeen määritettiin dermaalisen 10 kerroksen fibroblastien ja epidermiksen keratinosyyttien väliset suhteelliset vaikutukset.

III LSE:n siirtäminen hiiriin, joilta on poistettu ka- teenkorva 15

Juuri sulatetut LSE:t, edellä kuvatun kylmäsäilytyksen jälkeen, siirrettiin hiiriin, joilta oli poistettu ka-teenkorva, siirteiden erojen määrittämiseksi, so. minkä tahansa muutoksen siirteen kiinnittymisessä, osoituksen 20 lyhytaikaisesta vahingoittumisesta tai minkä tahansa muutoksen pitkäaikaisessa kiinnipysymisessä.

Kontrollina käytetyn jäädyttämättömän, siirtämättömän • ; LSE:n morfologia on esitetty kuvassa 3(A).

25 * * Sulatettuja LSE:itä tutkittiin siirron jälkeen. 6. päivä- nä ja 30. päivänä saadut tulokset on esitetty kuvissa • 3(B) ja vastaavasti 3(C). Kuudennen päivän siirteissä ei näkynyt mitään merkkiä degeneraatiosta tai pesäkekuoli- ; 30 öistä. 30. päivän siirteissä havaittiin verrannollinen , epidermaalinen pysyvyys ja veri suoni tusta ihomarrossa.

Mitään eroa ei myöskään havaittu kontrollina käytetyn, ·’ jäädyttämättömän LSE:n ja sulatetun LSE:n siirteen kiin- nittymisessä, minkä osoittivat morfologiset vertailut • 35 (tuloksia ei ole esitetty).

18 113833

Vaikka edellä esitetty keksintö on kuvattu yksityiskohtaisesti kuvaamalla ja esimerkein, jotta se olisi selvä ja voitaisiin ymmärtää, alan asiantuntijalle on ilmeistä, että keksinnön suojapiirin sisällä, jonka oheiset vaati-5 mukset ainoastaan määrittelevät, voidaan tehdä tiettyjä muutoksia ja modifikaatioita.

» l

Claims (17)

113833

1. Menetelmä viljellyn kudosjäljitelmän suojaamiseksi jäätymiseltä, tunnettu siitä, että 5 (a) mainittu viljelty kudosjäljitelmä upotetaan pe räkkäin sarjaan jäätymisen suoja-aineliuoksia, joiden konsentraatio kasvaa ja lämpötila laskee, kylmäsuojatun viljellyn kudosjäljitelmän tuottamiseksi, (b) mainittu viljelty kudosjäljitelmä jäähdytetään 10 lämpötilaan, joka on -110 °C tai sen alle, jäähdytys- nopeudella -10 °C minuutissa tai nopeammin lasiintuneen viljellyn kudosjäljitelmän tuottamiseksi, ja (c) mainittu lasiintunut viljelty kudosjäljitelmä säilytetään lämpötilassa, joka on -110 °C tai sen alle 15 säilötyn viljellyn kudosjäljitelmän tuottamiseksi, jolloin yhtä tai useampaa vaiheessa (a) mainitun jäätymisen suoja-aineliuossarjan jäsentä, joiden konsentraatio kasvaa ja lämpötila laskee, ja jotka sisältävät upotetun viljellyn kudosjäljitelmän, sekoitetaan olosuhteis-20 sa, jotka ovat riittävät saamaan aikaan mainitun jäätymisen suoja-aineliuoksen tehokkaan tunkeutumisen mainittuun ··· viljeltyyn kudosjälj itelmään ennen säilytystä. * · » * * • ·

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 25 siitä, että vaiheessa (a) * · . kylmäsuojattu viljelty kudosjäljitelmä tuotetaan * * · ;;; lopullisessa lämpötilassa -10 °C - -30 °C. * · ·

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu : ‘ 30 siitä, että vaiheessa (a) (i) mainittu viljelty kudosjäljitelmä upotetaan .···, ensimmäiseen jäätymisen suoja-aineliuokseen, jonka konsentraatio on 15% - 35% jäätymisen . suoja-ainetta perusalustassa, 10-20 minuutin · 35 ajaksi, ensimmäisen kylmäsuoj atun viljellyn : kudosjäljitelmän tuottamiseksi, (ii) mainittu ensimmäinen kylmäsuojattu viljelty 113833 kudosjäljitelmä upotetaan lämpötilassa 10 °C --2 °C toiseen jäätymisen suoja-aineliuokseen, jonka konsentraatio on 40% - 60% jäätymisen suoja-ainetta perusalustassa, 10-20 minuutin 5 ajaksi, toisen kylmäsuojatun viljellyn kudos- jäljitelmän tuottamiseksi ja lopuksi (iii) mainittu toinen kylmäsuojattu viljelty kudosjäl-jitelmä upotetaan lämpötilassa -10 °C - -30 °C kolmanteen jäätymisen suoja-aineliuokseen, jon-10 ka konsentraatio on 100% jäätymisen suoja-ai netta, 10-20 minuutin ajaksi, kolmannen kylmä-suojatun viljellyn kudosjäljitelmän tuottamiseksi, jolloin ainakin vaiheen (iii) viljeltyä kudosjäljitelmää 15 ja mainittua jäätymisen suoja-aineliuosta sekoitetaan olosuhteissa, jotka ovat riittävät saamaan aikaan mainitun jäätymisen suoja-aineliuoksen tehokkaan tunkeutumisen mainittuun viljeltyyn kudosjäljitelmään.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 2 tai 3 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että jäätymisen estoaineliuos si-sältää yhden tai useamman seuraavista aineista: soiuun ; tunkeutuva lasinmuodostusaine ja soluun tunkeutumaton • · · ! lasinmuodostusaine. 25 « * f ♦ ·

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu 'h* siitä, että mainittu soluun tunkeutumaton lasinmuodostus- : I I * t ·’ * aine on kompleksisen hiilihydraatin suurimolekyylipainoi- nen muoto, joka sisältää yhden tai useamman seuraavista: V 30 kondroitiinisulfaatti, polyvinyylipyrrolidoni ja pölyni eteeniglykoli.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu . siitä, että mainittu soluun tunkeutumaton lasinmuodostu- , : 35 aine on hetastarch.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu 113833 siitä, että mainittu hetastarch on hydroksietyylitärkke-lys.

8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu 5 siitä, että mainittu soluun tunkeutuva lasinmuodostusaine on jokin seuraavista: glyseroli, propyleeniglykoli, ety-leeniglykoli ja dimetyylisulfoksidi.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu 10 siitä, että mainittu soluun tunkeutuva lasinmuodostusaine on glyseroli.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittua vaiheen (c) säilöttyä viljeltyä 15 kudosjäljitelmää säilytetään nestemäisessä typessä lämpötilassa -196 °C.

11. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu jäätymisen suoja-aine, jonka 20 konsentraatio on 100%, sisältää jonkin seuraavista: 65% glyserolia DMEM:ssä + 0,3 % vastasyntyneen vasikan seerumia, 20,5 % dimetyylisulfoksidia + 15,5 % asetamidia * * ;,''j + 10 % propyleeniglykolia + 6 % polyetyleeniglykolia perusliuoksessa, jossa on 0,3 % vastasyntyneen vasikan •; * 25 seerumia DMEM:ssä, jolloin jäätymisen suoja-aineliuos, ; jonka konsentraatio on 100%, laimennetaan perusalustalla o. vaiheen (i) ja vaiheen (ii) jäätymisen suoja-aineliuosten tuottamiseksi. » ·

12. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu edelleen siitä, että mainittu säilötty viljelty kudosjäljitelmä sulatetaan nopeudella, joka on tehokas tuottamaan sulatetun elävän viljellyn kudos-jäljitelmän.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu edelleen siitä, että mainittu sulatettu elävä kylmäsäi- ' 35 113833 lötty viljelty kudosjäljitelmä huuhdellaan fysiologiseen pH:hon puskuroidulla isotonisella liuoksella.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu 5 siitä, että mainittu isotoninen liuos sisältää 0,5 - 2,0 M sakkaroosia.

15. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu jäähdytysnopeus 10 on -10 °C minuutissa - -30 °C minuutissa.

16. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu viljelty kudosjäljitelmä tyhjiöpakataan steriilisti suojaavaan 15 pussiin ennen mainittua jäähdytysvaihetta.

17. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu viljelty kudosjäl-jitelmä on elävä ihojäljitelmä tai sarveiskalvokudosjäl- 20 jitelmä. <1 t · • · * i » * t * * M I * e * » * ♦ » » 113833