NO311631B1 - Cryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter - Google Patents
Cryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter Download PDFInfo
- Publication number
- NO311631B1 NO311631B1 NO19961048A NO961048A NO311631B1 NO 311631 B1 NO311631 B1 NO 311631B1 NO 19961048 A NO19961048 A NO 19961048A NO 961048 A NO961048 A NO 961048A NO 311631 B1 NO311631 B1 NO 311631B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cultured tissue
- tissue equivalent
- cryoprotectant
- temperature
- equivalent
- Prior art date
Links
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title abstract description 27
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims abstract description 76
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 49
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 21
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 claims description 21
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 16
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 15
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 14
- 238000007496 glass forming Methods 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 claims description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 4
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 claims description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 claims description 2
- 229940027278 hetastarch Drugs 0.000 claims description 2
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 claims description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 claims 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 20
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 5
- 238000002513 implantation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 111
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 20
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 16
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 11
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 9
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 8
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 7
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 7
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 4
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 3
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 3
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004031 devitrification Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 2
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 2
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000000558 Varicose Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000005280 amorphization Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000000871 endothelium corneal Anatomy 0.000 description 1
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010075526 keratohyalin Proteins 0.000 description 1
- 238000001172 liquid--solid extraction Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 231100000324 minimal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012808 pre-inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000005123 simple squamous epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000013190 sterility testing Methods 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 231100000721 toxic potential Toxicity 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002723 toxicity assay Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Treatment Of Fiber Materials (AREA)
Description
Oppfinnelsen er rettet mot cryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter dannet ved in vitro teknologi. Cryokonservert dyrket vev kan bli lagret i ubegrensede tidsperioder før anvendelse. Det dyrkede vevet er en in vitro modell av det tilsvarende humane vev som, når det tas fra lagring, anvendes for transplantasjon eller implantasjon in vivo eller for screening av forbindelser in vitro.
Vevskulturteknikker anvendes for utvikling av vev- eller organekvivalenter. Disse teknikkene innbefatter kollagenmatrisestrukturer som kan remoduleres til funksjonelt vev eller organer ved riktig kombinasjon av levende celler, næringsstoffer og dyrkningsbetingelser.
For tiden er anvendelse av dyrkede vevsekvivalenter begrenset på grunn av at slike ekvivalenter har en begrenset oppbevaringstid. For tiden er det umulig å opprettholde en passende lagerbeholdning over tid. På grunn av begrenset holdbarhetstid til ekvivalentene er det stor grad av svinn. Utvikling av en vellykket cryokonserveringsmetode som vil forlenge lagringstiden hvorved dyrket vev kan lagres slik at tilfredsstillende lagerbeholding kan opprettholdes, og som vesentlig vil redusere svinnet, er ønskelig.
En slik cryokonserveringsmetode vil muliggjøre kommersiell anvendelse av slike ekvivalenter på grunn av lager av store produksjonsserier kan opprettholdes og kvalitetskontrollen inspisert. USP standardene omfatter sterilitetstesting som krever 14 dager. En ytterligere fordel med utvikling av en vellykket cryokonserveringsmetode er åt det vil muliggjøre hemming av veksten av den dyrkede vevsekvivalenten ved spesifikke utviklingsstadier for ytterligere testing og analysering.
Lagringstiden for biologiske materialer blir for tiden forlenget ved frysing. Stivning av en væske ved frysing kan foregå som krystallisering, som innbefatter et ordnet arrangement av molekyler. Alternativt kan frysingen foregå som amorfisasjon eller vitrifikasjon, og som omfatter stivning uten et ordnet arrangement.
Frysing av levende celler ved krystallisering er problematisk på grunn av at intracellulære iskrystaller blir dannet. Disse iskrystallene skader cellens levedyktighet ved tining. Cellene kan overleve stivning og tining, hvis de blir cryokonservert ved vitrifikasjon. Vitrifikasjon innbefatter avkjøling og varming av cellene ved kontrollerte rater, mens cellene er nedsenket i cryobeskyttelsesmidler.
Fahy et al., "Vitrification as an approach to cryopreservation", Crybiology 21:407-426 (1984), utviklet en cryobeskyttelsesfniddeloppløsning inneholdende dimetylsulfoksid (DMSO) og polymerer som vitrifiserte ved 1 atmosfære. Dette cryokonserveringsmediet ble modifisert for vitrifisering av humane monocyter. Takahashi et al., "Vitrification of Human Monocytes," Cryobiology 23:103-115 (1986).
Vitrifisering av celler og vev ved anvendelse av cryobeskyttelsesmidler er problematisk på grunn av at cellelevedyktigheten er lav ved tining fordi cellene ikke tolererer de sterkt konsentrerte cryobeskyttelsesmiddeloppløsningene som anvendes, høye rater med avkjøling og varming, termisk sjokk og isdannelser i løpet av oppvarming eller devitrifikasjon. Ved anvendelse av tidligere kjente fremgangsmåter er det ikke mulig å cryokonservere en dyrket vevsekvivalent, delvis på grunn av at den er relativt tykk og meget heterogen. Oppfinnerene heri har oppdaget at den samme cryokonserveringsmetoden ikke kan anvendes på alle vev. Det er følgelig et sterkt behov for en effektiv og kommersiell praktisk metode for cryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for vellykket konservering av dyrkede vevsekvivalenter ved meget lave temperaturer som unngår dannelsen av iskrystaller, minimaliserer den effektive konsentrasjonen av potensielt skadelige kjemikalier, og muliggjør hurtig introduksjon og fjerning av cryobeskyttelsesmidler ved mulige temperaturer, uten behov for avansert utstyr for å registrere nøyaktige betingelser konsentrasjons- og temperaturbetingelser.
Oppfinnerene har oppdaget en fremgangsmåte for cryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter dannet ved in vitro teknikker slik at vevene opprettholder deres levedyktighet og anvendbarhet som ekvivalenter av humane vev. Oppfinnelsen innbefatter anvendelse av agitasjon for å fremme penetrering av en effektiv mengde cryobeskyttelsesmiddel. Foreliggende fremgangsmåte muliggjør cryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter på en måte som beskytter den strukturelle integriteten og den cellulære levedyktigheten.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter følgende trinn:
1) nedsenking av dyrket vevsekvivalent i en avkjølt cryobeskyttelsesoppløsning, agitering av cryobeskyttelsesoppløsningen og det nedsenkede dyrkede vevet for å oppnå effektiv penetrering av cryobeskyttelsesmiddeloppløsningen inn i det dyrkede vevsekvivalentet og 2) frysing av det dyrkede vevet ved en høy fryserate til en temperatur ved eller under minst omtrent -110°C, mere foretrukket ved eller under minst -140°C, og mest foretrukket ved-196°C.
Når det er fryst kan den dyrkede vevsekvivalenten lagres i uendelige tidsperioder ved en temperatur på -196°C, temperaturen til flytende nitrogen.
Tining av den cryokonserverte vevsekvivalenten oppnås ved varming av det fryste vevet ved høy rate med temperaturøkning som blir utført i løpet av omtrent 1-3 sekunder. Den fryste dyrkede vevsekvivalent kan tines i et vandnbad ved 37°C eller ved en annen hurtig oppvarmingsmekanisme.
Før anvendelse som en ekvivalent for humant vev blir den tinte dyrkede vevsekvivalent skylt for å fjerne cryobeskyttelsesmiddeloppløsningen. Cryobeskyttelsesmiddeloppløsningen kan fjernes ved skylling med for eksempel en isoton bufferoppløsning ved fysiologisk pH. Dyrkede vevsekvivalenter kan deretter lagres temporært i en slik bufferoppløsning før anvendelse.
KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 (A) er et tverrsnitt av en levende hudekvivalent (LSE) etter cryokonservering ifølge fremgangsmåtene beskrevet heri sammenlignet med (B) et tverrsnitt av en ikke-fryst LSE-kontroll. Figur 2 er en graf på levedyktighetstesting av cryokonservert dyrket vev ved anvendelse av MTT-analysen. Figur 2 (A) er LSE-cryokonservert i 0.5 til 1.0 timer og deretter hurtig tint og inkubert i 24 timer i en 10% CO2 37°C inkubator. Levedyktigheten ble målt ved MTT-analyse av tre 0.5 cm^ deler av en 44 cm^ prøve, Figur 2 (B) er en dermal del av LSE hvor epidermlaget er fjernet etter cryokonserveringen for å analysere for fibroblastlevedyktighet. Levedyktigheten ble målt ved MTT-analyse av tre 0.5 cm^ deler av en 44 cm^ prøve. Figur 3 viser dyrepodning av cryokonserverte levende hudekvivalenter (LSE).
Figurene 3(A), 3(B) og 3(C) viser tidssekvensen for LSE pre- og post-podning på 2 x 2 cm full-tykkelsessår av atymiske mus vist i lysmikrograf (H&E) snitt av biopsivev. LSE- podningene ble fryst og lagret i 72 timer før tining og applikasjon samme dag. Figur 3(A) er ikke-fryst, ikke-podet kontroll-LSE (forstørrelse =135 X); figur 3(B) er cryokonservert LSE 6 dager etter podning (forstørrelse = 135X); figur 3(B) er cryokonservert LSE 30 dager etter podning (forstørrelse = 130X).
Vevsomkonstruering er et kommende område som anvender dyrkede vevsceller for å konstruere vevsekvivalenter som kan anvendes for å undersøke responsen på skade av kjemiske midler eller farmasøytiske forbindelser. Dyrket vev kan også anvendes for å danne podbart humant vev.
Vevsekvivalenter er grundig beskrevet i mange patenter, inkludert US-PS nr. 4.485.096; 4.485.097; 4.539.716; 4.546.500; 4.604.346; og 4.837.379, hvor alle er innkorporert heri som referanse. En vellykket anvendelse av vevsekvivalentet er betegnet "levende hudekvivalent", som har en morfologi som ligner virkelig human hud. Levende hudekvivalent (LSE) består av to lag: den øvre delen er dannet av differensierte og stratifiserte humane epidermale keratinocyter som dekker et lavere lag av humane dermale fibroblaster i en kollagenmatriks. Parentau, et al., "Epidermis Generated In Vitro: Practical Considerations and Applications", J. of Cellular Biochemistry, 45:245-251 (1991); Parentau, et al. "The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function", Cytotechnology, 9:163-171 (1992); og Bell et al., "The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties and Its Responses to Irritants", Toxic. in Vitro, 5:591-596 (1991). LSE for podning undersøkes nå i kliniske forsøk for tre indikasjoner: venøse sår, dermatologisk kirurgi og brannsår. LSE er et vev med full tykkelse, lagdelt i to lag, in vitro konstruert hudvev.
En in vitro organekvivalent av hornhinnen til øyet er utviklet som beskrevet i US-patent søknad serienr. 07/974.740, inkorporert heri som referanse. Hornhinnevevsekvivalenter har tre bestemte cellelag, det ytre laget, et stratifisert skjellepitel, midtre lag med kollagenfibre og stromaceller, og et indre lag, enkelt skjellepitel, også betegnet hornhinneendotel. En in vitro hornhonneekvivalent kan bli anvendt for in vitro toksisitetsanalyser som fungerert som nøyaktige og billige forutsigbare ikke-dyr beskyttende modeller for in vivo okulært og dermalt irritasjonspotensiale for mange typer av produkter og råmaterialer.
Målet for cryokonservering er å konservere den strukturelle integriteten og levedyktigheten til biologiske materialer i en ubegrenset tidsperiode slik at disse materialene kan være tilgjengelige og anvendes etter behov. Komplekst vev med begrenset levetid vil kreve cryokonservering for å øke produkttilgjengeligheten og anvendbarheten. Bakgrunnen for cryokonservering av biologisk materiale har derimot vist at optimalisering av en cryokonserveringsprotokoll for en bestemt celle ikke nødvendigvis gir gode resultater når den anvendes med en annen celletype eller med andre celler i et vev. Bilag-LSE krevde utvikling av mer spesialiserte metoder på grunn av forskjeller i celletetthet, vanninnhold og nivå på strukturell organisering av full-tykkelse LSE. Cryokonserveringsprotokollene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes på trippellags hornhinneekvivalenten og andre lignende strukturelt omfattende dyrkede vevsekvivalenter.
I. DEFINISJONER
Anvendt heri angir betegnelsen "dyrkede vevsekvivalenter" vevsekvivalenter fra pattedyrvev hvor vevsekvivalentene dannes ved hjelp av in vitro teknikker og er ment å innbefatte bilags hudekvivalenter, spesielt LSE og trippellagshornhinneekvivalenter. Morfologien til dyrkede vevsekvivalenter er lik in vivo pattedyrorganet, spesielt humant organ. For illustrering kan det hevdes at morfologien til LSE har mange likheter med human hud. Metabolisk og mitotisk aktive humane dermale fibroblaster (FIDE) finnes i det dermale laget til konstruksjonen og er vist å utskille kollagen og andre matrikskomponenter inn i gitteret. Epidermis består av et basallag som deler seg med en mitotisk rate som ligner den til human hud. Suprabasal epidermis viser samme strata som hud in vivo, med veldefinerte piggete og granulære lag inneholdende keratohyalin og lamellære granuler som blir dekket av et stratum corneum. Immunohistokjemi demonstrerer tilstedeværelse av ekstracellulære matrikskomponenter som rutinemessig finnes ved den dermo-epidermalgrensen i normal human hud, så som laminin, type IV kollagen og kalanin (GB3).
Ved anvendelse av betegnelsen "agitasjon" menes en hvilken som helst mekanisk metode for agitasjon for å forsterke perfusjonen av
cryobeskyttelsesmiddeloppløsningen inn i vevsekvivalenten, inkludert sentrifugering og risting.
Med terminologien "cryobeskyttelsesmiddeloppløsning" menes en hvilken som helst oppløsning som innbefatter "cellepenetrerende glassdannende midler" og "ikke-celle penetrerende glassdannende midler". Ikke-cellepenetrerende glassdannende midler innbefatter høymolekylvektsformer av komplekse karbohydrater, så som chondroitinsulfat, polyvinylpyrrolidon, polyetylenglykol eller hetastivelse, så som hydroksyetylstivelse. Cellepenetrerende glassdannende middel er fortrinnsvis glycerol, men kan innbefatte propylenglykol, etylenglykol, dimetylsulfoksid og andre penetrerende glassdannende midler kjent innenfor fagområdet.
Egnede cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger for anvendelse i foreliggende oppfinnelse innbefatter både cellepenetrerende glassdannende midler og ikke-cellepenetrerende glassdannende midler. Foretrukket cryobeskyttelsesmiddeloppløsning inneholder 65% glycerol i en base av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) + 0.3% nyfødt kalveserum (NCS). En annen egnet cryobeskyttelsesmiddeloppløsning for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er 20.5% dimetylsulfoksid (DMSO), 15.5% acetamid, 10.0% propylenglykol, 6.0% polyetylenglykol (PEG) i en base av 0.3% nyfødt kalveserum (NCS) i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM). Disse oppløsningene kan modifiseres og optimaliseres av fagfolk innenfor dette området ved anvendelse av kjente cryobeskyttelsesmidler og frysings-, lagrings-, tinings- og skylleprosedyrer som er kompatible med opprettholdelse av maksimal levedyktighet, avhengig av den bestemte applikasjonen.
II. CRYOKONSERVERING
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for vitrifisering av en dyrket vevsekvivalent, kjennetegnet
ved å:
(a) nedsenke nevnte dyrkede vevsekvivalent i en serie av
cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger ved økning i konsentrasjon og reduksjon i temperatur for å produsere en cryobeskyttet dyrket vevsekvivalent: (b) avkjøle nevnte cryobeskyttede levende huddyrkede vevsekvivalent til en temperatur ved eller under -110°C, ved en avkjølingsrate på -10°C pr minutt eller hurtigere for å produsere en vitrifisert dyrket vevsekvivalent; og (c) lagre nevnte vitrifiserte dyrkede vevsekvivalent ved en temperatur på -110°C eller
lavere for å produsere en lagret dyrket vevsekvivalent,
hvor en eller flere medlemmer av nevnte serier av cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger ifølge trinn (a) som øker i konsentrasjon og reduseres i temperatur inneholdende den nedsenkede dyrkede vevsekvivalent agiteres under betingelser tilstrekkelig for å oppnå effektiv penetrering av nevnte cryobeskyttelsesmiddeloppløsning i den nevnte dyrkede vevsekvivalent før lagring.
Videre angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for vitrifisering av en dyrket vevsekvivalent, kjenntegnet ved å: (a) nedsenke nevnte dyrkede vevsekvivalent i en serie av
cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger som øker i konsentrasjon og reduseres i temperatur for å produsere en cryobeskyttet dyrket vevsekvivalent ved en sluttemperatur på fra -10°C til -30°C. (b) avkjøling av nevnte cryobeskyttede dyrkede vevsekvivalent til en temperatur ved eller under -110°C ved en avkjølingsrate på -10°C pr minutt eller hurtigere for å produsere en vitrifisert dyrket vevsekvivalent; og (c) lagre nevnte vitrifisert dyrkede vevsekvivalent ved en temperatur på -110°C eller
lavere for å produsere en lagret dyrket vevsekvivalent,
hvor en eller flere medlemmer av nevnte serier av cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger ifølge trinn (a) med økning i konsentrasjon og reduksjon i temperatur inneholdende det nedsenkede dyrkede vevsekvivalentet agiteres under betingelser som er tilstrekkelige for å oppnå effektiv penetrering av nevnte cryobeskyttelsesmiddeloppløsning i den nevnte dyrkede vevsekvivalent før lagring.
Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for vitrifisering av en dyrket vevsekvivalent, kjennetegnet ved å:
(a) nedsenke nevnte dyrkede vevsekvivalent i en første
cryobeskyttelsesmiddeloppløsning som har en konsentrasjon på fra 15% til 35% cryobeskyttelsesmiddel i basismedium ved romtemperatur i en tidsperiode på fra 10 til 20 minutter for å produsere en første cryobeskyttet dyrket vevsekvivalent; (b) nedsenke nevnte første cryobeskyttede dyrkede vevsekvivalent ifølge trinn (a) i en andre cryobeskyttelsesmiddeloppløsning som har en konsentrasjon på fra 40% til 60% cryobeskyttelsesmiddel i basismedium ved en temperatur på fra 10°C til -2°C i en tidsperiode på fra 10 til 20 minutter for å produsere en andre cryobeskyttet dyrket vevsekvivalent; (c) til slutt nedsenke nevnte andre cryobeskyttede dyrkede vevsekvivalentet ifølge trinn (b) i en tredje cryobeskyttelsesmiddeloppløsning som har en konsentrasjon på 100% cryobeskyttelsesmiddel ved en temperatur på fra -10°C til -30°C i en tidsperiode på fra 10 til 20 minutter for å produsere en tredje cryobeskyttet dyrket vevsekvivalent; (d) avkjøle nevnte tredje cryobeskyttede dyrkede vevsekvivalent ifølge trinn (c) til en temperatur ved eller under -110°C ved en avkjølingsrate på -10°C pr minutt eller hurtigere for å produsere en vitrifisert dyrket vevsekvivalent; og (e) lagre nevnte vitrifiserte dyrkede vevsekvivalent ved en temperatur ved eller under -
110°C for å produsere en lagret dyrket vevsekvivalent,
hvori nevnte dyrkede vevsekvivalent fra minst trinn (c) og nevnte cryobeskyttelsesmiddeloppløsning agiters under betingelser som er tilstrekkelig for å oppnå effektiv penetrering av nevnte cryobeskyttelsesmiddeloppløsning inn i nevnte dyrkede vevsekvivalent.
Foreliggende cryokonserveringsmetode krever nedsenking av den dyrkede vevsekvivalent i cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger i en tidsperiode under betingelser som er tilstrekkelig for å muliggjøre ekvilibrering av cellene med cryobeskyttelsesmiddelet.
Dyrket vevsekvivalent nedsenkes i en gradert serie av
cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger med økende konsentrasjon og reduserende temperatur. Full styrke (100% konsentrasjon) cryobeskyttelsesmiddeloppløsning fortynnes med et basismedium for å produsere en serie av styrker med lavere konsentrasjon. Egnet basismedium innbefatter et hvilket som helst kjent pattedyrcelledyrkningsmedium anvendt av fagfolk innenfor dette området, og inkluderer
for eksempel Dulbeccos modifiserte Eagles medium. Før nedsenkingen blir serien av cryobeskyttelsesmiddeloppløsningene foravkjølt. Den dyrkede vevsekvivalent nedsenkes først i en cryobeskyttelsesmiddeloppløsning med konsentrasjon fra 15% til 35%, mer foretrukket 25% konsentrasjon, ved 22° til 25°C, mer foretrukket er ved romtemperatur. Deretter nedsenkes den dyrkede vevsekvivalentet i en 40% til 60% konsentrasjon cryobeskyttelsesmiddeloppløsning, mere foretrukket 50% konsentrasjon, ved 10° til -2°C, mer foretrukket ved 4°C. Til slutt blir den dyrkede vevsekvivalent nedsenket i en 100% konsentrasjon av cryobeskyttelsesmiddeloppløsning ved -10° til -30°C, fortrinnsvis -20°C. For hver av disse nedsenkningene blir den dyrkede vevsekvivalent nedsenket i den spesifikke oppløsningen i en tidsperiode på fra omtrent 10 til omtrent 20 minutter, mere foretrukket i omtrent 15 minutter. Overskudd av cryobeskyttelsesmiddeloppløsning fra hvert nedsenkningstrinn fjernes før tilsetning av en kaldere cryobeskyttelsesmiddeloppløsning med høyere konsentrasjon.
I løpet av et hvilket som helst av nedsenkningstrinnene, fortrinnsvis ved siste nedsenkningstrinn ved anvendelse av 100% konsentrasjon av
cryobeskyttelesmiddeloppløsning, agiteres den dyrkede vevsekvivalent i cryobeskyttelsesmiddeloppløsningen i en tidsperiode som er tilstrekkelig for å muliggjøre effektiv gjenomtrengning av cryobeskyttelsesmiddelet inn i den dyrkede vevsekvivalent. Fagfolk innenfor dette området kan lett bestemme egnede tidslengder nødvendig for agitering for å oppnå penetrering av det dyrkede vev basert på faktorer som for eksempel innbefatter, type av dyrket vevsekvivalent, mengde og sammensetning av cryokonserveringsoppløsningen, og kraften dannet i løpet av agitasjon. Agitasjonen blir fortrinnsvis utført i en tidsperiode på fra omtrent 10 til 20 minutter. En slik agitasjon blir fortrinnsvis utført ved anvendelse av et konvensjonelt ristefat.
Etter siste nedsenkningstrinn avkjøles den dyrkede vevsekvivalent og cryobeskyttelsesmiddeloppløsningen til minst omtrent -140°C til omtrent -180°C. Avkjølningsraten er fortrinnsvis fra omtrent -10°C pr minutt til omtrent -30°C pr minutt, mer foretrukket fra omtrent -15°C pr minutt til omtrent -20°C pr minutt. Avkjølingen kan oppnås ved anvendelse av en avkjølningsinnretning, inkludert for eksempel, en kommersiell programerbar cellefryser som kan programmeres til en temperatur på fra
-110°C til -196°C, mer foretrukket fra -140°C til -180°C.
Resulterende cryokonserverte dyrkede vevsekvivalenter lagres deretter for eksempel i en pose eller en plastbeholder, ved eller under glassovergangstemperaturen på omtrent -110°C. Den perfunderte dyrkede vevsekvivalent vakuumforsegles i en plastpose før frysing. Det er ønskelig å vakuumforsegle vevsekvivalenten på grunn av at denne prosedyren muliggjør hurtig tining av materialet etter nedsenkning i et 37°C vannbad. Vakuumforsegling muliggjør at den dyrkede vevsekvivalent lagres og tint under sterile betingelser og fremmer hurtig varmeoverføring i løpet av frysing og tines. Den cryokonserverte dyrkede vevsekvivalent kan vakuumforsegles ved anvendelse av konvensjonelt utstyr og hensiktsmessige plastposer som begge er lett tilgjengelige.
III. TINING AV DEN FRYSTE CRYOKONSERVERTE DYRKEDE
VEVSEKVIVALENT
Fryst dyrket vevsekvivalent tines ved oppvarming derav ved en høy rate med temperaturøkning slik at vevet tines i løpet av fra 1 til 3 sekunder. Egnede metoder for vanning av fryst dyrket vevsekvivalent ved en ekstrem høy tiningsrate innbefatter varming ved anvendelse av et vannbad eller varming ved anvendelse av induksjonsoppvarming. Den fryste dyrkede vevsekvivalent tines fortrinnsvis ved nedsenking av den vakuumforseglede fryste dyrkede vevsekvivalent i et vannbad ved en temperatur på 37°C.
På grunn av den toksiske egenskap til cryobeskyttelsesmidlene fjernes cryobeskyttelsesmiddeloppløsningen fra det tinte dyrkede vevet i løpet av omtrent 15 minutter etter tining, fortrinnsvis så fort som mulig etter tining, for å unngå å skade levedyktigheten til det dyrkede vevet. Når det dyrkede vevet er tint erstattes cryobeskyttelsesmiddeloppløsningen med en isoton bufferoppløsning ved fysiologisk pH (omtrent 6.8 til 7.4 pH), som fortrinnsvis innbefatter 0.5 til 2.0 M sukrose.
En dyrket vevsekvivalent dannet som beskrevet ovenfor kan anvendes for transplantasjon eller implantasjon in vivo eller for screening av forbindelser in vitro.
Følgende eksempler beskriver ytterligere materialer og metoder anvendt for utførelse av oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Etter å ha forsøkt flere rutinemessige kjente protokoller for cryokonservering av dyrket vevsekvivalent, levende hudekvivalent (LSE), uten vellykket forbedring av levedyktigheten ble det avklart at det høye nivået av epidermal organisering i LSE begrenset evnen til å oppnå cryokonservering ved anvendelse av konvensjonelle metoder. Ved cryokonservering virket LSE mer likt vev enn en enkeltcellesuspensjon. Oppfinnerene har utforsket cryokonserveringsprotokoller basert på det tidligere konseptet med vitrifikasjon.
I. FRYSING AV LSE VED KLASSISK VITRIFIKASJON
Vitrifikajson er en prosess for cryokonservering som anvender økende viskositet under avkjøling av en væske for å oppnå glassdannende fase for stivning i stedenfor dannelse av krystaller. Vitrifikasjon kan oppnås ved å senke temperaturen ved en rate som er hurtig nok til å forhindre at iskrystalle dannes, ved anvendelse av konvensjonelle fryseoppløsninger, eller ved økning av nivået av cryobeskyttelsesmidler til et nivå som er tilstrekkelig for å forhindre at iskrystaller dannes ved konvensjonelle fryserater.
Det antas at protokoller for sakte frysing, vanligvis ved anvendelse av en avkjølingsrate på l°C/minutt og en 5% til 20% konsentrasjon av cryobeskyttelsesmiddel, oppnår intracellulær vitrifikasjon slik at enkeltcellesuspensjoner har evne til å overleve kontrollert ekstracellulær iskrystalldannelse. (Hubel et al., "Intracellular lee Formation during the Freezing of Hepatocytes Cultured in a Double Collagen Gel." Biotechnol Prog., 7:554-559 (1991). Det er nå bestemt at komplekst, flerlagsvev med heterogene fysiske egenskaper og forskjellige celletyper i lagene skades ved fremgangsmåter for sakte frysing ved isdannelse. Den tredimensjonale strukturen til en dyrket vevsekvivalent, som definert heri, gjør den mottagelig for intracellulær isdannelse og ekstracellulær isdannelse.
Den første vitrifikasjonsoppløsningen som testes var ikke vellykket og hadde et meget høyt variasjonsnivå. Denne oppløsningen var modifisert VS1 (Fahy, et al., supra). Den modifiserte VSl-oppløsningen anvendt i disse testene inneholdt 20.5% dimetylsulfoksid (DMSO), 15.5% acetamid, 10.0% propylenglykol, 6.0% polyetylenglykol (PEG) i en basis av 0.3% nyfødt kalveserum (NCS) i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM). VS1 ble modifisert til å innbefatte anvendelse av DMEM som et basismedium og anvendelse av NCS i stedenfor serumalbumin.
Fortynninger av fullstyrke modifisert VS 1-oppløsning ble dannet med basismedium for å oppnå oppløsninger med styrke på 50% og 25%. Den trinnvis tilsetningsprotokollen var som følger: LSE ble nedsenket i 25% VS1 ved romtemperatur i 15 minutter og deretter erstattet med 50% VS1 ved 4.0°C i 15 minutter og deretter erstattet med 100% VS1 ved -20°C i 15 til 20 minutter. LSI ble deretter plassert inn i et -180°C holdekammer i dampfasen til flytende nitrogen helt til det nådde denne temperaturen (omtrent 15 minutter). LSE ble deretter lagret ved omtrent -130°C i tidspunkter som varierer fra 30 minutter til flere dager.
Tiningsprotokollen besto av nedsenkning av vitrifisert LSE inn i 50% VS1 + 1 molar (M) sukrose ved 4.0°C i 15 minutter og deretter erstatning av oppløsningen med 25% VS1 + IM sukrose ved romtemperatur i 15 minutter og deretter erstatning av oppløsningen med DMEM + IM sukrose ved romtemperatur i 15 minutter, etterfulgt av DMEM ved romtemperatur i 15 minutter.
Denne protokollen oppnådde levedyktighet (som bestemt ved histologisk undersøkelse) bare ved kantene av LSE med et større midtområde med ikke-levedyktige epidermale celler. Det ble antatt at grunnen til manglende levedyktighet var at cryobeskyttelsesmidlene ikke effektivt gjennomtrengte LSE. Denne mangelen på perfusjon av cryobeskyttelsesmiddel skyldtes den økende viskositeten til cryobeskyttelsesmiddeloppløsningen når temperaturen var redusert. Ved -20°C er cryobeskyttelsesmiddelet fortsatt en væske, men den er meget viskøs.
II. FRYSING AV LSE MED CRYOKONSERVERINGSMETODEN
A. For å øke levedyktigheten ble det foregående gjentatt ved anvendelse av foreliggende metode hvor LSE ble sentrifugert i 5 til 15 minutter i løpet av det endelige eller 100% VS1 perfusjonstrinnet. Denne metoden resulterte i en betydelig forbedring med nesten 100% levedyktighet, målt ifølge MTT konvertering. Gay et al., "The Living Skin Equivalent as a Model In Vitro for Ranking tje Toxic Potential of Dermal Irritants", Toxic. in Vitro, 6:303-315 (1992).
Morfologisk ble det observert liten eller ingen forskjell mellom fryst og ikke-fryst LSE. Til tross for at det så ut til å være en viss levedyktighet blant prøvene, så ble det registrert at når en prøve ikke ble riktig vitrifisert viste det morfologiske utseendet etter tining totalt ikke-levedyktige celler. På grunn av at oppskalering ved sentrifugering er upraktisk ble agitering på en risteplattform i en -20°C fryser undersøkt som et middel for å fremme perfusjonen. Denne typen agitasjon ga resultater som ligner de som ble observert ved anvendelse av sentrifugering som agiteringsmetode.
B. I dette eksperimentet ble en vitrifikasjonsoppløsning som ikke inneholdt den potensielle carcinogene forbindelse, acetamid undersøkt (W.F. Rall, Cryobiology, 24:387-404 (1987)). En ny vitrifikasjonsoppløsning inneholdende 65% glycerol i DMEM + 0.3% NCS (full styrke) ble vurdert. Både den trinnvise tilsetningsprosedyren og tineprotokollen var de samme som beskrevet ovenfor med modifisert VS1: Fortynninger av fullstyrkeoppløsning ble dannet med basismedium for å oppnå 50% og 25% oppløsningsstyrker. Den trinnvise tilsetningsprotokollen var som følger: LSE ble nedsenket i 25% oppløsning ved romtemperatur i 15 minutter, deretter erstattet med 50% oppløsning ved 4.0°C i 15 minutter, og deretter erstattet med 100% oppløsning ved
-20°C i 15 til 20 minutter. LSE ble deretter plassert inn i en -180°C oppbevaringsbeholder i dampfasen til flytende nitrogen helt til det hadde nådd denne temperaturen (omtrent 15 minutter). LSE ble deretter lagret ved omtrent -30°C i tidspunkter varierende fra 30 minutter til flere dager. For å tine ble vitrifisert LSE nedsenket inn i 50% oppløsning + 1 molar (M) sukrose ved 4.0°C i 15 minutter og deretter ble oppløsningen erstattet med 25% oppløsning + 1 M sukrose ved romtemperatur i 15 minutter, og deretter ble oppløsningen erstattet med DMEM + 1 M
sukrose ved romtemperatur i 15 minutter, etterfulgt av DMEM ved romtemperatur i 15 minutter.
Denne protokollen ga betraktelig høyere nivåer av levedyktighet enn med modifisert VS1. Denne oppløsningen reduserte også variasjonsnivået. Cryokonserverte LSE var vedvarende mer levedyktige. Morfologisk var det ingen tilsynelatende forskjell i utseende mellom fryst og ikke-fryst LSE som vist i figur 1. Levedyktigheten ble vurdert å være tilnærmet 100% ved histologisk undersøkelse og ved MTT-analyser som vist i figur 2. Toksisiteten til glycerolcryobeskyttelsesmiddel under agitasjonen ble testet ved forskjellige eksponeirngstider fra 5 minutter til 40 minutter, med foretrukket område for minimal toksisitet ved 10 til 15 minutter. C. I dette eksperimentet ble større størrelser av LSE vurdert. Det ble observert at variasjonen i levedyktighet kunne reduseres ved å øke overflatearealet av LSE i nær kontakt med oppvarmingsoppløsningen under tineprosedyren. Dette ble oppnådd ved å tlage et vakuum innenfor en beskyttende pose inneholdende perfusert LSE før det endelige frysetrinnet, for dermed å minimalisere isolering av luft mellom LSE og omgivende beskyttende pose. Denne prosedyren resulterte i en mye høyere oppvarmingsrate av vevet og økte den cellulære levedyktigheten til LSE, spesielt fibroblastene. Fibroblastene så ut til å være mer mottagelige for devitrifikasjon (dannelse av is i løpet av oppvarming) enn epidermale celler.
Tinte LSE ble inkubert en dag i medium ved 37°C før levedyktigheten til hvert lag ble vurdert ved anvendelse av MTT-levedyktighetsanalyse og rutinemessig histologi. LSE hurtig fryst ifølge denne metoden og anvendelse av 655 glycerol viste god levedyktighet 1 dag etter tining som vist i fig. 2(A). På grunn av at celletettheten i epidermale og dermale lag var meget forskjellige, ble de dermale lag (DE) i fryst LSE også målt separat (fig. 2(B)). Begge lagene viste god levedyktighet og opprettholdelse av morfologi som vist i figur 3.
Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av MTT-analyse, en kolorimetrisk MTT-omdanningsanalyse utviklet for å måle cellulær vekst og levedyktighet. Denne analysen er beskrevet i detalj i Gay et al., "The Living Skin Equivalent as a Model In Vitro, 6:303-315 (1992). Metabolisk reduksjon av oppløselig tetrazoliumsalt til et blått formazan presipitat er avhengig av tilstedeværelse av levedyktige celler med intakt mitochondirefunksjon. Denne analysen anvendes for å kvantifisere cytotoksisiteten i forskjellige celletyper, inkludert dyrkede humane keratinocyter. 1.5 ml LSE analysemedium inneholdende 0.33 mg MTT/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ble tilsatt hver brønn. LSE ble inkubert i MTT-inneholdende analysemedium i 3-4 timer. Ved slutten av omdanningsperioden ble den eksponerte delen av LSE tatt ut ved anvendelse av et 8 mm diameter hudbiopsistempel og ekstrahert i 2-24 timer ved romtemperatur i 0.3 ml isopropanol, surgjort med 0.04 N HC1. Etter endt ekstraheringsperiode ble 0.2 ml av hvert ekstrakt overført til en brønn av en 96-brønns skål og absorbansen ved 570 nm ble avlest på en plateavleser (Dynatech), med isopropanolekstraheringsmedium som en blank. For LSE er total MTT omdanning summen av kombinerte metaboliske aktiviteter til fibroblaster og keratinocyter i LSE. Ved å fjerne epidermis fira dermis etter MTT farging ble det relative bidraget til fibroblastene i dermalt lag og keratinocyter i epidermis bestemt.
III. PODNING AV LSE PÅ ATYMISKE MUS
Frisk tint LSE etter cryokonservering som beskrevet ovenfor, uten etter-tiningsinkubasjon, ble podet på atymiske mus for å bestemme eventuelle forandringer i podningsevne, dvs. eventuell forandring i podningsrate, tegn på korttids skade eller ved hvilken som helst forandring i langtidsvedvarenhet.
Morfologien til kontroll ikke-fryst, ikke-podet LSE er vist i figur 3(A).
Etter-podningsundersøkelser av tinte LSE etter 6 dager og 30 dager er vist i henholdsvis figurene 3B og 3C. Seks dagers podninger viste ingen tegn på degenerasjon eller fokale nekroser. Tredve dagers podninger viste sammenlignbar epidermal vedvarenhet, og vaskularisering av den dermale matriks. Det var i tillegg ingen forskjell mellom kontroll, ikke-fryst LSE i podningen og tint LSE i podningen som indikert ved morfologiske sammenligninger (data ikke vist).
Claims (17)
1.
Fremgangsmåte for vitrifisering av en dyrket vevsekvivalent, karakterisert ved å: (a) nedsenke nevnte dyrkede vevsekvivalent i en serie av
cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger ved økning i konsentrasjon og reduksjon i temperatur for å produsere en cryobeskyttet dyrket vevsekvivalent: (b) avkjøle nevnte cryobeskyttede levende huddyrkede vevsekvivalent til en temperatur ved eller under -110°C, ved en avkjølingsrate på -10°C pr minutt eller hurtigere for å produsere en vitrifisert dyrket vevsekvivalent; og (c) lagre nevnte vitrifiserte dyrkede vevsekvivalent ved en temperatur på -110°C eller
lavere for å produsere en lagret dyrket vevsekvivalent,
hvor en eller flere medlemmer av nevnte serier av cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger ifølge trinn (a) som øker i konsentrasjon og reduseres i temperatur inneholdende den nedsenkede dyrkede vevsekvivalent agiteres under betingelser tilstrekkelig for å oppnå effektiv penetrering av nevnte cryobeslcyttelsesmiddeloppløsning i den nevnte dyrkede vevsekvivalent før lagring.
2.
Fremgangsmåte for vitrifisering av en dyrket vevsekvivalent, karakterisert ved å: (a) nedsenke nevnte dyrkede vevsekvivalent i en serie av
cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger som øker i konsentrasjon og reduseres i temperatur for å produsere en cryobeskyttet dyrket vevsekvivalent ved en sluttemperatur på fra -10°C til -30°C. (b) avkjøling av nevnte cryobeskyttede dyrkede vevsekvivalent til en temperatur ved eller under -110°C ved en avkjølingsrate på -10°C pr minutt eller hurtigere for å produsere en vitrifisert dyrket vevsekvivalent; og (c) lagre nevnte vitrifisert dyrkede vevsekvivalent ved en temperatur på -110°C eller
lavere for å produsere en lagret dyrket vevsekvivalent,
hvor en eller flere medlemmer av nevnte serier av cryobeskyttelsesmiddeloppløsninger ifølge trinn (a) med økning i konsentrasjon og reduksjon i temperatur inneholdende det nedsenkede dyrkede vevsekvivalent agiteres under betingelser som er tilstrekkelige for å oppnå effektiv penetrering av nevnte cryobeskyttelsesmiddeloppløsning i den nevnte dyrkede vevsekvivalent før lagring.
3.
Fremgangsmåte for vitrifisering av en dyrket vevsekvivalent, karakterisert ved å: (a) nedsenke nevnte dyrkede vevsekvivalent i en første
cryobeskyttelsesmiddeloppløsning som har en konsentrasjon på fra 15% til 35% cryobeskyttelsesmiddel i basismedium ved romtemperatur i en tidsperiode på fra 10 til 20 minutter for å produsere en første cryobeskyttet dyrket vevsekvivalent; (b) nedsenke nevnte første cryobeskyttede dyrkede vevsekvivalent ifølge trinn (a) i en andre cryobeskyttelsesmiddeloppløsning som har en konsentrasjon på fra 40% til 60% cryobeskyttelsesmiddel i basismedium ved en temperatur på fra 10°C til -2°C i en tidsperiode på fra 10 til 20 minutter for å produsere en andre cryobeskyttet dyrket vevsekvivalent; (c) til slutt nedsenke nevnte andre cryobeskyttede dyrkede vevsekvivalentet ifølge trinn (b) i en tredje cryobeskyttelsesmiddeloppløsning som har en konsentrasjon på 100% cryobeskyttelsesmiddel ved en temperatur på fra -10°C til -30°C i en tidsperiode på fra 10 til 20 minutter for å produsere en tredje cryobeskyttet dyrket vevsekvivalent; (d) avkjøle nevnte tredje cryobeskyttede dyrkede vevsekvivalent ifølge trinn (c) til en temperatur ved eller under -110°C ved en avkjølingsrate på -10°C pr minutt eller hurtigere for å produsere en vitrifisert dyrket vevsekvivalent; og (e) lagre nevnte vitrifiserte dyrkede vevsekvivalent ved en temperatur ved eller under -
110°C for å produsere en lagret dyrket vevsekvivalent,
hvori nevnte dyrkede vevsekvivalent fra minst trinn (c) og nevnte cryobeskyttelsesmiddeloppløsning agiteres under betingelser som er tilstrekkelig for å oppnå effektiv penetrering av nevnte cryobeskyttelsesmiddeloppløsning i nevnte dyrkede vevsekvivalent.
4.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at nevnte cryobeskyttelsesmiddel oppløsning omfatter en eller flere midler valgt fra gruppen bestående av: et cellepenetrerende glassdannende middel og et ikke-cellepenetrerende glassdannende middel.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte ikke-celle-penetrerende, glassdannende middel er en høy molekylvektsform av et komplekst karbohydrat omfattende en eller flere medlemmer valgt fra gruppen bestående av: chondroitinsulfat, polyvinylpyrrolidon og polyetylenglykol.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte ikke-cellepenetrerende glassdannende middel er en hetastivelse.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte hetastivelse er hydroksyetylstivelse.
8.
Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte cellepenetrerende glassdannende middel velges fra gruppen bestående av: glycerol, propylenglykol, etylenglykol og dimetylsulfoksid.
9.
Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte cellepenetrerende glassdannende middel er glycerol.
10.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at nevnte lagrede dyrkede vevsekvivalent ifølge trinn (c) lagres i flytende nitrogen ved en temperatur på -196°C.
11.
Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte cryobeskyttelsesmiddel har en konsentrasjon på 100% som omfatter et medlem valgt fra gruppen bestående av: 65% glycerol i Dulbeccos modifiserte Eagles medium + 0.3% nyfødt kalveserum; 20.5% dimetylsulfoksid + 15.5% acetamid + 10% propylenglykol + 6% polyetylenglykol i en basis på 0.3% nyfødt kalveserum i Dulbeccos modifiserte Eagles medium, i det nevnte cryobeskyttelsesmiddeloppløsning som har en konsentrasjon på 100% fortynnes med basismediet for å produsere cryobeskyttelsesmiddeloppløsningene ifølge trinn (a) og trinn (b).
12.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at den videre omfatter: tining av nevnte lagrede dyrkede vevsekvivalent i en rate som er effektiv til å produsere en tint levedyktig dyrket vevsekvivalent.
13.
Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at den videre omfatter: skylling av nevnte tinte levedyktige cryokonserverte dyrkede vevsekvivalent med en isoton oppløsning buffret ved fysiologisk pH.
14.
Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte isotone oppløsning omfatter 0,5 til 2,0 M sukrose.
15.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at nevnte avkjølingsrate er fra -10°C pr minutt til -30°C pr minutt.
16.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at nevnte dyrkede vevsekvivalent blir sterilt vakuumforseglet i en beskyttende pose før nevnte avkjølingstrinn.
17.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at nevnte dyrkede vevsekvivalent er en levende hudekvivalent eller hornhinnevevsekvivalent.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/121,377 US5518878A (en) | 1993-09-15 | 1993-09-15 | Cryopreservation of cultured skin or cornea equivalents with agitation |
| PCT/US1994/010042 WO1995007611A1 (en) | 1993-09-15 | 1994-09-14 | Cryopreservation of cultured tissue equivalents |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO961048L NO961048L (no) | 1996-03-14 |
| NO961048D0 NO961048D0 (no) | 1996-03-14 |
| NO311631B1 true NO311631B1 (no) | 2001-12-27 |
Family
ID=22396314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19961048A NO311631B1 (no) | 1993-09-15 | 1996-03-14 | Cryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5518878A (no) |
| EP (1) | EP0719084B1 (no) |
| JP (1) | JPH09505032A (no) |
| KR (1) | KR100361357B1 (no) |
| AT (1) | ATE210373T1 (no) |
| AU (1) | AU683301B2 (no) |
| CA (1) | CA2182814C (no) |
| CY (1) | CY2364B1 (no) |
| DE (1) | DE69429436T2 (no) |
| DK (1) | DK0719084T3 (no) |
| ES (1) | ES2169734T3 (no) |
| FI (1) | FI113833B (no) |
| NO (1) | NO311631B1 (no) |
| NZ (1) | NZ273514A (no) |
| PT (1) | PT719084E (no) |
| WO (1) | WO1995007611A1 (no) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5723282A (en) * | 1991-07-08 | 1998-03-03 | The American National Red Cross | Method of preparing organs for vitrification |
| US5891617A (en) * | 1993-09-15 | 1999-04-06 | Organogenesis Inc. | Cryopreservation of harvested skin and cultured skin or cornea equivalents by slow freezing |
| DK0790767T3 (da) | 1994-11-09 | 2002-02-04 | Celadon Science Llc | Forbindinger til opheling af sår og fremgangsmåder til deres konservering |
| US20040002772A1 (en) * | 1995-04-28 | 2004-01-01 | Organogenesis, Inc. | Tissue equivalents with perforations for improved integration to host tissues and methods for producing perforated tissue equivalents |
| US5689961A (en) | 1996-01-30 | 1997-11-25 | Organogenesis Inc. | Ice seeding apparatus for cryopreservation systems |
| US6630001B2 (en) | 1998-06-24 | 2003-10-07 | International Heart Institute Of Montana Foundation | Compliant dehyrated tissue for implantation and process of making the same |
| AU6424799A (en) * | 1998-10-14 | 2000-05-01 | Katrina T. Forest | Method for vitrification of a biological specimen |
| AU2004200933B2 (en) * | 1998-10-14 | 2005-08-11 | Katrina T Forest | Method for vitrification of a biological specimen |
| US6403376B1 (en) * | 1998-11-16 | 2002-06-11 | General Hospital Corporation | Ultra rapid freezing for cell cryopreservation |
| US6300130B1 (en) * | 1998-11-16 | 2001-10-09 | The General Hospital Corporation And University Of Massachusetts | Ultra rapid freezing for cell cryopreservation |
| BR9915476A (pt) | 1998-11-19 | 2002-01-02 | Organogenesis Inc | Construtos de tecidos feitos por bioengenharia e métodos para a sua produção e utilização |
| US6358739B1 (en) | 1999-04-12 | 2002-03-19 | Modex Therapeutiques, S.A. | Transiently immortalized cells |
| US6194137B1 (en) * | 1999-04-13 | 2001-02-27 | Organ Recovery Systems, Inc. | Method of cryopreservation of blood vessels by vitrification |
| US6352708B1 (en) | 1999-10-14 | 2002-03-05 | The International Heart Institute Of Montana Foundation | Solution and method for treating autologous tissue for implant operation |
| US6878543B1 (en) | 1999-10-25 | 2005-04-12 | Nsgene Sa | Cultures of GFAP+ nestin+ cells that differentiate to neurons |
| KR20010008306A (ko) * | 2000-11-22 | 2001-02-05 | 김진경 | 저온처리 후 조직 배양 방법 |
| DE10061968A1 (de) * | 2000-12-13 | 2002-06-20 | Friedrich Hoffmann | Verfahren und Vorrichtung zum Einfrieren von Hornhautgewebe |
| JP2004520828A (ja) | 2000-12-27 | 2004-07-15 | オーテック・インターナショナル，インコーポレイテッド | 凍結保存された複合生体構築物の製造方法および該方法から得られる製造物 |
| DE10151296A1 (de) | 2001-10-17 | 2003-04-30 | Boehringer Ingelheim Pharma | Keratinozyten verwendbar als biologisch aktive Substanz bei der Behandlung von Wunden |
| US20030096412A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-05-22 | Cassell Allan J. | Method of preparing biological materials for cryopreservation using pre-chilled protectant |
| PL397820A1 (pl) | 2002-05-16 | 2012-07-16 | Absorber Ab | Sposób diagnozowania choroby oraz sposób określenia skuteczności leczenia lub oceny prognozy choroby związanej z odpornością lub naczyniowej u osobnika |
| JP5100078B2 (ja) | 2006-10-05 | 2012-12-19 | 株式会社セルバンク | 組織由来細胞の凍結保存方法 |
| CN101939631A (zh) * | 2008-01-17 | 2011-01-05 | 库克泌尿科学公司万斯产品公司 | 用于玻璃化的快速冷却设备 |
| CN102438445B (zh) * | 2009-02-23 | 2014-12-10 | 细胞与组织系统股份有限公司 | 组织的无冰低温贮藏法 |
| US10233420B2 (en) | 2010-09-01 | 2019-03-19 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods of recellularizing a tissue or organ for improved transplantability |
| JP6012164B2 (ja) * | 2011-11-25 | 2016-10-25 | 住友化学株式会社 | 多能性幹細胞由来の組織の凍結保存方法 |
| JP5915977B2 (ja) * | 2011-11-29 | 2016-05-11 | 学校法人明治大学 | 凍結細胞シートの製造方法 |
| JP2015518843A (ja) | 2012-05-25 | 2015-07-06 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 創傷、例えば、糖尿病性創傷の処置における、ｄｐｐ−４阻害剤と組み合わせてもよい生物活性物質としてのケラチン生成細胞の使用 |
| TW201422155A (zh) * | 2012-07-06 | 2014-06-16 | Arigos Biomedical Inc | 以氣體灌注快速冷卻與升溫預防玻璃質化組織受熱-力破壞的方法與裝置 |
| ES2671932T3 (es) | 2012-08-01 | 2018-06-11 | United Therapeutics Corporation | Tratamiento de hipertensión arterial pulmonar con células madre mesenquimatosas |
| ES2869701T3 (es) | 2012-08-01 | 2021-10-25 | United Therapeutics Corp | Tratamiento de hipertensión arterial pulmonar con células progenitoras endoteliales tratadas con prostaciclina |
| KR101480806B1 (ko) | 2012-09-19 | 2015-01-09 | 한국생산기술연구원 | 스캐폴드를 이용한 세포 또는 조직 동결 방법, 및 세포 또는 조직 동결용 키트 |
| ES2697573T3 (es) | 2013-01-09 | 2019-01-25 | United Therapeutics Corp | Tratamiento de la vasculopatía con prostaciclina y células madre mesenquimatosas |
| WO2014160000A1 (en) * | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Stratatech Corporation | Cryopreservation of viable human skin substitutes |
| WO2015000972A1 (en) * | 2013-07-02 | 2015-01-08 | Sg Austria Pte Ltd | A method of freeze-drying encapsulated cells, freeze-dried encapsulated cells, compositions containing freeze-dried encapsulated cells and uses of such cells and compositions |
| CN107635592A (zh) | 2015-03-26 | 2018-01-26 | 米罗马特里克斯医疗公司 | 充气的去细胞化胞外基质 |
| KR102606101B1 (ko) | 2016-10-24 | 2023-11-27 | 유나이티드 쎄러퓨틱스 코포레이션 | 트레프로스티닐에 의한 msc 면역조절 특성의 향상 |
| CN113016776A (zh) * | 2019-12-24 | 2021-06-25 | 上海明悦医疗科技有限公司 | 载体、抽真空装置与组织冻存系统 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4539716A (en) * | 1981-03-19 | 1985-09-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Fabrication of living blood vessels and glandular tissues |
| US4546500A (en) * | 1981-05-08 | 1985-10-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Fabrication of living blood vessels and glandular tissues |
| US4485096A (en) * | 1982-02-26 | 1984-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Tissue-equivalent and method for preparation thereof |
| US4485097A (en) * | 1982-05-26 | 1984-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Bone-equivalent and method for preparation thereof |
| US5084377A (en) * | 1984-09-19 | 1992-01-28 | Larry Rowan | Cryogenic suspension method |
| US4604346A (en) * | 1984-10-09 | 1986-08-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Skin-equivalent prepared by the use of punch biopsy |
| IT1207525B (it) * | 1987-06-23 | 1989-05-25 | Ist Naz Ric Sul Cancro | Metodo per la preservazione difogli trapiantabili di epitelio coltivato in vitro vitale. |
| US4837379A (en) * | 1988-06-02 | 1989-06-06 | Organogenesis Inc. | Fibrin-collagen tissue equivalents and methods for preparation thereof |
| US5145770A (en) * | 1990-06-04 | 1992-09-08 | Biosurface Technology, Inc. | Cryopreservation of cultured epithelial sheets |
-
1993
- 1993-09-15 US US08/121,377 patent/US5518878A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-09-14 WO PCT/US1994/010042 patent/WO1995007611A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-14 ES ES94927359T patent/ES2169734T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-14 AT AT94927359T patent/ATE210373T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-14 AU AU76831/94A patent/AU683301B2/en not_active Ceased
- 1994-09-14 PT PT94927359T patent/PT719084E/pt unknown
- 1994-09-14 JP JP7509235A patent/JPH09505032A/ja not_active Ceased
- 1994-09-14 EP EP94927359A patent/EP0719084B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-14 CA CA002182814A patent/CA2182814C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-14 NZ NZ273514A patent/NZ273514A/en unknown
- 1994-09-14 KR KR1019960701270A patent/KR100361357B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-09-14 DK DK94927359T patent/DK0719084T3/da active
- 1994-09-14 DE DE69429436T patent/DE69429436T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-03-11 FI FI961124A patent/FI113833B/fi not_active IP Right Cessation
- 1996-03-14 NO NO19961048A patent/NO311631B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-06-03 CY CY0300046A patent/CY2364B1/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CY2364B1 (en) | 2004-06-04 |
| NO961048L (no) | 1996-03-14 |
| DK0719084T3 (da) | 2002-04-08 |
| EP0719084A4 (en) | 1998-06-10 |
| EP0719084A1 (en) | 1996-07-03 |
| WO1995007611A1 (en) | 1995-03-23 |
| EP0719084B1 (en) | 2001-12-12 |
| NZ273514A (en) | 1997-10-24 |
| DE69429436T2 (de) | 2002-07-18 |
| KR960704461A (ko) | 1996-10-09 |
| JPH09505032A (ja) | 1997-05-20 |
| CA2182814A1 (en) | 1995-03-23 |
| US5518878A (en) | 1996-05-21 |
| KR100361357B1 (ko) | 2004-12-30 |
| NO961048D0 (no) | 1996-03-14 |
| FI961124A0 (fi) | 1996-03-11 |
| DE69429436D1 (de) | 2002-01-24 |
| FI113833B (fi) | 2004-06-30 |
| AU683301B2 (en) | 1997-11-06 |
| PT719084E (pt) | 2002-05-31 |
| CA2182814C (en) | 1999-02-02 |
| AU7683194A (en) | 1995-04-03 |
| FI961124A (fi) | 1996-03-15 |
| ATE210373T1 (de) | 2001-12-15 |
| ES2169734T3 (es) | 2002-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO311631B1 (no) | Cryokonservering av dyrkede vevsekvivalenter | |
| US5891617A (en) | Cryopreservation of harvested skin and cultured skin or cornea equivalents by slow freezing | |
| EP0532670B1 (en) | Cryopreservation of cultured epithelial sheets | |
| CA1310588C (en) | Method for cryopreserving heart valves | |
| US5964096A (en) | Method and package design for cryopreservation and storage of cultured tissue equivalents | |
| CN111657267B (zh) | 一种用于软骨，肌腱，半月板保存的无冰晶冷冻保存液和冷冻方法 | |
| Han et al. | Engineering challenges in tissue preservation | |
| CA2210532C (en) | Method and package design for cryopreservation and storage of cultured tissue equivalents | |
| AU627436B2 (en) | Device and method for cryopreserving blood vessels | |
| NO883900L (no) | Fremgangsmaate ved cryopreservering av hjerteklaffer. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |