DE69024260T2

DE69024260T2 - Verfahren zur Revitalisierung von Zellen vor dem Einfrieren

Info

Publication number: DE69024260T2
Application number: DE69024260T
Authority: DE
Inventors: Kelvin G M Brockbank; John F Carpenter
Original assignee: Cryolife Inc
Current assignee: Artivion Inc
Priority date: 1989-04-26
Filing date: 1990-04-12
Publication date: 1996-06-27
Anticipated expiration: 2010-04-13
Also published as: CA2012757A1; EP0399647A1; DE69024260D1; ATE131686T1; JPH0368501A; ES2081927T3; GR3018876T3; EP0399647B1; US5424207A; US5171660A; JP2859925B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Revitalisierung von Zellen oder Geweben, wie beispielsweise jener, die durch Gefrieren haltbar für Lagerung bei ultrakalter Temperatur gemacht werden sollen. Somit können der Stoffwechselenergiezustand und die Gewebe- oder Zellfunktion konserviert und beim anschließenden Auftauen und bei der Transplantation maximiert werden.
Derzeitige medizinische Technologie gestattet die Verwendung mehrerer verschiedener Gewebetypen für Transplantation, um angeborene, krankheitsbedingte oder degenerative Defekte des Gewebes eines Rezipienten zu korrigieren. Einige Beispiele schließen menschliche Allotransplantat-Herzventile, Adern, Augenhornhäute, Knochenmark usw. ein. Forscher stimmten allgemein überein, daß frisches Gewebe verbesserte Leistung gegenüber altem oder totem Gewebe ergibt.
Menschliches Gewebe bleibt in vitro für kurze Zeitdauer lebensfähig, z. B. gewöhnlich weniger als zwei bis drei Tage. Lagerungsperioden von dieser begrenzten Dauer sind gewöhlich ungeeignet für die meisten Gewebetypen infolge der Komplexitäten bei der Gewährleistung des besten Zusammenpassens von Spender und Repizient (z. B. jenen Faktoren, wie relativer Größe eines Transplantats, menschlichen Leukozytenantigens und AB O-Blutgruppe) sowie wegen der Zeit, die erforderlich ist, um das Gewebe hinsichtlich Pathogenen zu testen. Folglich ist viel von dem verfügbaren Spendergewebe infolge des ernsthaften Verlustes an Zellenlebensfähigkeit über den Zeitablauf unbenutzt. Diese Nachteile können durch die lebensfähige Gefrierhaltbarmachung und ultrakalte Lagerung des Gewebes umgangen werden.
Ultrakalte Lagerung von Zellen und Geweben wurde nach der Entdeckung 1949 von Polge, Smith und Parks, daß Glycerin verwendet werden konnte, um Zellen gegen Beeinträchtigung infolge des Einfrierens zu schützen, möglich. Mit der Errungenschaft der Niedertemperaturbiologie suchten auf dem medizinischen und biologischen Gebiet Tätige bessere Wege, um die Lebensfähigkeit gefrorener Bänderzellen oder -gewebe zu behalten.
Es wurde über mehrere Methoden zum Gefrieren von Zellen und Zellanhäufungen berichtet. Beispielsweise beschreibt die US-Patentschrift Nr. 3 303 662 ein Verfahren zur Haltbarmachung von Zellen, das ein Gefrierschutzmittel im Gefrierverfahren benutzt.
Die Europäische Patentveröffentlichung Nr.0 296 475 A beschreibt ein Verfahren zum Haltbarmachen gezüchteter Epithelflächen durch Inkubieren der Flächen bei Raumtemperatur bis zu 15 min.
Die internationale Patentveröffentlichung WO 89/01 286 betrifft eine Vorrichtung zur Verwendung beim Haltbarmachen von Blutgefäßen durch Gefrieren. Inkubation wird für Sterilisierungszwecke verwendet.
Die Leistung eines gefrierkonservierten transplantierbaren Gewebes steht in direkter Wechselbeziehung zu der Lebensfähigkeit jenes Gewebes nach dem Auftauen. Ein Parameter, der eine Einschätzung der Zellenlebensfähigkeit von Gewebe liefert, ist der allgemeine Stoffwechselenergiezustand der Zellen. Damit transplantierte Zellen ihre kritische Rolle in dem Rezipienten spielen können, müssen diese Zellen genügende Stoffwechsel kapazität haben, um schlüsselenergieabhängige Prozesse durchzuführen. Beispielsweise ist ein solcher Prozeß, der von der Zellstoffwechselenergie abhängt, die Biosynthese von Proteinen. Außerdem ist im wesentlichen jede Zell-, Gewebe- oder Organfunktion letztlich von der Energie, die vom Zellstoffwechsel geliefert wird, abhängig.
Zellen, deren Stoffwechsel und Funktion nach dem Auftauen unterdrückt werden, können sich nicht genügend erholen, um den Transplantationsschock beim Spender zu ertragen, und somit nicht überleben.
Es gibt mehrere Stufen in der Handhabung von menschlichem Gewebe für Gefrierkonservierung, die den Stoffwechselenergiezustand senken und die energieabhängigen Funktionen der Zellen schwächen können. Die Zeit zwischen Tod und Entnahme des Gewebes (warme Ischemie) und die Zeit von der Entnahme bis zur Gefrierkonservierung (kalte Ischemie) sind von größtem Einfluß. Verlängerte warme und/oder kalte Ischemie führt zu Zellen, die ernsthaft verminderten Stoffwechsel und ernsthaft verminderte Funktionalität haben.
Gefrierkonservierung selbst scheint die Zellenergie und Stoffwechselkapazität zu reduzieren und energieabhängige Funktionen wenigstens minimal zu vermindern. Somit gibt es einen seit langem bestehenden Bedarf hinsichtlich eines Verfahrens zur Aufrechterhaltung der Gewebelebensfähigkeit nach der Implantation und zur Revitalisierung von Zellen im Gewebe nach der Entnahme, so daß sich die Zellen von den vorübergehenden Stoffwechselbeeinträchtigungen und dem Funktionsverlust, der durch warme und kalte Ischemie verursacht wird, im wesentlichen vollständig erholen. Die Erfindung erfüllt daher diesen seit langem bestehenden Bedarf hinsichtlich stark verbesserter Lebensfähigkeit und maximiert die Funktionskapazität gefrierkonservierter Zellen nach dem Auftauen und der Transplantation. Außerdem sind revitalisierte Zellen besser in der Lage, der Härte der Gefrierkonservierung zu widerstehen.
Derzeit werden Gewebe in Lösungen, wie Gewebekulturmedien, laktathaltige Ringerlösungen, Kochsalzlösungen oder Collins-Lösung auf nasses Eis für den Transport gelegt. Die Konzentration von in diesen Lösungen enthaltenen Verbindungen, die Zeitdauer, während der die Gewebe darin gehalten werden, und die Temperatur, bei welcher die Gewebe transportiert werden, können stark variieren. Infolge der kombinierten Wirkungen dieser Variablen und infolge von Veränderungen der Zeiten warmer und kalter Ischemie ist es schwierig, den Grad von Stoffwechsel- und Funktionsverminderung für ein bestimmtes Gewebe vorauszusagen. Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß das Verfahren den Stoffwechselzustand und damit die Kapazität, daß Gewebe nach der Transplantation funktionieren, selbst mit stark variierenden Graden von Stoffwechsel- und Funktionsunterdrückung verbessert.
Demnach haben wir jetzt gefunden, daß es möglich ist, ein Verfahren zur Revitalisierung von Zellen oder Geweben vor der Gefrierkonservierung,
ein Verfahren zur Verbesserung der Transplantationszellen-Lebensfähigkeit und-Funktionsfähigkeit nach dem Auftauen,
ein Verfahren zur Verbesserung der Fähigkeit gefrierkonservierten Gewebes oder solcher Zellen, nach dem Auftauen und Transplantieren zu überleben und zu funktionieren, und
ein Verfahren zur Zellrevitalisierung, das gleichzeitig mit anderen Verfahren, wie antibiotischer Sterilisation, die bei der Vorbereitung transplantierbaren Gewebes für Gefrierkonservierung erforderlich sein können, zu bekommen.
Nach einem Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Vitalität einer Zelle, die nach Gefrierkonservierung und Auftauen für eine Transplantation geeignet ist, wobei diese Zelle einer Periode warmer und/oder kalter Ischemie vor der Gefrierkonservierung unterzogen wird, indem man diese Zelle in einem Nährmedium vor dem Gefrieren und vor der Zugabe eines Gefrierschutzmittels bei einer Temperatur von 27 bis 42 ºC und während einer Zeitdauer von 5 min bis 24 h inkubiert, um die Vitalität dieser Zelle nach dem Auftauen zu maximieren, wobei, wenn die Zelle eine Blutgefäßzelle ist, die Inkubation anders als bei 37 ºC während 4 h mit einem Nährmedium, das Delbecco's Minimal Essential Medium, 12 µg/ml Imipenem und 50 µg/ml Ancoban umfaßt, durchgeführt wird.
Nach einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Gefrierkonservierung von transplantierbarem Gewebe in Gegenwart eines Gefrierschutzmittels, indem man das Gewebe vor dem Gefrieren und vor der Zugabe des Gefrierschutzmittels in einem Nährmedium bei einer Temperatur von 27 bis 42 ºC während einer Zeitdauer von 5 min bis 24 h inkubiert, wobei nach dem Auftauen und der Verwendung das transplantierbare Gewebe verbesserte Lebensfähigkeit und/oder Funktionsfähigkeit gegenüber transplantierbarem Gewebe, das nicht einer solchen Inkubation unterzogen wurde, hat, wobei, wenn das Gewebe ein Blutgefäß ist, die Inkubation dann anders als bei 37 ºC während 4 h mit einem Nährmedium, das Delbecco's Minimal Essential Medium, 12 µg/ml Imipenem und 50 µg/l Ancoban umfaßt, durchgeführt wird.
Nach noch einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein optimal revitalisiertes Gewebe, welches warmer oder kalter Ischemie und anschließend einer Gefrierkonservierung und einem Auftauen oder einer Transplantation unterzogen wurde, mit Zellen, die für Verabreichung an einen Patienten mit der Notwendigkeit einer Behandlung mit ihnen geeignet sind, wobei diese Zellen in einem Nährmedium vor dem Gefrieren und vor der Zugabe eines Gefrierschutzmittels bei einer Temperatur von 27 bis 42 ºC und während einer Zeitdauer von 5 min bis 24 h inkubiert werden, um diese Zellen nach ihrer Gefrierkonservierung und ihrem Auftauen optimal zu revitalisieren, unter der Voraussetzung, daß, wenn das Gewebe ein Blutgefäß ist, dann die Inkubation anders als bei 37 ºC während 4 h mit einem Nährmedium, welches Delbecco's Minimal Essential Medium, 12 µg/ml Imipenem und 50 µg/ml Ancoban umfaßt, durchgeführt wird.
Im allgemeinen führt das hier beschriebene Verfahren zu erhöhter Zellebensfähigkeit und Funktionsfähigkeit nach dem Auftauen. Nach einem Revitalisierungsverfahren der Erfindung gefrierkonserviertes Gewebe ist von viel höherer Qualität für die Transplantation als Gewebe, welches ohne Verwendung des hier beschriebenen Revitalisierungsverfahrens gefrierkonserviert wurde.
Bevorzugte Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend beschrieben.

In der beigefügten Zeichnung beschreibt

Fig. 1 den Zellenergie- und Funktionszustand von Zellen nach Vorinkubation, Gefrierkonservierung, Auftauen und einer Inkubation nach dem Auftauen. Die Figur vergleicht die Zellenergie und den Funktionszustand von Gewebe, welches vor der Gefrierkonservierung auf 4 ºC gehalten wird, mit jenen von Gewebe, welches gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung revitalisiert (bei 37 ºC vorinkubiert) wurde. Die Zeit 0 für die Vorinkubation repräsentiert die hypothetische Abnahme des Zellstoffwechsel- und -funktionsstatus auf 50 % desjenigen, den man für Gewebe in situ findet. Diese Abnahme wird den vereinigten Wirkungen von warmer und kalter Ischemie vor der Inkubation zugeschrieben.
Fig. 2 zeigt kontinuierliche Aufzeichnungen von Wärmedissipation durch Herzventilblättchen. Revitalisierte Blättchenhälften ( ) wurden bei 37 ºC während 6 h inkubiert und dann gefrierkonserviert und aufgetaut, wie in Beispsiel 2 beschrieben. Die Kontrollhalbblättchen (+) wurden bei 4 ºC während 6 h gehalten und dann gefrierkonserviert und aufgetaut, wie in Beispieil 2 beschrieben. Revitalisierte Blättchen erzeugen Wärme mit einer mehr als zweifachen Rate im Vergleich mit nichtrevitalisierten Kontrollblättchen.
Das vorliegende Verfahren zur Revitalisierung von Gewebe oder Zellen gewährleistet eine erhöhte Zellebensfähigkeit und -funktionsfähigkeit nach dem Auftauen. Die Gewebe, die typischerweise hinsichtlich des Stoffwechsels und der Funktion reduziert werden, indem sie verschiedener Dauer warmer und kalter Ischemie ausgesetzt werden, werden in einer Weise behandelt, daß sie sich von diesen vorübergehenden, durch Ischemie eingeleiteten Beeinträchtigungen erholen. Da es gewöhnlich nicht praktisch ist, Gewebe unmittelbar nach dem Tod des Spenders zu entfernen und es gewöhnlich auch nicht möglich ist, das Gewebe unmittelbar nach der Beschaffung einer Gefrierkonservierung zu unterwerfen, sind Perioden von warmer und/oder kalter Ischemie unvermeidbar bei der Verarbeitung von menschlichem Gewebe für lebensfähige Gefrierkonservierung. Durch Behandlung des Gewebes vor der Gefrierkonservierung gewährleistet das Verfahren der vorliegenden Erfindung, daß der Stoffwechselenergiezustand und die Funktionsfähigkeit des Gewebes wiederhergestellt werden.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "Revitalisierung" eine Wiederherstellung oder Optimierung von Zell- oder Gewebestoffwechselverfahren und energieabhängigen Funktionen nach der Gefrierkonservierung durch Behandlung der Zellen oder des Gewebes vor der Gefrierkonservierung. Gewebe- und Zellfunktion sind letztendlich vom Zellstoffwechsel abhängig. Somit werden Zell-/Gewebelebensfähigkeit und -funktionsfähigkeit nach der Transplantation optimiert, um die Transplantationserfolgsrate zu maximieren. Revitalisierungsmessung, wie hier verwendet, ist nicht auf spezielle Stoffwechseleffekte oder -wege beschränkt, und es kann jedes Maß von Stoffwechselaktivität oder Gewebe- oder Zellfunktion verwendet werden. Beispielsweisen könne Proteinsynthese, Gefäßverengung, Nervenleitfähigkeit, Muskelkontraktionsfähigkeit, Aufnahme von radioaktiven Vorläufern, Produktion von radioaktiven oder fluoreszierenden Stoffwechselprodukten sowie andere Messungen von Stoffwechselaktivität oder stoffwechselenergieabhängige Verfahren bewertet werden.
Die hier beschriebenen Verfahren benutzten Zellen und Gewebe sowie Organe, die transplantiert werden sollen, und sind nicht auf spezielle Formen von transplantierbarem Gewebe beschränkt. Beispiele sind Knochenmarkzellen, Sehnen, Bänder, Inselchenzellen, Fibroplaste, Cornea, Blutgefäße, Herz, Leber, Embryo usw. Die Begriffe "ZEIIEN", "Gewebe" und "Organ" werden daher, wenn sie hier beschriebenes transplantierbares Material betreffen, in dem allgemeinsten Sinne verwendet und austauschbar benutzt, um Zellen, Gewebe, Organe usw. zu bezeichnen.
Nach Erhalt im Laboratorium wird das gewählte Gewebe von irgendwelchem unerwünschten Gewebe weggeschnitten und in ein geeignetes Gewebekulturmedium in einem Behälter gelegt, der eine ausreichende Sauerstoffversorgung des Mediums erlaubt. Das Gewebe und Medium werden in einen Inkubator oder ein gerütteltes Wasserbad ausreichend lange und bei einer wirkamen Temperatur eingesetzt, um Zell- oder Gewebelebensfähigkeit zu optimieren oder zu maximieren, nachdem die Probe Gefrierkonservierung unterzogen wurde und aufgetaut und für eine Transplantation in einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, präpariert wurde.
Eine Reihe von Gewebe- und/oder Zellkulturmedien kann bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung erfolgreich verwendet werden. Medien, wie abgeglichene Gewebekulturmedien oder einfache phosphatgepufferte Kochsalzlösung (ergänzt mit einem Nährstoff, wie Glucose) können für die meisten Gewebetypen verwendet werden. Außerdem kann eine Proteinsuspension, wie Blutserum oder künstliches Serum, in den Medien vorhanden sein.
Revitalisierung erfolgt während einer wirksamen Zeitdauer und bei einer Temperatur, welche für eine Revitalisierung des Gewebes wirksam ist und dabei Transplantationseffektivität maximiert.
Die für Revitalisierung erforderliche Behandlungszeit liegt im Bereich von 5 min bis 24 h, wobei die bevorzugte Zeit etwa 30 min bis 9 h beträgt. Die am meisten bevorzugte Zeit für Revitalisierung liegt bei etwa 6 h.
Die Temperatur, bei welcher das Gewebe behandelt wird, liegt im Bereich von 27 bis 42 ºC, wobei etwa 35 bis etwa 40 ºC bevorzugt sind. Die optimale Temperatur für Revitalisierung liegt bei 37 ºC.
Nach dem Revitalisierungsverfahren wird das Gewebe unter Befolgung der Standardmethoden in den ausgewählten Lösungen und gegebenenfalls in Gegenwart des oder der Gefrierschutzmittel, die sich für das jeweils bestimmte Gewebe als optimal erwiesen, gefrierkonserviert.
Das gefrorene Gewebe wird bei ultrakalten Temperaturen (z. B. - 196 ºC in flüssigem Stickstoff) gelagert. Die Auftau- und Verdünnungsstufen sind typischerweise jene, die sich für das bestimmte Gewebe als optimal erwiesen. Der Stoffwechsel- und Funktionsvorteil (gegenüber nichtrevitalisiertem Gewebe), den man durch Revitalisierung des Gewebes vor der Gefrierkonservierung erhält, wird nach den Stufen des Auftauens und Verdünnens beibehalten.
Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß ungeachtet des befolgten Gefrierkonservierungsverfahrens eine Behandlung des Gewebes vor dem Gefrieren zu verbesserter Gewebequalität (in bezug auf nichtrevitalisiertes Gewebe) nach dem Auftauen führt.
Die folgenden speziellen Beispiele erläutern die Erfindung für die Revitalisierung von menschlichem Herzventilgewebe vor der Gefrierkonservierung und die Beibehaltung dieses Stoffwechsel und Funktionsvorteils nach dem Auftauen und Verdünnen. Wie jedoch oben beschrieben, wird ersichtlich sein, daß sich diese technische Lehre auf alle transplantierbaren Gewebe erstreckt. Verschiedene Alternativen werden für den Fachmann aus der Lehre hier ersichtlich, und die Erfindung ist nicht auf spezielle erläuternde Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

Herzen wurden als Ganzes bestellt und zu dem Laboratorium transportiert. Bei der Vorbereitung für den Transport wurde jedes Herz in einen sterilen Eingeweidebeutel mit etwa 350 ml mit Laktat versetzter Ringer-Lösung, Kochsalzlösung oder Collins-Lösung gegeben. Der Beutel wurde mit einem Kunststoffband oder Nabelschnurstreifen dichtverschlossen und in einen zweiten Eingeweidebeutel gegeben, der ebenfalls dichtverschlossen wurde. Das Herz, welches so doppel verpackt war, wurde in einen Kunststoffbehälter gegeben, und der Deckel wurde dichtverschlossen. Der Behälter wurde dann in einen dritten sterilen Eingeweidebeutel gelegt und in einen Polystyrolschaumstoffversandbehälter mit nassem Eis gegeben. Nach Erhalt wurden die Aorta- und/Lungenschlagaderventile herausseziert und in die ursprüngliche Transportlösung gelegt.
Die Ventile wurden bei 4 ºC während 4 bis 72 g gelagert. Nach dieser Lagerungszeit wurden die Ventil blättchen herausgeschnitten, und jedes Blättchen wurde in zwei gleiche Teile geschnitten. Die Ventilblättchenstücke wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium ("DMEM") (geringer Glucosegehalt mit 10 % Kälberfetusserum) in sterilen Gewebekulturröhren gegeben und auf Eis gelagert. Eine Hälfte eines jeden Blättchens ließ man in dieser Lösung auf Eis. Die andere Hälfte des Blättchens wurde in eine sterile Gewebekulturröhre überführt, welche die gleiche Lösung enthielt, aber welche auf 37 ºC erwärmt worden war. Die sterilen Röhren, die diese halben Blättchen enthielten, wurden in einen Inkubator von 37 ºC gegeben. Nach 6 h wurden alle Blättchenhälften hinsichtlich der Zellebensfähigkeit und -funktionsfähigkeit geprüft.
Die Prüfung maß die Einarbeitung von ³H-2-Deoxyglucose in 2-Deoxyglycose-6-phosphat durch Blättchenzellen. Dieser Versuch bestimmt die Unversehrtheit der Zellmembran, die Funktionsfähigkeit der Transmembran-Glucosetransportproteine, die Unversehrtheit der Hexokinaseenzyme und den allgemeinen Energiezustand der Zelle. Der letzte Parameter ist wichtig, da ATP für die Phosphorylierung der 2-Deoxyglucose benötigt wird.
Die halben Blättchen wurden in etwa 2 ml sterile Hanks-Lösung bei Raumtemperatur während 3 bis 5 min gelegt. Sie wurden dann in 0,5 ml Hanks-Lösung (bei 37 ºC in einem Heizblock) mit einem Gehalt von 10 µCi/ml ³H-2-Deoxyglucose überführt. Nach einer 30minütigen Inkubation wurden die halben Blättchen unmittelbar in etwa 10 ml eiskalte Hanks- Lösung überführt. Die Lösung wurde mit einer Pipette entlüftet, und weitere 10 ml Hanks- Lösung wurden zugegeben. Dieses Waschverfahren, welches extrazelluläre 2-Deoxyglucose entfernt und intrazelluläre 2-Deoxyglucose, welche nicht phosphoryliert wurde, auswäscht, wurde weitere vier Male wiederholt. Die halben Blättchen wurden dann in 0,5 ml 1 M NaOH gelegt und bei 60 ºC 30 min inkubiert. Das Gewebe wurde dann durch Ultraschallbehandlung homogenisiert, und das resultierende Homogenat wurde 10 min in einer Tischplatten-Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Die Zerlegungen je Minute ("³H DPM") in dem resultierenden Obenschwimmenden wurden durch Flüssigkeitsszintiallationsauszählung bestimmt. Alle Werte für ³H DPM wurden für die Menge an in dem Obenschwimmenden vorhandenem Protein normalisiert. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle A. Tabelle A Vergleich von 2-Deoxyglucoseeinarbeitung (DPM/mg Protein) durch halbe Blättchen bei 6stündiger Inkubation bei 37 ºC gegenüber der Einarbeitung durch halbe Blättchen, die 6 h auf 4 ºC gehalten werdenDPM-Werte für Gewebe, vorinkubiert bei % 37 ºC gegenüber 4 ºC 4 ºC 37 ºC (37 ºC/4 ºC x 100) x ± SE = 206 ± 21 %
Die Werte demonstrieren, daß es eine etwa 2fache Verbesserung der Zellenlebensfähigkeit und -funktionsfähigkeit gibt, wenn das Gewebe durch Inkubation bei 37 ºC revitalisiert wird, im Vergleich mit Gewebe, das bei 4 ºC inkubiert wird. Dieser Unterschied ist im Diagramm bei Punkt A wiedergegeben. Solche Ergebnisse zeigen, daß Revitalisierung bei 37 ºC nach Ischemie zu einer Erholung der Zellen von vorübergehenden durch Ischemie eingeleiteten Stoffwechelreduzierungen und von der begleitenden Verminderung der Zellfunktion führt. So zeigen die Werte, daß eine Revitalisierung bei 37 ºC den Stoffwechselenergiestatus und die Funktion der Zellen und somit die Gesamtqualität der frischen Menschenherzventilblättchen verbessert.

Beispiel 2

Halbe Herzventil blättchen wurden präpariert und bei 4 oder 37 ºC inkubiert, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Diese halben Blättchen wurden dann gefrierkonserviert, und zwar im wesentlichen nach der Methode, die in der US-Patentschrift Nr.4 890 457 beschrieben ist. Die gefrorenen Blättchen wurden bei -196 ºC wenigstens 16 h gelagert. Die Blättchen wurden aufgetaut, und das Gefrierschutzmittel wurde verdünnt, wie in der obenerwähnten Patentschrift beschrieben ist. Unmittelbar nach dem Auftauen und Verdünnen wurden die halben Blättchen hinsichtlich der 2-Deoxyglucoseeinarbeitung geprüft, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle B gezeigt. Tabelle B Vergleich von 2-Deoxyglucoseeinarbeitung (DPM/mg Protein) durch halbe Blättchen bei 6stündiger Inkubation bei 37 ºC gegenüber halben Blättchen mit 6stündiger Inkubation bei 4 ºC. Nach den Inkubationen wurden alle Blättchen gefrierkonserviert, aufgetaut, verdünnt und unmittelbar bestimmt.DPM-Werte für Gewebe, vorinkubiert bei % 37 ºC gegenüber 4 ºC 4 ºC 37 ºC (37 ºC/4 ºC x 100) x ± SE = 304 ± 44 %
Die Werte demonstrieren, daß die Revitalisierung von Gewebe durch Inkubation bei 37 ºC während 6 h vor der Gefrierkonservierung zu einer dreifach größeren Zellebensfähigkeit und-funktionsfähigkeit gegenüber dem Fall führt, in welchem Gewebe vor der Gefrierkonservierung bei 4 ºC inkubiert wird. Dieser Unterschied wird im Diagramm bei Punkt B wiedergegeben. Die Revitalisierung bei 37 ºC führt zur Erholung der Zellen von vorübergehenden durch Ischemie eingeleiteten Stoffwechselbeeinträchtigungen und Funktionsverminderung, und der verbessere Stoffwechselzustand und die verbesserte Funktionsfähigkeit werden nach Gefrierkonservierung und Auftauen beibehalten. So verbessert die Revitalisierung bei 37 ºC erheblich den Stoffwechselenergiestatus und die Funktion und damit die Gesamtqualität des gefrierkonservierten und aufgetauten Gewebes.

Beispiel 3

Menschenherzventilblättchen wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme behandelt, daß nach dem Auftauen und dem Verdünnen die gesamten Blättchenhälften in DMEM (niedriger Glucosegehalt mit 10 % Kälberfetusserum) gelegt wurden und 6 h nach dem Auftauen bei 37 ºC inkubiert wurden. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Blättchenhälften hinsichtlich 2-Deoxyglucoseeinarbeitung geprüft, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle C. Tabelle C Vergleich von 2-Deoxyglucoseeinarbeitung (DPM/mg Protein) durch halbe Blättchen mit 6stündiger Inkubation bei 37 ºC gegenüber halben Blättchen mit 6stündiger Inkubation bei 4 ºC. Nach den Inkubationen wurden alle Bättchen gefrierkonserviert, aufgetaut, verdünnt und dann 6 h nach dem Auftauen bei 37 ºC inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Blättchen hinsichtlich der 2-Deoxyglucoseeinarbeitung untersucht. DPM-Werte für Gewebe, vorinkubiert bei % 37 ºC gegenüber 4 ºC 4 ºC 37 ºC (37 ºC/4 ºC x 100) x ± SE = 186 ± 33 %
Die Werte zeigen, daß die Revitalisierung von Gewebe durch Inkubation bei 37 ºC vor einer Gefrierkonservierung zu etwa der zweifach größeren Zellebensfähigkeit als jene führt, die man feststellt, wenn Gewebe vor der Gefrierkonservierung bei 4 ºC inkubiert wird, selbst nachdem das Gewebe nach dem Auftauen 6 h bei 37 ºC inkubiert wurde. Dieser Unterschied ist im Diagramm bei Punkt C wiedergegeben. Solche Ergebnisse zeigen, daß Revitalisierung bei 37 ºC nach Ischemie zur Erholung der Zellen von vorübergehenden durch Ischemie eingeleiteten Stoffwechselschädigungen und Funktionsverminderungen führt und der verbesserte Stoffwechselzustand und die verbesserte Funktionsfähigkeit nach Gefrierkonservierung, Auftauen und Inkubation beibehalten werden. So zeigen die Werte, daß eine Revitalisierung bei 37 ºC den Stoffwechselenergiestatus und die Funktionsfähigkeit und damit die Gesamtqualität des gefrierkonservierten und aufgetauten Gewebes verbessert. Außerdem zeigen diese Ergebnisse, daß revitalisiertes Gewebe einen ausgesprochenen Vorteil gegenüber nichtrevitalisiertem Gewebe während der ersten 6 h nach der Transplantation haben wird.

Beispiel 4

Menschenherzventilblättchen wurden behandelt, wie in Beispiel 2 beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, daß nach dem Auftauen und Verdünnen alle Blättchenhälften in DMEM (niedriger Glucosegehalt mit 10 % Kälberfetusserum) gelegt wurden und 16 h nach dem Auftauen bei 37 ºC inkubiert wurden. Nach dieser Inkubationszeit wurden die halben Blättchen hinsichtlich der 2-Deoxyglucoseeinarbeitung geprüft, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse finden sich nachfolgend in der Tabelle D. Tabelle D Vergleich der 2-Deoxyglucoseeinarbeitung (DPM/mg Protein) durch halbe Blättchen mit 6stündiger Inkubation bei 37 ºC gegenüber halben Blättchen mit 6stündiger Inkubation bei 4 ºC. Nach den Inkubationen wurden alle Blättchen gefrierkonserviert, aufgetaut, verdünnt und dann 16 h nachdem Auftauen bei 37 ºC inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die halben Blättchen hinsichtlich der 2-Deoxyglucoseeinarbeitung geprüft. DPM-Werte für Gewebe, vorinkubiert bei % 37 ºC gegenüber 4 ºC 4 ºC 37 ºC (37 ºC/4 ºC x 100) x ± SE = 198 ± 47 %
Diese Ergebnisse zeigen, daß revitalisierte Herzventilblättchen ihren funktionellen Vorteil gegenüber nichtbehandeltem Gewebe selbst nach 16 h bei 37 ºC nach dem Auftauen behalten. Dieser Unterschied ist im Diagramm bei Punkt D gezeigt.

Beispiel 5

Herzventilblättchen wurden, wie im Beispiel 2 beschrieben, behandelt, jedoch mit der Ausnahme, daß die Inkubation von 3 h Dauer bei 37 ºC vor der Gefrierkonservierung mit einer 3stündigen Inkubation bei 4 ºC verglichen wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle G gezeigt. Tabelle E Vergleich der 2-Deoxyglucoseeinarbeitung (DPM/mg Protein) durch halbe Blättchen mit 3stündiger Inkubation bei 37 ºC gegenüber halben Blättchen mit 3stündiger Inkubation bei 4 ºC. Nach den Inkubationen wurden alle Blättchen gefrierkonserivert, aufgetaut, verdünnt und unmittelbar untersucht. DPM-Werte für Gewebe, vorinkubiert bei % 37 ºC gegenüber 4 ºC 4 ºC 37 ºC (37 ºC14 ºC x 100) x ± SE = 154 ± 21 %
Die Werte zeigen, daß die Revitalisierung von Gewebe durch Inkubation bei 37 ºC während 3 h vor der Gefrierkonservierung zu etwa 1,5fach grnßever Zellebensfähigkeit führt als jene, die man feststellt, wenn Gewebe vor der Gefrierkonservierung bei 4 ºC inkubiert wird. Solche Ergebnisse zeigen, daß postischemische Revitalisierung bei 37 ºC, welche in so wenig wie 3 h durchgeführt werden kann, zu einer Erholung der Zeilen von vorübergehenden durch Ischemie eingeleiteten Stoffwechselstörungen und Funktionsverminderung führt und daß der verbesserte Stoffwechselzustand und die verbesserte Funktionsfähigkeit nach Gefrierkonservierung und Auftauen beibehalten werden. So verbessert eine Revitalisierung bei 37 ºC während 3 h merklich denm Stoffwechselenergiestatus und die Funktionsfähigkeit und somit die Gesamtqualität des gefrierkonservierten und aufgetauten Gewebes.

Beispiel 6

Menschenherzventilblättchen wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme behandelt, daß nach dem Auftauen und Verdünnen alle Blättchenhälften in DMEM (niedriger Glucosegehalt mit 10 % Kälberfetusserum) gelegt und nach dem Auftauen 6 h bei 37 ºC inkubiert wurden. Nach dieser Inkubationszeit wurden die halben Blättchen hinsichtlich der 2- Deoxyglucoseeinarbeitung geprüft, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle F gezeigt. Tabelle F Vergleich der 2-Deoxyglucoseeinarbeitung (DPM/mg Protein) durch halbe Blättchen mit einer 3stündigen Inkubation bei 37 ºC gegenüber halben Blättchen mit einer 3stündigen Inkubation bei 4 ºC. Nach den Inkubationen wurden alle Blättchen gefrierkonserviert, aufgetaut, verdünnt und dann 6 h nach dem Auftauen bei 37 ºC inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die halben Blättchen hinsichtlich der 2-Deoxyglucoseeinarbeitung untersucht. DPM-Werte für Gewebe, vorinkubiert bei % 37 ºC gegenüber 4 ºC 4 ºC 37 ºC (37 ºC14 ºC x 100) x ± SE = 180 ± 31 %
Die Werte zeigen, daß die Revitalisierung von Gewebe durch Inkubation bei 37 ºC während 3 h vor der Gefrierkonservierung zu etwa zweifach größerer Zellebensfähigkeit als jene führt, die man feststellt, wenn Gewebe vor der Gefrierkonservierung bei 4 ºC inkubiert wird, selbst nachdem das Gewebe eine 6stündige Inkubation bei 37 ºC nach dem Auftauen erhielt. Solche Ergebnisse zeigen, daß postischemische Revitalisierung bei 37 ºC zur Erholung der Zellen von vorübergehenden durch Ischemie eingeleiteten Stoffwechserlstörungen und Funktionsreduzierung führt und daß der verbesserte Stoffwechselzustand und die verbesserte Funktionsfähigkeit nach Gefrierkonservierung, Auftauen und Inkubation bei physiologischer Temperatur beibehalten werden. So verbessert die Revitalisierung bei 37 ºC erheblich den Stoffwechselenergiestatus und die Funktionsfähigkeit und damit die Gesamtqualität der gefrierkonservierten und aufgetauten Menschenherzventilblättchen. Außerdem zeigen diese Ergebnisse, daß das revitalisierte Gewebe einen ausgesprochenen Vorteil gegenüber nichtrevitalisiertem Gewebe in den ersten sechs Stunden nach der Transplantation hätte.

Beispiel 7

Herzventilplättchen werden, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme behandelt, daß nach dem Auftauen und Verdünnen zwei revitalisierte Blättchenhälften (bei 37 ºC 6 h vor der Gefrierkonservierung vorinkubiert) aus dem gleichen Ventil kurz mit Hanks-Lösung gespült und in ein Mikrokalorimeter mit offenem Fluß geben und mit einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/min mit Hanks-Lösung perfundiert werden. Die Gewebekammer wird auf 37 ºC gehalten, und die Wärmeverteilung durch das Gewebe wird kontinuierlich während einer 2stündigen Periode aufgezeichnet. Die beiden Kontrollblättchenhälften (vor der Gefrierkonservierung bei 4 ºC vorinkubiert) werden in identischer Weise aufgetaut, verdünnt und behandelt.
Die Rate der Wärmeverteilung durch die revitalisierten Blättchenhälften nach dem Auftauen ist mehr als das Zweifache der Rate, die man mit den nichtrevitalisierten Kontrollblättchenhälften findet, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Die mittlere Wärmeverteilung für revitalisierte Blättchenhälften liegt bei 22,03 µW, während jene für nichtrevitalisierte Kontrollblättchenhälften 10,5 µW beträgt. Die Wärmeverteilung steht in direkter Wechselbeziehung zu dem Stoffwechselenergiefluß von Zellen. Daher ist der Stoffwechselenergiefluß und somit die Kapazität des Gewebes zu funktionieren mehr als zweifach größer in revitalisierten Blättchenhälften als in nichtrevitalisierten Kontrollblättchenhälften. Dies steht in enger Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die man findet, wenn 2-Deoxyglucoseeinarbeitung als ein Maß für relativen Stoffwechselenergiestatus und Funktionsfähigkeit verwendet wird (d. h. Beispiel 2). So wird durch die beiden unabhängigen Messungen von Gewebe-Stoffwechselenergiestatus und Funktionsfähigkeit bestimmt, daß revitalisiertes Gewebe weit besser als nichtrevitalisiertes Gewebe nach dem Auftauen ist.

Beispiel 8

Ganze Herzen wurden beschafft und zu dem Laboratorium, wie in Beispiel 1 beschrieben, transportiert. Die Aorta- und Lungenarterienventile werden herausseziert, in ein Gewebekulturmedium (z. B. DMEM mit Glucose) gelegt und etwa 3 bis 12 h bei 37 ºC inkubiert. Gegebenenfalls können Antibiotika in die Inkubationslösung eingeschlossen werden. Nach der Inkubation und begleitenden Revitalisierung werden die Ventile nach dem in der US-Patentschrift Nr.4 890 457 beschriebenen Protokoll gefrierkonserviert. Nach der Transplantation haben solche Ventile überlegene Qualität gegenüber jenen, die vor der Gefrierkonservierung nicht revitalisiert wurden.
Zusammenfassend führt die Revitalisierung von Gewebe während 5 min bis 24 h vor der Gefrierkonservierung zu etwa 2- bis 3fach größerer Zellebensfähigkeit als sie beobachtet wird, wenn Gewebe vor der Gefrierkonservierung bei 4 ºC inkubiert wird, selbst im Vergleich mit Gewebe, welches nach dem Auftauen 6 bis 16 h bei 37 ºC inkubiert wurde. Somit führt postischemische Revitalisierung zur Erholung der Zellen von vorübergehenden durch Ischemie eingeleiteten Stoffwechselstörungen und von verminderter Funktionsfähigkeit. Der verbesserte Stoffwechselzustand und die verbesserte Funktionsfähigkeit werden nach Gefrierkonservierung, Auftauen und Inkubation beibehalten. Die Revitalisierung verbessert merklich den Stoffwechselenergiestatus, die Zellfunktion und somit die Gesamtqualität des gefrierkonservierten und aufgetauten Gewebes. Außerdem zeigen diese Ergebnisse, daß das revitalisierte Gewebe einen großen Vorteil gegenüber nichtrevitalisiertem Gewebe nach dem Transplantieren hat.

Claims

1. Verfahren zur Steigerung der Vitalität einer für Transplantation nach Einfrieren und Auftauen geeigneten Zelle, wobei diese Zelle vor dem Einfrieren Gegenstand einer Periode warmer und/oder kalter Ischämie ist, indem man diese Zelle vor dem Gefrieren und vor der Zugabe eines Gefrierschutzmittels in einem Nährmedium bei einer Temperatur von 27 bis 42 ºC und während einer Zeitdauer von 5 min bis 24 h inkubiert, um die Vitalität dieser Zelle beim Auftauen zu maximieren, wobei, wenn die Zelle eine Blutgefäßzelle ist, die Inkubation anders als bei 37 ºC während 4 h mit einem Nährmedium, das Delbecco's Minimal Essential Medium, 12 µg/ml Imipenem und 50 µg/ml Ancoban umfaßt, durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zelle während einer Zeitdauer von 3 bis 9 h inkubiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Zelle 6 h inkubiert wird.

4. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem die Zelle bei einer Temperatur im Bereich von 35 bis 40 ºC inkubiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Zelle bei etwa 37 ºC inkubiert wird.

6. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem die warmen und kalten Ischämieperioden vor der Inkubation auftreten.

7 Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem das Nährmedium die Form einer Lösung hat.

8. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem das Nährmedium ein Antibiotikum enthält.

9. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem die Zelle ein transplantierbares Gewebe umfaßt.

10. Verfahren zum Einfrieren von transplantierbarem Gewebe in Gegenwart eines Gefrierschutzmittels, bei dem man das Gewebe vor dem Gefrieren und vor der Zugabe des Gefrierschutzmittels in einem Nährmedium bei einer Temperatur von 27 bis 42 ºC und während einer Zeitdauer von 5 min bis 24 h inkubiert, wobei beim Auftauen und der Verwendung das transplantierbare Gewebe verbesserte Vitalität und/oder Funktionsfähigkeit gegenüber transplantierbarem Gewebe, das nicht einer solcher Inkubation unterzogen wurde, besitzt, wobei, wenn das Gewebe ein Wutgefäß ist, die Inkubation anders als bei 37 ºC während 4 h mit einem Nährmedium, das Delbecco's Minimal Essential Medium, 12 µg/ml Imipenem und 50 µg/ml Ancoban umfaßt, durchgeführt wird.

11. Optimal revitalisiertes Gewebe, das Gegenstand warmer oder kalter Ischämie gefolgt von Einfrieren und Auftauen vor der Transplantation war, mit Zellen, die für eine Verabreichung an einen Patienten bei Bedarf einer Behandlung mit ihnen geeignet sind, wobei diese Zellen vor dem Gefrieren und vor der Zugabe eines Gefrierschutzmittels in einem Nährmedium bei einer Temperatur von 27 bis 42 ºC und während einer Zeitdauer von 5 min bis 24 h inkubiert werden, um die Zellen nach ihrem Einfrieren und Auftauen optimal zu revitalisieren, wobei, wenn das Gewebe ein Blutgefäß ist, die Inkubation anders als bei 37 ºC während 4 h mit einem Nährmedium, das Delbecco's Minimal Essential Medium, 12 µg/ml Imipenem und 50 pg/ml Ancoban umfaßt, durchgeführt wird.

12. Gewebe nach Anspruch 11, bei dem die Zellen Herzgewebe umfassen.

13. Gewebe nach einem der Ansprüche 11 und 1 2, bei dem das Gewebe vor dem Einfrieren bei einer Temperatur von 35 bis 42 ºC inkubiert wird.

14. Gewebe nach Anspruch 13, bei dem das Gewebe vor dem Einfrieren bei 37 ºC inkubiert wird.

15. Gewebe nach einem der Ansprüche 11 bis 14, bei dem das Gewebe während einer Zeitdauer von 3 bis 9 h inkubiert wird.

16. Gewebe nach Anspruch 15, bei dem das Gewebe 6 h inkubiert wird.