DE19728161C2

DE19728161C2 - Verdünner und Verfahren zur Konservierung von Ebersperma

Info

Publication number: DE19728161C2
Application number: DE1997128161
Authority: DE
Inventors: Guenter Kamp
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-07-02
Filing date: 1997-07-02
Publication date: 2000-06-29
Anticipated expiration: 2017-07-03
Also published as: DE19728161A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf einen Verdünner zum Verdünnen einer Eberspermaprobe sowie auf ein Verfahren zur Konservierung von Ebersperma.

Nach Gewinnung von Ebersperma besteht oft die Notwendigkeit, solche Proben zu la gern bis eine entsprechende Verwendung, d. h. die Durchführung einer künstlichen Besamung, möglich ist. Bei der Lagerung darf das Ebersperma nicht geschädigt werden und soll so wenig wie möglich von seiner Motilität verlieren, um nach erfolgter Besa mung zu möglichst hohen Trächtigkeitsraten zu gelangen. In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Verfahren zur Konservierung von Ebersperma sowie verschiedene Medien zur Verdünnung und Lagerung von Ebersperma, im folgenden Verdünner ge nannt, entwickelt.

Bekannte Verdünner enthalten Glucose, EDTA als Chelatbildner, Puffersubstanzen, wie TRIS oder Hydrogencarbonat, Natriumcitrat, Antibiotika sowie ggf. weitere Salze von organischen und/oder anorganischen Säuren. Das Ebersperma wird nach seiner Gewin nung mit solch einem Verdünner verdünnt und anschließend auf unter 20°C abgekühlt. Diese verdünnten und abgekühlten Proben können dann gelagert werden. Um in der Praxis eine zufriedenstellende Trächtigungsrate zu erzielen, müssen die Eberspermapro ben nach 2 bis maximal 3 Tagen zur künstlichen Besamung verwendet werden. In der Literatur finden sich zwar Angaben zu verschiedenen Verfahren zur Konservierung von Ebersperma über 4, 5 oder noch mehr Tage, es hat sich jedoch herausgestellt, daß mit Spermaproben nach einer solch langen Lagerungszeit keine praxisgerechten Trächtig keitsraten mehr erzielen lassen. Obige Lagerungszeiten werden zudem kürzer, falls keine Antibiotika den Verdünnern zugesetzt werden.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Verdünner anzugeben, mit dem Proben von Ebersperma verdünnt und gelagert werden können, wobei längere Lage rungszeiten mit erhöhten Motilitätsraten der Spermien gegenüber den bekannten Ver dünnern erzielt werden können.

Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Konservierung von Ebersperma anzugeben, was ebenfalls die Möglichkeit einer längeren Lagerung der kon servierten Proben mit erhöhten Motilitätsraten der Spermien gegenüber den bekannten Verfahren eröffnet.

Diese Aufgaben werden gelöst durch einen Verdünner nach Anspruch 1 sowie durch ein Verfahren nach Anspruch 12, wobei vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung in den Ansprüchen 2 bis 11 und 13 bis 18 angegeben sind.

Der Verdünner für Ebersperma nach der Erfindung umfaßt Glucose, einen Chelatbild ner, mindestens ein Salz einer organischen und/oder anorganischen Säure sowie minde stens eine Puffersubstanz, wobei die mindestens eine Puffersubstanz Ammoniak, Am moniakwasser und/oder mindestens ein Ammoniumsalz umfaßt.

Der erfindungsgemäße Verdünner weist somit gegenüber den bekannten Verdünnern, die in Form eines Hydrogencarbonat-Salzes über ein Bikarbonat-Puffersystem (CO₂/HCO₃ ^-) verfügen, ein NH₃/NH₄ ⁺-Puffersystem auf Eberspermaproben, die mit dem Verdünner nach der Erfindung verdünnt werden, können in Gegenwart von Anti biotika bis zu 4 Tagen unter Beibehaltung hoher Motilitätsraten gelagert werden. Dies bedeutet eine erhebliche und überraschende Verbesserung gegenüber den in der Praxis möglichen 2 bis maximal 3 Tagen Lagerung, wobei die Motilitätsraten geringer sind.

Die DD 246 471 A1 beschreibt ein Medium zur Verdünnung und Flüssigkonservierung von Ebersperma, welches Glucose, Natriumcitrat, Natriumhydrogencarbonat, EDTA und Cysteinhydrochlorid enthält, wobei durch Zusatz des SH-Gruppenträgers Cystein und Optimierung der osmotischen Verhältnisse eine stabilisierende Wirkung auf die Spermienmembran und somit einen positiven Effekt auf die Vitalität und Befruchtungsfähigkeit der Spermien ausgeübt wird.

Das Mittel zum Lagern und Suspendieren von Zellen, welches aus der DE 39 38 907 A1 bekannt ist, enthält neben bekannten Substanzen, wie z. B. Elektrolyten und Zuckern, einen Chelatbildner für mehrwertige Metallionen. Mit diesem Mittel lassen sich Erythrozyten bis zu 2 Jahren lagern, wobei sich diese Ergebnisse jedoch nicht auf andere Zelltypen, insbesondere nicht auf Eberspermien, übertragen lassen.

Der erfindungsgemäße Verdünner kann auch ohne den Zusatz von Antibiotika verwen det werden, wobei gute Ergebnisse noch nach 2-tägiger Lagerung erzielt werden.

Die oben dargelegten Verlängerungen der Konservierungszeiten mit oder ohne Antibio tika bei gleichzeitig hohen Motilitätsraten haben wichtige betriebswirtschaftliche Vor teile in der Schweinezucht, da sich Kostenvorteile durch die Möglichkeit einer längeren Lagerung der Spermaproben und die höheren Trächtigkeitsraten ergeben.

Es wird angenommen, daß die Gründe für diese Möglichkeit der längeren Lagerung der verdünnten Eberspermien die folgenden sind.

Bei dem bekannten Puffer (CO₂/HCO₃ ^-) wie bei dem Puffersystem (NH₃/NH₄ ⁺) in dem Verdünnner nach der Erfindung kommt es zu einem Austausch mit dem intrazellulären Milieu (Spermien), wobei CO₂ bzw. NH₃ in die Spermien hineinstömt und sich im Laufe der Zeit ein Gleichgewicht beider Komponenten innen und außen einstellt. Je höher die Konzentration außen gewählt wird, um so mehr CO₂ bzw NH₃ wird in die Zellen diffundieren. CO₂ reagiert innerhalb der Spermien mit Wasser zur Kohlensäure, welche dissoziiert und Protonen freisetzt. NH₃ hingegen bindet intrazellulär Protonen durch die Bildung von NH₄ ⁺.

Es wurde nachgewiesen, daß der intrazelluläre pH-Wert in frischen Spermien bei 7,3 liegt, während nach einer Lagerung der Spermien unter Verwendung eines im Stand der Technik bekannten Verdünners der pH auf 5,9 absinkt. Diese intrazelluläre Ansäuerung wird ferner von einer Ansäuerung des extrazellularen Milieus begleitet. Die Protonenan reicherung ist wahrscheinlich auf eine Glucosemetabolisierung unter Bildung von Lactat zurückzuführen. Ebersperma toleriert in einem gewissen Umfang die Protonenakkumu lation, wie die Motilitätsraten nach einer Lagerung von 2-3 Tagen zeigen. Die im vor herigen Absatz beschriebene Wirkung eines bekannten Verdünners - CO₂ verstärkt die Protonenproduktion - gegenüber des erfindungsgemäßen Verdünners - NH₃ puffert die Protonenproduktion der Spermien ab - läßt den Schluß zu, daß die Ansäuerung des intra- und extrazellulären Milieus zwar gewisse Vorteile hinsichtlich einer besseren Konservierungsbedingung im schwach sauren Milieu und einer Reduktion der Stoff wechselaktivität besitzt, daß jedoch offensichtlich die Motilität der Spermien durch eine intrazelluläre Protonenabpufferung verbessert werden kann.

Nach einer Ausgestaltung der Erfindung enthält der Verdünner ein anorganisches Am moniumsalz, wie beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, etc. Die Kon zentration des anorganischen Ammoniumsalzes liegt vorteilhafterweise in dem Bereich von 0,1 bis 0,5 mMol/l Verdünner.

Der Verdünner nach der Erfindung umfaßt nach einer weiteren Ausgestaltung eine Puf fersubstanz, die in dem pH-Bereich um 7 abpuffert, wobei hier insbesondere HEPES in einer Konzentration von 1 bis 100 mMol/l Verdünner bevorzugt wird. HEPES ist bereits in zahlreichen Zellkulturmedien im Einsatz und gilt als sogenannter Good buffer (N. E. Good, G. D. Winget, W. Winter, T. N. Connolly, S. Izawa, R. M. M. Singh (1966): Hydrogen ion buffer for biological research 5, 469-477; vgl. auch Lindl und Bauer, Zell- und Gewebekultur, 1994, 3. Aufl., Gustav Fischer Verlag). Toxische Effekte von HEPES sind gemäß Sicherheitsdatenblatt der Firma Merck, Produzent dieser Substanz, nicht bekannt. Neben HEPES können auch andere Puffersubstanzen verwendet werden, so fern diese ausreichend verträglich für das Ebersperma sind und sofern gewährleistet ist, daß der pH-Wert bei mehrtägiger Lagerung des Eberspermas in der direkten Umgebung der Spermien nicht unter 6,0 absinkt.

Als besonders vorteilhaft hat sich die gleichzeitige intrazelluläre und extrazelluläre Pufferung der Protonenkonzentration herausgestellt, die z. B. durch die gleichzeitige Verwendung von Ammoniumchlorid und HEPES in dem Verdünner nach der Erfindung gewährleistet ist.

Ein gut geeigneter Verdünner nach der Erfindung umfaßt z. B. die folgenden Komponenten: Glucose (40,7 g), Natriumcitrat × 2H₂O (6,0 g), Mg-Acetat × 4H₂O (0,535 g), EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure (0,5 g), KCl (0,14 g), NH₄Cl (0,14 g), HEPES ([4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsäure; 2,5 g) in 1 Liter Milli-Q Wasser (Millipore) oder Aqua dest. (frisch destilliert). Die Osmolarität dieses Verdün ners beträgt 370 mosmol/l und sein pH-Wert liegt bei 7,2.

Der Verdünner kann ferner Antibiotika enthalten, wie beispielsweise 0,6 g Penicillin und 1,0 g Streptomycin oder Gentamycin. Hier sei aber angemerkt, daß eine Antibio tika-freie Konservierung des Eberspermas für die Zukunft eine wichtige Forderung sein wird, um ein weiteres Auftreten Antibiotika-resistenter Bakterienstämme durch die übermäßige Benutzung von Antibiotika in der Tierzucht einzuschränken.

Der Verdünner nach der Erfindung kann beispielsweise trocken als Pulver gelagert und versandt werden. Im trockenen Zustand ist der Verdünner nach der Erfindung minde stens ein Jahr haltbar. Eine fertige Verdünnerlösung sollte möglichst erst am Tag vor Gebrauch oder direkt kurz vor Gebrauch hergestellt und auf Osmolarität und pH über prüft werden.

Das Verfahren nach der Erfindung sieht die folgenden Schritte vor:

a) die Abkühlung des gewonnenen Ejakulats auf 12 bis 18°C,
b) die Verdünnung des abgekühlten Eberspermas mit einem Verdünner, der zuvor ebenfalls auf 12 bis 18°C abgekühlt wurde,
c) die Lagerung des verdünnten Eberspermas bei 12 bis 18°C.

Die Gewinnung des Eberejakulates erfolgt gemäß bekannten Methoden. Ein entschei dender Unterschied zu den bislang üblichen Verfahren im Stand der Technik besteht in der Abkühlung des unverdünnten Spermas auf 12 bis 18°C, wobei 15°C bevorzugt sind, und der erst anschließenden Zugabe des Verdünners, der zuvor ebenfalls auf eine Temperatur von 12 bis 18°C abgekühlt wurde, wobei 15°C bevorzugt sind. Bekannt war bisher, das Sperma zunächst bei 33-35°C mit einem Verdünner zu verdünnen und danach die verdünnte Probe abzukühlen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Eberspermaproben unter Verwendung eines Antibiotika-haltigen Verdünners bis zu 4 Tagen unter Beibehaltung hoher Motili tätsraten gelagert werden. Dies bedeutet im Vergleich zu den bekannten Verfahren eine erhebliche und überraschende Verbesserung gegenüber den in der Praxis möglichen 2 bis maximal 3 Tagen Lagerung, wobei die Motilitätsraten geringer sind. Das erfin dungsgemäße Verfahren kann auch mit einem Verdünner, der keine Antibiotika auf weist, durchgeführt werden, wobei gute Ergebnisse in Form eines hohen Anteils be weglicher Spermien noch nach 2-tägiger Lagerung erzielt werden.

Eine Ursache für die überraschenden Vorteile bei dem Verfahren nach der Erfindung könnte darin zu sehen sein, daß Eberspermien bei Körpertemperatur ihre Adeninnu kleotide (ATP, ADP und AMP) über Inosin abbauen. Dieser Verlust kann in der ersten Stunde nach Ejakulation 30 ± 10 Prozent der Gesamtnukleotidmenge frischer Spermien betragen. Dieses Ergebnis basiert auf HPLC-Analysen an Zellextrakten nach unter schiedlich langer Lagerung von Ejakulaten bei verschiedenen Temperaturen. Der Ver lust ist um so geringer, je früher die ATP-verbrauchenden Prozesse inhibiert werden.

Bei 15 ± 3°C ist zwar die Motilität weitgehend inhibiert, die ATP-Produktion läuft aber über die Glykolyse weiter. Durch eine frühzeitige Temperaturabsenkung kommt es also zu einer geringeren Abnahme an ATP, d. h. AMP akkumuliert schwächer und steht als Substrat für die weitere Deaminierung nicht in gleichem Ausmaß zur Verfügung. Diese temperaturabhängigen Konzentrationsveränderungen im ATP-Spiegel der Eberspermien konnten ebenfalls belegt werden. Die ATP Konzentration in frischen Ejakulaten (28 ± 4 nmol/10⁸ Spermien) sinkt nach 1 Std. bei 35°C auf 8 ± 6 nmol/10⁸ Spermien, während sie bei 15°C nicht signifikant verändert ist (26 ± 4 nmol/10⁸ Spermien).

Durch die nach dem Verfahren nach der Erfindung zuerst zu erfolgende Abkühlung der Spermien und anschließender Verdünnung sind die Spermien offensichtlich nach einem längeren Zeitraum der Lagerung im Vergleich zu bisher bekannten Verfahren bewegli cher, wenn sie wieder erwärmt werden, wobei dies auf den oben geschilderten höheren ATP-Level zurückzuführen sein könnte.

Die Vorteile des oben geschilderten Verfahrens nach der Erfindung lassen sich gut mit den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verdünners nach Anspruch 1 kombinieren, indem der Verdünner nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bei dem Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18 verwendet wird.

Die Abkühlung des Eberspermas sollte nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung innerhalb eines Zeitraumes von 20 bis 40 Minuten durchgeführt werden, um einerseits die oben geschilderten Vorteile optimal auszunutzen und um andererseits die Spermien selbst nicht durch eine zu rasches Abkühlen zu schädigen. Für die Abkühlung sind ent sprechende Gefäße mit einem Oberflächen/Volumenverhältnis zu wählen, die eine Temperaturadaptation in diesem Zeitraum ermöglichen.

Nach erfolgter Abkühlung wird das Sperma mit dem möglichst die gleiche Temperatur aufweisenden Verdünner gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung bevorzugt im Verhältnis 1 : 9 (Ebersperma : Verdünner) versetzt. Der Verdünner wird in bekannter Weise zum Sperma gegeben. Es werden möglichst sterile Gefäße verwendet, wobei das Labor bei der Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung keimarm sein sollte.

Die verdünnten Eberspermaproben können vorteilhafterweise in länglichen Schläuchen und hängend bei 15°C gelagert werden. Sofern diese Proben nicht bewegt werden, sammeln sich die bei dieser Temperatur immotilen Spermien am Boden des Gefäßes an. Nach etwa 3 Stunden sind alle Spermien am Boden des Schlauches sedimentiert. In die sem Zustand können die Proben 4 Tage gelagert werden und zwar mit deutlich geringe rem Motilitätsverlust der Spermien gegenüber bekannten Verfahren.

Wie oben bereits erwähnt, sollten die Spermienproben während der Lagerung nicht be wegt werden, da sich ein durch den Stoffwechsel der Spermien konservierendes Medium in der Zone des Spermienpellets ausbildet. Dies basiert im wesentlichen auf der oben beschriebenen Protonenproduktion der Spermien durch den Glycolyse-abhängigen Energiestoffwechsel. Die Ansäuerung extrazellulär konnte dabei über eine pH-Elek trode, die in direkter Umgebung der Spermien justiert wurde, nachgewiesen werden.

Falls eine Konservierung ohne Antibiotika durchgeführt wird, können alternativ die oberen Zweidrittel der Flüssigkeitssäule nach einer etwa 3-stündigen, hängenden Lage rung durch Drehen des Schlauches abgeschnürt und die Schlauchenden durch Plastik klemmen oder ähnliches verschlossen werden. Der kleinere, die sedimentierten Sper mien enthaltende Schlauchteil kann dann abgeschnitten und z. B. im Gefrierfach einge froren werden.

Vor der Verwendung müssen die konservierten Eberspermaproben vor Inseminierung für etwa 20-30 Minuten auf 35-37°C, z. B. im Wasserbad oder Wärmeschrank, in be kannter Weise aufgewärmt werden. Die Inseminierung kann dann anschließend erfol gen.

Ein Ausführungsbeispiel wird nachfolgend zur weiteren Erläuterung der Erfindung be schrieben.

Bestimmung der Motilitätsraten von konserviertem Ebersperma (1) Konservierung nach der Erfindung

Frisch gewonnene Eberspermien wurden über einen Zeitraum von 30 Minuten auf 15°C abgekühlt. Anschließend wurden Proben der Eberspermien mit dem im folgenden ange gebenen Verdünner im Verhältnis 1 : 9 verdünnt, wobei der Verdünner zum Sperma ge geben wurde. Der Verdünner wies ebenfalls eine Temperatur von 15°C auf. Die ver dünnten Proben wurden in längliche Schläuche gegeben und hängend bei 15°C gela gert.

Die Motilitätsraten der Spermien wurden direkt nach obiger Behandlung (Tag 0) und anschließend alle 24 Stunden bis Tag 4 bestimmt. Für die Bestimmung der Motilitätsra ten wurden die Spermienproben nochmals 1 : 10 verdünnt. Die Bewegung der Spermien wurde anschließend mit einem Videomikroskop aufgezeichnet und die Bildsequenzen wurden visuell danach ausgewertet, welcher Teil der Spermien eine Vorwärtsbewegung von mindestens 20 µm/sec zeigte. Spermien mit solch einer Vorwärtsbewegung sind in der Tab. 1 als motile Spermien (in Prozent, bezogen auf eine Gesamtzahl an ausgewerte ten Spermien von 200) bezeichnet. Pro Auswertungstag wurde der Anteil der motilen Spermien in 10 verschiedenen Proben bestimmt.

Der verwendete Verdünner hatte die folgende Zusammensetzung:

g pro l Wasser (sterilfiltriert oder Aqua dest.)
Glucose	40,7
Natriumcitrat × 2H₂O	6,0
Mg-Acetat × 4H₂O	0,535
EDTA	0,5
KCl	0,14 g
NH₄Cl	0,14
HEPES	2,5

Der Verdünner hatte eine Osmolarität von 370 mosmol/l und wies einen pH-Wert von 7,2 auf.

(2) Kontrollkonservierung gemäß Stand der Technik

Die Unterschiede zu (1) waren die folgenden: Die Spermien wurden bei etwa 34°C mit dem im folgenden angegebenen Verdünner im Verhältnis 1 : 9 verdünnt, wobei der Ver dünner zum Sperma gegeben wurde. Anschließend wurden die verdünnten Proben auf 15°C abgekühlt und wie unter (1) weiterbehandelt. Die Motilitätsraten wurden an den Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 wie bei (1) bestimmt.

Der verwendete Verdünner (BTS-Verdünner von Pursel und Johnson) hatte die folgende Zusamensetzung:

g pro l Wasser (sterilfiltriert oder Aqua dest.)
Glucose	40,7
Natriumcitrat × 2H₂O	6,0
Natriumhydrogencarbonat	1,25
EDTA	1,25
KCl	0,75 g

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Abnahme der Motilität in Prozent der Gesamtspermien in Abhängigkeit von der Dauer der Lagerung und des Konservierungsverfahrens und des verwendeten Ver dünners

Bei dem Verfahren und dem Verdünner nach der Erfindung (1) sank die Motilität von 90% am Tag 0 über 80% und 75% bis auf 70% am Tag 4, während bei dem bekann ten Konservierungsverfahren unter Einsatz des BTS-Verdünners (2) die Motilität ausge hend vom gleichen Ausgangswert über 80%, 65% und 50% bis auf 35% am Tag 4 absank. Dies bedeutet, daß am Tag 4 in den Eberspermaproben nach (1) doppelt so viele, vitale Spermien als in den Eberspermaproben nach (2) vorlagen.

Claims

1. Verdünner für Ebersperma, der Glucose, einen Chelatbildner, mindestens ein Salz einer organischen und/oder anorganischen Säure sowie mindestens eine Puffersubstanz umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Puffersubstanz Ammoniak, Ammoniakwasser und/oder mindestens ein Ammoniumsalz umfaßt.

2. Verdünner nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Puf fersubstanz ein anorganisches Ammoniumsalz darstellt.

3. Verdünner nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des an organischen Ammoniumsalzes 0,1 bis 5 mMol/l Verdünner beträgt.

4. Verdünner nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das anorganische Ammoniumsalz Ammoniumchlorid ist.

5. Verdünner nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er ferner eine Puffersubstanz enthält, welche den pH im Bereich von 7 abpuffert, insbesondere den pH bei der Lagerung des Eberspermas nicht unter 6 absinken läßt.

6. Verdünner nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß diese Puffersubstanz HEPES ist.

7. Verdünner nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die HEPES-Konzentration 1 bis 100 mMol/l Verdünner beträgt.

8. Verdünner nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß er einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5, insbesondere von 7,0 bis 7,5, aufweist.

9. Verdünner nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Osmolarität von 250 bis 500 mOsm/l, insbesondere von 320 bis 420, aufweist.

10. Verdünner nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß er 40,7 g Glucose, 6,0 g Natriumcitrat × 2H₂O, 0,535 g Magnesiumacetat × 4H₂O, 0,5 g Ethylendiamintetraessigsäure, 0,14 g Kaliumchlorid, 0,14 g Ammoniumchlorid, 2,5 g HEPES pro 1 l destilliertes oder filtersterilisiertes Wasser umfaßt.

11. Verdünner nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß er fer ner Antibiotika, insbesondere 0,6 g Penicillin und 1,0 g Streptomycin, umfaßt.

12. Verfahren zur Konservierung von Ebersperma, gekennzeichnet durch

a) die Abkühlung des gewonnenen Ejakulats auf 12 bis 18°C,
b) die Verdünnung des abgekühlten Eberspermas mit einem Verdünner gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, der zuvor ebenfalls auf 12 bis 18°C abgekühlt wurde, und
c) die Lagerung des verdünnten Eberspermas bei 12 bis 18°C.

13. Verfahren zur Konservierung von Ebersperma nach Anspruch 12, gekennzeichnet durch die Abkühlung des gewonnenen Ejakulats von der Körpertemperatur auf 12 bis 18°C über einen Zeitraum von 20 bis 40 Minuten.

14. Verfahren zur Konservierung von Ebersperma nach Anspruch 12 oder 13, gekennzeichnet durch die Abkühlung des gewonnenen Ejakulats auf 15°C und durch die Verdünnung des auf 15°C abgekühlten Eberspermas mit dem ebenfalls auf 15°C abgekühlten Verdünners.

15. Verfahren zur Konservierung von Ebersperma nach einem der Ansprüche 12 bis 14, gekennzeichnet durch ein Verdünnungsverhältnis von Ebersperma zu Verdünner im Bereich von 1 : 3 bis 1 : 15, insbesondere 1 : 9.

16. Verfahren zur Konservierung von Ebersperma nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das verdünnte Ebersperma in länglichen Schläuchen por tioniert und hängend gelagert wird.

17. Verfahren zur Konservierung von Ebersperma nach Anspruch 16, dadurch gekenn zeichnet, daß das Ebersperma während der Lagerung nicht bewegt wird.