WO2001009287A2 - Druckbehandlungsverfahren von zellen - Google Patents

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WO2001009287A2
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Roland Meyer-Pittroff
Wolfram Mittelmeier
Manfred Schmitt
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Hoehn Gerrit
Meyer Pittroff Roland
Wolfram Mittelmeier
Manfred Schmitt
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    • A61F5/00—Orthopaedic methods or devices for non-surgical treatment of bones or joints; Nursing devices; Anti-rape devices
    • A61F5/01—Orthopaedic devices, e.g. splints, casts or braces
    • A61F5/30—Pressure-pads
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    • A61F7/00—Heating or cooling appliances for medical or therapeutic treatment of the human body

Definitions

  • the invention relates to a method for changing the replication ability and / or the protein structure of human or animal cells and / or tissues and / or of microorganisms or pions present in or with the cells, by high pressure treatment.
  • High pressure technology in the pressure range from 100 Mega Pascal (MPa) to 1000 MPa has been gaining increasing importance in food technology for several years.
  • the industrial use of this technology for food preservation is based on the possibility of inactivating microorganisms without significantly affecting the taste of many treated foodstuffs.
  • High-pressure technology is based on two basic principles:
  • Le Cha telier The principle of Le Cha telier is the most important basis for understanding pressure-induced influences on chemical reactions. This principle states that under equilibrium conditions reactions that are associated with a decrease in volume are required by pressure. Temperature and pressure influence the kinetics of chemical reactions. The cause is the change in the chemical potential of the substances involved. For the position of the equilibrium, the change of AV response volume crucial. Under pressure, the equilibrium of the reaction is shifted in the direction of the most compact state. The effect of an increase in pressure on the reaction rate and thus on the rate constant k x depends on the change in the activation volume
  • the second basic principle is that of isostatic, which states that pressure acts uniformly and immediately on a body and on the inside of a body.
  • the pressure build-up is therefore independent of time.
  • the hydrostatic pressure is generated with the help of a pump in a suitable steel cylinder. Maintaining a certain pressure for a defined period of time does not require additional energy. Under pressure, the physical and chemical properties of water change, such as density, ion dissociation, pH and the melting point of ice. Macromolecular changes in conformation, structural changes in cell membranes and changes in crystallization behavior go hand in hand with a decrease in volume and are accelerated by pressure.
  • the disadvantage of this method is that the immune system of the transplant recipient is also severely restricted in its functionality in relation to pathogenic microorganisms. This often leads to infectious diseases in transplant patients. Especially in the first days after the transplant, immunosuppressive drugs are administered in high doses because rejection of the graft may occur, especially in these first days. This immune system suppression often leads to infections, which in many cases lead to death.
  • tissue transplantation is not only the lack of tissue tolerance, but also the possible contamination of the tissue with pathogens.
  • pathogens for example, microorganisms such as viruses, bacteria, fungi, protozoa or piones.
  • the method according to the invention can, for example, change the replication ability and the protein structure of cells.
  • the ability of replication means the ability of the cells to divide.
  • the ability to replicate can either be reduced or stopped completely by the pressure treatment, ie the cells can also have been killed, for example, after the treatment by the process described here.
  • Adhesion or enzyme production or release e.g. with the aim of a reduced distribution of
  • Intercellular substance e.g. collagen
  • Tissues are usually cell groups of similarly differentiated cells. This term also includes tissues that to a large extent do not consist of cells and the majority of which consist of intercellular substances. Tissues of this type are, for example, bones which, in addition to cells, largely consist of the organic bone matrix and bone mineral. According to the invention, such tissues are also included which only consist to a small extent of cells, such as bones, cartilage, tendons, ligaments or vessels.
  • the method can be applied to cells or tissues produced by microorganisms are infected or which are associated with microorganisms.
  • microorganisms are understood to mean, for example, viruses, bacteria, protozoa and fungi, in particular, of course, those microorganisms which have a pathogenic potential. Furthermore, cells infected with prions can be treated in such a way that a selective destruction of the pore structure is brought about.
  • the cells treated by the method according to the invention are generally in the form of cell assemblies, preferably tissue assemblies.
  • tissue assemblies preferably organs such as kidneys, heart, liver, spleen, but also the intestine, stomach and bones, tendons, ligaments or vessels are referred to as tissue associations. Bones, tendons and vessels, for example, are preferably treatable according to the invention.
  • the organs treated by the method according to the invention are, for example, autogenous organ preparations which are removed from a patient whose organ is infected by tumor cells, for example, and which are reimplanted after the treatment according to the invention.
  • the method according to the invention can either be used "gently", ie the tumor cells are reduced or killed in their replication ability without influencing the healthy cells, and the tissue treated in this way is re-implanted in the patient.
  • the replication capacity of the malignant cells die after their life cycle without further multiplication and can be broken down by the organism.
  • the cells killed during the pressure treatment or whose replication capacity is reduced can be removed from the remaining tissue before the re-implantation in the patient.
  • the method presented according to the invention should preferably be used - with regard to bone transfer - to reduce allergenic properties, reduce infection risks and to kill tumor cells.
  • the preservation of the basic substance of the bone plays an important role as a lead structure.
  • the method has the advantage that existing pathogens or tumor cells are killed and the body's own tissue is reimplanted, which can serve as the basis for the new growth, for example of the bone.
  • the method can also be used to treat organs from foreign donors, in particular to change those protein structures on the cells which are responsible for a rejection reaction. These are in particular MHC and HLA proteins.
  • organs from foreign donors in particular to change those protein structures on the cells which are responsible for a rejection reaction.
  • MHC and HLA proteins are in particular MHC and HLA proteins.
  • xenogenic organs e.g. from pigs or cattle
  • the treatment here also serves to reduce the natural rejection reaction of the body and thereby to reduce or avoid the administration of immunosuppressive drugs to a minimum.
  • the process is generally carried out in such a way that the cells to be treated, which, as already stated above, are preferably present in tissue associations such as organs, are preferably placed in a physiological medium and surrounded by an envelope.
  • Physiological media are to be understood as media which are known per se and which are normally used for the storage of organs or for the cultivation of cells in cell culture. This is, for example, a physiological saline solution, supplemented, for example, with nutrients, antibiotics, cytostatics, hormones, lyphomkinins, etc.
  • the composition of the surrounding medium naturally depends on the cells to be treated and is known to the person skilled in the art or can be determined by experiment.
  • the tissue for example the bone
  • a sheath without such a medium, which is liquid-tight and is intended to prevent the ingress of liquid from the outside.
  • This is, for example, a plastic cover.
  • the shell itself is surrounded by a medium, which leads to a uniform distribution of the high pressures of over 100 MPa. Without the surrounding medium, the cells would inevitably be completely destroyed. A uniform distribution of the pressures is only ensured by the liquid surrounding them.
  • the liquid is preferably a viscous agent, for example glycol, in combination with water or a mixture of ether and kerosene. Other liquids can be used by a specialist.
  • gaseous media can also be used, which change to a liquid state due to the high pressures used. Examples include propane, butane or carbon dioxide.
  • the cell material to be treated is surrounded not only by one, but by several, at least two shells in order to prevent contamination of the tissue as far as possible.
  • the pressures used according to the invention are over 100 MPa. They are preferably in a range from 100 to 1000 MPa, with pressures in the range from 100 to 500 to 400 to 300 to 250 MPa being preferred. Pressures in the range of 100-300 MPa are particularly preferably used; In this area, depending on the type of cells to be treated and the type of effect to be achieved, the pressures are set by the expert by means of preliminary tests.
  • the pressure treatment according to the invention is composed of three phases, namely a pressure build-up phase, a pressure holding time phase and a pressure reduction phase.
  • the length of the individual phases and the speeds with which the pressure is built up and released are likewise determined by the person skilled in the art depending on the effect to be achieved. For example, it has been found that the pressure can be built up at 100 MPa per minute, followed by a holding time of 5-10 minutes and a pressure reduction phase of 100 MPa per minute. After a waiting time of 5-10 minutes, the pressure treatment is preferably repeated, the repetition being able to take place two to ten times or more until the effect achieved is achieved.
  • Such a repeated pressure treatment according to the invention can achieve a comparable effect to that of a simple pressure treatment, but the pressures used are significantly lower.
  • the pressure in a simple pressure treatment to inhibit the replication ability of cells and / or microorganisms is preferably from 200 MPa, more preferably from 225 MPa, whereas with multiple pressure treatment this effect can be achieved at pressures below 200 MPa, preferably 150 MPa.
  • the repeated repetition of the pressure treatment under more gentle pressure conditions also largely prevents damage to the surrounding tissue.
  • variable pressure treatment is provided according to the invention, with an adaptation to the sample to be treated and a lowering of the pressure compared to one due to the variable design of the pressure program simple pressure treatment can be done.
  • inhibition of the replication ability can preferably be achieved even at pressures below 200 MPa, more preferably 150 MPa.
  • the duration of the pressure treatment is in turn strongly dependent on the cells to be treated and on the type of effect to be achieved.
  • the pressure treatment can take place, for example, for up to three hours, all times from 1 second to 3 hours or even more being conceivable.
  • a period of 5 seconds to 60 minutes has preferably been found, a pressure treatment of 5 seconds to 60 seconds, preferably 5-30 seconds or 5-10 seconds at high pressures of from 200 MPa being preferred.
  • the length of the pressure treatment and the height of the pressure treatment are generally inversely related, i.e. the higher the pressure, the shorter the duration of the treatment and the lower the pressure, the longer the duration of the treatment or lower the pressure and the shorter the duration of the pressure treatment, the more often the procedure has to be repeated.
  • the temperature during the treatment can be from -45 ° C for deep-frozen cell groups to + 150 ° C, whereby of course the physiological temperatures of approx. 37 ° C ⁇ 2 ° C can preferably be used. Temperatures of up to 150 ° C can of course only act on the cells for a short time if it is not desired that they be completely destroyed. The preferred temperature level can also be determined by the person skilled in the art by experiments.
  • the method according to the invention can be used particularly preferably for the treatment of bones, tendons and vessels.
  • bones contaminated with tumor cells can be pressure treated. Since tumor cells divide much more frequently than normal cells, the pressure treatment on cells in the cell division phase is particularly efficient, selectively tumor cells can be killed, while the normal cells are not or not so seriously impaired in their replication ability that their survival would be endangered.
  • tissues such as bone tissue and tendons and vessels are treated in such a way that all cells, including the healthy cells, are destroyed. Material treated in this way is then used again in the patient and serves as a lead structure for building new healthy tissue. Bones or bone parts treated in this way can be used as bone replacement material.
  • part of the cells or tissue is removed from the treated or to be treated tissue prior to treatment and / or implantation.
  • FIGURE 1 Hydrostatic pressure treatment of U-2 OS cells from 125 MPa to 300 MPa. A control group was assigned to each pressure area, which was exposed to normal culture conditions during the pressure treatment period.
  • Figure 2 Representation of the cell number after 48h cultivation of Saos-2 and NIH-3T3 cells after HDB from 150 MPa to 200 MPa. Increasing HD causes a reduction in the viability of all cell lines.
  • FIG. 3 Viability loss of Saos-2 cells and NIH-3T3 cells determined by trypan blue staining (TF) after 48 hours of cultivation. HD's of 175 MPa show no reduction in viability in the TF; HD's above 200 MPa lead to complete loss of viability in both cell lines.
  • Figure 4 Representation of the cell number after 72 h cultivation of Saos-2 cells and NIH-3T3 cells after HDB from 150 MPa to 200 MPa. Measurement of the adherent cells / ml culture medium; After 72 hours of cultivation, further cell growth takes place after 150 MPa HDB; an HDB of 175 MPa reduces the number of adherent cells in both cell rows. From an HDB of 200 MPa, cell adherence can no longer be determined.
  • Figure 5 Illustration of the loss of viability of Saos-2 and NIH-3T3 cells after 72 h of cultivation. Rising hydrostatic pressures cause increased loss of cell line viability; From an HD of 200 MPa, survival of Saos-2 or NIH-3T3 cells could not be demonstrated in any of the cultures.
  • the application of the hydrostatic pressure (HD) was carried out with a pressure applicator from Dunze High Pressure Technology (Hamburg, FRG).
  • the inner diameter of the pressure chamber is 20 mm with any adjustment of the height of the pressure cylinder.
  • the pressure build-up and release rates can be varied with this device.
  • a pressure build-up rate of 100 MPa / mm was chosen for the tests.
  • the maximum hydrostatic pressure set in each test was maintained for 5 minutes (pressure plateau) in all tests.
  • the temperature interval was between 31 ° C and 37 ° C.
  • the pressure chamber was filled with water and 20% glycol.
  • NIH 3T3 cells immortalized fibroblasts from the mouse embrio of the "NIH Swiss mouse", cells of the 126th passage being used for the experiments. The cells were grown in Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) with 10% fetal calf serum without antibiotic addition ,
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle Medium
  • U-2 OS cells are osteosarcoma cells of human origin, hypodiploid with epithelium-like morphology. They come from a 15 year old Caucasian patient whose osteosarcoma len were isolated in 1964. The cells were grown in Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) with 10% fetal calf serum without antibiotics.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle Medium
  • Saos-2 cells are primary human osteosarcoma cells.
  • the cellemia comes from an 11 year old Caucasian patient.
  • the epithelial cells are hyperdiploid to hypopentaploid.
  • the cells were grown in Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) with 10% fetal calf serum without antibiotics.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle Medium
  • the pressure tests were carried out with 7 pressure levels, starting at 150 MPa and increasing by 25 MPa steps up to 300 MPa. At each of the pressure levels, 3 samples of the respective cell membrane were exposed to the corresponding hydrostatic pressure. Cell splitting took place 2 days before the respective pressure test. The cell number of the samples for the pressure experiments before the pressure treatment was 30,000 cells / ml in a 2 ml Eppendorf vessel, which was placed in the pressure chamber for the tests. The cell number was determined before the experiment. After the pressure treatment, the cells were distributed in 24-well culture dishes (Falcon, Becton Dickinson).
  • the viability of the U20S cell line after pressure treatment and 72 h culture was determined in order to determine the pressure range that the cells can withstand, or the pressure range at which cell survival can no longer be guaranteed.
  • the cell number and the cell viability were determined by trypan blue staining in Saos-2 and in NIH 3T3 cells after 48h and 72h certainly.
  • a control sample (cells without pressure treatment) was carried with each experiment. The control samples were assessed according to the assessment criteria of pressure-treated cells. Each sample that was placed in the pressure vessel contained the above cell number and DMEM cell culture medium. The effects of pressure build-up and breakdown rates were not included in the studies.
  • the loss of viability of human Saos-2 cells and mu ⁇ nen NIH-3T3 cells determined by means of trypan blue staining shown in FIG. 3 only showed a reduction in cell viability in Saos-2 cells of 33% of the initial value before pressure treatment and in NIH-3T3 from an HDB of 200 MPa Cells a reduction of 66% of the total cell number. At lower pressures of 175 MPa, no reduction in viability was found using trypain blue staining; the HDB of 225 MPa caused a complete loss of cell viability in both cell lines.
  • both cell lines were able to show m culture after HDB with 150 MPa growth (see FIG. 4).
  • a cell count of 60,000 / ml was paid for both cell lines, caused by further cell growth after pressure treatment.
  • An increase in the HDB to 175 MPa led to one Reduction of cell growth in Saos-2 and NIH-3T3 cells to 10000 / ml within 72 hours of cultivation.
  • After treatment of the cells with an HD of 200 MPa a complete loss of adherence of all cultivated cells could be achieved.
  • the control sample had a cell count of 100,000 cells / ml after 72 hours of cultivation.
  • NIH 3T3 cells show higher loss of viability, measured with trypan blue staining of the cells, than Saos-2 cells, the adhesion behavior after HDB with 150 MPa and 175 MPa of the two cell lines showing no significant differences.
  • the number of living, adherent Saos-2 cells after 48h culture and 175 MPa HDB is reduced up to 72h, so that a sublethal damage of the cells present after 48h culture and 175 MPa HDB must be postulated in Saos-2 cells, which is not caused by trypan blue staining of the cells could still be detected by determining the adhesion behavior after 48 hours of culture.
  • the same could be observed with NIH 3T3 cells in the HD range of 175 MPa.
  • Saos-2 and NIH 3T3 cells showed increased staining with trypan blue after 72 h, so that cell damage can also be assumed in this pressure range, which cannot be determined after 48 h by assessing the adhesion and trypan blue staining.
  • the tests we have carried out show that vital cells can withstand previously unknown, high hydrostatic pressures in a study period of up to 72 hours after HDB.
  • the pressure ranges that cause lethal damage to the examined cell lines depend on the one hand on the level of the applied pressure and on the other hand also show cell-specific differences.
  • HDB as a method for killing microorganisms in vital tissue, is a possibility of being used as a therapeutic method. It makes sense to use higher or lower temperatures as a further physical variable during the HDB, since bacteria are much more sensitive to high pressures at temperatures higher than 35 ° C and at temperatures near freezing point. The use of longer pressure plateaus as well as faster pressure build-up and pressure reduction rates are further possibilities to find an area which allows selective damage to microorganisms.
  • bone cylinders with a diamond-coated special milling cutter were removed from paired human femur bones, ie from the femoral neck (along the longitudinal axis) and the distal epiphysis (transverse).
  • the size the cylinder was 7.5 mm in diameter and 15 mm in length.
  • the mechanical test was carried out in a universal test machine with specially designed brackets in the form of a pressure test with 20 samples of untreated, 150 MPa high-pressure treated and 225 MPa high-pressure treated bone cylinders, each in a side comparison.
  • the pressure treatment was among the above. Conditions carried out.
  • Crosshead speed 0.1 m / s. Surprisingly, there was no significant reduction with 150 MPa pressure treatment and only a slight reduction in the breaking load of 15% with 225 MPa pressure treatment.

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Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Veränderung der Replikationsfähigkeit und/oder der Proteinstruktur von menschlichen oder tierischen Zellen und/oder menschlichem oder tierischem Gewebe und/oder von in oder mit den Zellen und/oder dem Gewebe vorliegenden Mikroorganismen oder Prionen, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen und/oder das Gewebe und/oder die in oder mit diesen Zellen vorliegenden Mikroorganismen Drücken von über 100 MPa in einem bei diesen Drücken flüssigen Medium ausgesetzt werden.

Description

DRUCKBEHA-STDLU GSVERFAHREN VON ZELLEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Veränderung der Replikationsfahigkeit und/oder der Proteinstruktur von menschlichen oder tierischen Zellen und/oder Geweben und/oder von in oder mit den Zellen vorliegenden Mikroorganismen oder Pπonen, durch Hochdruckbehandlung.
Die Anwendung der Hochdrucktechnologie im Druckbereich von 100 Mega Pascal (MPa) bis 1000 MPa gewinnt m der Lebensmitteltechnologie seit einigen Jahren an zunehmender Bedeutung. Die industrielle Verwendung dieser Technologie zur Haltbarmachung von Lebensmitteln basiert auf der Möglichkeit eine Inaktivierung von Mikroorganismen zu erzielen, ohne dabei die Geschmacksqualltat vieler behandelter Nahrungsstoffe wesentlich zu beeinträchtigen. Zwei grundlegende Prinzipien liegen der Hochdrucktechnologie zu Grunde:
Das Prinzip von Le Cha tel ier bildet die wichtigste Grundlage zum Verständnis druckinduzierter Einflüsse auf chemische Reaktionen. Dieses Prinzip besagt, daß unter Gleichgewichtsbedm- gungen Reaktionen, die mit einer Volumenabnahme gekoppelt sind, durch Druck gefordert werden. Temperatur und Druck beeinflussen d e Kinetik chemischer Reaktionen. Die Ursache ist die Änderung des chemischen Potentials der beteiligten Substanzen. Für die Lage des Gleichgewichtes ist die Änderung des Reaktionsvol umens AV entscheidend. Unter Druck wird das Gleichgewicht der Reaktion m Richtung des koMPaktesten Zu- standes verschoben. Die Auswirkung einer Druckerhohung auf die Reaktionsgeschwindigkeit und damit auf die Geschwindigkeitskonstante kx hangt mit der Änderung des Aktivierungsvolumens
(ΔV*) zusammen. Die Geschwindigkeitskonstante k nimmt zu, wenn das Aktivierungsvolumen einen negativen Wert annimmt und umgekehrt. Diese beiden Zusammenhange werden in den Gleichungen
(2.1) und (2.2) dargestellt.
- RT(d \nK dP)τ = ÄV (2.1)
- RT(d \n k dP)τ = AV' (2.2)
Das zweite grundlegende Prinzip ist das der Isostatik, welches besagt, daß Druck gleichmaßig und unverzüglich auf einen Korper und auf das Innere eines Korpers wirkt. Somit ist der Druckaufbau unabhängig von der Zeit.
Der Hydrostatische Druck wird mit Hilfe einer Pumpe in einem dafür geeigneten Stahlzylmder erzeugt. Die Aufrechterhaltung eines bestimmten Drucks für einen definierten Zeitraum erfordert keine zusätzliche Energie. Unter Druck verandern sich physikalische und chemische Eigenschaften von Wasser, wie z.B. Dichte, Ionendissoziation, pH-Wert und der Schmelzpunkt von Eis. Makromolekulare Konformationsanderungen, Strukturveranderungen von Zellmembranen und verändertes Kristallisierungsverhalten gehen mit einer Volumenabnahme einher und werden durch Druck beschleunigt. Durch Hochdruckbehandlung können zum einen verschiedene Enzyme inaktiviert werden (ATPasen von Mikroorganismen, Actomyosm- und Myosm ATPasen im Fischmuskel), andererseits kommen nahezu baroresistente Enzyme vor (Lipooxigena- se, Peroxidase), die ihre Aktivität unter Druck kaum andern. Forschungsaktivitaten sind bisher in der Lebensmitteltechnolo- gie im Bereich der Inaktivierung von Mikroorganismen durch Hochdruckbehandlung unternommen worden. Im Gegensatz dazu liegen bisher keinerlei Untersuchungen vor, die das Verhalten humaner Zellen unter Druckbehandlung beschreiben. Theoretisch ergeben sich unterschiedliche Ansätze für Untersuchungen an menschlichen Zellen und Geweben, wie z.B. Hochdruckbehandlung von Lungengewebe und Gefaßendothel im Bereich der Baromedizm, Hochdruckbehandlung von Knochen im Rahmen der Osteomyelitis, Hochdruckbehandlung von Tumorzellen im Bereich der onkologischen Forschung um nur einige Ansätze zu nennen.
In der Transplantationschirurgie ist es Stand der Technik, daß vor einer Transplantation die Gewebevertraglichkeit zwischen Spender und Empfanger untersucht wird. Erst wenn diese Untersuchung zeigt, daß der MHC (Major histocoMPatibility complex) und das HLA (Human leucocyte locus) von Spender und Empfanger weitgehend übereinstimmen, wird eine Transplantation durchgef hrt. Trotz dieser Untersuchungen ist es lediglich bei Autotransplantaten und Synotransplantaten möglich , eine Abwehrreaktion des Immunsystems gegen das Transplantat gänzlich auszuschließen. Aus diesem Grund werden Patienten bei Transplantationen lmmunsupprimierende Medikamente, wie beispielsweise Cyclosporin, verabreicht, die das Immunsystem soweit supprimieren, daß keine Abwehrreaktion mehr stattfindet .
Der Nachteil dieser Methode liegt darin, daß das Immunsystem des Transplantatempfangers durch die Supprimierung auch in seiner Funktionalitat gegenüber pathogenen Mikroorganismen stark eingeschränkt ist. So kommt es bei Transplantations- patienten vielfach zu Infektionserkrankungen. Insbesondere in den ersten Tagen nach der Transplantation werden lmmunsupprimierende Medikamente m hohen Dosen verabreicht, da es insbesondere n diesen ersten Tagen zu einer Abstoßung des Transplantates kommen kann. Durch diese Immunsystemsuppnmierung kommt es häufig zu Infektionen, die in vielen Fallen zum Tode fuhren.
Ein weiterer Nachteil bei der Transplantation von Geweben ist nicht nur die mangelnde Gewebevertraglichkeit , sondern auch die mögliche Kontamination des Gewebes mit Krankheitserregern. Hierbei handelt es sich beispielsweise um Mikroorganismen wie Viren, Bakterien, Pilze, Protozoen oder Pπonen.
Ein weiterer Nachteil bei der Transplantation von Geweben ist die mögliche Kontamination mit Tumorzellen. So wäre es wünschenswert, um Abstoßungsreaktionen weitgehend zu vermeiden, Tumorgewebe aus einem Patienten zu entnehmen, die Tumorzellen weitestgehend so zu eliminieren, daß ein weiteres Wachstum ausgeschlossen ist, und dieses Gewebe anschließend wieder m den Patienten einzubringen.
Alternativ zur Transplantation wird derzeit nach wie vor die Bestrahlung zur Tumorbehandlung eingesetzt. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß neben dem Tumorgewebe auch gesundes Gewebe in starkem Ausmaß zerstört wird. Überdies tritt bei diesem Verfahren eine starke Strahlenbelastung beim Patienten auf.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren weisen, wie oben beschrieben, gravierende Nachteile auf.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, welches diese Nachteile weitgehend vermeidet oder doch zumindest deutlich verringert, so daß die mit einer Transplantation verbundenen Gefahren entweder ganzlich eliminiert oder zumindest in akzeptabler Weise vermindert werden .
Diese Aufgabe wird durch das erfmdungsgemaße Verfahren nach Anspruch 1 gelost, wobei menschliche und/oder tierische Zellen und/oder menschliches oder tierisches Gewebe und und/oder die m oder mit diesen Zellen und/oder dem Gewebe vorliegenden Mikroorganismen oder Prionen Drucken von über 100 MPa ausgesetzt werden. Die Zellen sind dabei von einem Medium umgeben, welches bei diesen Drucken flussig ist.
Weitere Ausgestaltungsformen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung, den Patentansprüchen sowie den Ausfuhrungsbeispielen. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die nachfolgend genannten Beispiele und bevorzugten Ausgestaltungen beschrankt.
Durch das erfmdungsgemaße Verfahren können beispielsweise die Replikationsfahigkeit und die Proteinstruktur von Zellen verändert werden. Unter Replikationsfahigkeit wird erfmdungs- gemaß die Fähigkeit der Zellen verstanden, sich zu teilen. Durch die Druckbehandlung kann die Replikationsfahigkeit entweder vermindert oder völlig gestoppt werden, d.h. die Zellen können nach der Behandlung durch das hier beschriebene Verfahren z.B. auch abgetötet worden sein. Es ist aber auch möglich, durch gezielte Auswahl der Parameter des hier beschriebenen Verfahrens, also durch Steuerung sowohl der Hohe der Drucke, der Temperatur, der Einwirkungsdauer der Drucke, durch Auswahl der die Zellen umgebenden Medien, durch verschiedene pH-Werte sowie durch mehrfache Wiederholung der Druckeinwirkung das Verfahren so zu steuern, daß die nachfolgenden Wirkungen, entweder einzeln oder in Kombination, erzielbar sind: Verminderung der Replikationsfahigkeit von Zellen und/oder Mikroorganismen;
Abtotung der Zellen und Mikroorganismen;
Veränderung der Proteinstruktur von Zellen, beispielsweise der MHC-Molekule oder HLA-Molekule, um das immunogene Potential der Zellen zu beeinflussen;
Selektive Abtotung von Tumorzellen;
Änderung der Struktur von Prionen, so daß sie ihr pathogenes Potential verlieren;
Veränderung von Zellleistungen wie zum Beispiel der
Adhäsion oder der Enzymproduktion bzw. -ausschuttung, z.B. mit dem Ziel einer verminderten Ausschuttung von
Proteasen;
Veränderung von biologischen Eigenschaften der
Interzellularsubstanz (z.B. Kollagen);
Veränderung des Zellverbundes zur Auflosung von Geweben;
Veränderung der mechanischen Eigenschaften von Geweben;
Veränderung der Tertiär- und Quartarstruktur von
Proteinen.
Das Verfahren kann bei menschlichen und tierischen Zellen oder Geweben angewendet werden. Bei Gewebe handelt es sich in der Regel um Zellverbande gleichartig differenzierter Zellen. Unter diesen Begriff fallen aber auch solche Gewebe, die zu einem größeren Teil nicht aus Zellen bestehen und der größte Anteil aus Interzellularsubstanz besteht. Derartige Gewebe sind beispielsweise Knochen, die neben Zellen zum größten Teil aus der organischen Knochenmatrix und Knochenmineral bestehen. Erfindungsgemaß sind auch derartige Gewebe umfaßt, die nur zu einem geringen Anteil aus Zellen bestehen, wie Knochen, Knorpel, Sehnen, Bander oder Gefäße. Das Verfahren kann bei Zellen oder Geweben angewendet werden, die von Mikroorganismen befallen sind oder die mit Mikroorganismen vergesellschaftet sind. Unter Mikroorganismen sind erf dungsgemaß beispielsweise Viren, Bakterien, Protozoen und Pilze zu verstehen, insbesondere natürlich solche Mikroorganismen, die ein pathogenes Potential besitzen. Weiterhin können mit Prionen befallene Zellen derart behandelt werden, daß eine selektive Zerstörung der Pπonenstruktur bewirkt wird.
Die durch das erfmdungsgemaße Verfahren behandelten Zellen liegen im allgemeinen in Form von Zellverbanden, bevorzugt also Gewebeverbanden, vor. Als Gewebeverbande werden beispielsweise Organe bezeichnet, wie Niere, Herz, Leber, Milz, aber auch Darm, Magen sowie Knochen, Sehnen, Bander oder Gefäße. Erf dungsgemaß bevorzugt behandelbar sind beispielsweise Knochen, Sehnen und Gefäße.
Die durch das erfmdungsgemaße Verfahren behandelten Organe sind beispielsweise autogene Organpraparate, die einem Patienten, dessen Organ beispielsweise von Tumorzellen befallen ist, entnommen werden und nach der erfindungsgemaßen Behandlung wieder reimplantiert werden. Das erfindungsgemaße Verfahren kann entweder "schonend" angewendet werden, d.h. die Tumorzellen werden möglichst selektiv, ohne die gesunden Zellen zu beeinflussen, m ihrer Replikationsfahigkeit herabgesetzt oder abgetötet, und das derart behandelte Gewebe wird dem Patienten wieder implantiert. Die in ihrer Replikationsfahigkeit suppnmierten malignen Zellen sterben nach ihrem Lebenszyklus ab, ohne sich weiter zu vermehren und können vom Organismus abgebaut werden. Wahlweise können die bei der Druckbehandlung abgetöteten oder in ihrer Replikationsfahigkeit herabgesetzten Zellen vor der Reimplantierung in den Patienten von dem restlichen Gewebe entfernt werden. Es ist aber auch möglich, die entnommenen Gewebeteile wie Knochen, Sehnen und Gefäße einer solchen Druckbehandlung zu unterziehen, daß praktisch alle vorhandenen lebenden Zellen abgetötet werden. Das verbleibende, nicht mehr lebensfähige Gewebe wird dann in den Patienten implantiert und dient als Leitstruktur für den Aufbau neuer Knochensubstanz, neuer Sehnen und neuer Gefäße. Auch im Fall der Transplantation von Knochen, Sehnen oder Gefäßen, wobei praktisch alle lebenden Zellen abgetötet werden, ist erf dungsgemaß vorgesehen, daß nach der erfmdungsgemaßen Druckbehandlung abgetötete Zellen vor der Implantation zumindest teilweise entfernt werden, falls erforderlich. Besonders bewahrt hat sich die Verwendung von bertragenem Knochen als Leitsubstanz (sog. osteokonduktiver oder osteomduktiver Effekt) .
Die Übertragung des Knochens als Leitsubstanz ist bereits seit langem bekannt. Übertragener (allogener) Knochen wird „schleichend" umgebaut und der übertragene Knochen dient somit als Leitstruktur. Weitere Untersuchungen konnten die zugrunde liegenden Mechanismen aufklaren. Allogene Knochensegmente haben jedoch aufgrund der Antigen-Eigenschaften und resultierender Abwehrreaktionen den Nachteil, nur erheblich verzögert einzuwachsen im Vergleich zu körpereigenen, d.h. autogenen Transplantaten.
Anhand von keramisierten Knochensegmenten konnte nachgewiesen werden, daß die Mineralsubstanz des Knochens als Leitschiene für die Knochenneubildung dient (Mittelmeier, W., 1992, Demeter Verlag, Monographie Kochenneubildung im ersatzschwachen Lager) . Um den allogenen Knochen in optimierter Form (weniger Abwehrreaktion) und unter Minderung des Infektions- und Tumorrisikos übertragen zu können, wurden zahlreiche Versuche unternommen, den Knochen physikalisch und chemisch aufzubereiten (Übersicht der betreffenden Literatur in der Monographie von Mittelmeier, W., 1992, Demeter Verlag, Monographie Knochenneubildung im ersatzschwachen Lager) .
Um den Knochen nach Tumorbefall von dem betreffenden
Ubertragungsrisiko des Tumors befreien zu können (durch
Abtotung aller Zellen) , wurden bereits ionisierende Strahlen versucht .
Das erfindungsgemaß vorgestellte Verfahren soll bevorzugt - bezüglich der Knochenübertragung - zur Minderung allergener Eigenschaften, Reduktion von Infektionsrisiken und zur Abtotung von Tumorzellen eingesetzt werden. Dabei spielt die Erhaltung der Grundsubstanz des Knochens als Leitstruktur eine wesentliche Rolle.
Das Verfahren hat den Vorteil, daß vorhandene Krankheitserreger oder Tumorzellen abgetötet und körpereigenes Gewebe reimplantiert wird, welches als Grundlage für das neue Wachstum, beispielsweise des Knochens, dienen kann.
Das Verfahren kann jedoch auch dazu benutzt werden, Organe von fremden Spendern zu behandeln, um insbesondere diejenigen Proteinstrukturen auf den Zellen zu verändern, die für eine Abstoßungsreaktion verantwortlich sind. Hierbei handelt es sich insbesondere um MHC- und HLA- Proteine. Es ist neben allogenen Geweben aber auch möglich, xenogene Organe (beispielsweise aus Schweinen oder Rindern) zu behandeln, die an einen menschlichen Empfanger transplantiert werden sollen. Die Behandlung dient hier ebenfalls dazu, die naturliche Abstoßungsreaktion des Korpers zu vermindern und hierdurch die Verabreichung immunsuppπmierender Medikamente auf ein Mindestmaß zu reduzieren oder zu vermeiden.
Das Verfahren wird im allgemeinen so durchgeführt, daß die zu behandelnden Zellen, die, wie bereits oben ausgeführt, bevorzugt m Gewebeverbanden wie Organen vorliegen, bevorzugt in ein physiologisches Medium gegeben und von einer Hülle umgeben werden. Unter physiologischen Medien sind solche an sich bekannten Medien zu verstehen, die üblicherweise zur Aufbewahrung von Organen oder zur Kultivierung von Zellen in der Zellkultur eingesetzt werden. Hier handelt es sich beispielsweise um physiologische Kochsalzlosung, supplementiert beispielsweise mit Nährstoffen, Antibiotika, Zytostatika, Hormonen, Lyphomkinen usw. Die Zusammensetzung des umgebenden Mediums hangt naturlich von den zu behandelnden Zellen ab und ist dem Fachmann bekannt oder kann durch Versuche ermittelt werden. Das Gewebe, beispielsweise der Knochen, kann aber auch direkt ohne ein derartiges Medium von einer Hülle umgeben sein, die flussigkeitsdicht sein und ein Eindringen von Flüssigkeit von außen verhindern soll. Hierbei handelt es sich beispielsweise um eine Kunststoffhülle. Die Hülle selbst ist von einem Medium umgeben, was zu einer gleichmaßigen Verteilung der hohen Drucke von über 100 MPa führt. Ohne das umgebende Medium wurden die Zellen zwangsläufig völlig zerstört werden. Nur durch die sie umgebende Flüssigkeit wird eine gleichmaßige Verteilung der Drucke sichergestellt. Bei der Flüssigkeit handelt es sich bevorzugt um viskose Mittel, beispielsweise Glykol, in Verbindung mit Wasser oder ein Gemisch aus Ether und Kerosin. Weitere Flüssigkeiten können vom Fachmann eingesetzt werden. Anstatt flussiger Medien können auch gasformige Medien eingesetzt werden, die durch die angewendeten hohen Drucke in einen flussigen Zustand übergehen. Beispiele hierfür sind Propan, Butan oder Kohlendioxid.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist das zu behandelnde Zellmaterial nicht nur von einer, sondern von mehreren, zumindest zwei Hüllen umgeben, um eine Kontamination des Gewebes soweit wie möglich zu verhindern.
Die erfindungsgemaß eingesetzten Drücke liegen bei über 100 MPa. Bevorzugt liegen sie in einem Bereich von 100 - 1000 MPa, wobei Drucke im Bereich von 100 - 500, bis 400, bis 300, bis 250 MPa bevorzugt sind. Insbesondere bevorzugt werden Drücke im Bereich von 100 - 300 MPa eingesetzt; in diesem Bereich werden je nach Art der zu behandelnden Zellen und nach Art der zu erzielenden Wirkung die Drücke durch Vorversuche vom Fachmann eingestellt.
In Vorversuchen hat sich beispielsweise herausgestellt, daß eine deutliche Hemmung der Replikationsfahigkeit der Zellen ab ungefähr 150 MPa einsetzt, wobei eine erhebliche Reduktion der Replikationsfahigkeit und damit der Uberlebensfahigkeit der Zellen ab 175 MPa erzielbar ist und, beispielsweise bei Fibroblastenzellen in der Zellkultur, ab 225 MPa keine überlebenden Zellen mehr nachweisbar sind. Der Fachmann wird, um die optimalen Drucke zu ermitteln, die geeignet sind, eine bestimmte Wirkung zu erzielen, Vorversuche an gleichen oder vergleichbaren Zellen, Geweben und/oder Organen vornehmen. Die Ergebnisse der Druckbehandlung werden durch geeignete Kontrollexperimente, beispielsweise durch Messung der Enzymexpression, der Replikationsfahigkeit, der Abstoßungsrate, des Wachstums von Tumorzellen und durch die Vielzahl der zur Verfugung stehenden biochemischen, einer Analysetechnik zugänglichen Parameter, überprüft.
Die erfmdungsgemaße Druckbehandlung setzt sich aus drei Phasen zusammen, nämlich einer Druckaufbauphase, einer Druckhaltezeitphase und einer Druckabbauphase. Die Lange der einzelnen Phasen und die Geschwindigkeiten, mit der der Aufbau und der Abbau des Druckes erfolgt, werden ebenfalls vom Fachmann in Abhängigkeit von der zu erzielenden Wirkung bestimmt. So hat sich beispielsweise herausgestellt, daß der Druckaufbau mit 100 MPa pro Minute, gefolgt von einer Haltezeit von 5 - 10 Minuten und einer Druckabbauphase von 100 MPa pro Minute erfolgen kann. Nach einer Wartezeit von 5 - 10 Minuten wird bevorzugt die Druckbehandlung wiederholt, wobei die Wiederholung zwei bis zehn mal oder öfter erfolgen kann, bis die erzielte Wirkung erreicht wird. Durch eine derartige wiederholte Druckbehandlung kann erfindungsgemaß eine vergleichbare Wirkung erzielt werden, wie bei einer einfachen Druckbehandlung, wobei jedoch die eingesetzten Drucke deutlich darunter liegen. Beispielsweise betragt der Druck bei einer einfachen Druckbehandlung zur Hemmung der Replikationsfahigkeit von Zellen und/oder Mikroorganismen bevorzugt ab 200 MPa, bevorzugter ab 225 MPa, wohingegen bei mehrfacher Druckbehandlung diese Wirkung bei Drucken unter 200 MPa, bevorzugt 150 MPa, erreicht werden kann. Durch die mehrmalige Wiederholung der Druckbehandlung unter schonenderen Druckbedingungen wird überdies eine Schädigung des umgebenden Gewebes weitgehend verhindert.
Ebenso ist erfindungsgemaß eine variable Druckbehandlung vorgesehen, wobei aufgrund der variablen Gestaltung des Druckprogramms eine Anpassung an die zu behandelnde Probe sowie eine Erniedrigung des Drucks im Vergleich zu einer einfachen Druckbehandlung erfolgen kann. Auch bei einer variablen Druckgestaltung kann bspw. eine Hemmung der Replikationsfahigkeit bevorzugt schon bei Drucken unter 200 MPa, bevorzugter 150 MPa, erreicht werden.
Die Dauer der Druckbehandlung ist wiederum stark von den zu behandelnden Zellen und von der Art der zu erzielenden Wirkung abhangig. Die Druckbehandlung kann beispielsweise bis zu drei Stunden lang erfolgen, wobei alle Zeiten von 1 Sekunde bis zu 3 Stunden oder auch mehr denkbar sind. Bevorzugt hat sich em Zeitraum von 5 Sekunden bis 60 Minuten herausgestellt, wobei eine Druckbehandlung von 5 Sekunden bis 60 Sekunden, bevorzugt 5 - 30 Sekunden oder 5 - 10 Sekunden bei hohen Drucken von ab 200 MPa bevorzugt wird. Die Lange der Druckbehandlung und die Hohe der Druckbehandlung stehen im allgemeinen im umgekehrten Verhältnis zueinander, d.h. je hoher der Druck, desto kurzer die Zeitdauer der Behandlung und je niedriger der Druck, desto langer die Zeitdauer der Behandlung bzw. e geringer der Druck und je kurzer die Zeitdauer der Druckbehandlung, desto häufiger ist das Verfahren zu wiederholen.
Die Temperatur wahrend der Behandlung kann von -45 °C bei tiefgefrorenen Zellverbanden bis +150°C liegen, wobei natürlich bevorzugt die physiologischen Temperaturen von ca. 37°C ± 2°C einsetzbar sind. Temperaturen bis 150°C können selbstverständlich nur kurzzeitig auf die Zellen einwirken, wenn nicht erwünscht ist, daß deren vollständige Zerstörung erfolgt. Auch die bevorzugte Temperaturhohe kann vom Fachmann durch Versuche festgestellt werden.
Besonders bevorzugt kann das erfmdungsgemaße Verfahren zur Behandlung von Knochen, Sehnen und Gefäßen eingesetzt werden. Beispielsweise können mit Tumorzellen kontaminierte Knochen druckbehandelt werden. Da Tumorzellen sich wesentlich häufiger teilen als die normalen Zellen, die Druckbehandlung auf Zellen in der Zellteilungsphase besonders effizient wirkt, können selektiv Tumorzellen abgetötet werden, wahrend die Normalzellen in ihrer Replikationsfahigkeit nicht oder nicht so gravierend gestört werden, daß ihr Überleben gefährdet wäre. Bei einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform werden Gewebe wie Knochengewebe und Sehnen und Gefäße so behandelt, daß sämtliche Zellen, also auch die gesunden Zellen, zerstört werden. Derart behandeltes Material wird dann in den Patienten wieder eingesetzt und dient als Leitstruktur zum Aufbau neuen gesunden Gewebes. Derart behandelte Knochen oder Knochenteile können als Knochenersatzmaterial zum Einsatz kommen. Wahlweise wird vor der Behandlung und/oder der Implantation em Teil der Zellen oder des Gewebes von dem behandelten oder zu behandelnden Gewebe entfernt.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausfuhrungsbei- spielen naher erläutert. Die Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschrankt.
Es wird auf die folgenden Figuren Bezug genommen:
FIGUR 1: Hydrostatische Druckbehandlung von U-2 OS Zellen von 125 MPa bis 300 MPa. Jedem Druckbereich ist eine Kontrollgruppe zugeordnet, die im Zeitraum der Druckbehandlung normalen Kulturbedingungen ausgesetzt war.
Figur 2 : Darstellung der Zellzahl nach 48h Kultivierung von Saos-2- und NIH-3T3 Zellen nach HDB von 150 MPa bis 200 MPa. Steigender HD verursacht eine Reduktion der Viabilitat aller Zelllinien.
Figur 3 : Durch Trypanblau-Farbung (TF) ermittelter Viabili- tatsverlust von Saos-2 Zellen und NIH-3T3 Zellen nach 48h Kultivierung. HD's von 175 MPa zeigen in der TF keine Reduktion der Viabilitat; HD's ab 200 MPa fuhren zum vollständigen Viabilitatsverlust beider Zelllinien.
Figur 4 : Darstellung der Zellzahl nach 72h Kultivierung von Saos-2 Zellen und NIH-3T3 Zellen nach HDB von 150 MPa bis 200 MPa. Messung der adharenten Zellen/ml Kulturmedium; Nach 72h Kultivierung erfolgt weiteres Zellwachstum nach 150 MPa HDB; eine HDB von 175 MPa reduziert die Anzahl adharenter Zellen beider Zellreihen, Ab einer HDB von 200 MPa kann keine Adhärenz von Zellen mehr festgestellt werden.
Figur 5: Darstellung des Viabilitatsverlusts von Saos-2- und NIH-3T3-Zellen nach 72h Kultivierung. Steigende hydrostatische Drucke verursachen vermehr-ten Viabilitatsverlust der Zelllinien; ab einem HD von 200 MPa konnte bei keiner der Kulturen ein überleben von Sa- os-2- oder NIH-3T3 Zellen nachgewiesen werden.
BEISPIELE
Zur Beurteilung, welchen hydrostatischen Drücken murine und humane Zellen standhalten können, wurden drei unterschiedliche immortalisierte Zellreihen gewählt. Da bisher keine Anhaltspunkte für das Verhalten muriner und humaner Zellen vorliegen, wurde primär versucht, Druckbereiche zu ermitteln, denen die o.g. Zelllmien standhalten können. Weiterhin sollte untersucht werden, ob die Zellen unterschiedlich auf den applizierten Druck reagieren.
Material und Methode
Die Applikation des hydrostatischen Drucks (HD) erfolgte mit einem Druckapplikator der Firma Dunze Hochdrucktechnik (Hamburg, FRG) . Der Innendurchmesser der Druckkammer betragt 20 mm bei beliebiger Einstellung der Hohe des Druckzylinders. Die Druckaufbau- und Abbauraten können mit diesem Gerat variiert werden. Bei den Versuchen wurde eine Druckaufbaurate von 100 MPa/Mmute gewählt. Der bei jedem Versuch festgelegte maximale hydrostatische Druck wurde bei allen Versuchen für 5 Minuten (Druckplateau) aufrechterhalten. Das Temperaturintervall lag zwischen 31° C und 37 °C. Die Druckkammer war mit Wasser und 20% Glykol gefüllt.
Zelllinien und Zellkulturmedien
Hydrostatische Drucke wurden an drei unterschiedlichen Zellli- nien getestet. Dabei handelte es sich um:
1. NIH 3T3 Zellen, immortalisierte Fibroblasten vom Mause Embrio der „NIH Swiss mouse" , wobei für die Versuche Zellen der 126 ten Passage verwendet wurden. Die Kultur der Zellen erfolgte in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kalberserum ohne Antibiotikazusatz.
2. U-2 OS Zellen sind Osteosarkomzellen humanen Ursprungs, hy- podiploid mit epithelahnlicher Morphologie. Sie entstammen einer 15 jahrigen kaukasischen Patientin, deren Osteosarkomzel- len 1964 isoliert wurden. Die Kultur der Zellen erfolgte in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kalberserum ohne Antibiotikazusatz.
3. Saos-2 Zellen sind primäre, humane Osteosarkomzellen . Die Zelllmie stammt von einer 11 jahrigen kaukasischen Patientin. Die epithelahnlichen Zellen sind hyperdiploid bis hypopen- taploid. Die Kultur der Zellen erfolgte m Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kalberserum ohne Antibiotikazusatz .
Hydrostatische Druckbehandlung (HDB)
Die Druckversuche erfolgten mit 7 Druckstufen, beginnend bei 150 MPa, m 25 MPa Schritten steigernd bis 300 MPa. Bei jeder der Druckstufen wurden 3 Proben der jeweiligen Zelllmie dem entsprechenden hydrostatischen Druck ausgesetzt. Das Zell- splittmg erfolgte 2 Tage vor dem jeweiligen Druckversuch. Die Zellzahl der Proben für die Druckexperimente betrug vor der Druckbehandlung bei allen Versuchen 30000 Zellen/ml in einem 2ml Eppendorfgefaß, welches für die Versuche in die Druckkammer gegeben wurde. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte vor dem Versuch. Nach der Druckbehandlung erfolgte die Verteilung der Zellen in 24 Loch Kulturschalen (Falcon, Becton Dickin- son) . In einem ersten Versuch wurde die Viabilitat der Zellli- nie U20S nach Druckbehandlung und 72h Kultur bestimmt um den Druckbereich zu ermitteln, dem die Zellen standhalten können, bzw. den Druckbereich zu ermitteln, bei dem em Überleben der Zellen nicht mehr gewahrleistet ist. In einem zweiten Versuch wurde die Zellzahl sowie die Zellviabilitat durch Trypanblau- farbung bei Saos-2 - und bei NIH 3T3 Zellen nach 48h und 72h bestimmt. Bei jedem Versuch wurde eine Kontrollprobe (Zellen ohne Druckbehandlung) mitgeführt. Die Beurteilung der Kontrollproben erfolgte entsprechend den Beurteilungskriterien druckbehandelter Zellen. Jede Probe die in den Druckbehälter gegeben wurde enthielt die o.g. Zellzahl und DMEM Zellkulturmedium. Nicht in die Untersuchungen eingeschlossen waren Auswirkungen der Druckaufbau- und Abbaurate.
In der ersten Versuchsreihe wurden U-2 OS Zellen mit hydrostatischem Druck, ausgehend von 125 Megapascal (MPa) in 25 MPa Stufen steigernd bis 300 MPa, behandelt. Nach hydrostatischer Druckbehandlung von 125 MPa wurde nach 72h Kultur eine Vermehrung von U-2 OS Zellen festgestellt. Die Zellzahl hatte sich von initial 30000 Zellen vor der HDB auf 83000 Zellen/ml nach 72h Kultur vergrößert. Nach Steigerung der Druckbelastung auf 150 MPa war weiterhin ein Zellwachstum möglich, jedoch wurde eine im Vergleich zur 125 MPa HD reduzierte Zellmenge von 73000 Zellen/ml beobachtet. Die HDB mit 175 MPa verursachte eine weitere Reduktion der Zellzahl nach 72h Kultur auf 35000 Zellen/ml. Die Steigerung des HD auf 200 MPa verursachte eine 100%ige Viabilitätsreduktion der Zellen. Bei einer Kontrollprobe, die keiner Druckbehandlung ausgesetzt war, wurde nach 72h Kultur eine Zellzahl von über 250 000 Zellen/ml beobachtet. Die Versuchungsergebnisse sind in Figur 1 dargestellt.
In einer zweiten Versuchsreihe wurden humane Saos-2 Osteosar- komzellen und murine NIH-3T3 Mäusefribroblasten hydrostatischen Drücken, beginnend bei 150 MPa mit Steigerung der Druckstufen um 25 MPa bis 300 MPa ausgesetzt. Nach 72h Kultur konnte bei den mit einer HDB von 200 MPa behandelten Zellen kein Überleben beobachtet werden, weshalb die graphische Darstellung der 72h-Werte (siehe Figur 4) nur HD von maximal 200 MPa mit einbezieht. Beeinflussung der Zellviabilitat
Nach HDB von 150 MPa wurde nach 48h Kultur bei beiden Zellli- nien kein Zelluntergang beobachtet. Die Zellzahl betrug bei beiden Zelllmien 30000/ml. Wurde der HD auf 175 MPa gesteigert, zeigte sich nach 48h Kultur eine Reduktion der Zellzahl bei Saos-2 Zellen auf 24000/ml und bei NIH-3T3 Zellen auf 20000/ml. Eine HDB von 200 MPa fuhrt zu einer Viabilitatsre- duktion bei Saos-2- und NIH-3T3 Zellen auf 3300/ml. Eine HDB von 225 MPA verursachte den vollständigen Viabilitatsverlust beider Zellreihen. Wie anhand der Figur 2 erkennbar, lagen die Zellzahlen bei den Kontrollproben, die keiner Druckbehandlung unterzogen wurden, bei 46 000 Zellen/ml (Saos-2) bzw. 57 000 Zellen/ml (NIH-3T3) .
Der in Figur 3 dargestellte mittels Trypanblaufarbung ermittelte Viabilitatsverlust von humanen Saos-2 Zellen und muπnen NIH-3T3 Zellen zeigte erst ab einer HDB von 200 MPa eine Reduktion der Zellviabilitat bei Saos-2 Zellen von 33% des Ausgangswertes vor Druckbehandlung und bei NIH-3T3 Zellen eine Reduktion von 66% der Gesamtzellzahl. Bei niedrigeren Drucken von 175 MPa wurde keine Reduktion der Viabilitat mittels Try- panblau Färbung festgestellt, die HDB von 225 MPa verursachte einen vollständigen Verlust der Zellviabilitat beider Zellli-
Nach Kultivierung der Zellen für 72h konnten beide Zelllmien nach HDB mit 150 MPa Wachstum m Kultur zeigen (siehe Figur 4). Bei beiden Zelllmien wurde eine Zellzahl von 60000/ml gezahlt, verursacht durch weiteres Zellwachstum nach Druckbehandlung. Eine Steigerung der HDB auf 175 MPa führte zu einer Verminderung des Zellwachstums bei Saos-2- und NIH-3T3 Zellen auf 10000/ml innerhalb von 72h Kultivierung. Nach Behandlung der Zellen mit einem HD von 200 MPa konnte em vollständiger Adharenzverlust aller kultivierter Zellen erreicht werden. Die Kontrollprobe wies nach 72h Kultivierung eine Zellzahl von 100 000 Zellen/ml auf.
Durch Trypanblaufarbung der Zellen wurde nach 72h Kultivierung der Viabilitatsverlust der Zelllmien ermittelt. Die Ergebnisse sind in Figur 5 dargestellt. Nach HDB mit 150 MPa zeigten Saos-2- und NIH 3T3 Zellen 17%Vιabιlιtatsverlust , nach Steigerung der HDB auf 175 MPa zeigten Saos-2 Zellen 67% Reduktion ihrer Viabilitat und NIH 3T3 Zellen zeigten 88% Viabilitatsverlust. Ab einer HDB von 200 MPa wurde in allen Zellkulturen em 100%tιger Viabilitatsverlust verursacht. Die HDB mit 225 MPa, 250 MPA und 300 MPa werden graphisch nicht dargestellt, da es hier zur vollständigen Schädigung der Zellen kam. Die Kontrollproben wiesen jeweils erwartungsgemäß keinen Viabilitatsverlust auf.
DISKUSSION:
Um die Möglichkeit einer medizinischen Anwendung der hydrostatischen Hochdrucktherapie zu untersuchen, wurden vitro Druckversuche durchgeführt, indem die immortalisierten humanen Osteosarkomzelllmien U-2 OS- und Saos-2- sowie lmmortalisier- te Mausefibroblasten NIH 3T3 hydrostatischen Drucken zwischen 125 MPa und 300 MPa ausgesetzt wurden. In einem ersten Versuch wurden U-2 OS Zellen in 25 MPa Schritten hydrostatischen Drucken von 125 MPa bis 300 MPa ausgesetzt. Hierbei zeigte sich, daß nach 72h Kultivierung em Überleben der verschiedenen Zelllmien nach HDB von 150 MPa möglich war und Drucke von 250 MPa em Überleben der Zellreihen in Kultur unmöglich machten. Der so ermittelte Druckbereich wurde für die weiteren Versuche mit Saos-2- und NIH 3T3-Zellen verwendet. Insgesamt reagierten alle Zellreihen bei Steigerung des HD mit einer Viabilitatsre- duktion, wobei unabhängig vom applizierten Druck eine unterschiedliche, zellspezifische Toleranz gegen HDB vorzuliegen scheint. NIH 3T3 Zellen zeigen nach 72h Kultivierung höhere Viabilitatsverluste, gemessen mit Trypanblaufarbung der Zellen, als Saos-2 Zellen, wobei das Adhasionsverhalten nach HDB mit 150 MPa und 175 MPa beider Zellmien keine wesentlichen Unterschiede aufweist. Die Zahl lebender, adharenter Saos-2 Zellen nach 48h Kultur und 175 MPa HDB reduziert sich bis zu 72h, so daß eine nach 48h Kultur und 175 MPa HDB vorliegende subletale Schädigung der Zellen bei Saos-2 Zellen postuliert werden muß, die weder durch Trypanblaufarbung der Zellen noch durch die Bestimmung des Adhasionsverhaltens nach 48h Kultur nachgewiesen werden konnte. Gleiches konnte bei NIH 3T3 Zellen im HD Bereich von 175 MPa beobachtet werden. Innerhalb des 150 MPa HD Bereiches zeigten Saos-2 und NIH 3T3 Zellen eine nach 72h vermehrte Anfarbung mit Trypanblau, so daß auch m diesem Druckbereich von Zellschaden ausgegangen werden muß, die durch Beurteilung von Adhäsion und Trypanblaufarbung nach 48h nicht bestimmt werden können.
Schädigung der Zellen in niedrigen Druckbereichen von 150 MPa, bei denen keine Zellschadigung mittels Trypanblaufarbung gezeigt werden konnte, scheinen sich zumindest auf das Adhasionsverhalten von Saos-2 und NIH 3T3 Zellen auszuwirken: Nach einer Kultivierung beider Zelllmien zeigt sich nach 48h eine Reduktion des Zellwachstums im Vergleich zur Kontrollgruppe, em Viabilitatsverlust kann jedoch noch nicht nachgewiesen werden. Im Zeitmtervall von 48h bis 72h verdoppelt sich die Zellzahl m Kultur von Saos-2 und NIH 3T3 Zellen, wobei nach 72h Kultivierung 17% adharenter Saos-2 und NIH 3T3 Zellen eine letale Schädigung aufweisen, welche innerhalb der Kontrollgruppe nicht nachgewiesen wurde.
Die von uns durchgeführten Versuche zeigen, daß vitale Zellen in einem Untersuchungszeitraum bis zu 72h nach HDB bisher unbekannten, hohen hydrostatischen Drucken standhalten können. Die Druckbereiche, die eine letale Schädigung der untersuchten Zelllinien verursachen, sind zum einen abhangig von der Hohe des applizierten Drucks und weisen zum anderen auch zellspezifische Unterschiede auf.
Durch diese Versuche zeigte sich überdies, daß die HDB als Methode zur Abtotung von Mikroorganismen in vitalem Gewebe eine Möglichkeit darstellt, als therapeutisches Verfahren zur Anwendung zu gelangen. Es ist sinnvoll, als weitere physikalische Größe höhere, bzw. niedrigere Temperaturen wahrend der HDB zu verwenden, da Bakterien bei Temperaturen hoher als 35°C und bei Temperaturen nahe dem Gefrierpunkt wesentlich sensibler gegen hohe Drucke reagieren. Auch die Anwedung längerer Druckplateaus sowie schnellerer Druckaufbau- und Druckabbauraten sind weitere Möglichkeiten, einen Bereich zu finden, der eine selektive Schädigung von Mikroorganismen zulaßt.
Versuche zu mechanischen Eigenschaften von Knochengewebe nach Hochdruckbehandlung
In weiteren exemplarischen Untersuchungen wurden Knochenzylinder mit einer diamant-beschichteten Spezialfrase aus paarigen humanen Oberschenkelknochen, d.h. aus Schenkelhals (entlang Langsachse) und distaler Epiphyse (quer) entnommen. Die Große der Zylinder betrug 7,5 mm Durchmesser und 15 mm Lange. Die mechanische Prüfung erfolgte in einer Universal-Prufmaschme mit speziell konstruierten Halterungen in Form eines Druckversuches mit je 20 Proben unbehandelter, mit 150 MPa hochdruckbehandelter sowie mit 225 MPa hochdruck-behandelter Knochenzy- lmder jeweils im Seitenvergleich. Die Druckbehandlung wurde unter den obengen. Bedingungen durchgeführt. Traversen- Geschwindigkeit: 0,1 m/s. Es ergab sich überraschenderweise mit 150 MPa Druckbehandlung keine signifikante Reduktion und mit 225 MPa Druckbehandlung nur eine geringe Minderung der Bruchlast von 15 %.
Diese Versuche zeigen, daß Knochen bzw. Knochenteile die bei dem erfmdungsgemaßen Verfahren eingesetzten Drucke überstehen, ohne daß eine wesentliche Verschlechterung der mechanischen Eigenschaften auftritt. Demgemäß können die erfindungsgemaß behandelten Knochen nach dem erfmdungsgemaßen Druckbehandlungsverfahren als Transplantate verwendet werden. Bei Anwendung von Drucken über 225 MPa können die mechanischen Eigenschaften von Knochen verändert werden.

Claims

Druckbehandlungsverfahren von ZellenAnsprüche
1. Verfahren zur Veränderung der Replikationsfahigkeit und/oder der Protemstruktur von menschlichen oder tierischen Zellen und/oder menschlichem oder tierischem Gewebe und/oder von in oder mit den Zellen und/oder dem Gewebe vorliegenden Mikroorganismen oder Prionen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen und/oder das Gewebe und/oder die in oder mit diesen Zellen vorliegenden Mikroorganismen Drucken von über 100 MPa in einem bei diesen Drucken flussigen Medium ausgesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in Form von Zellverbanden vorliegen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Zeilverbande Gewebe eingesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe nur zu einem geringen Teil aus Zellen besteht.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Gewebe Knochen, Knorpel, Sehnen, Bander, Gefäße, oder andere Gewebe oder Organe eingesetzt werden.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellverbände Tumorzellen und/oder Mikroorganismen und/oder Prionen enthalten.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit Mikroorganismen, die Bakterien, Viren, Pilze und/oder Protozoen sind, und/oder mit Prionen kontaminiert sind.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Gewebe zu transplantierendes Gewebe eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das zu transplantierende Gewebe nach der Druckbehandlung weitgehend ohne Zellen vorliegt.
10. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
Drücke im Bereich von 100 - 1000 MPa, bevorzugt bis 800,
600, 500, 300, 250, 200 oder 150 MPa eingesetzt werden.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
Drucke im Bereich von 100 - 225, bis 175 oder bis 150 MPa eingesetzt werden.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Hemmung der Replikationsfahigkeit der Zellen und/oder der Mikroorganismen Drucke ab 200, bevorzugt ab 225 Mpa eingesetzt werden.
13. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß mehrfache oder variable Druckbehandlungen mit Drucken unter 200 MPa, bevorzugt 150 MPa, eingesetzt werden.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Druckbehandlung von Knochen Drucke eingesetzt werden, die 50 - 100 MPa über den bei Weichteilgewebe, z.B. Sehnen, eingesetzten Drücken liegen.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Druck so gewählt wird, daß die immunogenen Oberflachenbereiche der Zellen des Gewebes verändert werden, die Replikationsfahigkeit der Zellen jedoch weitgehend erhalten bleibt.
16. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeicnnet , daß der Druck so gewählt wird, daß selektiv insbesondere die Tumorzellen, entzündetes Gewebe und/oder die in oder mit den druckbehandelten Zellen vorliegenden Mikroorganismen in ihrer Replikationsfahigkeit inhibiert oder abgetötet werden und/oder ihre Protemstruktur verändert wird oder das patho- gene Potential von Prionen zumindest verringert wird.
17. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen des Knochen-, Sehnen- und/oder Gefaßgewebes von
Transplantaten solchen Drucken ausgesetzt werden, die ihre
Replikationsfahigkeit im wesentlichen inhibieren oder sie abtoten.
18. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Drucke für einen Zeitraum von einer Sekunde bis zu mehreren Stunden aufrechterhalten werden.
19. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Druckbehandlung 5 bis 60, bevorzugt 5 bis 30 oder 5 bis 10 Sekunden, weiterhin bis zu 3, bevorzugt bis zu 2 oder bis zu einer Stunde, weiterhin bis zu 60, bevorzugt bis zu 40 oder 30 oder 10 oder fünf Minuten aufrechterhalten bleibt, je in Abhängigkeit von den zu behandelnden Zellen oder Zellverbanden oder Mikroorganismen.
20. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Druckbehandlung mehrmals, bevorzugt 1 bis 10 mal wiederholt wird.
21. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Druckbehandlung zumindest eine Druckaufbau-, Druckhalte- und Druckabbauphase aufweist, die mehrfach wiederholt werden kann.
22. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur wahrend der Druckbehandlung -45 bis +150 °C, bevorzugt +20 bis 40 °C oder +32 bis 40 °C oder +36 bis 38 °C betragt.
23. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu behandelnden Zellen von zumindest einer flussigkeits- dichten Hülle umgeben sind und die Flüssigkeit außerhalb der Hülle vorliegt.
24. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Flüssigkeit em Gemisch aus einem viskosen Mittel, bevorzugt Glykol, und Wasser, oder Ether und Kerosin oder em bei den eingesetzten Drucken flussiges Gas oder Gasgemisch eingesetzt wird.
25. Verwendung von durch em Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche behandelten Zellen in der Transplantationsmedizm, zur Herstellung von Gewebeprapara- ten und als diagnostisches Mittel.
26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die behandelten Zellen Knochen, Gefäße und/oder Sehnen sind.
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