DE60012996T2

DE60012996T2 - Verwendung der bioaktiven fraktion aus dem urindestillat der kuh ("go mutra") zur verstärkung der wirksamkeit von anti-infektiva, anti-krebsmitteln und ernährungsmitteln

Info

Publication number: DE60012996T2
Application number: DE60012996T
Authority: DE
Inventors: S.P.S. Khanuja; S Lucknow 226 010 KUMAR; A.K Lucknow 226 010 SHASANY; J.S. Lucknow 226 010 ARYA; M.P. Lucknow 26 010 DAROKAR; M. Lucknow 226 010 SINGH; P Lucknow 226 010 SINHA; S. Lucknow 226 010 AWASTHI; S.C. Lucknow 226 010 GUPTA; V.K. Lucknow 226 010 GUPTA; M.M. Lucknow 226 010 GUPTA; R.K. Lucknow 226 010 VERMA; S. Lucknow 226 010 AGARWAL; S.B. Lucknow 226 010 MANSINGHKA; S.H. Lucknow 226 010 DAWLE
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2000-10-20
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2020-10-21
Also published as: CN1234372C; MXPA03002653A; AU2005237162A1; AU2005237162B2; BR0017342A; KR100848394B1; CA2425025A1; EP1330253A1; CN100536856C; CN1788735A; KR20040015010A; EP1330253B1; WO2002032436A1; AU3048601A; AU2001230486B2; DK1330253T3; CN1454092A; DE60012996D1; CA2425025C; ATE273014T1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Kuhharn-Destillat zur Verwendung als Aktivitätsverstärker und Verfügbarkeitsförderer für bioaktive Moleküle, einschließlich infektionsverhindernder und antineoplastischer Mittel. Die Moleküle, die irgendeine Aktivität in Form entweder des Hemmens oder des Förderns einer biologischen Funktion exprimieren, werden bei dieser Erfindung als bioaktives Molekül, z.B. Antibiotika, Arzneimittel, nutrazeutische Produkte, kardiovaskuläre, leberschützende, neurotonische Produkte usw., bezeichnet. Die vorliegende Erfindung spielt beim drastischen Reduzieren der Dosis von Antibiotika, Arzneimitteln und antineoplastischen Mitteln eine direkte Rolle, während sie die Effizienz der Absorption von bioaktiven Molekülen erhöht.
Stand der Technik
Bei der Ayurveda wird Kuhharn zum Verbessern der Gesundheit im Allgemeinen vorgeschlagen. Er ist jedoch noch nie wissenschaftlich bezüglich seiner Nützlichkeit als solcher geprüft worden. Die Anmelder haben eine gewisse Neugierde bezüglich dieser Komponente in den Zubereitungen entwickelt und diesbezüglich viele Fragen gestellt: Ob der Bestandteil Kuhharn als solcher irgendeine Aktivität aufweist oder keine solche Aktivität besitzt, jedoch die Aktivität anderer Komponenten in der Zubereitung verbessert? Welches die im Harn der Kuh anwesenden Komponenten sind? Ob der Harn Mikroorganismen enthält, die heilsam sind? Ob die Abbauprodukte aus dem Harn heilsam sind? Um diese Fragen zu beantworten, hat der Anmelder „Kamadhenu Arka", das Harndestillat aus „Go-Vigyana Anusandhana Kendra", Nagpur, Indien, erworben. Dieses Harndestillat wird zum Trinken vorgeschlagen, um die Gesundheit allgemein zu verbessern, und in verschiedenen Flaschengrößen verkauft und vertrieben. Die Anmelder haben den Harn an Luria agar und Nährbouillon unter sterilen Bedingungen getestet und keinerlei Mikroorganismenwachstum beobachtet. Um zu prüfen, ob dieser auf das Wachstum verschiedener Mikroorganismen hemmend wirkt, wurden Escherichia coli und Mycobacterium smegmatis bei verschiedenen Temperaturen im Bereich von 20 bis 40°C in Anwesenheit und Abwesenheit des Kuhharn-Destillats gezüchtet; es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Koloniezahl beobachtet. Erstaunlicherweise verbesserte das gleiche Destillat die antibiotische Wirkung gegen diese Bakterien, was zu dieser Erfindung geführt hat. Die Neuigkeit der Erfindung liegt in der durch genaue Versuche zum Vorschein gebrachten Tatsache, dass die Verbesserungswirkung und ihre Effektivität nur in dem Konzentrationsbereich erzielt werden können, der sich buchstäblich im Nano- oder Mikromolbereich befindet. Und wenn eine höhere Konzentration/Dosis in der Rezeptur oder den Kombinationen verwendet wird, so tritt die Aktivität bzw. treten die Aktivitäten nicht auf. Das dürfte der Grund für die Nichterfassung eines derartigen wertvollen Potentials von Kuhharn (Go-mutra) sein. Millionen von Dosen des jährlichen Verbrauchs von Antibiotika gehen verloren, da diese nicht verwendbar oder wirksam gezielt an die infektiösen Organismen gebracht werden können aufgrund verschiedener Faktoren wie effiziente Absorption, Transportierung an die Zielstelle, Retentionszeit, Bedienung der Ausflusspumpe, Metabolismus usw. So werden große Anteile der von uns angewendeten Arzneimittel verschwendet und nur ein äußerst geringer Prozentsatz wird gezielt an die infektiösen Mikroben herangebracht. Auch verbleibt die unbenutzte Menge an Arzneimittel/Antibiotikum als Belastung im Körper und in der Umwelt und wirkt als Selektionsdruck zum Erleichtern des Auftretens von Arzneimittelresistenz in Parasiten und ihrem Vorherrschen, was schließlich zum Versagen der Antibiotika gegen resistente Infektionen führt. Auch ist dies für Nebenwirkungen, Krankheiten und die Reduzierung der Lebenserwartung verantwortlich, die in der älteren Bevölkerung noch akuter sind. Eine der Arten und Weisen, die zum Reduzieren der Arzneimitteldosis machbar gewesen sind, ist der Synergismus zwischen zwei therapeutischen Mitteln gewesen. Wenn jedoch beide antibiotische Eigenschaften aufweisen, so bleibt das Problem des kontinuierlichen Selektionsdrucks auf Mikroben wahrscheinlicherweise auch weiterhin bestehen. So haben die Anmelder daran gedacht, Kuhharn zu verwenden, der nicht mikrobizid ist, jedoch beim Vorliegen zusammen mit einem Arzneimittel oder einem aktiven Molekül dessen Aktivität und Verfügbarkeit verbessert (Bioverstärker). Auf diese Weise wird der Selektionsdruck ausgeglichen und gleichzeitig die Dosis von Antibiotika oder Arzneimitteln zum Minimieren der Nebenwirkungen reduziert, was auch von hoher wirtschaftlicher Bedeutung ist.
Die vorliegende Erfindung war das Resultat geplanter Experimente zum Bereitstellen einer neuartigen Zusammensetzung für das Verbessern der Aktivität und Bioverfügbarkeit von Antibiotika, Arzneimitteln und anderen Molekülen unter Verwendung von „Kuhharn-Destillat" in verschiedenen Rezepturen.
Die Bioverfügbarkeit von Nährstoffen und die Verstärkungswirkung von Antibiotika ist beim Menschen, bei Pflanzen sowie bei der Gesundheit von Tieren relevant und deshalb sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren auch dafür bestimmt, in der landwirtschaftlichen und tierärztlichen Praxis verwendet zu werden.
Kuhharn (Go-mutra) kann als die wirksamste Substanz/Sekretion tierischen Ursprungs mit der Fähigkeit betrachtet werden, die Gesundheit im Allgemeinen zu verbessern, dies bedarf jedoch der Untermauerung durch wissenschaftliche Versuche. So haben die Anmelder es als sich lohnend betrachtet, diesen Aspekt wissenschaftlich zu untersuchen und die molekulare Basis der Werte durch in vitro- und in vivo-Assays zu definieren. Die Anmelder haben zuerst untersucht, ob er irgendwelche Arzneimittel fördernde Elemente enthält, da eine derartige Eigenschaft ihn zu einer äußerst nützlichen natürlichen Substanz machen würde. In letzter Zeit ist die Verwendung von „Piperin" als Bioverfügbarkeitsförderer beschrieben worden (US-Patentschriften 5,616,593 und 5,972,382). Bis heute ist daher der bekannte dokumentierte Bioverfügbarkeitsförderer Piperin gewesen und im Stand der Technik, wie folgt, sind eine Reihe von mit dieser Verbindung verbundene Erfindungen beschrieben worden.
Offenbarung der Erfindung
Die Hauptaufgabe besteht darin, eine neue Verwendung der bioaktiven Fraktion als Bioverstärker und Bioverfügbarkeitsförderer bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Zusammensetzung für das Verbessern der Aktivität und der Bioverfügbarkeit von Antibiotika, Arzneimitteln und anderen Molekülen unter Verwendung der aktiven Fraktion von Kuhharn-Destillat bereitzustellen.
Noch eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren für das Extrahieren der aktiven Fraktion aus dem Kuhharn bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf ein bekanntes, in reichlichen Mengen verfügbares Kuhharn-Destillat als Verstärker der antibiotischen Wirkung auf das Target. Das erfindungsgemäße Molekül fördert die Absorption von Antibiotika durch die Zellmembran in tierischen Zellen, gram-positiven und gram-negativen Bakterien. Ähnliche Aktivitäten können auch durch Verwendung des Destillats von Kuhharn bei 40-50°C und des Konzentrats, das lyophilisiert und zur weiteren Verwendung gelöst wird, erzielt werden. Des Weiteren bietet Harndestillat vom Büffel, Kamel, Reh eine ähnliche Aktivität der Bioverfügbarkeit.
Kurze Beschreibung der beiliegenden Zeichnung
1 stellt die HPLC-Charakteristik von Kuhharn-(Go-mutra-)Destillat dar.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Unser Schwerpunkt war hier, nach einem reichlich verfügbaren Material mit bioverstärkender Wirkung hoher Potenz zu suchen. Außerdem bestand eine Eigenschaft, nach der die Anmelder suchten, aus der der Bioverstärkung eines nur sehr wenig verfügbaren antineoplastischen natürlichen Mittels, nämlich „Taxol" (Peclitaxel), das in mikroskopisch geringen Mengen durch die Eibe (Taxus spps.) gebildet wird und daher immer ein in begrenztem Maße verfügbares Molekül darstellt. Kuhharn-Destillat hat die Abtötungsaktivitäten verschiedener Antibiotika auf Bakterien verbessert. Noch wichtiger war die offensichtliche Verbesserung der Zellteilungshemmungsaktivität gegen die Brustkrebszellinie MCF-7.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt umfassend eine wirksame Menge von Kuhharn-Destillat als Bioverfügbarkeitsförderer und ein pharmazeutisch akzeptables Zusatzmittel, das unter antineoplastischen Verbindungen, Antibiotika, Arzneimitteln, therapeutischen und nutrazeutischen Mitteln, Ionen und ähnlichen Molekülen ausgewählt wird, die auf Lebendsysteme gezielt angewendet werden.
Bei einer anderen Ausführungsform soll das Kuhharn-Destillat als Bioverfügbarkeitsförderer für die antineoplastische Therapie direkt oder in Kombination mit antineoplastischen Molekülen verwendet werden.
Bei noch einer anderen Ausführungsform soll das Kuhharn-Destillat bei einer antifungalen Therapie für Pilzinfektionen verwendet werden.
Bei noch einer anderen Ausführungsform sind die antifungalen Mittel Azol, Clotrimazol, Mystatin, Amphotericin und ähnliche Materialien.
Bei noch einer anderen Ausführungsform sind pilzdeckende Infektionen Myzet-Verbindungen, Candida, Hefe- und/oder andere fungizide Verbindungen.
Bei noch einer anderen Ausführungsform soll das Kuhharn-Destillat bei der TB-Therapie, einschließlich vielfach resistenter Tuberkulose, in Kombination mit Isoniazid und anderen antituberkulösen Mitteln verwendet werden.
Bei noch einer anderen Ausführungsform tragen die Bioverfügbarkeitsförderer zum Übertragen der Verbindung durch die Membran und zur höheren Effizienz an der Zielstelle bei.
Bei noch einer anderen Ausführungsform sind die Antibiotika Chinolone, Fluorchinolone wie Nalidixinsäure und andere wie beispielsweise Rifampicin, Tetracyclin, Ampicillin und ähnliche Verbindungen.
Bei noch einer anderen Ausführungsform sind die Antibiotika, Ionen und ähnliche Verbindungen Isoniazid und Wasserstoffperoxid.
Bei noch einer anderen Ausführungsform tragen die Bioverfügbarkeitsförderer zur besseren Wirkung der Antibiotika und anderen Moleküle auf das Target durch verbesserte Effizienz bei.
Bei noch einer anderen Ausführungsform kann das Lebendsystem aus Bakterien, Pilzen oder anderen Lebendzellen bestehen.
Bei noch einer anderen Ausführungsform werden die antibakteriellen Mittel aus der Gruppe ausgewählt, die Chinolone, Rifampicin, Tetracyclin und Ampicillin umfasst.
Bei noch einer anderen Ausführungsform liegt das Kuhharn-(Go-mutra-) Destillat im Bereich von 0,001 μl/ml bis 100 μl/ml.
Bei noch einer anderen Ausführungsform liegt die verwendete lyophilisierte aktive Fraktion im Bereich zwischen 0,1 μg/ml bis 100 μg/ml.
Bei noch einer anderen Ausführungsform verbessert die bioaktive Fraktion die Aktivität von antibakteriellen Mitteln, antineoplastischen Mitteln und Antituberkulosemitteln 2 bis 80 mal.
Bei noch einer anderen Ausführungsform verbessert die bioaktive Fraktion die Aktivität von antibakteriellen Mitteln 2 bis 80 mal.
Bei noch einer anderen Ausführungsform ist das antibakterielle Mittel ein Antituberkulosemittel, das unter Isoniazid, Pyrazinamid und anderen ähnlichen Verbindungen ausgewählt wird.
Bei noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform verbessert die bioaktive Fraktion die Aktivität von Antituberkulosemitteln 2 bis 20 mal.
Bei noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das antineoplastische Mittel aus der Gruppe ausgewählt, die aus Paclitaxel (Taxol) besteht.
Bei noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verbessert die bioaktive Fraktion die Aktivität von antineoplastischen Mitteln 2 bis 20 mal.
Die von uns für das Screenen angewendete Methodologie umfasste spezifisch entwickelte Bioassay, wie unten beschrieben. Die bei dieser Erfindung verwendeten Bakterien- und Pilzstämme wurden im Handel von Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, erhalten, und wiesen Eigenschaften auf, die dem oben erwähnten ATCC-Stamm entsprachen.
1. Assay zur Bioverfügbarkeitsförderung antinfektiöser Mittel.

a) Die mindestens erforderliche Hemmkonzentration (MHK) von Antibiotika wird gegen Escherichia coli (entspricht ATCC 10536), Bacillus subtilis (entspricht ATCC 6015) und Mycobacterium smegmatis (entspricht ATCC 10231) im Nährbouillon- und Plattendiffusionstest bestimmt.
b) Die antibiotischen Mittel werden in Konzentrationen von 1/4, 1/3, 1/2 und der MHK-entsprechend entweder als solche oder in Kombination mit der Testverbindung in verschiedenen Konzentrationen auf einer Platte und in Nährbouillon zum vergleichenden Beurteilen der Hemmung zugesetzt.
c) Diese Kombination, die einen signifikanten Vorteil oder eine höhere Aktivität als das Antibiotikum als solches bezüglich einer verbesserten Hemmung des Bakterienwachstums (große Hemmungszone bei der Plattendiffusion und Affektivität einer geringeren Konzentration beim Nährbouillontest) aufweist, wird für künftige Tests ausgewählt.
d) Beim Nährbouillontest wird die Aktivität durch Zählen der Anzahl lebensfähiger Zellen bei einer vorgegebenen Behandlung quantifiziert und in die soundsoviel malige Verstärkung umgewandelt durch Kombination im Vergleich mit Antibiotikum/Arzneimittel als solchem bezüglich des Abtötungsprozentsatzes der Zellen.
e) Es folgte ein Vorbehandlungstest zum Bestimmen, ob die Verbindung zusammen mit Antibiotikum zum Erhöhen der Aktivität erforderlich ist oder ob das Entfernen derselben nach der Behandlung oder vor der Behandlung mit Antibiotikum vorteilhaft wäre. Zu diesem Zweck werden die Zellen 4 bis 8 Stunden mit der Verbindung behandelt und die Verbindung daraufhin herausgewaschen und die Zellen durch Zentrifugieren und Waschen in sterilem Wasser davon befreit. Daraufhin folgte eine Behandlung mit Antibiotikum wie in den Schritten b bis d.

2. Assay zur Bioverfügbarkeitsförderung von antineoplastischen Mitteln.

a) MCF-7 (eine im Handel von National Center for Cell Sciences (NCCS), Pune, erhältliche Brustkrebszellinie) wird in einer Dichte von ca. 0,1 × 10⁶ Zellen in MEM-Medium in den Vertiefungen von Platten mit 24 Vertiefungen eingeimpft.
b) Nach 18 Stunden wird dies in jeder Vertiefung durch frisches Medium ersetzt.
c) Die Testkomponente(n) wird bzw. werden in den erwünschten Konzentrationen in verschiedene Vertiefungen direkt nach dem Ersetzen des Mediums eingegeben.
d) Die Beobachtungen bezüglich der Zellzahl nach 36 Stunden werden aufgezeichnet, wofür die folgenden Schritte erforderlich sind. i. Das Medium wird aus den Vertiefungen entfernt. ii. Die Vertiefungen werden mit 1 ml PBS (Phosphatbuffer-Kochsalzlösung) gespült. iii. In jede Vertiefung werden 500 μl frisch zubereitete Trypsinlösung (0,1% in PBS) eingegeben. iv. Die Trypsinlösung wird nach 30 Sekunden entfernt und die Platte leicht mit dem Finger angestoßen, bis die Zellen von der Plattenoberfläche losgelöst werden. v. 1 ml frisches MEM-Wachstumsmedium wird hinzugegeben und mit einer Pipette zur Bildung einer Zellsuspension gerührt. vi. 10 μl der Zellsuspension werden auf das Hämozytometer übertragen und ein Deckglas wird auf die Zählkammer aufgebracht. vii. Die Anzahl lebensfähiger Zellen wird in 5 großen Quadraten gezählt und die Ablesewerte von 5 Mikroskopfeldern zum Bestimmen des Durchschnittswerts genommen. viii. Die Zellzahl (Titer pro ml) der Originallösung wird daraufhin als Durchschnittszahl × 10³ berechnet.

Zusammensetzung der mindestens erforderlichen Menge Medium (MEM): 100 ml
3. Bioverfügbarkeitstests durch biologische Membran

a) Speziell konstruierte U-Röhren aus Glas, die aus zwei Komponenten bestehen (gegensätzliche L-Type) wurden verwendet, bei denen ein offenes Ende einer L-förmigen Röhre sich so verjüngte, dass sie in das sich nicht verjüngende Ende der anderen L-Röhre passte (1).
b) Die Membran aus Ziegendarm (anfänglicher Teil) wurde gestreckt und befestigt, um als Barriere zwischen den beiden Enden derart zu wirken, dass durch Zusammenfügen der beiden L-Röhren eine U-Röhre gebildet wurde.
c) Steriles destilliertes Wasser wurde daraufhin in beide Seiten bis auf die gleiche Höhe bzw. das gleiche Niveau eingefüllt. Das Antibiotikum/die Verbindung wurde daraufhin in die (sich verjüngende) Donator-Röhre hineingegeben und durch ein Spektrophotometer wurde die Übertragung des Moleküls unter Anwendung von UV- und sichtbaren Absorptionsmaximas der entsprechenden Moleküle durch Bestimmung der OD bei definierten Wellenlängen beobachtet.

Beispiele
Im nächsten Schritt der Erläuterung der Wirkung des Verstärkers haben die Anmelder mit den Abtötungsaktivitäten verschiedener Antibiotika gegen die Bakterien einzeln und in Kombination mit der Testkomponente (Kuhharn-Destillat) der oben beschriebenen Methode entsprechend experimentiert. Diese Experimente werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Wenn die Bakterien in Anwesenheit der Verbindung gezüchtet wurden, wurde keine signifikante Abtötung als solcher beobachtet. Bei allen Versuchen wurde die Konzentration des Kuhharn-Destillats bei 1 μl/ml gehalten, es sei denn, es wird etwas Spezifisches erwähnt.
Beispiel 1
Durch Kuhharn-Destillat vermittelte Erhöhung der Abtötungswirkung von Antibiotika gegen das gram-negative Bakterium Escherichia coli.
Tabelle 1
Es fand eine Berechnung statt in Form der überlebenden Fraktion lebensfähiger Zellen auf die Behandlung mit Antibiotikum und Kuhharn-Destillat in Kombination hin bzw. der überlebenden Fraktion lebensfähiger Zellen auf die Behandlung mit Antibiotikum allein hin.
Beispiel 2
Durch Kuhharn-Destillat vermittelte Erhöhung der Abtötungswirkung von Antibiotika gegen das gram-positive Bakterium Bactillus subtilis.
Tabelle 2
Beispiel 3
Durch Kuhharn-(Go-mutra-)Destillat vermittelte Erhöhung der Abtötungswirkung von Antibiotika gegen das Bakterium Mycobacterium smegmatis.
Tabelle 3
Aus den obigen Versuchen wurde der Schluss gezogen, dass die Wirkung des Antibiotikums steigt, wenn es zusammen mit Kuhharn-Destillat angewendet wird.
Beispiel 4
Durch Kuhharn-Destillat vermittelte Erhöhung der Abtötungswirkung von Izoniazid und Wasserstoffperoxid gegen den oxyR-Mutanten des Bakteriums Escherichia coli
Die Konzentration des Kuhharn-Destillats beträgt 0,001 μl/ml.
Tabelle 4
Das oxyR-Gen ist für das Induzieren eines Regulons von durch Wasserstoffperoxid induzierbaren Genen in Escherichia coli erforderlich (Christman M F, Storz G und Ames BN (1989), OxyR, ein positiver Regulator von durch Wasserstoffperoxid induzierbaren Genen in Escherichia coli und Salmonel typhimurium, ist einer Familie von bakteriellen Regulatorproteinen homolog (Proc. Natl. Acad. Sci. (UA), 86: 3484-3488). Die Mutanten dieser Gene sind gegen Arzneimittel wie Isoniazid und Wasserstoffperoxid empfindlich, die freie Radikale bilden, die das Zellsystem beschädigen. So werden die Abtötungsaktivitäten dieser Verbindungen durch Kuhharn 5 bis 8 mal erhöht.
Beispiel 5
Durch Kuhharn-Destillat vermittelte Erhöhung der Aktivität von antineoplastischen Verbindungen
Die Konzentration des Kuhharn-Destillats beträgt 1 μl/ml. Tabelle 5
Die Anmelder beobachteten ähnliche Ergebnisse bezüglich der Verbesserung in der tierischen Zellkultur (vom National Center for Cell Sciences (NCCS), Pune, erhaltene Krebszellinie MCF-7), bei der die Abtötungswirkung der antineoplastischen Chemikalie „Taxol" erhöht wird. Die Komponenten des Kuhharn-Destillats trugen in unserer Studie dazu bei, andere Verbindungen durch die Membran hindurch zu übertragen und dadurch die Absorption in der tierischen und pflanzlichen Zelle, gleichgültig um welche Bakterien es sich handelt, zu erhöhen. Dies ist wiederum bezüglich der Absorption der Medikamente, Arzneimittel, neutrazeutischen Mittel und von anderen damit verbundenen Verbindungen und Ionen durch die Zellen ungeheuer wichtig.
Beispiel 6
Bioverstärkung des antifungalen Mittels Clotrimazol durch die bioaktive Fraktion Gm-IV
Die Konzentration der aktiven Fraktion wird bei 10 μg/ml gehalten. Tabelle 6
Bei anderen Beobachtungen verbessert die Kuhharn-Destillatverbindung den Transport der Antibiotika z.B. Rifampicin, Tetracyclin, Ampicillin durch den Darm sowie eine künstliche Membran. Die Verbesserung des Transports ist ca. 2- bis 7-fach.
Heute wird nun auf die Qualitätssicherung von rohen Medikamenten aus alternativen, im indischen medizinischen System weitverbreitet verwendeten Quellen große Bedeutung gelegt. Die vorliegende Erfindung erweitert den Umfang und die Verwendung des Kuhharn-Destillats bei der therapeutischen und neutrazeutischen Anwendung.
Beispiel 7
Entwicklung der Pulverform
Für das Verbessern der Nützlichkeit und Bequemlichkeit der Anwendung von Kuhharn (Go-mutra) haben die Anmelder weitere Fraktionierungen durchgeführt, um eine feste Form zu erreichen, die außerdem von dem typischen Geruch des Kuhharn-Destillats frei ist, was für den Menschen akzeptabler ist. Zu diesem Zweck wurde das Harndestillat wie durch das folgende Verfahren beschrieben fraktioniert.
Fraktionierung eines weißen kristallinischen Feststoffs aus Kuhharn
Schritt 1: Kuhharn wird aseptisch direkt von der Kuh, die in einem hygienischen Umfeld gehalten wird, in einem Edelstahlbehälter eingesammelt.
Schritt 2: Fünfzehn Liter Kuhharn werden kontinuierlich bei 40-50°C in einem Glasdestillationsapparat zur Erzielung von 10-12 Litern des Destillats in 16 bis 18 Stunden destilliert.
Schritt 3: Das Destillat wird zur weiteren Verwendung in Kunststoff- oder Glasbehältern mit sterilisierter Oberfläche verpackt.
Schritt 4: 200 ml Kuhharn-Destillat wurde mit der Hälfte dieses Volumens an Methanol gemischt und mit Hexan extrahiert.
Schritt 5: Die Hexanfraktion (Gm-I) wurde lyophilisiert und auf eine ähnliche Aktivität wie diejenige des Kuhharns (Go-mutra) hin getestet.
Schritt 6: Die wässrige Fraktion wurde mit Ethylacetat extrahiert und die Ethylacetatfraktion (Gm-II) wurde lyophilisiert und auf eine ähnliche Aktivität wie diejenige von Kuhharn (Go-mutra) hin getestet.
Schritt 7: Des Weiteren wurde eine weißen Niederschlag enthaltende wässrige Fraktion mit Butanol extrahiert und die Butanolfraktion (Gm-III), die einen hellgelben Niederschlag aufwies, wurde lyophilisiert und auf eine ähnliche Aktivität wie diejenige von Kuhharn (Go-mutra) hin getestet.
Schritt 8: Die übrige wässrige, weißen kristallinen Niederschlag (Gm-IV) enthaltende Fraktion wurde getrocknet und auf eine ähnliche Aktivität wie diejenige von Kuhharn (Gomutra) hin getestet.
Schema
200 ml mit 100 ml Methanol gemischtes Kuhharn-Destillat
Das im Bereich von 10 bis 20 Gramm pro 100 ml des Destillats erhaltene weiße Pulver (Gm-IV) wies alle die obigen Aktivitäten, wie sie für das Kuhharn-Destillat in Konzentrationen von 0,001 bis 10 μg/ml beschrieben worden sind, jedoch eine viel höhere Beständigkeit und keinen unangenehmen Geruch auf und wurde daher als das fortschrittliche erfindungsgemäße Produkt verwendet. Die Neuigkeit der Erfindung beruht auf der durch genaue Versuche zum Vorschein gebrachten Tatsache, dass die Verbesserungswirkung und ihre Wirksamkeit nur im Konzentrationsbereich erzielt werden können, der buchstäblich beim nano- bis mikromolaren Niveau liegt. Und wenn eine höhere Konzentration/Dosierung in der Rezeptur oder Kombinationen verwendet wird, tritt die Aktivität bzw. treten die Aktivitäten nicht auf.
Physikalischer Charakter der Gm-IV Fraktion

Farbe: Weiß Physikalischer Zustand: Kristallinischer Feststoff Löslichkeit: Wasserlöslich und wasserhaltige Mischung Schmelzpunkt: über 400°C Spezifisches Gewicht: 1,006 RF-Wert in Methanol: Chloroform (50:50) Phase: 0,65

HPLC Charakterisierung von Kuhharn-(Go-mutra-) Destillat
Es wurde eine HPLC an LC-8A Shimadzu HPLC mit Wasser:Acetonitril (80:20) als mobiler Phase, einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min, UV-Detektion bei 275 nm und einer C-18 E MERCK-(150 × 4 mm) Säule durchgeführt. Zwei Haupt-Peaks (Retentionszeit 5,334 und 11,310 min) wurden in dem Profil des Kuhharn-(Go-mutra-) Destillats beobachtet (1).
Die weitere Charakterisierung zum Überprüfen der chemischen Natur der Verbindung wurde durch den Feigl-Test durchgeführt (E Stahl, Thin Layer Chromatography), der positiv verlief, was auf das Vorliegen von Glucosid oder Zucker hinweist.
Die Neuigkeit der Erfindung besteht darin, dass aus Kuhharn-(Go-mutra-) Destillat eine beständige feste Fraktion isoliert werden konnte, die wasserlöslich ist und keinen Harngeruch aufweist und direkt in irgendeiner Rezeptur verwendet werden kann.
Die Gm-IV-Fraktion verbessert auch den Transport von Antibiotika und Vitaminen durch die Darmmembran von Säugern. Das den verbesserten Transport von Rifampicin durch die Gm-IV-Fraktion beschreibende Beispiel ist im Folgenden aufgeführt.
Beispiel 8
Die durch die Gm-IV-Fraktion von Kuhharn-(Go-mutra-) Destillat vermittelte Verbesserung der Bioverfügbarkeit durch die biologische Membran (Rifampicin, 1 mg/ml und Gm-IV-Fraktion, 1,0 μg/ml)
Tabelle 7
Da sowohl das Kuhharn-(Go-mutra-) Destillat als auch die Gm-IV-Fraktion eine verbesserte Membrandurchlässigkeit durch Verbessern des Durchgangs der Antibiotika durch die halbdurchlässige Membran und die Säugerdarmmembran aufweisen, kann angenommen werden, dass die obigen Substanzen für das Verbessern des Transports durch den Darm und des Transports von Molekülen durch Membranen verschiedener biologischer Funktionen, einschließlich der Harnausscheidungs-/Nierensysteme, verwendet werden können.
Bei allen den Versuchen 1 bis 5 hat sich die Verbesserungsaktivität des lyophilisierten erfindungsgemäßen Produkts als die gleiche Verbesserungsaktivität wie diejenige des Destillats erwiesen.
Die Erfindung kann des Weiteren wie folgt erklärt werden:

1. Die Probe weist eine Verbesserung der Bioverfügbarkeit von Rifampicin (Antibiotikum) und Vitamin B-12 durch die Säugerdarmmembran (es wurde ein Ziegendarm verwendet) innerhalb von 2 Stunden auf und diese erhöht sich noch weiter bis zu 4 Stunden lang.
2. Sie weist eine klare Hemmung der Wirkung von Ascorbinsäure zur Verhinderung der Oxidation aufgeschnittener Äpfel auf, was darauf hinweist, dass sie wahrscheinlicherweise das Isoniazid (INH) durch oxidativen Mechanismus, der die Arzneimittelwirkung von INH synergistisch erhöht, verbessert.
3. Das Destillat wies eine Verbesserung der Wirkung von INH selbst in 10-50-tausendfacher Verdünnung im Endvolumen der Kultur auf.
4. Noch interessanter ist die Beobachtung, dass bei einer Konzentration von 1 μl/ml das Destillat eine Verbesserung der Aktivität von Taxol um mindestens das 5-fache aufwies. Weitere Versuche in dieser Richtung sind prioritätsmäßig durchgeführt worden.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge von Kuhharn-Destillat als Bioverfügbarkeitsförderer und pharmazeutisch akzeptable Zusatzmittel ausgewählt aus antineoplastischen Verbindungen, Antibiotika, Medikamenten, therapeutischen und nutrazeutischen Mitteln, Ionen und ähnlichen Molekülen, die gezielt auf Lebendsysteme angewandt werden.
Zusammenfassung nach Anspruch 1, wobei das Kuhharn-Destillat als Bioverfügbarkeitsförderer für die antineoplastische Therapie direkt oder in Kombination mit antineoplastischen Molekülen, bei der TB-Therapie einschließlich der Vielfachresistenz-Tuberkulose, in Kombination mit Isoniazid und anderen Antituberkulose-Mitteln oder bei der Antifungaltherapie für Pilzinfektionen verwendet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Bioverfügbarkeitsförderer zum Übertragen der Verbindung durch die Membran und zur besseren Wirksamkeit an der Zielstelle beiträgt und/oder das Antibiotikum und andere Moleküle dabei unterstützt, am Target durch Erhöhen der Wirksamkeit besser zu wirken und/oder die Membrandurchlässigkeit für Moleküle, Medikamente durch die halbdurchlässige Membran und Säugerdarmmembran verbessert und zum Verbessern des Transports durch den Darm und des Transports von Molekülen durch Membranen verschiedener biologischer Funktionen verwendet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Antibiotika um Fluorchinolone wie Nalidixinsäure und andere wie Rifampicin, Tetracyclin und Ampicillin handelt, diese jedoch nicht darauf beschränkt sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Antibiotika, Ionen und ähnlichen Verbindungen Isoniazid und Wasserstoffperoxid sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die antifungalen Mittel Azole, Clotrimazol, Mystatin, Amphotericin und ähnliche Materialien sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei Pilze umfassende Infektionen, Myzeten, Candida, Hefe- und andere fungizide Verbindungen sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Lebendsystem um Bakterien, Pilze oder irgendwelche Lebendzellen handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Kuhharn-(Gomutra-)Destillats im Bereich von 0,001 μl/ml bis 100 μl/ml liegt.
Verfahren für das Zubereiten von Pulver (Gm-IV) aus Kuhharn-Destillat, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) Mischen des Kuhharn-Destillats mit der Hälfte des Volumens an Methanol und Extrahieren mit Hexan. b) Lyophilisieren der Hexanfraktion (Gm-I) und Prüfen auf ähnliche Aktivität wie diejenige von Kuhharn (Go-mutra). c) Extrahieren der wässrigen Fraktion mit Ethylacetat und Lyophilisieren der Ethylacetatfraktion (Gm-II) und Prüfen auf ähnliche Aktivität wie diejenige von Kuhharn (Go-mutra). d) Des Weiteren Extrahieren der wässrigen, weißen Niederschlag enthaltenden Fraktion mit Butanol und Lyophilisieren der hellgelben Niederschlag enthaltenden Butanolfraktion (Gm-III) und Prüfen auf ähnliche Aktivität wie diejenige von Kuhharn (Gomutra). e) Trocknen der verbleibenden wässrigen, weißen kristallinen Niederschlag enthaltenden Fraktion (Gm-IV) und Prüfen auf ähnliche Aktivität wie diejenige von Kuhharn (Go-mutra).
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das lyophilisierte Extrakt Gm-IV aus Kuhharn-Destillat nicht den typischen Geruch von Kuhharn-Destillat aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das lyophilisierte Extrakt Gm-IV folgende Eigenschaften aufweist: Farbe: Weiß Physikalischer Zustand: Kristallinischer Feststoff Löslichkeit: Wasserlöslich und wasserhaltige Mischungen Schmelzpunkt: über 400°C Spezifisches Gewicht: 1,006 RF-Wert in Methanol: Chloroform (50:50) Phase: 0,65
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Anfangskuhharn-Destillat HPLC-Eigenschaften mit zwei Hauptpeaks bei Retentionszeiten von 5,334 und 11,310 min aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das lyophilisierte Extrakt alle die Aktivitäten aufweist wie diejenigen des Destillats in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 100 μg/ml, mit einer viel höheren Beständigkeit bei Raumtemperatur und Löslichkeit im Wasser.
Lyophilisiertes bioaktives Produkt, das aus Kuhharn-Destillat erhalten wird und den folgenden physikalischen Charakter aufweist: Farbe: Weiß Physikalischer Zustand: Kristallinischer Feststoff Löslichkeit: Wasserlöslich und wasserhaltige Mischung Schmelzpunkt: Über 400°C Spezifisches Gewicht: 1,006 RF-Wert in Methanol: Chloroform (50:50) Phase: 0,65
Lyophilisiertes Produkt nach Anspruch 19, wobei das bioaktive Produkt Gm-IV nicht den typischen Geruch von Kuhharn-Destillat aufweist und/oder wobei das bioaktive Produkt in einer Konzentration von 0,1 bis 100 μg/ml verwendet wird und eine viel höhere Beständigkeit bei Raumtemperatur und Löslichkeit in Wasser aufweist.
Ein lyophilisiertes Produkt nach Anspruch 19 wird zum Verbessern der Membrandurchlässigkeit für Moleküle, Arzneimittel durch die halbdurchlässige Membran und die Darmmembran von Säugern verwendet und kann zum Verbessern des Transports durch den Darm und des Transports von Molekülen durch Membranen mit verschiedenen biologischen Funktionen verwendet werden.
Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge der aus Kuhharn-Destillat erhaltenen bioaktiven lyophilisierten Fraktion, die als Bioverstärker und Bioverfügbarkeitsförderer verwendet wird sowie ein oder mehrere nutrazeutische Mittel, Antibiotika, Antiinfektions-, antineoplastische Mittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die bioaktive Fraktion eine verbessernde Aktivität für antibakterielle Mittel, antineoplastische Mittel und Antituberkulosemittel um das 2 bis 80-fache oder für Antituberkulosemitteln oder von antineoplastischen Mitteln um das 2 bis 20-fache aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die antibakteriellen Mittel aus der Gruppe ausgewählt werden umfassend Chinolone, Rifampicin, Tetracyclin und Ampicillin und Antituberkulosemittel, die unter Isoniazid, Pyrazinamid und Ethambutol ausgewählt werden, jedoch nicht darauf beschränkt sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das antineoplastische Mittel Paclitaxel (Taxol) ist.
Verwendung von Kuhharn-Destillat bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung als Bioverstärker und Bioverfügbarkeitsförderer für ein oder mehrere nutrazeutische Mittel, Antibiotika, anti-infektiöse und antineoplastische Mittel.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei die antibakteriellen Mittel aus der Gruppe ausgewählt werden umfassend Chinolone, Rifampicin, Tetracyclin und Ampicillin oder wobei das antibakterielle Mittel unter Isoniazid, Pyrazinamid und Ethambutol ausgewählt wird.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das antineoplastische Mittel Paclitaxel (Taxol) ist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Kuhharn-Destillat als Bioverfügbarkeitsförderer für die antineoplastische Therapie direkt oder in Kombination mit antineoplastischen Molekülen verwendet wird.
Verwendung nach Ansprüchen 22-25, wobei die Konzentration des Kuhharn-Destillats und lyophilisierten Pulvers äußerst kritisch ist und eine erhöhte Menge über der oberen Grenze die Wirkung/Aktivität in Rezepturen oder verabreichten Dosen negativ beeinflussen kann.