KR100848394B1

KR100848394B1 - 항감염제, 항암제, 및 영양제의 생증진제로서의 소 오줌증류물('Ｇｏ-ｍｕｔｒａ') 유래의 생활성 분획의 용도

Info

Publication number: KR100848394B1
Application number: KR1020037004325A
Authority: KR
Inventors: 슈만 프리트 싱 카누자; 슈실 쿠마르; 아지트 쿠마르 샤사니; 자이 샨카르 아리아; 마헨드라 판두랑 다로카르; 모니카 싱; 프라치 신하; 소우미야 아와스티; 슈바쉬 찬드라 굽타; 비벡 쿠마르 굽타; 마단 모한 굽타; 람 키쇼어 베르마; 스웨타 아가르웰; 슈닐 발크리쉬나 만싱카; 슈레쉬 하리바우 다울
Original assignee: 카운슬 오브 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치
Priority date: 2000-10-20
Filing date: 2000-10-20
Publication date: 2008-07-24
Also published as: AU2005237162A1; BR0017342A; DK1330253T3; CN1234372C; MXPA03002653A; CN1454092A; CA2425025A1; EP1330253A1; CN1788735A; AU2005237162B2; WO2002032436A1; AU3048601A; CA2425025C; CN100536856C; KR20040015010A; AU2001230486B2; DE60012996D1; DE60012996T2; ATE273014T1; EP1330253B1

Abstract

본 발명은 생체이용율 촉진제로서 소 오줌 증류물 유래의 유효량의 생활성 분획과, 항암제, 항생제, 약물, 치료제와 영양제, 이온, 및 생명체를 표적으로 하는 유사한 분자로부터 선택된 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는 새로운 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

항감염제, 항암제, 및 영양제의 생증진제로서의 소 오줌 증류물('Ｇｏ-ｍｕｔｒａ') 유래의 생활성 분획의 용도{Use of bioactive fraction from cow urine distillate ('Ｇｏ-ｍｕｔｒａ') as a bio-enhancer of anti-infective, anti-cancer agents and nutrients}

본 발명은 소 오줌 증류물의, 항감염제와 항암제를 포함한 생활성 분자의 활성 증진제과 이용율 촉진제로서의 완전히 신규한 용도에 관한 것이다. 생물학적 기능을 억제하거나 촉진시키는 형태로 활성을 나타내는 분자를 본 발명에서는 생활성 분자라고 하며, 예를 들어 항생제, 약물, 영양제, 심혈관약, 간장보호제, 신경-강장제 등이 있다. 본 발명은 생활성 분자의 흡수 효율을 증진시켜 항생제와 항암제의 투여량을 현저하게 줄이는 것과 직접적인 관련이 있다.

아유르베다(Ayurveda)에서는 소 오줌은 전반적인 건강을 향상시킨다고 알려져 있다. 그러나, 단독으로 어떤 유용성을 갖는지 여부에 대해 과학적으로 한번도 시험되지 않았다. 본 출원인은 제제에서의 이 성분에 대한 호기심을 가지고, "소 오줌 성분 자체가 어떤 활성을 갖고 있는지 아니면 제제에서 다른 성분의 활성을 증진시키는 것 외에는 어떠한 활성도 갖고 있는 것인지?", "소 오줌에 존재하는 성분은 무엇인가?", "소 오줌이 미생물을 함유하고 있는지 그렇지 않은지, 그중 어느 쪽이 더 유익한가?", "소 오줌으로부터의 분해 산물이 유익한가?" 하는 많은 의문을 가졌다. 이러한 질문에 대한 답을 얻기 위해, 본 출원인은 인도 Nagpur의 "Go-Vigyana Anusandhana Kendra"로부터 오줌 증류물 "Kamadhenu Arka"를 입수했다. 이것은 전반적인 건강을 향상시키기 위해 음용하라고 되어 있는 오줌 증류물이며 다양한 크기의 병에 담아 판매 보급되고 있다. 출원인은 멸균상태에서 Luria 한천과 브로쓰에 상기 오줌을 시험하였으나 어떠한 미생물의 증식도 목격하지 못했다. 소 오줌이 다른 미생물의 증식을 억제하는지에 대해 시험하기 위해, Escherichia coli 및 Mycobacterium smegmatis를 소 오줌 증류물의 존재 및 부존재 하에서 20 내지 40℃ 범위의 여러가지 온도 하에서 증식시켰으나, 콜로니 수에 있어 아무런 의미있는 차이도 목격되지 않았다. 놀랍게도, 동일한 상기 증류물은 이러한 세균에 대한 항생제의 작용을 증진시켰으며, 이로 인해 본 발명에 이르게 되었다. 본 발명의 신규성은 증진 작용 및 그 효과를 정확히 단지 나노 및 마이크로 몰 수준의 농도 범위에서 얻을 수 있다는 사실이 정확한 실험을 통해서 밝혀졌다는 것에 있다. 제제에 고농도/고용량으로 사용할 경우에는 활성이 나타나지 않는다. 그것이 소 오줌(Go-mutra)의 가치가 지금껏 밝혀지지 않은 이유일 것이다. 항생제가 효율적인 흡수, 표적 부위로의 수송, 체류시간, 유출펌프의 작동, 대사 등과 같은 다양한 인자로 인해 감염 미생물에 효과적으로 사용되거나 표적화 되지 못했기 때문에 해마다 수백만 투여량의 항생제 소비가 낭비로 이어졌다. 그러므로, 우리가 투여하는 항생제 중 많은 부분이 낭비되며 단지 아주 작은 비율만이 감염 미생물에 표적화되고 있다. 또한, 사용된 약물/항생제의 양은 신체와 환경에 부담이 되며, 미 생물에 대한 약물의 내성 발현과 그 우세를 촉진시키는 선택 압력(selcetion pressure)으로서 작용하게 되어 결국 내성 감염균에 대해 효과적인 항생제가 없어질 수 있다. 이것은 또한 부작용, 질병, 평균수명 감소의 원인이 되며, 이는 노인 집단에 보다 심각하다. 약물의 투여량을 감소시킬 수 있는 방법 중 하나는 두 가지 치료제 사이의 상승작용을 이용하는 것이다. 그러나, 두 가지 모두 항생제 특성을 갖는다면, 여전히 미생물에 대한 끊임없는 선택 압력의 문제가 계속될 것이다. 그러므로, 본 출원인은 약물 또는 활성 분자와 함께 존재할 경우 그 활성 및 이용율을 증진시키기는 하지만 살균제는 아닌, 즉 생증진제인 소 오줌을 사용하는 것을 생각해 냈다. 이러한 방법으로, 선택 압력은 역으로 균형을 이룰 것이며 항생제 또는 약물의 투여량이 줄어들어 부작용을 최소화할 것이며 이는 또한 상업적으로도 매우 중요하다.

본 발명은 계획된 실험의 결과로서, 소 오줌 증류물을 다양한 제제에 사용하여 항생제, 약물, 및 다른 분자의 활성 및 생체이용율을 향상시키는 새로운 방법을 제공한다.

영양물의 생체이용율과 항생제 효과의 증진은 동물뿐만 아니라 인간, 식물의 건강과 관계가 있으며, 그리하여 본 발명의 조성물과 방법은 또한 농업과 수의학 분야에서 사용되는 것으로 의도된다.

소 오줌(Go-mutra)는 전반적인 건강 향상 능력을 갖는 가장 효과적인 동물 유래 물질/분비물이라고 할 수 있지만, 과학적 실험을 통해 실로 입증할 필요가 있다. 그러므로, 출원인은 이것을 과학적으로 고찰하고 in vitro 및 in vivo 어세이 를 통해 그 가치의 분자적 근거를 정의할 가치가 있다고 여겼다. 약물 촉진 특성은 천연 물질을 더욱 유용하게 하기 때문에, 출원인은 첫 실험수행에서 그것이 약물 촉진제 요소를 함유하고 있는지를 조사하였다. 최근에는, 생체이용율 증진제로서 '피페린(piperine)'의 사용이 알려졌다(미국특허 5,616,593 및 5,972,382). 그러므로, 지금까지 공지되고 입증된 생체이용율 증진제는 피페린이며 상기 선행 기술 이후에 이 화합물과 관련된 일련의 발명이 이루어졌다.

발명의 개시

본 발명의 주된 목적은 생증진제 및 생체이용율 촉진제로서의 생활성 분획의 신규 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 소 오줌 증류물 유래의 활성 분획을 이용하여 항생제, 약물, 및 다른 분자의 활성과 생체이용율을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 소 오줌 유래 활성 분획의 추출 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 풍족하게 입수할 수 있는 공지의 소 오줌 증류물의, 표적에 대한 항생제 작용의 증진제로서의 신규 용도에 관한 것이다. 본 발명의 분자는 동물 세포, 그람양성균, 및 그람음성균의 세포막을 통한 항생제의 흡수를 돕는다. 40-50℃에서의 소 오줌 증류물과 그 농축액으로부터 유사한 활성을 또한 얻을 수 있으 며, 그것을 또 다른 용도를 위해 동결건조하고 용해시킬 수 있다. 또한, 버팔로, 낙타, 사슴 유래의 오줌 증류물도 유사한 활성의 생체이용율을 제공한다.

발명의 상세한 설명

여기에서는 풍족하게 입수 가능하며 효능이 큰 생증진(bioenhancement) 작용을 갖는 물질을 찾는데 주력하였다. 게다가, 출원인이 연구하고자 했던 것은 주목나무(Taxus spps.)에서 매우 적게 생성되어 입수성 면에서 항상 제한적인 분자인, 거의 입수 불가능한 천연 항암제 '탁솔'(파클리탁셀)의 생증진이었다. 소 오줌 증류물은 다양한 항생제의 세균에 대한 살균 활성을 향상시켰다. 더욱 중요한 것은 유방암 세포주 MCF-7에 대한 세포분열 억제 활성을 현저하게 증진시키는 것이었다.

본 발명의 한 구현예에서, 생체이용율 촉진제로서 유효한 양의 소 오줌 증류물과 항암제, 항생제, 약물, 치료제와 영양제, 이온, 및 생물을 표적으로 하는 유사 분자 중에서 선택된 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

또 다른 구현예에서, 소 오줌 증류물을 항암치료를 위해 직접적으로 또는 항암제 분자와 조합하여 생체이용율 촉진제로서 사용한다.

또 다른 구현예에서, 소 오줌 증류물을 진균 감염에 대한 항진균 치료에 사용한다.

또 다른 구현예에서, 상기 항진균제는 아졸, 클로트리마졸, 마이스타틴, 암포테리신, 및 유사 물질이다.

또 다른 구현예에서, 상기 진균에 의한 감염은 균사체, 캔디다, 효모, 또는 그 외의 다른 살진균제에 의한다.

또 다른 구현예에서, 상기 소 오줌 증류물을 다제내성 결핵(multi drug resistance tuberculosis)을 포함한 TB 치료에 이소니아지드 및 그 이외의 항결핵제와 조합하여 사용한다.

또 다른 구현예에서, 상기 생체이용율 촉진제는 상기 화합물을 막을 통해 수송시켜 화합물이 표적 부위에서 보다 효과적으로 작용하는 것을 돕는다.

또 다른 구현예에서, 상기 항생제는 퀴놀론계 항생제, 플루오로퀴놀론계 항생제, 날리딕산, 리팜피신, 테트라사이클린, 암피실린, 및 유사 계열의 화합물이다.

또 다른 구현예에서, 상기 항생제, 이온, 및 유사 화합물은 이소니아지드와 과산화수소이다.

또 다른 구현예에서, 상기 생체이용율 촉진제는 항생제와 그 외의 분자가 표적부위에 작용하여 효과가 증진되는 것을 돕는다.

또 다른 구현예에서, 상기 생물은 세균, 진균, 또는 모든 살아있는 세포일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 항생제는 퀴놀론계 항생제, 리팜피신, 테트라사이클린, 및 암피실린을 포함하는 그룹에서 선택된다.

또 다른 구현예에서, 소 오줌(Go-mutra) 증류물은 0.001㎕/ml 내지 100㎕/ml의 범위이다.

또 다른 구현예에서, 사용되는 동결건조 분획은 0.1㎍/ml 내지 100㎍/ml의 범위이다.

또 다른 구현예에서, 소 오줌 증류물의 생활성 분획은 항생제, 항암제, 및 항결핵제의 활성을 2 내지 80배 증진시킨다.

또 다른 구현예에서, 상기 생활성 분획은 항생제의 활성을 2 내지 80배 증진시킨다.

또 다른 구현예에서, 상기 항생제는 이소니아지드, 피라진아미드, 및 그 외의 유사한 화합물로부터 선택된 항결핵제이다.

또 다른 구현예에서, 상기 생활성 분획은 항결핵제의 활성을 2 내지 20배 증진시킨다.

또 다른 구현예에서, 항암제는 파클리탁셀(탁솔)로 구성된 그룹에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 생활성 분획은 항암제의 활성을 2 내지 20배 증진시킨다.

우리가 수행한 이러한 스크리닝 방법은 하기한 바와 같이 특이적으로 디자인된 바이오어세이를 포함한다. 본 발명에서 사용된 세균주 및 진균주는 Chandigarh의 Institute of Microbial Technology(IMTECH)에서 상업적으로 입수하였는데, 이들은 ATCC 균주에 해당하는 특성을 가졌다.

1. 항감염제의 생증진 어세이

a) 브로쓰 및 디스크 확산 어세이로 Escherichia coli(ATCC 10536에 해당), Bacillus subtilis(ATCC 6015에 해당), 및 Mycobacterium smegmatis(ATCC 10231에 해당)에 대한 항생제의 최저억제농도(MIC)를 결정한다.

b) 억제 정도를 비교 평가하기 위해, MIC의 1/4, 1/3, 1/2, 및 MIC의 농도의 항생제를 단독으로 그리고 다양한 농도의 시험 화합물과 조합하여 디스크 및 브로쓰에 부가한다.

c) 세균 증식의 억제 증진의 측면에서 항생제 단독의 경우보다 현저한 이점 또는 높은 활성을 나타내는 조합(디스크 확산법에서의 큰 억제 부위 및 브로쓰 어세이에서의 보다 낮은 농도)을 다음 실험을 위해 선택한다.

d) 브로쓰 어세이에서 활성은 주어진 처치 하에 살아있는 세포의 수를 세어 정량하고, 항생제/약물 단독으로 사용한 경우와 비교하여 조합한 경우에 증진된 세포 사멸 배수로 전환한다.

e) 항생제의 활성을 증진시키기 위해 화합물을 함께 사용해야 할지 또는 항생제 치료 후에 제거하거나 항생제 치료 전에 처리해야 하는지를 결정하기 위해 전처치 어세이를 하는 것이 유익할 것이다. 이를 위해, 세포를 화합물로 4 내지 8시간동안 처리한 다음 원심분리로 세척하여 그 화합물을 제거하고 멸균수로 세척한다. 그 다음, b 내지 d 단계에서와 같이 항생제로 처리한다.

2. 항암제의 생증진에 대한 어세이

a) MEM 배지가 들어 있는 24 웰 플레이트의 웰에 MCF-7(Pune의 National Center for Cell Sciences(NCCS)에서 입수한 상업적 유방암 세포)를 약 0.1x10⁶ 세포의 밀도로 접종한다.

b) 각각의 웰을 18시간 후에 신선한 배지로 교환한다.

c) 배지 교환 직후에 시험 성분(들)을 서로 다른 웰에 원하는 농도로 부가한다.

d) 36시간 후에 세포수를 관찰하여 기록하며, 이를 위해서는 다음 단계가 필요하다.

ⅰ. 웰에서 배지를 제거한다.

ⅱ. 웰을 1ml PBS(인산염 완충 식염수 용액)로 세정한다.

ⅲ. 각각의 웰에 신선하게 제조한 트립신(PBS 중 0.1%) 500㎕를 부가한다.

ⅳ. 30초 후에 트립신 용액을 제거하고 세포가 플레이트 표면으로부터 떨어질 때까지 플레이트를 살살 친다.

ⅴ. 신선한 MEM 증식 배지 1ml를 부가하고 피펫으로 교반하여 세포 현탁액을 얻는다.

ⅵ. 세포 현탁액 10㎕를 헤모사이토미터(haemocytometer)에 넣고 커버 글래스를 계수 챔버에 올려 놓는다.

ⅶ. 5개의 큰 스퀘어 내에 있는 살아있는 세포 수를 세고 5개의 현미경 필드에서 측정된 세포수의 평균을 낸다.

ⅷ. 그리고 나서, 원래의 샘플에서의 세포수(ml 당 역가)를 평균 수x 10³으로 계산한다.

MEM 배지(Minimum Essential Medium)의 조성: 100ml

MEM 분말(Sigma-Aldrich, USA) = 0.96g

HEPES 완충제(Sigma-Aldrich, USA) = 0.26g

중탄산나트륨 = 0.22g

페니실린 G = 10mg

스트렙토마이신 = 20mg

겐타마이신 = 5mg

우태아혈청 = 15ml

증류수 = 85ml

3. 생물막을 통한 생체이용율 시험

a) 두 개의 부분(마주보는 L자형)으로 구성된 특별히 고안된 U자형 유리관을 사용하였으며, 상기 튜브는 한 쪽의 L자형 튜브 부분의 한쪽 개방 단부를 테이퍼지게 하고 테이퍼지지 않은 다른 쪽 L자형 튜브의 단부 내로 연결시켰다.

b) 염소 위장(처음 부분) 막을 잡아 당기고, 두 개의 L-튜브를 결합시켜 U자형 튜브가 만들어지도록 두 개의 말단 사이에서 막으로 작용하도록 고정하였다.

c) 그리고 나서, 멸균 증류수를 양쪽 모두에 동일한 높이/수준으로 채웠다. 항생제/화합물을 공여 튜브(테이퍼진 튜브)에 부가하고, 각각의 분자의 최대 흡수를 갖는 소정의 파장의 UV 및 가시광선을 이용하여 분광광도계를 통해 OD를 측정함으로써 분자의 이동을 관찰하였다.

도 1은 소 오줌(Go-mutra) 증류물의 HPLC 특징을 나타낸다.

다음 단계의 증진제 작용에 대한 설명 단계에서, 출원인은 단독으로 사용할 경우와 상기 방법에 따른 시험 성분(소 오줌 증류물)과 조합하여 사용할 경우의 다양한 항생제의 사멸활성을 실험하였다. 이러한 실험들을 하기 실시예에 기재하였다. 세균을 상기 화합물의 존재 하에서 증식시킬 때, 어떠한 유의성 있는 살균도 관찰되지 않았다. 모든 실험에서, 구체적으로 언급하지 않았다면 소 오줌 증류물 농축액의 농도를 1㎕/ml로 유지하였다.

실시예 1

소 오줌(Go-mutra) 증류물에 의한 그람 음성균 Escherichia coli에 대한 항생제의 살균 활성의 향상

[표 1]

항생제	농도 ㎍/ml	항생제 단독 처리시 살아있는 세포의 생존율	항생제+소 오줌 증류물 조합으로 처리 시 살아있는 세포의 생존율	*항생제 활성의 증진 배수
리팜피신	10	0.86	0.17	5.0
리팜피신	30	0.05	0.007	7.1
암피실린	4	1.11	0.60	1.85
암피실린	6	0.09	0.02	4.50
암피실린	8	0.05	0.01	5.00

항생제와 소 오줌 증류물을 조합하여 처치 시 살아있는 세포의 생존율/ 항생제 단독으로 처치 시 살아있는 세포의 생존율을 계산하였다.

실시예 2

소 오줌(Go-mutra) 증류물에 의한 그람 양성균 Bacillus subtilis에 대한 항생제 살균 활성의 증진

[표 2]

항생제	농도 ㎍/ml	항생제 단독 처리시 살아있는 세포의 생존율	항생제+소 오줌 증류물 조합으로 처리 시 살아있는 세포의 생존율	*항생제 활성의 증진 배수
리팜피신	0.005	1.1	0.28	5.5
리팜피신	0.05	0.03	0.01	3.0
암피실린	0.1	1.00	0.3	3.3
암피실린	0.5	0.18	0.06	3.0

실시예 3

소 오줌(Go-mutra) 증류물에 의한 세균 Mycobacterium smegmatis에 대한 항생제 살균 활성의 증진

[표 3]

항생제	농도 ㎍/ml	항생제 단독 처리시 살아있는 세포의 생존율	항생제+소 오줌 증류물 조합으로 처리 시 살아있는 세포의 생존율	*항생제 활성의 증진 배수
리팜피신	0.05	0.008	0.0001	80
리팜피신	0.1	0.006	0.0036	1.5
암피실린	0.5	0.07	0.006	11.6

상기 실험으로부터 항생제를 소 오줌 증류물과 함께 적용할 때 그 효력이 증가하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4

소 오줌(Go-mutra) 증류물에 의한 세균 Escherichia coli의 oxyR 돌연변이체에 대한 이소니아지드와 과산화수소의 사멸 활성의 증진. 상기 소 오줌 증류물의 농도는 0.001㎕/㎖이다.

[표 4]

	농도	이소니아지드/H₂O₂ 단독 처리시 살아있는 세포의 생존율	이소니아지드/H₂O₂+소 오줌 증류물 조합으로 처리 시 살아있는 세포의 생존율	*이소니아지드/H₂O₂ 활성의 증진 배수
이소니아지드	250㎍/㎖	7.5 x 10⁷	0.99 x 10⁷	7.5
과산화수소(H₂O₂)	0.003% v/v	7.14 x 10⁷	1.2 x 10⁷	5.9

Escherichia coli에서의 과산화수소-유도 유전자의 레균론(regulon)을 유도하기 위해서는 oxyR 유전자가 필요하며(Christman M F, Storz G 및 Ames BN(1989) Oxy R), Escherichia coli 및 Salmonella typhimurium에서의 과산화수소 유도 유전자의 양성 조절자는 세균의 조절 단백질 계통과 유사하다(Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 86:3484-3488). 이러한 유전자의 돌연변이체는 이소니아지드 및 과산화수소와 같은 약물에 대한 감수성이 있어서, 유리 라디칼을 생성하고 세포계를 손상시킨다. 그러므로 이러한 화합물의 사멸 활성은 소 오줌에 의해 5 내지 8배 증가한다.

실시예 5

소 오줌(Go-mutra) 증류물에 의한 항암제의 활성의 증진. 소 오줌 증류물의 농도는 1㎕/ml 이다.

[표 5]

탁솔농도 ㎍/㎖	생세포의 초기 역가	탁솔 단독으로 처리 시 생세포의 최종 역가	탁솔+소 오줌 증류물로 처리 시 생세포의 최종 역가
0.001	0.9 x 10⁶	0.059 x 10⁶	0.039 x 10⁶
0.005	0.9 x 10⁶	0.042 x 10⁶	0.032 x 10⁶
0.01	0.9 x 10⁶	0.036 x 10⁶	0.012 x 10⁶

본 출원인은 동물세포 배양(Pune의 National Center for Cell Science(NCCS)로부터 입수한 암세포계 MCF-7)에서 항암제 '탁솔'의 사멸 활성이 증가하는 유사한 결과를 관찰하였다. 연구 대상인 소 오줌의 성분은 세균, 동물세포, 및 식물세포에 상관없이 다른 화합물이 막을 통해 수송되는 것을 도움으로써 흡수를 증가시킨다. 이것은 결과적으로 세포의 약물, 약제, 영양제, 및 그 외의 유사 화합물과 이 온의 흡수에 있어 매우 중요하다.

실시예 6

생활성 분획 Gm-Ⅳ에 의한 항진균제 클로트리마졸의 생증진. 활성 분획의 농도는 10㎍/㎖로 유지한다.

[표 6]

처리	최저억제농도(MIC) ㎍/㎖	증진 배수
클로트리마졸	4.40	0.0
클로트리마졸+GmⅣ	0.88	5.0

다른 실험예의 경우에서, 소 오줌 증류물은 항생제(예: 리팜피신, 테트라사이클린, 암피실린)의 인공막 뿐만 아니라 위장관을 통한 수송을 증진시킨다. 수송이 약 2 내지 7배로 증진된다.

인도의 의약 시스템에서 널리 사용되고 있는 대체 원료로부터의 조 약물(crude drugs)의 품질 보증에 대한 중요성이 현재 강조되고 있다. 본 발명은 치료학 및 영양학적 적용분야에서 소 오줌 증류물의 범위 및 용도를 증대시킨다.

실시예 7

산제의 개발

본 출원인은 소 오줌(Go-mutra) 적용의 실용성과 간편성을 증진시키기 위해 소 오줌 증류물 냄새가 없어 사람들이 보다 쉽게 사용할 수 있는 고체 형태가 되도록 더욱 분별증류 하였다. 이러한 목적을 위해, 오줌 증류물을 하기 방법에 따라 분별증류 하였다.

소 오줌으로부터 백색 결정체의 분별증류

단계 1: 소 오줌을 소로부터 직접 스테인레스 스틸 용기에 무균상태로 수집하고, 위생적인 환경을 유지하였다.

단계 2: 유리제 증류장치에서 소 오줌 15리터를 40-50℃에서 계속해서 증류하여 16 내지 18시간 후에 증류물 10-12리터를 획득하였다.

단계 3: 상기 증류물을 이후의 사용을 위해 표면이 멸균된 플라스틱 또는 유리 용기에 넣었다.

단계 4: 소 오줌 증류물 200ml를 그 부피의 반에 해당하는 메탄올과 혼합하고 헥산으로 추출하였다.

단계 5: 헥산 분획(Gm-I)을 동결건조하고 소 오줌(Go-mutra)과 유사한 활성을 갖는지를 시험하였다.

단계 6: 수성 분획을 에틸아세테이트로 추출하고 그 에틸아세테이트 분획(Gm-Ⅱ)을 동결건조하고 소 오줌(Go-mutra)과 유사한 활성을 갖는지를 시험하였다.

단계 7: 백색 침전물을 함유하는 수성 분획을 부탄올로 추출하고, 연노란색의 침전물을 갖는 상기 부탄올 분획(Gm-Ⅲ)을 동결건조하고 소 오줌(Go-mutra)과 유사한 활성을 갖는지를 시험하였다.

단계 8: 백색 결정성 침전물(Gm-Ⅳ)을 함유하는 남아있는 수성 분획을 건조하고 소 오줌(Go-mutra)과 유사한 활성을 갖는지를 시험하였다.

도해

증류물 100ml당 10g 내지 20g의 범위로 얻어지는 백색 분말(Gm-Ⅳ)는 훨씬 큰 안정성을 가지면서 0.001 내지 10㎍/㎖ 농도의 소 오줌 증류물에 대해 상기 기재된 바와 같은 활성 모두를 나타내었고, 불쾌한 냄새가 없으므로 본 발명의 향상된 산물로서 이용되었다. 본 발명의 신규성은, 증진 작용 및 효과가 실제로 단지 나노 내지 마이크로 몰 수준의 농도 범위에서 획득될 수 있다는 명확한 실험을 통해 밝혀진 사실에 있다. 더 높은 농도/투여량을 제제 또는 조합에 사용할 경우 활 성(들)이 나타나지 않는다.

Gm-Ⅳ의 물리학적 특성

색: 백색

물리학적 상태: 수용성이며 물을 함유하는 혼합물

녹는점: 400℃ 초과

비중: 1.006

메탄올:클로로포름(50:50 v/v) 상에서의 RF 값: 0.65

소 오줌( Go-mutra ) 증류물의 HPLC 특징

이동상 물:아세토니트릴(80:20 v/v), 유속 1.0ml/분, UV 검출 275nm, 및 C-18E MERCK(150X4mm) 칼럼으로 LC-8A Shimadzu HPLC에서 HPLC를 수행하였다. 소 오줌(Go-mutra) 증류물의 프로파일에서 두 개의 주요 피크(체류시간 5.334분 및 11.310분)가 관찰되었다(도 1).

상기 화합물의 화학적 특성을 시험하기 위한 실험을 배당체나 당의 존재를 알려주는 Feigl 시험(In: E Stahl, 박막 크로마토그래피)을 통해 수행하였다.

본 발명의 신규성은 소 오줌(Go-mutra) 증류물로부터 안정한 고체 분획을 분리할 수 있으며 그 고체 분획은 수용성이고 오줌 냄새가 없으며 모든 제제에 직접적으로 사용될 수 있다는 것에 있다.

분획 Gm-Ⅳ는 또한 포유류 위장관 막을 통한 항생제와 비타민의 수송을 증진시킨다. 분획 Gm-Ⅳ에 의한 리팜피신의 수송 증진을 설명하는 실시예를 아래에 기재하였다.

실시예 8

소 오줌(Go-mutra) 증류물의 분획 Gm-Ⅳ에 의해 매개되는, 생물막을 통한 생체이용율의 증가(리팜피신, 1mg/ml 및 분획 Gm-Ⅳ, 1.0㎍/ml)

[표 7]

공여 튜브 의 화합물(들):	파장 (nm)	수여 튜브에서의 막을 통과한 화합물에 특이적인 흡광도로서 측정된 OD
공여 튜브 의 화합물(들):	파장 (nm)	1시간	2시간	3시간	4시간	5시간	6시간
리팜피신	A₃₄₀	0.0097	0.0214	0.0334	0.0771	0.0858	0.0910
리팜피신	A₄₇₅	0.0177	0.0284	0.0309	0.0412	0.0484	0.0496
리팜피신+Gm-Ⅳ	A₃₄₀	0.0525	0.0961	0.1353	0.1639	0.1919	0.1989
리팜피신+Gm-Ⅳ	A₄₇₅	0.0502	0.0904	0.0793	0.0966	0.1157	0.1183

소 오줌(Go-mutra) 증류물과 분획 Gm-Ⅳ, 모두가 반투과막과 포유류 위장관 막을 통해 항생제의 수송을 증진시킴으로써 증가된 막 투과성을 나타내었기 때문에, 장관 수송 및 뇨/신장계를 포함한 다양한 생물학적 기능을 갖는 막을 통한 수송을 향상시키는데 상기 물질을 사용할 수 있다.

1 내지 5의 모든 실험에서, 본 발명의 동결건조 산물의 활성 증진 효과가 증류물과 동등한 활성 증진 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.

본 발명을 다음과 같이 더 설명할 수 있다:

1. 샘플은 2시간 이내에 포유류 위장관 막(염소의 장을 사용하였다)을 통한 리팜피신(항생제) 및 비타민 B-12의 생체이용율이 향상되어 그것이 4시간까지 계속 증가되는 것을 보여준다.

2. 절단된 사과의 산화를 막는 아스코르브산의 작용에 대한 명백한 억제는 증류물이 INH의 약물 작용을 상승시키는 산화 기전에 의해 이소니아지드(INH)의 작 용을 향상시키는 것을 의미한다.

3. 상기 증류물은 배양물의 최종 부피에서 1만 내지 5만 배로 희석되는 경우에도 INH의 작용을 증진시키는 것으로 나타났다.

4. 보다 흥미로운 것은 상기 증류물이 1㎕/ml일 경우에 탁솔의 활성을 최소 5배 향상시키는 것이다. 이런 방향으로 추가적인 실험이 우선적으로 이루어졌다.

Claims

약학적 활성성분의 활성을 증진시키는데 유효한 양의 40~50℃에서의 소 오줌 (Go-mutra) 증류물과 항암제, 항생제, 항진균제, 약물, 치료제와 영양제, 및 이온으로부터 선택된 약학적 활성성분을 포함하는 상기 약학적 활성성분의 활성을 증진시키기 위한 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 소 오줌 증류물은 항암 치료를 위해 직접적으로 또는 항암제와 조합하여 항암제의 활성을 증진시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 소 오줌 증류물은 이소니아지드 및 다른 항결핵제와 조합하여 다제내성(multi drug resistance) 결핵을 포함한 결핵 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 소 오줌 증류물은 감염에 대한 항진균 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 소 오줌 증류물은 화합물이 막을 통과하여 표적 부위에서 효과를 향상시키도록 도와주는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 항생제는 퀴놀론계 항생제, 플루오로퀴놀론계 항생제, 날리딕산, 리팜피신, 테트라사이클린, 및 암피실린을 포함하는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 항생제 및 이온은 이소니아지드와 과산화수소인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 소 오줌 증류물은 상기 약학적 활성성분의 효능을 증진시킴으로써 표적에 대한 활성을 증진시키도록 도와주는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 항진균제는 클로트리마졸, 마이스타틴, 또는 암포테리신인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 항진균제는 균사체, 캔디다, 또는 효모의 살진균제인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 소 오줌(Go-mutra) 증류물의 농도는 0.001 ㎕/ml 내지 100 ㎕/ml의 범위에서 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 소 오줌(Go-mutra) 증류물은 반투과막 및 포유류 위장관막에 대한 약물 분자의 막투과성을 증진시켜 장관 수송 및 생물막을 통한 수송을 증진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
40~50℃에서의 소 오줌(Go-mutra) 증류물을 그 부피의 반에 해당하는 메탄올과 혼합한 다음 헥산으로 추출하는 단계;

상기 헥산 추출물(Gm-I)을 동결건조하고 상기 소 오줌(Go-mutra) 증류물의 약학적 활성성분의 활성 증진 효과를 갖는지 여부를 검사하는 단계;

에틸 아세테이트로 수성 분획을 추출하고 그 에틸 아세테이트 분획(Gm-Ⅱ)을 동결건조하고, 상기 소 오줌(Go-mutra) 증류물의 약학적 활성성분의 활성 증진 효과를 갖는지 여부를 검사하는 단계;

백색 침전물을 함유하는 수성 분획을 부탄올로 더욱 추출하고, 연노란색의 침전물을 갖는 그 부탄올 분획(Gm-Ⅲ)을 동결건조하고, 상기 소 오줌(Go-mutra) 증류물의 약학적 활성성분의 활성 증진 효과를 갖는지 여부를 검사하는 단계; 및

백색 결정 침전물(Gm-Ⅳ)를 함유하는 남아있는 수성 분획을 동결건조하고, 상기 소 오줌(Go-mutra) 증류물의 약학적 활성성분의 활성 증진 효과를 갖는지 검사하는 단계를 포함하는 소 오줌 증류물로부터 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ)를 제조하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 소 오줌(Go-mutra) 증류물 유래의 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ)은 소 오줌 증류물 냄새가 없는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ)은 하기 특성을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 방법:

색상: 백색

물리학적 상태: 고체 결정

용해성: 수용성이며 물을 함유하는 혼합물

녹는점: 400℃ 초과

비중: 1.006

메탄올:클로로포름(50:50 v/v) 상에서의 RF 값: 0.65.
제 14 항에 있어서, 출발물질인 소 오줌(Go-mutra) 증류물은 이동상으로서 물:아세토니트릴(80:20 v/v), 유속 1.0ml/분, 및 C-18E MERCK(150X4mm) 칼럼으로 하여 LC-8A Shimadzu HPLC를 수행한 결과 5.334분과 11.310분의 체류시간을 갖는 두 개의 주요 피크를 갖는 HPLC 특성을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ)은 0.1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml 범위의 농도에서 상기 소 오줌 증류물과 약학적 활성성분의 활성 증진 효과가 동일하며 실온에서의 안정성 및 수용성이 40~50℃의 소 오줌 증류물보다 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
하기 물리학적 특징을 갖는, 제 14 항의 방법에 따라 획득된 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ):

색상: 백색

물리학적 상태: 고체 결정

용해성: 수용성이며 물을 함유하는 혼합물

녹는점: 400℃ 초과

비중: 1.006

메탄올:클로로포름(50:50) 상에서의 RF 값: 0.65.
제 19 항에 있어서, 상기 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ)은 소 오줌 증류물 냄새가 없는 것을 특징으로 하는 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ).
제 19 항에 있어서, 상기 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ)은 0.1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml 범위의 농도로 사용되고 실온에서 안정성 및 수용성이 40~50℃의 소 오줌 증류물보다 증가된 것을 특징으로 하는 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ).
제 19 항에 있어서, 상기 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ)은 약물분자의 반투과막 및 포유류 위장관막을 통한 막투과성을 향상시키는데 사용되어 장관 수송 및 생물막을 통한 수송을 증진시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ).
유효한 양의 제 19 항에 따른 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ) 및 하나 이상의 영양제, 항생제, 항감염제, 항암제를 포함하는 조성물.
제 23 항에 있어서, 상기 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ)은 항생제, 항암제, 및 항결핵제 활성을 2 내지 80 배 증진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 23 항에 있어서, 상기 항생제는 퀴놀론계 항생제, 리팜피신, 테트라사이클린, 및 암피실린을 포함하는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 23 항에 있어서, 상기 항생제는 이소니아지드, 피라진아미드, 및 에탐부톨에서 선택된 항결핵제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 23 항에 있어서, 상기 동결건조 추출물(Gm-Ⅳ)은 항결핵제의 활성을 2 내지 20 배 증진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 23 항에 있어서, 상기 항암제는 파크리탁셀(탁솔)로 구성된 그룹에서 선 택되는 것을 특징을 하는 조성물.
제 23 항에 있어서, 상기 동결건조 추출물(Gm-IV)은 항암제의 활성을 2 내지 20배 증진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
40~50℃에서의 소 오줌 증류물을 포함하는 영양제, 항생제, 항감염제, 및 항암제 중 하나 이상의 약학적 활성성분에 대한 활성 증진제.
제 30 항에 있어서, 상기 항생제는 퀴놀론계 항생제, 리팜피신, 테트라사이클린, 및 암피실린으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 활성 증진제.
제 30 항에 있어서, 상기 항생제는 이소니아지드, 피라진아미드, 및 에탐부톨로부터 선택된 항결핵제인 것을 특징으로 하는 활성 증진제.
제 30 항에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀(탁솔)로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 활성 증진제.
제 30 항에 있어서, 상기 소 오줌 증류물은 직접적으로 또는 항암제 분자와 조합하여 항암제의 활성 증진제로서 사용되는 것을 특징으로 하는 활성 증진제.
제 30 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 소 오줌 증류물의 농도는 100 ㎕/㎖을 넘게 되면 제제 또는 투여량에서의 활성을 손상시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 활성 증진제.