CN100475221C - 一种防护和/或修复dna氧化损伤的组合物(rcud)及其方法 - Google Patents

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Abstract

一种对于防护和/或修复DNA氧化损伤有用的组合物，所述组合物包含重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，组合物中氨的含量范围是5-15mg/L，并选择性含有抗氧化剂；以及一种使用权利要求1中的组合物防护和/或修复DNA氧化损伤的方法，所述方法包括以下步骤：确定样品中折叠的DNA的量，在DNA暴露在氧化损伤DNA的试剂之前或者之后，将所述组合物混合到所述DNA中，并确定混合物中折叠的DNA的百分比，其表示对DNA氧化损伤的防护和/或修复。

Description

一种防护和/或修复DNA氧化损伤的组合物(RCUD)及其方法
技术领域
一种对于保护和/或修复DNA免于氧化损伤有用的组合物，所述组合物包含重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，组合物中氨的含量范围是5-15mg/L，并选择性含有抗氧化剂；以及一种使用权利要求1中的组合物保护和/或修复DNA免于氧化损伤的方法，所述方法包括以下步骤：估计样品中折叠的DNA的量，在DNA暴露在DNA氧化损伤试剂之前或者之后，将所述组合物混合到所述DNA中，并确定混合物中表示折叠的DNA的百分比，其表示了对DNA氧化损伤的防护和/或修复。
背景技术
在吠陀经中，将牛产品与神酒进行了比较(梨俱吠陀10.15pp.47)。在印度草医学中，牛尿是潘克戈亚(Panchagavya)的成分之一。根据沙许拉特(Susrut)，牛尿具有若干药物特性(45/221，pp-61，72，220，221)。沙拉克(Charak)[斯洛卡(Solka)-100pp.72]也描述了其性质。牛尿被广泛地应用于印度草医学中，用以纯化否则会具有毒性的某些材料(pp.73)。然而，文献和经文中没有提到尿或其蒸馏物作为保护细胞免受DNA损伤和染色体变异的保护者的作用。为了研究牛尿蒸馏物的性质，申请人得到了KamdhenuArk，这是由Govigyan Anusandhan Kendra(GVAK)，Nagpur(印度)制备销售的牛尿蒸馏物。这种尿蒸馏物被建议用于口服以增进大众健康(general health)和控制体重增加、浮肿、胃痛、消化不良、皮肤病以及心脏问题等。KamdhenuArk的生产过程表明，牛尿应该是新鲜并且不含氨。在NEERI进行的试验显示，牛尿的贮藏会导致氨的形成，这可以从下面的表1中看出。
表1：牛尿中氨的含量
Figure C0382637500051
申请人以前的工作是关于香烟烟雾产生的氧化损伤能够被维生素C防止。作者证实，将亚临床或者维生素C少量缺乏的豚鼠(guinea pig)暴露在香烟烟雾中会引起膜蛋白的氧化以及肺微粒体蛋白大量氧化降解。进一步，共轭二烯烃、丙二醛和荧光色素的形成表明，暴露于烟雾也可以诱导微粒体脂质过氧化。然而，当对豚鼠喂食维生素C时，则产生对蛋白质的损伤和脂类过氧化的完全防护作用。同时，当中止暴露在香烟烟雾并进行抗坏血酸治疗后，烟诱导的蛋白质和脂类的损伤得到逆转。如果推广到人的话，这个结果提示相对大剂量的维生素C可以保护吸烟者免受香烟烟雾引起的氧化损伤以及相关联的退化性疾病。(Panda，chattopadhyay和Chatterjee；free radicalbiology & medicine，Vol.29，No.2，pp.115-124，2000)。
发明内容
本发明的主要目的是开发一种防止和矫正DNA损伤的天然组合物。
本发明的另一个主要目的是开发一种防止和矫正DNA损伤的方法。
本发明的另一个目的是开发一种制备RCUD的工艺。
主要目的是提供Kamdhenu Ark作为DNA损伤保护物的新应用。
发明的另一个目的是提供去除Kamdhenu Ark中氨的方法，其目的是去除氨的毒性(如果有的话)并提高其防护DNA损伤的活性。
发明的另一个目的是鉴定重蒸Kamdhenu Ark作为DNA损伤保护剂的活性成分。
一种对于保护和/或修复DNA免于氧化损伤有用的组合物，所述组合物包含重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，组合物中氨的含量范围是5-15mg/L，并选择性含有抗氧化剂；以及一种使用权利要求1中的组合物保护和/或修复DNA免于氧化损伤的方法，所述方法包括以下步骤：确定样品中折叠的DNA的量，在DNA暴露在氧化损伤DNA的试剂之前或者之后，将所述组合物混合到所述DNA中，并确定混合物中折叠的DNA的百分比，用以表示对DNA氧化损伤的防护和/或修复。
附图说明
图1表示的是在注射重蒸Kamdhenu-Ark后GCMS的探测器响应。
本发明是寻找具有保护暴露在DNA损伤化学试剂的细胞免于DNA损伤的性质的天然抗氧化剂的结果。在这方面的努力中，通过对按照古代经文和文献描述，给牛专门喂食含有特殊草药，并对牛的尿进行蒸馏而制备了Kamdhenu Ark。这些牛是在GVAK，Deolapar(Nagpur区)在GVAK，Nagpur的发明人的严格监督下饲养的。在所得到的蒸馏物(大约400ml/批)中加入加入10-25ml(25％)正磷酸(分析纯)进行重蒸馏，使蒸馏的Ark的pH值降低至2以下。将重蒸和改良的Ark用于所有以后进行的NEERI实验。
具体实施方式
一种对于保护和/或修复DNA免于氧化损伤有用的组合物，所述组合物包含重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，组合物中氨的含量范围是5-15mg/L，并选择性含有抗氧化剂；以及一种使用权利要求1中的组合物保护和/或修复DNA免于氧化损伤的方法，所述方法包括以下步骤：确定样品中折叠的DNA的量，在DNA暴露在氧化损伤DNA的试剂之前或者之后，将所述组合物混合到所述DNA中，并确定混合物中折叠的DNA的百分比，用以表示对DNA氧化损伤的防护和/或修复。
本发明的一种实施方式中，其中一种对于保护和/或修复DNA免于氧化损伤有用的组合物，所述组合物包含重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，组合物中氨的含量范围是5-15mg/L，并选择性含有抗氧化剂。
在本发明的另一种实施方式中，其中RCUD是无色的。
在本发明的又一种实施方式中，其中RCUD是水溶性的。
在本发明的再一种实施方式中，其中RCUD具有大约1.006的比重。
在本发明的又一种实施方式中，其中RCUD具有3.0-5.0范围内的pH值。
在本发明的另一种实施方式中，其中RCUD氨氮(NH3N)的含量在5-15mg/L的范围内。
在本发明的另一种实施方式中，其中RCUD所含挥发性脂肪酸的含量在1000-3000mg/L的范围内。
在本发明的另一种实施方式中，其中抗氧化剂从包含挥发性酸、喹啉和烃衍生物的组中选择。
在本发明的另一种实施方式中，其中挥发性脂肪酸是乙酸、丙酸和丁酸的衍生物。
在本发明的另一种实施方式中，其中挥发性脂肪酸的衍生物是：乙酸-2-丙烯酯；乙酸巯基甲酯；2-丁烯二腈；富马腈(Fumanonitrile)；2，2，3-三氯丙酸、3-氯丙酸、3-甲基-2-戊烯酸；异戊酸；3-羟基丁酸乙醚；4-甲基-2-三甲基苯甲酸；(邻-三乙基硅烷氧基)苯基三乙基甲硅烷基乙酸；3-苯基丙酸(肉桂酸)；巯基乙酸；1-氢吲哚-3-ol-醋酸酯；乙酸苯酯；3-甲基喹啉。
在本发明的另一种实施方式中，其中喹啉从包含3-甲硫基喹啉和3-甲基喹啉的组中选择。
在本发明的另一种实施方式中，其中组合物闻起来像尿。
在本发明的另一种实施方式中，其中组合物被用作药物组合物。
在本发明的另一种实施方式中，其中组合物用于分析遗传材料。
在本发明的另一种实施方式中，其中一种使用权利要求1中的组合物保护和/或修复DNA免于氧化损伤的方法，所述方法包括以下步骤：
·估计样品中折叠的DNA的量，
·在DNA暴露在氧化损伤DNA的试剂之前或者之后，将所述组合物混合到所述DNA中，以及
·确定混合物中折叠的DNA的百分比，其表示对DNA氧化损伤的防护和/或修复。
在本发明的另一种实施方式中，其中DNA被从包含放线菌素D、二氧化锰(MnO2)和过氧化氢(H2O2)的组中选择的化合物所损伤。
在本发明的另一种实施方式中，其中所述组合物大约增强150-250倍抗基因毒性效果。
在本发明的另一种实施方式中，其中一种去除牛尿蒸馏物中的氨以得到重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)的方法，所述方法包括下列步骤：使用浓度为82％-88％的正磷酸对牛尿蒸馏物进行重蒸，并得到重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)。
在本发明的另一种实施方式中，其中一种如权利要求15中所述的方法，其使用正磷酸处理将蒸馏物的pH值降低至2以下。
在本发明的另一种实施方式中，其中一种权利要求15所述的方法，其中在大约100℃的温度下对蒸馏物进行重蒸。
在本发明的另一种实施方式中，其中权利要求15所述的方法，其中重蒸可以帮助去除牛尿的毒性。
在本发明的另一种实施方式中，其中权利要求15所述的方法，其中所述方法使蒸馏物的氨水平从1000-1500mg/L浓度范围降低到5-15mg/L范围。
公开了一种包含抗氧化剂的含有牛尿蒸馏物的药物组合物，其中该牛尿蒸馏物的含量可有效防护DNA损伤。抗氧化剂可以是挥发性脂肪酸。
本发明涉及低氨含量的重蒸的牛尿蒸馏物在DNA损伤保护中的新应用。DNA是危险化学品和废物最主要的细胞靶位之一，其可以在暴露之后因碱基改变和糖磷脂骨架断裂而被损伤。
如果细胞内发生DNA损伤，与基因组完整性和DNA损伤修复机制相关的基因会被诱导，其结果是，将细胞周期阻止在G1期。接着，损伤的DNA被修复，进而被阻止的细胞周期也得到恢复，细胞进入S期(DNA合成期)。然而，如果损伤不能够被修复的话，在正常情况下执行修复任务的同样基因会诱导细胞发生凋亡(程序式细胞死亡)，从而维持系统不含有缺陷的细胞。本发明直接参与帮助由损伤DNA的化学试剂例如过氧化氢(H2O2)、放线菌素D和二氧化锰(MnO2)引起的损伤修复。
氨来源于牛尿中的尿，是由存在于大量微生物内的脲酶的酶水解作用产生的。尽管氨对人的健康是有毒的，但在Kamdhenu Ark中的剂量并未对人的健康或者健康人带来负面作用。然而，在人使用之前，将其从Ark中去除掉至少对于敏感人群是理想的。因此，对从GVAK，Nagpur获得的Kamdhenu Ark使用正磷酸处理后进行再次蒸馏。重蒸馏的过程需要将10-25ml(85％)正磷酸(分析纯)加入到400ml K-Ark中以使其pH值降低至2以下，这可以将氨固定在残留物中。重蒸馏是在大约100℃的温度下进行的，并检测了蒸馏物中的氨。据检测，蒸馏物中氨的水平是5-15mg/L。去除氨的结果是，细胞毒性表现消失，而该毒性表现是可以在重蒸前含氨的K-Ark中观察到的。使用氨水平在5到15mg/L之间变化的Kamdhenu-Ark(RCUD)进行以后的实验。本发明是设计的实验的结果，证明Kamdhenu-Ark具有作为保护暴露于DNA损伤化学试剂的细胞免于DNA损伤的保护者性质。
牛尿作为Panchagavya的一个组分被认为可以引起体重减少、消除某些心脏疾病、消化不良、胃痛和水肿。然而，其在防止DNA损伤方面的作用还没有在任何文献和经文中被提到过。所以，申请人认为确定重蒸Kamdhenu-Ark在体外保护暴露于DNA损伤化学试剂的细胞内的DNA损伤的效率是值得的。申请人还用气相色谱-质谱(GC-MS)对重蒸Kamdhenu-Ark进行了分析，并鉴定出可能作为抗氧化剂的成分，其与其他已知的保护DNA损伤的抗氧化剂作用方式相似。
发明涉及牛尿蒸馏物作为细胞DNA损伤化学试剂例如放线菌素、过氧化氢和二氧化锰的防护物的新应用。在重蒸牛尿蒸馏物中鉴定的化合物担当抗
实施例
在下面的步骤中，证明了Kamdhenu Ark对放线菌素D、H2O2和MnO2所引起的DNA损伤的防护作用。在这方面的努力中，申请人测验了放线菌素D、H2O2和MnO2对多形核白细胞的DNA损伤作用以及按上述方法得到的测试组分经过改良的Kamdhenu Ark(重蒸牛尿蒸馏物)所产生的保护作用。这些实验将在下面的实施例中介绍。
不论是预先用重蒸牛尿蒸馏物对多形核白细胞处理，还是在加入DNA损伤化学试剂时再用用重蒸牛尿蒸馏物对多形核白细胞处理，都观察到对DNA损伤的防护作用。
事实上，重蒸牛尿蒸馏物对由于上述DNA损伤试剂所引起的DNA损伤也有统计学上显著的减轻作用。
下面提供的实施例仅仅是本申请的发明的详细描述，而不应理解为对本发明范围的限制。
实施例-I
详细阐述重蒸牛尿蒸馏物介导的对DNA损伤化学试剂放线菌素-D引起的多形核白细胞的DNA损伤的防护作用(表-2)。
表2：放线菌素D所诱导的DNA损伤以及重蒸牛尿蒸馏物(改良的K-Ark)的保护作用各组的百分比
  实验细节   组I   组II   组III   组IV   组V   平均值   SD   P值
  对照(0.1％DMSO) 70 75 69 66   69   70   2.92   -
  KamdhenuArk(改良的)   70   70 68 74 72 71 2.28 NS
  放线菌素D(阳性对照)   40   38   44   28   39   38   5.30   *P＜0.001
  KamdhenuArk(60μl)+放线菌素D(预处理)   43   43   53   57   26   44   10.73   *P＜0.01
KamdhenuArk(60μl)+放线菌素D(同时处理)   73   73   77   85   73   76   4.66   NS
结果是5组实验的平均值。*P值是与阴性对照(0.1％DMSO)比较计算得到的。测试的K-Ark剂量是60μl，NS＝不显著。
已知的DNA损伤化学试剂放线菌素-D所引起的DNA损伤在统计上显著的；P值＜0.001。
如果将体积为30μl的牛尿蒸馏物未经过改良的Kamdhenu Ark与放线菌素D同时加入，与对照组比较尽管观察到统计学显著的DNA损伤，但还是有少许减轻作用的。另一方面，30μl和60μl的重蒸牛尿蒸馏物与放线菌素D同时加入时，对DNA损伤有减轻作用。所观察到的异常可能是由于未改良的Kamdhenu Ark中含有氨。在暴露到放线菌素之前，用60μl的重蒸牛尿蒸馏物预处理多形核白细胞(PMNs)的结果是，没有产生显著的DNA损伤，这表明重蒸牛尿蒸馏物可以保护细胞免受DNA损伤。
在暴露到放线菌素-D之后，再用重蒸牛尿蒸馏物对PMNs进行后处理，也不会引起统计上显著的DNA损伤。
实施例-2
详细阐述重蒸牛尿蒸馏物介导的对DNA损伤化学试剂过氧化氢(H2O2)引起的多形核白细胞的DNA损伤的保护作用(表-3)。
表3：过氧化氢(H2O2)所引起的DNA损伤以及重蒸牛尿蒸馏物的保护作用各组的百分比
实验细节   组I   组II     组III     组IV     组V  平均值     SD P值
  对照(0.1％DMSO)   80   71     70     71     87  76     2.92   -
  kamdhenuArk(未改良)   70   70     68     74     72  71     2.28   NS
  过氧化氢(H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)(阳性对照)   20   29     24     43     38  31     8.56   *P＜0.001
(接上页)
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+KamdhenuArk预处理 43 43 53 57 26 44 10.73 *P＜0.01
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+KamdhenuArk(同时处理) 69 67 85 71 60 70 8.18 *P＞0.05
  H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>+KamdhenuArk后处理   60   61   75   61   62   64   5.64   *P＞0.05
结果是5组实验的平均值。*P值是与阴性对照(0.1％DMSO)比较计算得到的。测试的K-Ark剂量是60μl，NS＝不显著。已知的DNA损伤化学试剂过氧化氢(H2O2)所引起的DNA损伤是统计上显著的；(P值＜0.001)。
用60μl的重蒸牛尿蒸馏物预处理多形核白细胞(PMNs)的结果是，暴露于H2O2的细胞没有发生显著的DNA损伤，并且牛的重蒸产物表现出重蒸牛尿蒸馏物可以保护细胞免受DNA损伤。
在PMNs暴露于过氧化氢10分钟后，同时加入H2O2和重蒸牛尿蒸馏物，如此用重蒸牛尿蒸馏物进行后处理，得到了同样的结果，也没有产生统计上显著的DNA损伤。
实施例-3
详细阐述重蒸牛尿蒸馏物介导的对DNA损伤化学试剂二氧化锰(MnO2)引起的多形核白细胞的DNA损伤的保护作用(表-4)。
表4：二氧化锰(MnO2)所引起的DNA损伤以及重蒸牛尿蒸馏物的保护作用各组的百分比
实验细节   组I   组II   组III   组IV   组V   平均值   SD   P值
对照(0.1％DMSO) 80 71 70 71 87 76 6.68 -
  KamdhenuArk(未改良)   70   70   68   74   72   71   2.28   NS
  20μl二氧化锰(MnO<sub>2</sub>)(阳性对照)   22   30   22   15   16   21   5.36   *P＜0.001
  20μl二氧化锰(MnO<sub>2</sub>)+60μlKamdhenu Ark(改良的)(同时处理)   60   67   60   60   60   61   2.80   NS
结果是5组实验的平均值。*P值是与阴性对照(0.1％DMSO)比较计算得到的。测试的K-Ark剂量是60μl，NS＝不显著。已知的DNA损伤化学试剂二氧化锰所引起的DNA损伤是统计上显著的；(P值＜0.001)。将多形核白细胞(PMNs)同时暴露到MnO2和60μl重蒸牛尿蒸馏物中，未观察到统计上显著的DNA损伤。
实施例-4
详细阐述重蒸牛尿蒸馏物(1μl浓缩物)介导的对DNA损伤化学试剂过氧化氢(H2O2)引起的多形核白细胞的DNA损伤的保护(表-5)
表5：过氧化氢(H2O2)所引起的DNA损伤以及重蒸牛尿蒸馏物(1μl浓缩物)的保护作用各组的百分比
实验细节   组I   组II   组III   组IV   组V   平均值   SD   P值
对照(0.1％DMSO) 70 70 69 66 69 70 2.92 -
1μl Kamdhenu Ark(改良的) 62 59   60 66 62 62 2.68 NS
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(阳性对照)10μl 24 24 24 33 24 26 4.02 *P＜0.001
  H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(10μl)+kamdhenu Ark(改良的)1μl   67   68   66   68   68   67   0.89   NS
结果是5组实验的平均值。*P值是与阴性对照(0.1％DMSO)比较计算得到的。测试的K-Ark剂量是60μl，NS＝不显著。已知的DNA损伤化学试剂过氧化氢(H2O2)所引起的DNA损伤是统计上显著的；(P值＜0.001)。
用1μl重蒸牛尿蒸馏物和H2O2同时处理多形核白细胞(PMNs)的结果是没有观察到统计上显著的DNA损伤，这说明重蒸牛尿蒸馏物在1μl的水平能够保护细胞免受DNA损伤。
实施例-5
详细阐述牛尿蒸馏物(1μl浓缩物)与重蒸牛尿蒸馏物(1μl浓缩物)对DNA损伤化学试剂过氧化氢(H2O2)引起的多形核白细胞的DNA链断裂的保护作用的比较(表-6)。
表6：牛尿蒸馏物(1μl浓缩物)与重蒸牛尿蒸馏物(1μl浓缩物)对过氧化氢(H2O2)所引起的DNA链断裂保护作用的比较各组的百分比
实验细节   组I   组II   组III   组IV   组V   平均值   SD   P值
  对照(0.1％DMSO)   70   75   69   66   69   70   2.92   -
Kamdhenu Ark(改良的)(1μl)   62   66   60   66   62   63   2.68   N.S.
  Kamdhenu Ark(含氨)1μl   46   37   45   34   45   41   5.50   *P＜0.001
  H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(阳性对照)10μl   24   24   24   33   24   26   4.02   *P＜0.001
  H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(10μl)+Kamdhenu Ark(改良的)(1μl)   67   68   66   68   68   67   0.89   N.S.
  H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>(10μl)+Kamdhenu Ark(含氨)   42   32   33   34   33   35   4.08   *P＜0.001
结果是5组实验的平均值。*P值是与阴性对照(0.1％DMSO)比较计算得到的。测试的K-Ark剂量是60μl，NS＝不显著。已知的DNA损伤化学试剂过氧化氢(H2O2)所引起的DNA损伤是统计上显著的；(P值＜0.001)。
用1μl牛尿蒸馏物和H2O2同时处理多形核白细胞(PMNs)表现出统计上显著的DNA损伤。然而，重蒸牛尿蒸馏物可以保护细胞免受DNA损伤。
本发明是寻找具有保护暴露在DNA损伤化学试剂的细胞免于DNA损伤的性质的天然抗氧化剂的结果。
在本发明的一种实施方式中，将重蒸牛尿蒸馏物作为针对DNA损伤化学试剂的阳性试剂进行试验。
在一种实施方式中，发现重蒸牛尿蒸馏物含有抗氧化剂例如1)苯甲酸和己酸。在另一种实施方式中，重蒸牛尿蒸馏物用作放线菌素D所引起的DNA损伤的阳性试剂。
在一种实施方式中，发现重蒸牛尿蒸馏物含有抗氧化剂例如1)苯甲酸和己酸。在另一种实施方式中，重蒸牛尿蒸馏物用作针对H2O2所引起的DNA损伤的保护试剂。
在一种实施方式中，发现重蒸牛尿蒸馏物含有抗氧化剂。在另一种实施方式中，重蒸牛尿蒸馏物用作针对MnO2所引起的DNA损伤的阳性试剂。
在另一种实施方式中，重蒸牛尿蒸馏物作为针对DNA损伤化学试剂的保护试剂的效果是通过在PMN暴露到DNA损伤化学试剂之前的预处理、同时处理以及后处理进行研究的。
在另一种实施方式中，牛尿蒸馏物表现出具有损伤DNA的性质，这可以通过重蒸将牛尿蒸馏物中的氨从1000-1500mg/L去除到5-15mg/L来减轻。
在另一种实施方式中，60μl重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)可以为暴露到放线菌素D的PMN提供保护。
在另一种实施方式中，60μl重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)可以为暴露到MnO2的PMN提供保护。
在另一种实施方式中，60μl重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)可以为暴露到H2O2的PMN提供保护。
在另一种实施方式中，1μl重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)可以为暴露到H2O2的PMN提供保护。
试剂的制备
●溶液A
Figure C0382637500161
●平衡盐溶液(BSS)
Figure C0382637500162
Figure C0382637500171
5mM葡萄糖
●溶液B
Figure C0382637500172
●溶液C
9M-尿素
Figure C0382637500174
10mM-NaOH
Figure C0382637500175
2.5mM-EDTA
Figure C0382637500176
0.1％十二烷基硫酸钠
●溶液D
0.2N-NaOH
●溶液E
1M-葡萄糖
100μl-巯基乙醇
●溶液F
6.7μg/mL溴化乙啶
●1μg/ml放线菌素D的0.1％DMSO(二甲基亚砜)溶液
●H2O2
Figure C0382637500179
150μM
●MnO2
Figure C03826375001710
250ppm或者250mg/L(贮存)
DNA损伤以及RCUD对其保护的分析
将15ml溶液A加入到5ml全血中，充分混合并在2-4℃下保持30分钟。将混合物以800×g离心10分钟。去掉上清，用平衡盐溶液清洗沉淀，以800×g离心10分钟后去掉清洗液。将此步进行两次。用溶液B溶解包含外周多形核白细胞(PMN)的沉淀。
分别用10μl放线菌素D、10μl H2O2和2.5-20mg/Ml(终体积)的MnO2处理1ml含有大约1×106细胞的悬浮于溶液B中的PMN；还有一个试管中加入0.1％DMSO(阴性对照)作为对照。在每个试管中加入BBS溶液以补足2ml。将混合物在5％CO2、95％的湿度的恒温箱中于37℃孵育1小时。孵育后，在每个试管中加入5ml冰冷的0.9％NaCl，800g离心10分钟，去掉上清。在每个试管的沉淀中加入1.5ml溶液B。将试管(对照和三个试验组)充分混合并把混合物平均地分配到三个试管中，0.2ml/试管，标记为B、P和T，接着加入200μl溶液C。充分混匀后，将三个试管B、P和T在冷的条件(0℃)下保持10分钟以裂解细胞。
在试管T中加入400μl溶液E。之后在所有试管B、P和T中均加入200μl溶液D。将试管保持在0℃30分钟。接着，对试管B中的物质进行三次30秒的超声降解处理。进一步，将B、P和T在20℃孵育1个小时。在试管B和P中，加入400μl溶液E并在0℃孵育10分钟。在所有试管中，均加入1.5ml溶液F后在涡流混合器上进行匀浆处理，之后在520nm的激发光和590nm的发射光下进行15分钟的荧光光谱分析。使用下面的公式确定残余双链DNA的百分比.[Krishnamurthi等(2003)和Birnboim、Jevcak(1981)]。
Figure C0382637500181
其中，P、B和T是590nm处的发射荧光。
将含有大约1×106细胞的悬浮在溶液B中的PMN置于四个试管A、B、C和D中。在试管B中加入60μl重蒸牛尿蒸馏物(RCUD)后，37℃孵育10分钟。在试管C中加入DNA损伤化学试剂(放线菌素D或者H2O2或者MnO2)后，在37℃孵育10分钟，之后加入60μl RCUD。在试管A中，只加入60μl RCUD，用BSS补足体积。将混合物在95％的湿度的5％CO2恒温箱中37℃下孵育1个小时。其他步骤按照在C和D中描述的进行。
参考文献：
1.Krishnamurthi，K.，Saravana Devi，S.，Chakrabarti，T.含淤泥提取物的PAH对中国仓鼠卵巢细胞培养的基因毒性作用(Genotoxic effects of PAHcontaining sludge extracts in Chinese hamster ovary cell cultures)Biomedical andEnvironmental Sciences 2003，16(1)，76-89。
2.Birnboim H.C和J.J.Jevcak(1981)用于快速检测低计量辐射对人类白细胞造成的DNA链断裂的荧光方法(Fluorometric Method for Rapid Detectionof DNA strand breaks in Human white blood cells produced by low Doses ofRadiation)Cancer Res.，41：1889-1892.

Claims (21)

1.一种用于防护和/或修复DNA氧化损伤的组合物，所述组合物包含重蒸牛尿蒸馏物RCUD，该RCUD含有苯甲酸和己酸成分，组合物中氨的含量范围是5-15mg/L，并选择性含有抗氧化剂，其中，RCUD是通过使用浓度为82％到88％的正磷酸对牛尿进行重蒸馏而得到的。
2.权利要求1所述的组合物，其中RCUD是无色的。
3.权利要求1所述的组合物，其中RCUD是水溶性的。
4.权利要求1所述的组合物，其中RCUD具有比重大约为1.006。
5.权利要求1所述的组合物，其中RCUD具有pH值在3.0-5.0的范围内。
6.权利要求1所述的组合物，其中RCUD中的氨氮即：NH3N的浓度在5-15mg/L的范围内。
7.权利要求1所述的组合物，其中抗氧化剂从包含挥发性脂肪酸、喹啉和烃衍生物的组中选择。
8.权利要求7所述的组合物，其中RCUD中挥发性脂肪酸的含量在1000-3000mg/L的范围内。
9.权利要求8所述的组合物，其中，该挥发性脂肪酸的衍生物是乙酸-2-丙烯酯，乙酸巯基甲酯，2-丁烯二腈，富马腈，2，2，3-三氯丙酸，3-氯丙酸，3-甲基-2-戊烯酸，异戊酸，3-羟基丁酸乙酯，4-甲基-2-三甲基苯甲酸，(邻-三乙基硅烷氧基)苯基三乙基甲硅烷基乙酸，3-苯基丙酸，肉桂酸，巯基乙酸，1-氢吲哚-3-ol-乙酸酯，乙酸苯酯，3-甲基喹啉。
10.权利要求9所述的组合物，所述挥发性酸是挥发性脂肪酸，其是乙酸、丙酸和丁酸的衍生物。
11.权利要求7所述的组合物，其中喹啉从包含3-甲硫基喹啉和3-甲基喹啉的组中选择。
12.权利要求1所述的组合物，其中组合物闻起来像尿。
13.权利要求1所述的组合物，其中组合物用作药物组合物。
14.权利要求1所述的组合物，其中组合物用于分析遗传材料。
15.一种使用权利要求1的组合物体外防护和/或修复DNA氧化损伤的方法，所述方法包括以下步骤：
a.确定体外样品中折叠的DNA的量，
b.在DNA暴露在氧化损伤DNA的试剂之前或者之后，将所述组合物混合到所述DNA中，以及
c.确定混合物中折叠的DNA的百分比，其表示的是对DNA氧化损伤的防护和/或修复。
16.权利要求15所述的方法，其中DNA被从包含放线菌素D、二氧化锰MnO2和过氧化氢H2O2的组中选择的化合物所损伤。
17.权利要求15所述的方法，其中所述组合物大约增强150-250倍的抗基因毒性效果。
18.权利要求1所述的组合物，其中使用正磷酸处理将蒸馏物的pH值降低至2以下。
19.权利要求1所述的组合物，其中重蒸馏是在大约100℃的温度下进行。
20.权利要求1所述的组合物，其中重蒸馏有助于去除牛尿的毒性。
21.权利要求20所述的组合物，其中所述重蒸馏使蒸馏物中氨的浓度从1000-1500mg/L降低到5-15mg/L。
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从牛尿中制取苯甲酸和马尿酸. 周冠军，龙光荣，何永言，陈永珏.化学通报，第1期. 1959
从牛尿中制取苯甲酸和马尿酸. 周冠军，龙光荣，何永言，陈永珏.化学通报，第1期. 1959 *

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