DE3110559C2

DE3110559C2 - Vollsynthetisches Zellkulturmedium

Info

Publication number: DE3110559C2
Application number: DE3110559A
Authority: DE
Inventors: Joseph H. Dipl.-Chem. Dr. 6350 Bad Nauheim Wissler
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1981-03-18
Filing date: 1981-03-18
Publication date: 1985-05-09
Also published as: EP0060565A3; ATE20540T1; JPS57170186A; DE3110559A1; EP0060565A2; EP0060565B1; DE3271820D1

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein vollsynthetisches Zellkulturmedium, das zusätzlich zu den üblichen Bestandteilen von Kulturmedien mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren und/oder mindestens ein Flavanoid und/oder mindestens ein Ubichinon und/oder Vitamin U und/oder Mevalolacton enthält. Das Zellkulturmedium der Erfindung enthält vorzugsweise kein Serum, jedoch mindestens ein definiertes Protein, insbesondere hochreines, molekulareinheitliches Serumalbumin. Das Zellkulturmedium eignet sich insbesondere zur Verwendung zur Kultur von eukariontischen Zellen, wie Leukozyten, Fibroplasten, Endothel- und Herzmuskelzellen.

Description

medium der Erfindung zusätzlich mindestens ein definiertes Protein, das in einer besonders bevorzugten Ausführungsform hochreines, molekular einheitliches Serumalbumin ist

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann das vollsynthetische Zellkulturmedium der Erfindung noch weitere, für die Kultur von eukaryontischen Zellen, wie Leukozyten, günstige Verbindungen aus den Stoffklassen der Polyhydroxyverbindungen und Zucker, Aminosäuren und Peptide, Nucleoside und Nucleosidbasen, anionischen Verbindungen und/oder Vitamine enthalten, deren Verwendung in den bekannten Kulturmedien nicht üblich ist

Vorzugsweise ist das Zellkulturmedium der Erfindung frei von Tensiden, Schwermetallsalzen und Farbstoffen, die die Zellen schädigen und die Gewinnung der gewünschten Zellprodukte aus der Kulturlösung stören können.

Das Zellkulturmedium der Erfindung eignet sich in hervorragender Wei^e zur Kultur von eukaryontischen Zellen, wie Knochen-narkszellen, Endothelzeilen, Herzmuskelzellen und insbesondere von Leukozyten, während deren Kultur zelluläre Sekrete erzeugt werden. Diese hervorragende Eignung des Kulturmediums der Erfindung ist auf seine stoffliche Zusammensetzung zurückzuführen, die eine Reihe von besonders wertvollen Stoffen für die Erhaltung des Lebens der Zellen und ihr Wachstum einschließt Die Art dieser zusätzlichen Verbindungen wird nachstehend im einzelnen erläutert. Ihre besondere Eignung in Zellkulturmedien wurde bisher nicht beschrieben. D?.s Zellkulturmedium der Erfindung schädigt also die zu kultivierenden Zellen nicht, sondern fördert im Gegenteil ihr Wachstum in Hervorragender Weise und ermöglicht somit auch die Gewinnung von zellulären Sekretprodukten, wie Medial ..ren, in besonders günstiger Weise.

Außer zur Zellkultur mit dem Ziel der Gewinnung zellulärer Sekrete eignet sich das Zellkulturmedium der Erfindung auch für Kulturen, deren Ziel die biologische Untersuchung der Zellen und ihrer Funktionen ist. Beispiele für solche Kulturen sind die Anlegung von ZeIlstammünien, die Untersuchung der Motilität von Zellen, Zellklonierung und Zelltypisierung. Das Zellkulturmedium eigent sich sowohl für Suspensions- und Schichtkulturen als auch für Diffusionskulturen an Membranen.

Ein zweiter wesentlicher Vorteil des vollsynthetischen Zellkulturmediums der Erfindung besteht darin, daß die während der Kultur entstandenen Proteine und andere gewünschte Produkte verhältnismäßig leicht aus der Kulturlösung gewonnen werden können, da diese kein die Gewinnung erschwerendes Proteingemisch (Serum) enthält, sondern nur wenige definierte, vorzugsweise ein einziges, bestimmtes Protein.

Nachstehend werden die Bestandteile des erfindungsgemäßen Kulturmediums im einzelnen erläutert, wobei zunächst die üblicherweise in solchen Medien verwendeten Stoffgruppen aufgeführt werden.

Eine erste wesentliche Stoffgruppe in Kulturmedien sind Salze. Unter diese Gruppe fallen als notwendige Bestandteile Alkali- und Erdalkalimetallionen, wie Na-, K-, Mg- und Ca-Ionen als Kationen, sowie Chlorid·, Phosphat-, Sulfat-, Carbonat- und Acetationen als Anionen. Die Verwendung von Salzen mit den vorstehend genannten Ionen ist in den Zellkulturmedien für die Erhaltung der Lebensfunktionen der Zellen erforderlich.

Eine zweite wichtige Stoffgruppe in Kulturmedien sind Zucker und Zuckerderivate. Zu dieser Gruppe gehören als notwendige und übliche Bestandteile beispielsweise Glucose, Ribose, 2-Desoxy-D-ribose und myo-Inosit

Aminosäuren und ihre Derivate sind eine dritte wesentliche Stoffgruppe in Zellkulturmedien. Oblicherweise werden Gemische aus den natürlich vorkommenden Aminosäuren verwendet, wobei einzelne Aminosäuren, wie Carnitin und L-Ornithin, in den bekannten Kulturmedien fehlen. Bekannt ist ferner auch die Verwendung bestimmter Peptide, wie Glutathion.

ίο Eine weitere Gruppe von Stoffen, die in den herkömmlichen Kulturmedien enthalten sind, sind Nucleotide, Nucleoside und ihre Derivate, beispielsweise Adenin, Adenosin, Guanin, Thymidin, Uracil und Hypoxanthia

Schließlich sind in den üblichen Zellkulturmedien auch verschiedene Vitamine, Vitaminoide und Coenzyme enthalten, wie Ascorbinsäure, Biotin, Pantothenat, Ergocalciferol, Riboflavin, Vitamin A, Vitamin Bi₂, Pyridoxal und Nicotinamid. Als zusätzliches Steroid ist ferner die Verwendung von Cholesterin in Kulturmedien bekannt-

Nach Bedarf werden den bekannten Kulturmedien auch Antibiotika, wie Penicillin oder Streptomycin, zugesetzt Üblicherweise enthalten diese Kulturmedien außerdem Tenside, Schwermetallionen und Farbstoffe.

Die vorstehend genannten Stoffe werden in zahlreiche Kombinationen als iCulturmedien zur Zellkultur verwendet Üblicherweise wird den aus den genannten Stoffen erhaltenen wäßrigen Lösungen Serum zugesetzt, wenn eine langer dauernde Zellkultur notwendig oder gewünscht ist.

Das Kulturmedium der Erfindung zeichnet sich durch folgende Unterschiede gegenüber den bekannten Kulturmedien aus:

1. Das Medium der Erfindung enthält zusätzlich zu den vorstehend bezeichneten üblichen Stoffgemischen wenigstens eine der folgenden Komponenten:

mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren,
mindestens ein Flavanoid,
mindestens ein Ubichinon,
Vitamin U,
Mevalolacton.

Die ungesättigten Fettsäuren sind als Vitamin F bekannt Sie erweisen sich als wertvolle Synthesebausteine für die zu kultivierenden Zellen, insbesondere im Fall von Leukozytenkultureri. Als ungesättigte Fettsäuren kommen vorzugsweise ölsäure, Linolsäure und Linolensäure und ihre Derivate in Frage. Das Zellkulturmedium der Erfindung enthält mindestens zwei dieser Säuren, um das Nahrungsangebot für die Zellen auf einer breiten Basis zu halten. Die ungesättigten Fettsäuren sind im Zellkulturmedium der Erfindung in einer Menge von 0,1 bis 20 μίτιοΙ/Ι enthalten.

Flavanoide (Bioflavanoide) sind als Flavonderivate und als Vitamin P bekannt. Auch diese Stoffgruppe erweist sich wegen seiner günstigen Wirkungen auf ZeIlmembranen als wertvoller Bestandteil für die zu kultivierenden Zellen, insbesondere Leukozyten und Endothelzeilen. Bevorzugt für die Verwendung im Zellkulturmedium der Erfindung sind Flavanoide, wie Morin, insbesondere solche mit einem L-Rutinose- oder einem L-Rhamose-Rest, wie Rutin, Hesperidin und Querc'trin. Besonders wirksam ist Rutin, das auch wegen seines verhältnismäßig niedrigen Preises bevorzugt ist. Die Flavanoide sind im Zellkulturmedium der Erfindung in

einer Menge von 0,1 bis 50 μΐηοΐ/ΐ, vorzugsweise von 1 bis 20 μπιοΐ/i enthalten.

Ubichinone sind Coenzyme, die als Elektronenüberträger bei biologischen Oxidationsprozessen beteiligt sind und bei der oxidativen Phosphorylierung eine Rolle spielen. Auch diese Stoffgruppe stellt deshalb einen wertvollen Bestandteil des Zellkulturmediums der Erfindung dar. Beispiele für geeignete Ubichinone sind Ubichinon Q30 und Ubichinon Q₅₀ (Coenzym Qio). Die

winnung zellulärer Mediatoren wäre die mögliche gleichzeitige Entstehung humoraler Mediatoren für die Identifizierung der gewünschten Produkte sehr ungünstig. Es würde erhebliche Schwierigkeiten bereiten, bei der Isolierung festzustellen, ob'ein bestimmter Mediator humoraler oder zellulärer Herkunft ist und ob er aus der Spezies der Zellen oder derjenigen des Serums stammt Außerdem ist es nicht sinnvoll, Zellen in aufwendigen Arbeitsvorgängen zunächst von Serum und anderen

Ubichinone sind im Medium der Erfindung in einer 10 Körperflüssigkeiten abzutrennen, um sie dann wieder Menge von 0,01 bis 20 μιτιοΐ/ΐ enthalten, wobei die mit (Fremd-)Seren zu versetzen. Ferner können ungün-Obergrenze nur durch den hohen Preis dieser Verbindungen und ihre Löslichkeit bestimmt wird. Bevorzugt
ist ein Bereich von 0,05 bis 2,0 μΐηοΐ/ΐ.

Vitamin U (DL-Methylmethioninsulfoniumchlorid) ist ebenfalls ein wertvoller Bestandteil des Zellkulturmediums, der für das Gedeihen der Zellen günstig ist. Das Vitamin. U wird in einer Menge von 0,1 bis 20 μιηοΐ/ΐ eingesetzt

Mevalolacton p.S-Dihydroxy-a-methyl-tf-valerolac- 20 Erfindung ist deshalb normalerweise proteinfrei und ton) ist ein wichtiger biochemischer Baustein für die eignet sich aus diesem Grund auch ':■.■; Untersuchungen Biosynthese der Isoprenoide und deshalb für das Zellwachstum von großem Vorteil. Es wird in einer Menge
von 0,5 bis 30μηιο1/Ι, insbesondere von 1 bis 15 μπιο!/!
eingesetzt

Jede der vorstehend als Kennzeichen des Mediums
der Erfindung genannten Komponenten (ungesättigte
Fettsäuren, Flavanoid, Ubichinon, Vitamin U, Mevalolacton) ergibt bereits bei alleinigem Zusatz zu einem _ _ ₌

Zellkulturmedium üblicher Zusammensetzung eine be- 30 freier Form toxisch wären. Aus den genannten Gründen trächtliche Verbesserung der Wachstums- und Lebens- wird im Medium der Erfindung bevorzugt auch mindebedingungen der Zellen. Diese kommen beispielsweise stens ein Protein verwendet, jedoch, um die mit der durch die Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen Verwendung von Proteingemischen Undefinierter Zunach Beendigung der Kultur zum Ausdruck. Demnach sammensetzung (Serum) verbundenen Nachteile zu verwird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe be- 35 meiden, nur ein Protein oder ein Gemisch aus vorzugsreits durch ein Zellkulturmedium gelöst, das nur eine der weise wenigen definierten Proteinen. Besonders bevorvorstehend bezeichneten Komponenten zusätzlich zu zugt enthält das Zellkulturmedium der Erfindung nur den üblichen Bestandteilen eines Kulturmediums ent- ein definiertes Protein.

^näit· Spezielle Beispiele für Proteine sind Serumaibumin,

3evorzugte Ausführungsformen des Zellkulturme- 40 Fibrinogen, Ovalbumin und ähnliche Proteine, die nicht diums der Erfindung enthalten mindestens zwei der ge- oder nur in definierter Weise zur Mediatorbildung befähigt sind. Das bevorzugte Protein im Zellkulturmedium der Erfindung ist Serumalbumin, da es als Träger für hydrophobe Stoffe und als Wirkstoff auf Zslloberflä-45 chen besonders gut geeignet ist. Um d^;e vorteilhaften Wirkungen des Proteinzusatzes zu erhalten, muß das Protein (Serumaibumin) mindestens in einer Menge von 0,5 μπιοΙ/1 in der Kulturlösung enthalten sein.

Das Zellkulturmedium der Erfindung kann auch mehrere Proteine enthalten, solange diese definiert sind und nicht oder nur in definierter Weise zur Mediatorbildung befähigt sind.

stige Immunreaktionen in heterologen Systemen das Gedeihen der Zellen und die Beurteilung der Sekretionsreaktionen stören.

Der Serumzusatz dient normalerweise als Proteinquelle im Zellkulturmedium und zur Verbesserung des Oberflächenverhaltens (Chemokinesis) der Zellen. Verhältnismäßig kurze Zeit können die Zellen auch ohne Proteine am Leben erhalten werden. Das Medium der

über die Chemokinesis und Chemotaxis der Zellen, bei denen Proteine stören können. Für die länger dauernde Kultur von Zellen, insbesondere Leukozyten, ist jedoch ein Zusatz eines Proteins zu dem Zellkulturmedium aus mehrer -n Gründen bevorzugt.

Ohne Protein im ZeHkulturmedium sind die Zellen nicht motil (keine Chemokinesis). Ferner wird ein Protein als Träger für hydrophobe Moleküle benötigt, die in

nannten Komponenten in beliebiger Auswahl, wobei wiederum die Zweierkombinationen bevorzugt sind, bei denen eine Komponente mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren sind.

Durch die Kombination mehrerer dieser Komponenten wird eine noch größere Verbesserung der Kulturbedingungen erreicht. Spezielle Beispiele für besonder? günstige Kombinationen der zusätzlichen Komponenten des Mediums sind:

a) zwei oder drei ungesättigte Fettsäuren und ein Flavanoid;

b) die Kombination nach a) + ein Ubichinon,

c) die Kombination nach a) + Vitamin U;

d) zwei oder drei ungesättigte Fettsäuren, Vitamin U und Mevalolacton;

e) ein Flavanoid, ein Ubichinon und Mevalolacton;

f) alle möglichen Kombinationen mit vier der Komponenten;

g) die Kombination aller Komponenten.

3. Leben den vorstehend unier a) bis c) genannten Merkmalen kann sich das Medium der Erfindung noch durch weitere, wanlweise vorhandene Komponenten

auszeichnen, die in herkömmlichen Medien nicht üblich sind. Hierzu gehören:

60 —

2. Obwohl Serum ein das Leben der Zellen förderndes komplexes Substanzgemisch ist, das aus diesem Grund in herkömmlichen Zellkulturmedien weit verbreitet ist, ist seine Verwendung im Medium der Erfindung nicht bevorzugt. Die Gründe dafür sind: Bei der Verwendung des Mediums zur Kultur von Leukozyten und der Ge-

anionische Stoffe, nämlich Citronen-, Bernstein- und/oder Brenztraubensäure. Diese Verbindungen sind weitere wertvolle Nahrungsstoffe für uas Gedeihen der Zellen, insbesondere bei Leukozytenkulturen. Sie können in einer Menge von 0,1 bis 5, vorzugsweise 0,? bis 1 μΐηοΙ/l enthalten sein. Polyhydroxyverbindungen, Zucker und Zuckerderivate, nämlich Xylitol, D-Xylose, D-Galactose, Glycerin und/oder Glucurono-^Lacton. Auch die-

se Verbindungen sind wertvolle Nahrungsmittel: sie können einzeln oder im Gemisch in einer Menge von 0,1 bis 5, vorzugsweise 0.2 bis 2 μπιοΙ/Ι im Zellkulturmedium der Erfindung enthalten sein.

— Aminosäuren und Derivate, nämlich L-Ornithin. Sarcosin und Taurin. Auch diese in Zellkulturmedien ungewöhnlichen Aminosäuren erweisen sich als sehr wertvolle Nahrungsbestandteile bei der Kultur von Leukozyten. Diese Verbindungen können im Medium der Erfindung einzeln oder im Gemisch in einer Menge von 0,05 bis 2, vorzugsweise 0.1 bis 1 μπιοΙ/Ι enthalten sein.

— Carnitin und Carnosin. Carnitin (3-Hydroxy-4-[trimethylammonio]-buttersäure-beta:n) dient im Fettsäurestoffwechsel als Übertrager von Acylgruppen und hat Vitamincharakter. Carnosin (N-p¹-Alanyl-L-histidin) hat eine noch weitgehend unbekannte Funktion, ist aber in Geweben weit verbreitet. Beide Stoffe sind wertvolle Aufbaustoffe für das Wachstum der Zellen. Carnitin kann im Medium in einer Menge von 1 bis 200, insbesondere von 10 bis 100 μίτιοΙ/Ι. Carnosin in einer Menge von 0.1 bis 20. insbesondere von 1 bis 10μπιοΙ/1 enthalten sein.

— Nucleoside und Nucieosidbasen. nämlich Cytidin, Guanosin, 5-Methylcytosin und/oder Uridin. Auch diese Verbindungen sind in herkömmlichen Zellkulturmedien unüblich, jedoch als Bausteine der Nahrung für Zellteilungen wertvoll. Diese Stoffe können in einer N! ^%nge von 0,01 bis 1, vorzugsweise 0,02 bis 03 μπιοΙ/Ι einzeln oder im Gemisch im Kulturmedium der Erfindung enthalten sein. Nucleotide werden dem Medium der Erfindung im Gegensatz zu bekannten Medien vorzugsweise nicht zugesetzt, da sie als solche nicht in die Zellen aufgenommen werden.

> .tU.,.1..^, ,.u.,,,,^,1 TIlU,,..,, ,>., _li-lT.HllJP,-_.-_Kl₁j_riJ,-1,4-naphthochinon). Vitamin Ki enthält den wichtigen Phytolrest. Der Zusatz dieses Vitamins bewirkt ein besonders günstiges Wachstum der Zellen, insbesondere bei Leukozytenkulturen. Es kann in einer Menge von 0,1 bis 2, vorzugsweise 0.2 bis 1 μπιοΙ/Ι im Zellkuiturmedium der Erfindung eingesetzt werden.

45

4. Es enthält vorzugsweise kein Tensid, kein Schwermetallsalz und keinen Farbstoff.

Tenside, die in den bekannten Zellkulturmedien vermutlich dazu dienen sollen, hydrophobe Stoffe in Lösungen zu halten, sind im Medium der Erfindung störend, da sie sich ungünstig airt das Reinigungsverhalten und die Struktur der von den Zellen sekretierten Proteine, wie Mediatoren, auswirken können. Schwermetallionen werden im Zellkuiturmedium der Erfindung vermieden, da sie die Aktivität der sekretierten Proteine durch Verbindung mit den Suifhydrylgruppen schädigen und das Redoxpotential des Kulturmediums stören können. Außerdem fördern sie die Zersetzung einiger Vitamine, wie Vitamin C. Farbstoffe sind störend, da sie sich mit Spurenproteinen aufgrund hydrophober Wechselwirkungen irreversibel verbinden können.

Die Bestandteile des Zeilkulturmediums der Erfindung sind in ihren Mengenverhältnissen in der wäßrigen Lösung so aufeinander abgestimmt, daß die Konzentrationen der Komponenten im Medium weitgehend den natürlichen Konzentrationsbereichen des Plasmas angepaßt sind; vgL Geigy AG (Herausgeber) (1969) in Documenta Geigy, Wissenschaftliche Tabellen, 7. Auflage, Geigy S.A., Basel. Das Prinzip der Anpassung an die natürlichen Konzentrationsbereiche des Plasmas wird vorzugsweise nur dann verlassen, wenn es wirtschaftlich nicht sinnvoll ist. Beispielsweise wird das teuere Serumalbumin vorzugsweise nur in solcher Menge zugesetzt, daß die Chcmokincsis der Zellen nicht beeinträchtigt ist.

Zur Kultur der Zellen können dem Medium der Erfindung nach Bedarf weitere Zusätze einverleibt werden, die dem beabsichtigten Zweck dienen. Beispielsweise können zur Auslösung physiologischer Funktionen Mitogene, Chemokinesine oder Chemotaxine zugesetzt werden.

Außerdem können neben den üblichen Phosphat- und Carbonat-Puffersystemen auch andere Puffer, beispielsweise organische Puffersysteme wie HEPES = N-(2-HydroxyäthyI)-piperazin-N'-2-äthansulfonsäure, üblicherweise in einer Konzentration von 0.01 mol/l eingesetzt werden.

In der nachstehenden Tabelle I sind die Bestandteile eines herkömmlichen Zellkulturmediums zusammengestellt. Das Medium von Tabelle I entspricht bezüglich der Komponenten im wesentlichen dem bekannten Medium 199, wobei nur die Tenside, Schwermetallsalze, Farbstoffe und Nucleotide fehlen, die im Zellkuiturmedium der Erfindung vorzugsweise weggelassen werden. Die Medium-Zusammensetzung gemäß Tabelle I dient als Grundgemisch für die in den nachstehenden Beispielen erläuterten Medien der Erfindung. Dies bedeutet, daß in den Beispielen jeweils nur die zusätzlich eingesetzten Komponenten tabellarisch oaer im Text angegeben werden. Die Konzentrationen der Bestandteile des Grundgemisches gemäß Tabelle I entsprechen nicht denjenigen des Mediums 199, sondern sind im Sinn der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung an die natürlichen Plasmakonzentrationen angepaßt.

-7 υ-, »„π λ Li.j: ...: 1 \i/ :. λ

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ASTM-1-Qualität verwendet; vgl. ASTM D-1193-70 Standard-Specifikation for Reagent Water 1970; Annual Book of ASTM-Standards, Easton Maryland. ASTM 1970. Es ist darüber hinaus von möglichen Endotoxin-Kontaminationen durch Ultrafiltration an tensidfreien Membranen mit der Ausschlußgrenze von 10 000 DaI-tons befreit. Das fertige Medium wird filtersterilisiert an tensidfreien Membranen mit <0,2 μπι Porengröße.

Tabelle	I	Komponente	mol/l
Nr.	KCI	5,0 m
1	KH₂PO₄	0,2 m
2	NaCl	120,0 m
3	Na₂HPO₄	0,8 m
4	Na₂SO₄	0,2 m
5	L-Ascorbinsäure	0,2 m
6	Cholinchlorid	50,0 μ
7	2-Desoxy-D-ribose	5,0 μ
8	D-Glucose	5,0 m
9	myo-Inosit	0,5 m
10	Na-Acetat	0,2 m
11	D-Ribose	20,0 μ
12	CaCl₂	2,0 m
13	MgCl₂	1,0 m
14	NaHCO₃	!0,0
15	Penicillin	1,0 μ
16	Streptomycin	1,0 μ
17	L-Glutamin	1,0 m
18

Tabelle I (Fortsetzung)

Komponente

19	L-Alanin
20	L-Asparagin
21	L-Asparaginsäure
22	L-Glutaminsäure
23	Glycin
24	L-Prolin
25	L-Serin
26	L-Arginin
27	4-Aminobenzoesäure
28	L-Cystein
29	L-Histidin
30	L-Hydroxyprolin
31	L-Isoleucin
32	L-Leucin
33	L-Lysin-HCi
34	L-Methionin
35	L-Phenylalanin
36	L-Threonin
37	L-Tryptophan
38	L-Tyrosin
39	L-Valin
40	Glutathion reduziert
41	Adenin
42	Adenosin
43	Guanin
44	Hypoxanthin
4ί»	Thymidin
46	Thymin
47	Uracil
48	Xanthin
49	D-Biotin
50	Da-C-pantothenat
Ci	Ergocalciferol
52	Folsäure
53	D,L-i*-Liponsäure
54	Menadion
55	Nicotinsäureamid
56	Pyridoxal-HCI
57	Pyridoxin-HCl
58	Riboflavin
59	Thiamin-HCl
60	D,L-«-Tocopherylacetat
61	Vitamin-A-acetat
62	Vitamin Bi2
63	Cholesterin
64	Äthanol
65	ph 7,10

ίο

inol/l

0,2 m 0,1 m 0,1 m 0,1 m 0,2 m 0,1 m 0,1 m 0,1 m 2.0 μ 0.2 m 0,1 m

10,0 μ 0.2 m 0,2 m 0,2 πι 0,1 m 0,1 m 0,2 m

50,0 μ 0,1 m 0,2 m 3,0 μ

50,0 μ

50,0 μ 5,0 μ 5,0 μ

20,0 μ 5,0 μ 5,0 μ 5,0 μ 1,0 μ 5,0 μ 0,5 μ 5,0 μ 2,0 μ 0,2 μ

20,0 μ 5,0 μ 2,0 μ 1,0 μ 5,0 μ 1,0 μ 1,0 μ 0,5 μ 1,0 μ 1,0 m

Die Beispiele erläutern die Erfindung, wobei die Bei-. spiele 1 und 2 auf die Verwendbarkeit eines proteinfreien Mediums der Erfindung und die übrigen Beispiele auf die Kultur von Zellen in dem Medium der Erfindung, das ein definiertes Protein enthält, gerichtet sind.

Beispiel 1

Es wird ein Zellkulturmedium hergestellt, das neben dem Grundgemisch gemäß Tabelle I folgende Bestandteile gemäß Tabelle II enthält

Tabelle Il

Komponente

Menge, |imol/l

Linolsäure

Linolensäure

ölsäure

Rutin

Vitamin U

D-Galactose

Bernsteinsäure

D-Xylose

L-Ornithin

Sarcosin

Guanosin

D,L-Carnitin

1.0 5.0 5,0 5,0 1.0

500,0 100,0 20,0 50,0 50,0 20,0 50.0

In dem Medium, das die in Tabelle Il genannten Besiaiiuieiie zusätzlich zu dem Grundgcmisch enthält, werden etwa 10⁶ Lymphozyten/ml aus Hundemilz kultiviert. Die Kultur wird unter üblichen sterilen Bedingungen (37°C. 3% CO₂) als Schichtkultur durchgeführt. Zur Stimulierung der Zellteilung wird der Kultur 50 nmol/l Lektin aus Canavalia ensiformis (Concanavalin A) zugesetzt. Nach 48 Stunden werden die Zellen gezählt und einer Chromosomenanalyse unterworfen. Die Zahl der lebenden Zellen ist größer 90%. Beim Hauptteil der Zellen ist Mitose angeregt worden.

Beispiel 2

30 Es wird ein Zellkulturmedium hergestellt, das neben dem Grundgemisch gemäß Tabelle 1 folgende Bestandteile gemäß Tabelle III enthält.

Tabelle III	Menge, μπιοΐ/ΐ
Komponente	1,5
Linolsäure	4,0
Linolensäure	5,0
ölsäure	0,1
Coenzym Q10	5.0
Mevalolacton	50,0
Glycerin	10,0
Xylitol	5,0
5-Methylcytosin	5,0
Carnosin

40

45 Mit dem Medium gemäß Grundgemisch und Tabelle III werden bei der Kultur von Lymphozyten unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen vergleichbare Ergebnisse hinsichtlich Lebensfähigkeit und Mitose erzielt

Beispiel 3

Es wird ein Zellkulturmedium hergestellt, das neben dem Grundgemisch gemäß Tabelle I folgende Bestandteile gemäß Tabelle IV enthält

Tabelle IV

60 Komponente

Menge, μπιοΐ/l

Mevalolacton
D-Glucurono-y-Iacton
Taurin

D,L-Carnitin

Vitamin Ki Menschliches Serumablumin

5,0 100,0

0,1 50,0

02 30,0

v_;: li 12

■ι Indem Medium wird eine Fibroplasten-Monoschicht- Die Herstellung und Kultur der Leukozyten erfolgt

kultur durchgeführt. Die Bedingungen entsprechen den unter sterilen Bedingungen. Die Kultur wird 40 Stunden

;^f" in Beispiel 1 genannten. Nach Beendigung der Kultur lang durchgeführt, um eine befriedigende Mediatoraus-

fi zeigen die Zellen eine Lebensfähigkeit > 92%. beute zu erhalten. Die Temperatur der Kultur beträgt

Fi 5 etwa37°C, die Zellkonzentration etwa 5 χ 10'Zellen/ml

;jj Beispiel 4 und der CCVPartialdruck über der Kultur etwa 1,5%.

\i\ Nach Beendigung der Kultur werden die Leukozyten

fl Beispiel 3 wird mit der Änderung wiederholt, daß aus der Kulturlösung abzentrifugiert. Ihre Lebensfähig-

anstelle von Mevalolacton die gleiche Menge Morin keit ist größer als 98%. Sie können erneut kultivert,

gj eingesetzt wird. Die Lebensfähigkeit der Zellen nach io kryopreserviert oder einer anderen Verwendung zuge-

j| der Kultur ist > 90%. führt werden.

Beispiel 5 Beispiele

Beispiel 3 wird mit der Änderung wiederholt, daß 15 In dem Zellkulturmedium gemäß Beispiel 7 werden anstelle von Mevalolacton Vitamin U in einer Menge unter im übrigen gleichen Bedingungen Schweineaortavon 2 μίτιοΙ/Ι eingesetzt wird. Die Lebensfähigkeit der Endothelzellen als Monoschicht-Sekundärkultur kulti-Zellen nach der Kultur ist > 90%. viert. Durch den Zusatz von Angiotropinen aus Leuko

zyten werden zahlreiche Mitosen stimuliert. B e i s ρ i e I 6 20

Beispiel 3 wird mit der Änderung wiederholt, daß
zusätzlich Linolsäure, Linolensäure, Quercitrin und Coenzym Q10 in Mengen von 2,0, 5,0, 3,0 und 0,2 μπιοΙ/Ι
eingesetzt werden. Die Lebensfähigkeit der Zellen nach 25
Beendigung der Kultur ist >95%.

Beispiel 7

Für eine Kultur von Leukozyten zur Herstellung und 30
Gewinnung von zellulären Mediatoren aus den Leukozyten wird ein besonders reiches Zellkulturmedium verwendet, das neben dem Grundgemisch die folgenden in
Tabelle V angegebenen Bestandteile enthält.

35
Tabelle V

Nr.	Komponente	mol/l
1	D-Galactose	0,5 m
2	D-Glucurono-^-Ia<"on	0,1 m
3	Glycerin	50,0 μ
4	Na-Citrat	50,0 μ
5	Na-Pyruvat	0,1 m
6	Bernsteinsäure	0,1 m
7	Xylit	10,0 μ
8	D-Xylose	20,0 μ
9	Menschliches Serumalbumin	7,7 μ
10	L-Ornithin	50,0 μ
11	Sarcosin	50,0 μ
12	Taurin	0,1 m
13	Cytidin	50,0 μ
14	Guanosin	20,0 μ
15	5-Methylcytosin	5,0 μ
16	Uridin	20,0 μ
17	Rutin	5,0 μ
18	Coenzym-Qio (Ubichinon 50)	0,1 μ
19	Linolsäure	1,0 μ
20	Linolensäure	5,0 μ
21	ölsäure	5,0 μ
22	Carnosin	5,0 μ
23	Mevalolacton	5,0 μ
24	D.L-Carnitin	50,0 μ
25	Vitamin Ki	0,2 μ
26	Vitamin U	1.0 μ
27	Concanavalin A	50.0 η

Claims

Patentansprüche:

1. Vollsynthetisches Zellkulturmedium, enthaltend Salze, Zucker, Aminosäuren, Nucleoside und Nucleosidbasen. Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme, Steroide und weitere übliche Zusätze in wäßriger Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren in einer Menge von 0,1 bis 20 μπιοΐ/ΐ und/oder mindestens ein Flavanoid in einer Menge von 0,1 bis 50 μΐηοΐ/ΐ und/oder mindestens ein Ubichinon in einer Menge von 0,01 bis 20 umol/l und/oder Vitamin U in einer Menge von 0,1 bis 20 μΐηοΐ/ΐ und/oder Mevalolacton in einer Menge von 0,5 bis 30 μπιοΐ/ΐ enthält.

2. Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein definiertes Protein enthält

3. Medium nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es hochreines, molekular einheitliches Serumalbumin enthält

4. Medium nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als ungesättigte Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure enthält

5. Medium nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Flavanoid Rutin enthält

6. Medium nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Ubichinon Coenzym Qm enthält

7. Medium nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens einen der Cioffe Xylitol, D-Xylose, D-Galactose, Glycerin und Glucurono-^-Lacton in einer Menge von 0,1 bis 5 μπιοΐ/ΐ enthält.

8. Medium nach Anspruch I bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens einen der Stoffe L-Ornithin,Sarcosin undTaurin in einer Menge von 0,05 bis 2 μιηοΙ/Ι enthält.

9. Medium nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens einen der Stoffe Carnitin in einer Menge von 1 bis 200 μπιοϊ/Ί und Carnosin in einer Menge von 0,1 bis 20 μιτιοΙ/1 enthält.

10. Medium nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens einen der Stoffe Cytidin, Guanosin, 5-Methylcytosin und Uridin in einer Menge von 0,01 bis 1 μΐηοΐ/l enthält.

11. Medium nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens einen der Stoffe Citronensäure, Bernsteinsäure und Brenztraubensäure in einer Menge von 0,1 bis 5 μΐηοΙ/1 enthält.

12. Medium nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Vitamin Ki in einer Menge von 0,1 bis 2 μπιοΙ enthält.

13. Medium nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es frei ist von Tensiden. Schwermetallsalzen und Farbstoffen.

!4. Verwendung des Zellkulturmediums gemäß Anspruch 1 bis 13 zur Kultur von eukaryontischen Zellen.

15. Ausführungsform nach Anspruch 14 zur Kultur von Leukozyten von Säugern.

Für die Kultur von Zellen verschiedener Art, wie Knochenmarks-, Endothel- und Kerzmuskelzellen oder Leukozyten, sind verschiedene Kulturmedien bekannt Diese Medien sind in der Regel wäßrige Lösungen, die eine Vielzahl von verschiedenen Verbindungen enthalten. Hauptbestandteile der Kulturmedien sind Salze, Zucker und Metaboliten, Aminosäuren, Nucleotide und Nucleoside, Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme, Steroide und weitere Zusätze, wie Tenside, Schwermetallsalze

ίο und Farbstoffe. Spezielle Beispiele für übliche Kulturmedien sind unter den Bezeichnungen »HAM«, »Medium 199« und »NCTC« bekannt; vgl. H. J. Morton, in vitro 6 (1970), S. 89 bis 108.

Zur Kultur von Zellen, wie Leukozyten, wird den Kulis turmedien bei einer geplanten Dauer der Kultur über 1 Stunde meist Serum, beispielsweise Kalbsserum oder Pferdeserum, zugesetzt da die Serumbesta*-. ireile für die Erhaltung der Lebensfunktionen der Zellen günstig sind. Wenn jedoch die serumhaltige Kulturlösung auf Proteine (Mediatoren) aufgearbeitet werden soll, die durch die Kultur erzeugt werden, bereitet die Gewinnung der meist nur in geringen Konzentrationen enthaltenen Produktproteine wegen der Vielzahl der aus dem Serum stammenden fremden Proteine große Schwierigkeiten. Außerdem kann dabei nicht mit Sicherheit festgestellt werden, ob ein bestimmter Mediator humoraler oder zellulären Ursprungs ist und von welcher Spezies er stammt; d. h. ob er ein Mediator der Spezies ist, deren Zellen kultiviert wurden, oder der Spezies, von der das verwendete (meist heterologe) Serum stammt.

Neben den serumhaltigen Kulturmedien sind zwar auch serumfreie, synthetische Medien bekannt, vgl. H. J. Morton, a. a. O. Auch diese bekannten Medien haben aber bei der Kultur von Zellen, wie Leukozyten, bzw. bei der Aufarbeitung der entstandenen Mediatoren verschiedene Nachteile, da die in ihnen enthaltenen Tenside, Schwermetallsalze und/oder Farbstoffe die entsprechenden Mediatoren schädigen oder verunreinigen.
Andererseits fehlen den bekannten serumfreien Medien häufig essentielle Bestandteile, die für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Leukozyten erforderlich sind. Unter den bekannten Kulturmedien befindet sich somit keines, das beispielsweise für eine Leukozytenkultur zur Gewinnung von zellulären Spurensekreten, wie Entzündungsmediatoren, in befriedigender Weise verwendet werden kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues vollsynthetisches Kulturmedium für die Kultur von Zellen, insbesondere von eukaryontischen bellen, wie Leukozyten, bereitzustellen, mit dem sowohl günstige Bedingungen für die Zellkultur geschaffen werden, als auch eine problemlose Aufarbeitung der Kulturlösung und Gewinnung der von den Zellen sekretierten Proteine ermöglicht wird.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein vollsynthetisches Zellkulturmedium, enthaltend Salze, Zucker, Aminosäuren, Nucleoside und Nucleosidbasen, Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme, Steroide und weitere übliche Zusätze in wäßriger Lösung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es zusätzlich mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren in einer Menge von 0,1 bis 20 μπιοϊ/Ι und/ oder mindestens ein Flavanoid in einer Menge von 0,1 bis 50 μπιοϊ/Ι und/oder mindestens ein Ubichinon in einer Menge von 0,01 bis 20 μηιοΐ/i und/oder Vitamin U in einer Menge von 0,1 bis 20 μπιοϊ/Ι und/oder Mevalolacton in einer Menge von 0,5 bis 30 μΐηοΙ/Ι enthält.
Vorzugsweise enthält das vollsynthetische Zellkultur-