ES2259566B1 - Suplementacion para los medios de manipulacion embrionaria y/o celular. - Google Patents
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Abstract
Se trata de aumentar la calidad y seguridad de los medios que se utilizan en manipulaciones embrionarias y celulares mediante la suplementación, en el medio de manipulación, por uno o varios de los siguientes compuestos: hialurona sintética (HAs), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados obtenidos de semillas de soja (FAG), sustituyendo a otras que son normalmente añadidas a los medios de manipulación embrionaria y que producen daños potenciales y/o contaminaciones con virus, priones, endotoxinas, etc., siendo esto importante para la calidad de los embriones o células, que se consiguen generar, tanto para la producción de animales transgénicos, para producción animal, como para terapia celular o para reproducción asistida, consiguiéndose disminuir la adhesividad y aumentar la viscosidad sin perder la fluidez del medio, lo cual es imprescindible en micro-manipulaciones como ICSI, la transferencia nuclear, las biopsias embrionarias, la microinyección de células en embriones en estado preimplantacional, o la fusión de células.
Description
Suplementación para los medios de manipulación
embrionaria y/o celular.
La presente invención se refiere a un sistema
para aumentar la calidad y seguridad de los medios que se utilizan
en manipulaciones embrionarias y celulares, formado dicho medio de
manipulación con uno o varios de los siguientes compuestos:
hialurona sintética (HAs), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados
obtenidos de semillas de soja (FAG), generado con ello embriones y
células de calidad, tanto para la producción de animales
transgénicos, para la producción animal, como para terapia celular
o para reproducción asistida.
El objeto de la invención es, por tanto,
proporcionar unos suplementos para producir un medio óptimo para
facilitar las micromanipulaciones embrionarias/celulares, de gran
utilidad en Biología, Biomedicina y Biotecnología, mejorando los
medios de manipulación embrionaria/celular, lo cual produce
embriones y/o células de mayor calidad y mejora el porcentaje de
implantación embrionaria y la posterior supervivencia de dichos
embriones o
células.
células.
Para muchas técnicas de manipulación
embrionaria/celular se necesitan medios con una alta viscosidad y a
la vez con la suficiente fluidez para permitir el control del
movimiento del fluido que acompaña a las células que se están
manipulando, y que impida la adhesividad de las células manipuladas
a la placa de cultivo, entre ellas o a otras moléculas del
medio.
Las macromoléculas utilizadas normalmente en los
medios de manipulación pueden ser por una parte obtenidas de la
sangre, como el suero y la albúmina sérica, las cuales suponen una
potencial fuente de contaminación (virus, priones, endotoxinas), o
pueden ser macromoléculas sintéticas como el polivinilpirrolidona
(PVP), polivinilalcohol (PVA), Ficoll, etc., que no difunden del
interior celular y que no son digeridas por los enzimas lisosomales
celulares, por lo que se retienen en el interior de las células
después de las manipulaciones embrionarias/celulares.
Aunque aparentemente estas moléculas sintéticas
son inocuas, se trata de elementos que no están presentes en
ninguna ulula animal, y que en varios casos se ha documentado que
pueden ser tóxicas para la viabilidad celular. Por ejemplo se ha
determinado que el PVP puede interferir con la descondensación
nuclear que el espermatozoide debe realizar para llevar a cabo una
correcta fertilización (Dozortsev et al., 1995. Sperm plasma
membrana damage prior to intracytoplasm sperm injection: a necessary
condition for sperm nucleus decondensation. Human Reproduction 10,
2960-64). Se han observado efectos muy negativos en
embriones de ratón cuando los espermatozoides se incubaban con PVP
antes de la fecundación (Mizuno et al., 2002. Fertilization
and embryo development in mouse ICSI model using human and mouse
sperm alter immobilization in polyvinlypyrrolidones. Human
Reproduction 17,
2350-55).
2350-55).
Recientemente ha sido prohibido el uso de
Percoll con partículas de sílices cubiertas de PVP en reproducción
asistida humana, por el riesgo de contaminación por endotoxinas, y
por las alteraciones producidas en la membrana de los gametos, por
lo que estos gametos deben ser lavados intensamente para eliminar
el Percoll-PVP, lo cual va en detrimento de la
calidad de los gametos. Sin embargo PVP sigue siendo utilizado en
algunas micromanipulaciones como la ICSI, aunque es imprescindible
producir nuevas alternativas.
Los suplementos para medios de manipulación
embrionaria y celular que la invención propone resuelve de forma
plenamente satisfactoria la problemática anteriormente expuesta, en
los diferentes aspectos comentados, puesto que constituyen un medio
óptimo para facilitar las micro-manipulaciones
embrionarias/celulares, y no producen los potenciales daños y/o
contaminaciones en lo referente a virus, priones, endotoxinas,
etc.
De forma más concreta, la presente invención
proporciona unos suplementos para producir un medio óptimo para
facilitar las micromanipulaciones embrionarias y celulares en la
asistencia reproductiva humana y animal, por ejemplo la inyección
intracitoplasmática (ICSI), en transferencia nuclear, tanto con
fines terapéuticos, como con fines reproductivos, en el caso de
animales no humanos, en la producción de animales transgénicos no
humanos, como la inyección de células troncales en embriones
preimplantacionales, para producir quimeras, en la producción de
animales transgénicos mediante ICSI, en manipulaciones celulares
utilizadas en transgénesis o en terapia celular, en biopsias
embrionarias, etc.
La suplementación que la invención propone,
consiste en el empleo de uno o varios de los siguientes compuestos:
hialurona sintética (HAs), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados
obtenidos de semillas de soja (FAG), como medio para la
micromanipulación embrionaria y celular.
La hialurona es un polímero natural formado por
repeticiones de unidades de disacáridos de
N-acetilglucosamina y ácido
D-glucoronico, y se distribuye por todo el
organismo. Generalmente es obtenida por fermentación bacterial
continua de Streptococcus equi (Cifonelli JA, Dorfman A.
Biosynthesis of Hyaluronic acid by group A Streptocuccus: The
uridine nucleotides of groups a. Streptococcus. J. Biological
Chemistry 1957; 288:547-557).
La suplementación del medio de la presente
invención combina la presencia de HAs y FAG en cualquier
proporción. El suplemento del medio puede ser añadido a cualquier
medio celular o embrionario, como por ejemplo medios tamponados con
bicarbonato, HEPES o MOPS. La presente invención contempla
cualquier combinación de las proporciones de fosfolípidos y ácidos
grasos presentes en el FAG.
Cuando se combina la presencia de hialurona y de
ácidos grasos insaturados obtenidos de semillas de soja, se pueden
modificar las condiciones de viscosidad y fluidez del medio, así
como las características de adhesividad, de tal forma que
dependiendo de las necesidades del micromanipulador se puede
ajustar la viscosidad y fluidez sin que se pierda las
características que evitan que los embriones y/o células se peguen a
la placa de cultivo y no se puedan manipular correctamente.
Mediante la suplementación en el medio de
manipulación con HAs y/o FAG, se consigue disminuir la adhesividad
y aumentar la viscosidad sin perder la fluidez del medio, lo cual
es imprescindible en micro-manipulaciones como ICSI,
la transferencia nuclear, las biopsias embrionarias, la
microinyección de células en embriones en estadio
preimplantacional, o la fusión de células. Este aumento de
viscosidad que se produce, permite el control exacto del flujo de
medio a través de las pipetas de manipulación, evitando añadir a
dicho medio cualquier otro producto que pudiera afectar a la
viabilidad de las células de mamífero. Además, la hialurona posee
unas características quelantes de iones que protege a las células
del daño celular y nuclear; es una molécula fisiológica, presente en
el tracto genital femenino que es fácilmente eliminada por las
células mediante enzimas lisosomales, difunde fácilmente del
interior celular, evita que los embriones o células se peguen a las
placas de cultivo, o a las micro-herramientas
utilizadas en la manipulación embrionaria, y no solo no tiene
efectos negativos en el desarrollo embrionario, sino que además
mejora la calidad de los embriones resultantes de la manipulación y
los niveles de implantación. La HAs y/o FAG, representan una
alternativa efectiva y fisiológica a las macromoléculas utilizadas
en los medios de manipulación para modular las micromanipulaciones
realizadas en los embriones/células de mamíferos.
La actividad quelante de la HAs protege a las
preparaciones de espermatozoides y embriones/células que por daño
de la membrana, bien producida por los procesos de congelación,
bien por procesos endógenos, liberan endonucleasas que degradan el
DNA del espermatozoide. Se ha observado que gracias a la presencia
de HAs se produce una inhibición de estas endonucleasas por la
captura de iones imprescindibles para el funcionamiento de estas
endonucleasas. Además la movilidad de los espermatozoides aumenta,
probablemente debido a la captación de iones de zinc, produciendo
un efecto similar al descrito en espermatozoides humanos, donde ha
sido demostrado que la presencia de agentes quelantes aumenta la
movilidad de los espermatozoides.
La hialurona y los fosfolípidos o ácidos grasos
insaturados obtenidos de semillas de soja, presentan una actividad
antioxidante de tal forma que protegen a embriones y células de los
daños producidos por los radicales libres de oxígeno. Para producir
embriones/células de buena calidad, se debe reducir el daño
oxidativo causado por estos radicales. La primera consecuencia de
los mencionados radicales es la fragmentación del DNA, lo cual
produce la mortalidad embrionaria y en algunos casos tumores
infantiles.
Cuando los espermatozoides se manipulaban en
presencia de HAs en lugar de PVP, se produce un mayor número de
blastocistos, con mayor calidad embrionaria, y además estos
blastocistos se implantaban con una frecuencia
superior.
superior.
La hialurona se utiliza para mejorar las
condiciones de cultivo in vitro, como por ejemplo en el caso
de embriones de cerdo cultivados en medio NCSU-23.
Similares resultados han sido obtenidos con ovocitos de ratón y
con embriones de vaca.
También se ha demostrado que la suplementación
del medio con fosfolípidos acelera la respuesta acrosomal de los
espermatozoides humanos. Cuando se añade al cultivo in
vitro, por ejemplo de embriones de vaca en sustitución del
suero fetal, se producen embriones de alta calidad, que soportan
perfectamente los procesos de congelación y descongelación,
eliminando los riesgos que comporta la utilización de suero
fetal.
Eliminar los suplementos obtenidos de la sangre
como el suero, es imprescindible para el transporte internacional
de embriones. Además permite estandarizar las condiciones de
cultivo, ya que al utilizar proteínas biológicas conteniendo
macromoléculas en cantidad variable, y cuya concentración difiere
entre los distintos lotes, nunca se puede asegurar unas condiciones
estándares.
Los ejemplos que se describen a continuación,
ilustran las formas particulares de realización de la presente
invención, y no se pretende en absoluto con ello limitar el alcance
de protección de la misma.
\newpage
Ejemplo
1
El esperma del epidídimo es recogido y
resuspendido uniformemente en medio M2. Las células espermáticas
recogidas se lavan por centrifugación en un tubo de centrifuga de
propileno de 1.5 ml con 1 ml de medio fresco, y se resuspenden para
obtener una concentración final de 1-2 millones
espermatozoides/ml. Posteriormente, se hacen alícuotas de
60-70 microlitros de suspensión espermática en
tubos criogénicos (NUNC, Cophenhagen) que son correctamente
cerrados y directamente colocados en nitrógeno liquido a -196ºC,
durante 10-15 minutos, sin completa inmersión, para
evitar la contaminación de las muestras con nitrógeno liquido. Las
muestras posteriormente son guardadas por periodos de hasta 4
semanas a -80ºC, evitando su descongelación durante la transición de
-196ºC a -80ºC. La esterilidad fue mantenida durante todo el
procedimiento.
Las muestras de espermatozoide son descongeladas
a temperatura ambiente durante 10 minutos previamente a su uso.
Posteriormente se diluyen en 10% de PVP o en 80% hialuronate (ácido
hialuronico) en M2, soluciones con viscosidades semejantes. Esta
solución final de esperma deberá ser microinyectada a temperatura
ambiente durante las próximas dos horas.
Durante la fertilización de ovocitos en metafase
II por inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), el
espermatozoide completo puede ser inyectado. Sin embargo, la
inyección de la cola del gameto masculino debe ser evitada si su
centrosoma no participa en el proceso de fertilización (i. e. en
ratón). Esto facilita el proceso de microinyección y disminuye el
volumen de fluido que se inyecta en el citoplasma del ovocito. La
microinyección podrá ser realizada de forma convencional, [i.e.
metodología para hámster esta descrita en Yanagida, K., Yanagimachi,
R., Perrault, S. D. y R. G. Kleinfield, Biology of Reproduction
44, 440-447 (1991); Perry AC, Wakayama T, Kishikawa
H, Kasai T, Okabe M, Toyoda Y, Yanagimachi R.Mammalian transgenesis
by intracytoplasmic sperm injection. Science. 1999 May
14;284(5417):1180-3.], o con ayuda de una
unidad de microinyección piezoeléctrica (Piezo Impact Drive Unit de
Prime Tech Ltd. ; Tsukuda, Ibaraki-Ken, Japón).
Esta unidad utiliza el efecto piezoeléctrico para mover en vaivén,
de forma controlada, la pipeta de inyección, pequeñas distancias,
de aproximadamente 0.5 micrómetros. La unidad permite la regulación
de la intensidad y la duración de cada pulso.
Para la inyección en el ovocito de un núcleo de
espermatozoide mezclado con PVP o ácido hialuronico, la cola del
espermatozoide, si es que tiene una, es aspirada primero en el
capilar de inyección. Este capilar deberá tener una punta, de
sección recta siempre que se utilice una unidad piezoeléctrica, con
un diámetro interno en torno de los 6-8 \mum,
dependiendo de la especie de que se trate. En algunas especies, como
por ejemplo en el ratón, la inyección de la cabeza del
espermatozoide es suficiente para un desarrollo embrionario normal,
y esto simplifica el proceso de micromanipulación, por lo que se
puede inyectar únicamente las cabezas que se separan durante el
proceso de congelación-descongelación que son
también las que probablemente más han sufrido en el proceso de
congelación-fragmentación.
Durante la inyección intracitoplasmática, el
ovocito es colocado mediante presión negativa y con ayuda de una
pipeta de sujeción, con su placa metafásica distante del punto de
penetración, a las 6 o 12 horas. La zona pelúcida es perforada por
la aplicación de pulsos piezoeléctricos con una intensidad y
velocidad suficientes. Después de expulsar el pedazo de zona que se
queda en la punta de la pipeta de inyección, en la gota de
micromanipulación o en el espacio perivitelino del ovocito, la
cabeza del espermatozoide se aproxima de la abertura de la pipeta
de inyección. Se avanza la pipeta de inyección, hasta dos tercios
del diámetro del ovocito, y ahí , se aplica un único pulso de
intensidad mínima para que su membrana se abra. La relajación de
la membrana del ovocito indica su penetración. El espermatozoide
es liberado con una cantidad mínima de fluido, no más de unos 6
picolitros, en el citoplasma del ovocito, transportando así el
transgón de interés a su interior. La pipeta de inyección es
posteriormente extraída del citoplasma del ovocito suavemente para
evitar el riesgo de lisis celular. La microinyección se ejecuta lo
más rápido posible, en grupos de 10 - 15 ovocitos, que, después de
10 - 15 minutos de recuperación en la gota de microinyección, se
colocan en condiciones de cultivo (i. e. medio KSOM + aminoácidos
para ovocitos de ratón, equilibrado a 5% CO_{2} y 37ºC).
Los embriones que se desarrollan in vitro
hasta el estadio de 2-8 células, morula o
blastocisto no eclosionado, son transferidos al oviducto o útero de
una hembra pseudopreñada. En ratón, entre 15-20
embriones son transferidos por animal receptor.
En un experimento realizado en ratón, un total
de 239 ovocitos han sido inyectados con espermatozoides
resuspendidos en medio M2 suplementado con 10% PVP (n 115) o 80% HA
(n124). Cuando ICSI ha sido ejecutada con HA, 29 de 35 blastocistos
transferidos (83%) se implantaran. Esta proporción de implantación
ha sido considerablemente superior (p < 0.05, Chi cuadrado) a la
observada en el grupo de ICSI con PVP, en la cual apenas 19 de los
35 blastocistos transferidos (54%) lograran implantarse. Teniendo
en cuenta estos resultados, se puede concluir que el uso de HA para
ICSI en ratón, podrá ser mejor alternativa que PVP. Podrá aun ser
más benéfico si la adhesividad de los espermatozoides en la
micropipeta es eliminada y si tajas de implantación superiores a
las conseguidas con PVP son mantenidas.
Ejemplo
2
Como se puede observar en la metodología de ICSI
en ratón, citada en el Ejemplo 1, los resultados de implantación
son muy bajos, probablemente debido a la fragmentación que se
produce en el DNA del espermatozoide durante la manipulación
necesaria para la realización de la ICSI. Se ha descrito que el
aumento de los radicales libres de oxigeno y la presencia de
endonucleasas del espermatozoide, que se liberan como consecuencia
del daño celular, producen la fragmentación del DNA del
espermatozoide. Este espermatozoide con el DNA dañado no se puede
reconocer fácilmente, por lo que se microinyecta en el ovocito,
dando lugar a un embrión inviable o a una perdida fetal, dependiendo
del grado de fragmentación nuclear. Se han procesado los
espermatozoides de 5 ratones que iban ha ser inyectados (ICSI) en
ovocitos con M2 en presencia de PVP o de HAs. Los espermatozoides
son congelados y descongelados como se indica en el ejemplo 1.
Después se mantienen 2 horas a 22ºC y se determina el grado de
fragmentación del núcleo espermático; se puede observar que en
ausencia de HAs había una media de 45% de fragmentación, mientras
que en presencia de HAs estos porcentajes se redujeron al 25%.
Ejemplo
3
Embriones de vaca son producidos a partir de
vacas superovuladas. Siete días después de la inseminación estos
embriones son recogidos mediante el lavado del útero de 20 vacas
utilizando dos medios, por una parte PBS suplementado con 5% de
FCS, o con PBS suplementado con 0,3% de FAG. El porcentaje de
recogida de embriones, calculado en función del total de embriones
recogidos por cuerpos lúteos observados, es similar para los dos
medios de lavado utilizados (Tabla 1).
Los embriones recogidos anteriormente se colocan
en medio TCM-199, tamponado con hepes, y
suplementado con 5% FCS o con 0,3% FAG. Después de 2 horas de
exposición a 22ºC, los embriones se transfieren a gotas de cultivo
y se introducen en estufas de cultivo a 39ºC con 5% CO_{2}, 5%
O_{2} y 90% N_{2} Después de 24 y 48 horas se determina la
proporción de embriones que se desarrollan hasta blastocisto y
eclosionan correctamente (Tabla 2). No se observan diferencias en
desarrollo entre los grupos de embriones
\hbox{cultivados con
TCM-199 suplementados 5% FCS o con 0,3%
FAG.}
En un tercer experimento, embriones en dí as 7
de desarrollo se congelan para estudiar su criotolerancia. En
primer lugar los embriones se mantienen a temperatura de 22ºC
durante 1 hora en el medio conteniendo FCS o FAG. Posteriormente
los embriones se equilibran durante 5 minutos a 22ºC, en 1,5 M de
etilenglicol y 0,3% sucrosa en PBS suplementado con 0,5% BSA.
Finalmente los embriones se introducen en pajuelas de 0,25 ml y se
congelan utilizando procedimientos de equilibrado estándares. La
descongelación se realiza en baño a 30ºC, y posteriormente se
cuantifica el porcentaje de supervivencia
pos-descongelación y posterior desarrollo in
vitro (Tabla 3).
| Tratamiento | Nº animales | Nº total de CL | Nº total de embriones | Porcentaje de recogida |
| (%) | ||||
| PBS + FCS | 10 | 190 | 104 | 54.7 |
| PBS + FAG | 10 | 219 | 117 | 53.4 |
| Tratamiento | Nº de blastocitos | Nº embriones vivos | Embriones eclosionados |
| 48 h (%) | 72 h (%) | ||
| TCM-199 + FCS | 37 | 33/37 (89.2) | 15/33 (45.4) |
| TCM-199 + FAG | 41 | 38/41 (92.7) | 16/38 (42.1) |
| Tratamiento | Nº embriones | Nº embriones vivos | Embriones |
| recuperados/congelados | 48 h (%) | eclosionados (%) | |
| TCM-199+ FCS | 25/25 | 18/25 (72.0) | 7/18 (38.8) |
| TCM-199+ FAG | 26/27 | 21/26 (80.7%) | 9/21 (42.8) |
Claims (9)
1. Suplementación para los medios de
manipulación embrionaria y/o celular, tanto para la producción de
animales transgálicos, para la producción animal, como para terapia
celular o para reproducción asistida, caracterizada porque
está constituida por uno o varios de los siguientes compuestos:
hialurona sintética (HAs), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados
obtenidos de semillas de soja (FAG), que evitan los potenciales
daños y/o contaminaciones en lo referente, por ejemplo, a virus,
priones o endotoxinas.
2. Suplementación para los medios de
manipulación embrionaria y/o celular, según reivindicación 1ª,
caracterizada porque combina la presencia de HAs y FAG en
cualquier proporción.
3. Suplementación para los medios de
manipulación embrionaria y/o celular, según reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque contempla cualquier
combinación de las proporciones de fosfolípidos y ácidos grasos
presentes en el FAG.
4. Suplementación para los medios de
manipulación embrionaria y/o celular, según reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque el suplemento del medio
puede ser añadido a cualquier medio celular o embrionario, como por
ejemplo a medios tamponados con bicarbonato, HEPES o MOPS.
5. Empleo de hialurona sintética (HAs),
fosfolípidos o ácidos grasos insaturados obtenidos de semillas de
soja (FAG), de las reivindicaciones anteriores, para eliminar la
adhesividad, y aumentar la viscosidad y fluidez para la producción
y preparación de medios que permitan la manipulación in vitro
de embriones antes de su implantación al útero.
6. Empleo de hialurona sintética (Has),
fosfolípidos o ácidos grasos insaturados (FAG), de las
reivindicaciones anteriores, para eliminar la adhesividad, y
aumentar la viscosidad y fluidez para la producción y preparación
de medios que permitan la manipulación in vitro de células
somáticas y embrionarias.
7. Empleo de hialurona sintética (Has),
fosfolípidos o ácidos grasos insaturados (FAG), según
reivindicaciones anteriores, para proteger a los embriones/células
de la acción de radicales libres de oxigeno y mejorar la
supervivencia y la posterior implantación en el útero.
8. Empleo de hialurona sintética (Has),
fosfolípidos o ácidos grasos insaturados (FAG), según
reivindicaciones anteriores, para inactivar endonucleasas celulares
que degradan el DNA nuclear.
9. Empleo de hialurona sintética (Has),
fosfolípidos o ácidos grasos insaturados (FAG), según
reivindicaciones anteriores, para estandarizar las condiciones de
cultivo con suplementos de macromoléculas con funciones
biológicas.
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