ES2259566B1 - Suplementacion para los medios de manipulacion embrionaria y/o celular. - Google Patents

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Abstract

Se trata de aumentar la calidad y seguridad de los medios que se utilizan en manipulaciones embrionarias y celulares mediante la suplementación, en el medio de manipulación, por uno o varios de los siguientes compuestos: hialurona sintética (HAs), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados obtenidos de semillas de soja (FAG), sustituyendo a otras que son normalmente añadidas a los medios de manipulación embrionaria y que producen daños potenciales y/o contaminaciones con virus, priones, endotoxinas, etc., siendo esto importante para la calidad de los embriones o células, que se consiguen generar, tanto para la producción de animales transgénicos, para producción animal, como para terapia celular o para reproducción asistida, consiguiéndose disminuir la adhesividad y aumentar la viscosidad sin perder la fluidez del medio, lo cual es imprescindible en micro-manipulaciones como ICSI, la transferencia nuclear, las biopsias embrionarias, la microinyección de células en embriones en estado preimplantacional, o la fusión de células.

Description

Suplementación para los medios de manipulación embrionaria y/o celular.
Objeto de la invención
La presente invención se refiere a un sistema para aumentar la calidad y seguridad de los medios que se utilizan en manipulaciones embrionarias y celulares, formado dicho medio de manipulación con uno o varios de los siguientes compuestos: hialurona sintética (HAs), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados obtenidos de semillas de soja (FAG), generado con ello embriones y células de calidad, tanto para la producción de animales transgénicos, para la producción animal, como para terapia celular o para reproducción asistida.
El objeto de la invención es, por tanto, proporcionar unos suplementos para producir un medio óptimo para facilitar las micromanipulaciones embrionarias/celulares, de gran utilidad en Biología, Biomedicina y Biotecnología, mejorando los medios de manipulación embrionaria/celular, lo cual produce embriones y/o células de mayor calidad y mejora el porcentaje de implantación embrionaria y la posterior supervivencia de dichos embriones o
células.
Antecedentes de la invención
Para muchas técnicas de manipulación embrionaria/celular se necesitan medios con una alta viscosidad y a la vez con la suficiente fluidez para permitir el control del movimiento del fluido que acompaña a las células que se están manipulando, y que impida la adhesividad de las células manipuladas a la placa de cultivo, entre ellas o a otras moléculas del medio.
Las macromoléculas utilizadas normalmente en los medios de manipulación pueden ser por una parte obtenidas de la sangre, como el suero y la albúmina sérica, las cuales suponen una potencial fuente de contaminación (virus, priones, endotoxinas), o pueden ser macromoléculas sintéticas como el polivinilpirrolidona (PVP), polivinilalcohol (PVA), Ficoll, etc., que no difunden del interior celular y que no son digeridas por los enzimas lisosomales celulares, por lo que se retienen en el interior de las células después de las manipulaciones embrionarias/celulares.
Aunque aparentemente estas moléculas sintéticas son inocuas, se trata de elementos que no están presentes en ninguna ulula animal, y que en varios casos se ha documentado que pueden ser tóxicas para la viabilidad celular. Por ejemplo se ha determinado que el PVP puede interferir con la descondensación nuclear que el espermatozoide debe realizar para llevar a cabo una correcta fertilización (Dozortsev et al., 1995. Sperm plasma membrana damage prior to intracytoplasm sperm injection: a necessary condition for sperm nucleus decondensation. Human Reproduction 10, 2960-64). Se han observado efectos muy negativos en embriones de ratón cuando los espermatozoides se incubaban con PVP antes de la fecundación (Mizuno et al., 2002. Fertilization and embryo development in mouse ICSI model using human and mouse sperm alter immobilization in polyvinlypyrrolidones. Human Reproduction 17,
2350-55).
Recientemente ha sido prohibido el uso de Percoll con partículas de sílices cubiertas de PVP en reproducción asistida humana, por el riesgo de contaminación por endotoxinas, y por las alteraciones producidas en la membrana de los gametos, por lo que estos gametos deben ser lavados intensamente para eliminar el Percoll-PVP, lo cual va en detrimento de la calidad de los gametos. Sin embargo PVP sigue siendo utilizado en algunas micromanipulaciones como la ICSI, aunque es imprescindible producir nuevas alternativas.
Descripción de la invención
Los suplementos para medios de manipulación embrionaria y celular que la invención propone resuelve de forma plenamente satisfactoria la problemática anteriormente expuesta, en los diferentes aspectos comentados, puesto que constituyen un medio óptimo para facilitar las micro-manipulaciones embrionarias/celulares, y no producen los potenciales daños y/o contaminaciones en lo referente a virus, priones, endotoxinas, etc.
De forma más concreta, la presente invención proporciona unos suplementos para producir un medio óptimo para facilitar las micromanipulaciones embrionarias y celulares en la asistencia reproductiva humana y animal, por ejemplo la inyección intracitoplasmática (ICSI), en transferencia nuclear, tanto con fines terapéuticos, como con fines reproductivos, en el caso de animales no humanos, en la producción de animales transgénicos no humanos, como la inyección de células troncales en embriones preimplantacionales, para producir quimeras, en la producción de animales transgénicos mediante ICSI, en manipulaciones celulares utilizadas en transgénesis o en terapia celular, en biopsias embrionarias, etc.
La suplementación que la invención propone, consiste en el empleo de uno o varios de los siguientes compuestos: hialurona sintética (HAs), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados obtenidos de semillas de soja (FAG), como medio para la micromanipulación embrionaria y celular.
La hialurona es un polímero natural formado por repeticiones de unidades de disacáridos de N-acetilglucosamina y ácido D-glucoronico, y se distribuye por todo el organismo. Generalmente es obtenida por fermentación bacterial continua de Streptococcus equi (Cifonelli JA, Dorfman A. Biosynthesis of Hyaluronic acid by group A Streptocuccus: The uridine nucleotides of groups a. Streptococcus. J. Biological Chemistry 1957; 288:547-557).
La suplementación del medio de la presente invención combina la presencia de HAs y FAG en cualquier proporción. El suplemento del medio puede ser añadido a cualquier medio celular o embrionario, como por ejemplo medios tamponados con bicarbonato, HEPES o MOPS. La presente invención contempla cualquier combinación de las proporciones de fosfolípidos y ácidos grasos presentes en el FAG.
Cuando se combina la presencia de hialurona y de ácidos grasos insaturados obtenidos de semillas de soja, se pueden modificar las condiciones de viscosidad y fluidez del medio, así como las características de adhesividad, de tal forma que dependiendo de las necesidades del micromanipulador se puede ajustar la viscosidad y fluidez sin que se pierda las características que evitan que los embriones y/o células se peguen a la placa de cultivo y no se puedan manipular correctamente.
Mediante la suplementación en el medio de manipulación con HAs y/o FAG, se consigue disminuir la adhesividad y aumentar la viscosidad sin perder la fluidez del medio, lo cual es imprescindible en micro-manipulaciones como ICSI, la transferencia nuclear, las biopsias embrionarias, la microinyección de células en embriones en estadio preimplantacional, o la fusión de células. Este aumento de viscosidad que se produce, permite el control exacto del flujo de medio a través de las pipetas de manipulación, evitando añadir a dicho medio cualquier otro producto que pudiera afectar a la viabilidad de las células de mamífero. Además, la hialurona posee unas características quelantes de iones que protege a las células del daño celular y nuclear; es una molécula fisiológica, presente en el tracto genital femenino que es fácilmente eliminada por las células mediante enzimas lisosomales, difunde fácilmente del interior celular, evita que los embriones o células se peguen a las placas de cultivo, o a las micro-herramientas utilizadas en la manipulación embrionaria, y no solo no tiene efectos negativos en el desarrollo embrionario, sino que además mejora la calidad de los embriones resultantes de la manipulación y los niveles de implantación. La HAs y/o FAG, representan una alternativa efectiva y fisiológica a las macromoléculas utilizadas en los medios de manipulación para modular las micromanipulaciones realizadas en los embriones/células de mamíferos.
La actividad quelante de la HAs protege a las preparaciones de espermatozoides y embriones/células que por daño de la membrana, bien producida por los procesos de congelación, bien por procesos endógenos, liberan endonucleasas que degradan el DNA del espermatozoide. Se ha observado que gracias a la presencia de HAs se produce una inhibición de estas endonucleasas por la captura de iones imprescindibles para el funcionamiento de estas endonucleasas. Además la movilidad de los espermatozoides aumenta, probablemente debido a la captación de iones de zinc, produciendo un efecto similar al descrito en espermatozoides humanos, donde ha sido demostrado que la presencia de agentes quelantes aumenta la movilidad de los espermatozoides.
La hialurona y los fosfolípidos o ácidos grasos insaturados obtenidos de semillas de soja, presentan una actividad antioxidante de tal forma que protegen a embriones y células de los daños producidos por los radicales libres de oxígeno. Para producir embriones/células de buena calidad, se debe reducir el daño oxidativo causado por estos radicales. La primera consecuencia de los mencionados radicales es la fragmentación del DNA, lo cual produce la mortalidad embrionaria y en algunos casos tumores infantiles.
Cuando los espermatozoides se manipulaban en presencia de HAs en lugar de PVP, se produce un mayor número de blastocistos, con mayor calidad embrionaria, y además estos blastocistos se implantaban con una frecuencia
superior.
La hialurona se utiliza para mejorar las condiciones de cultivo in vitro, como por ejemplo en el caso de embriones de cerdo cultivados en medio NCSU-23. Similares resultados han sido obtenidos con ovocitos de ratón y con embriones de vaca.
También se ha demostrado que la suplementación del medio con fosfolípidos acelera la respuesta acrosomal de los espermatozoides humanos. Cuando se añade al cultivo in vitro, por ejemplo de embriones de vaca en sustitución del suero fetal, se producen embriones de alta calidad, que soportan perfectamente los procesos de congelación y descongelación, eliminando los riesgos que comporta la utilización de suero fetal.
Eliminar los suplementos obtenidos de la sangre como el suero, es imprescindible para el transporte internacional de embriones. Además permite estandarizar las condiciones de cultivo, ya que al utilizar proteínas biológicas conteniendo macromoléculas en cantidad variable, y cuya concentración difiere entre los distintos lotes, nunca se puede asegurar unas condiciones estándares.
Ejemplos de realización de la invención
Los ejemplos que se describen a continuación, ilustran las formas particulares de realización de la presente invención, y no se pretende en absoluto con ello limitar el alcance de protección de la misma.
\newpage
Ejemplo 1
Producción de ICSI en ratón sustituyendo en el medio de manipulación, el PVP por hialurona Obtención y congelación de los espermatozoides
El esperma del epidídimo es recogido y resuspendido uniformemente en medio M2. Las células espermáticas recogidas se lavan por centrifugación en un tubo de centrifuga de propileno de 1.5 ml con 1 ml de medio fresco, y se resuspenden para obtener una concentración final de 1-2 millones espermatozoides/ml. Posteriormente, se hacen alícuotas de 60-70 microlitros de suspensión espermática en tubos criogénicos (NUNC, Cophenhagen) que son correctamente cerrados y directamente colocados en nitrógeno liquido a -196ºC, durante 10-15 minutos, sin completa inmersión, para evitar la contaminación de las muestras con nitrógeno liquido. Las muestras posteriormente son guardadas por periodos de hasta 4 semanas a -80ºC, evitando su descongelación durante la transición de -196ºC a -80ºC. La esterilidad fue mantenida durante todo el procedimiento.
Las muestras de espermatozoide son descongeladas a temperatura ambiente durante 10 minutos previamente a su uso. Posteriormente se diluyen en 10% de PVP o en 80% hialuronate (ácido hialuronico) en M2, soluciones con viscosidades semejantes. Esta solución final de esperma deberá ser microinyectada a temperatura ambiente durante las próximas dos horas.
Microinyección intracitoplasmática del núcleo de espermatozoide
Durante la fertilización de ovocitos en metafase II por inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), el espermatozoide completo puede ser inyectado. Sin embargo, la inyección de la cola del gameto masculino debe ser evitada si su centrosoma no participa en el proceso de fertilización (i. e. en ratón). Esto facilita el proceso de microinyección y disminuye el volumen de fluido que se inyecta en el citoplasma del ovocito. La microinyección podrá ser realizada de forma convencional, [i.e. metodología para hámster esta descrita en Yanagida, K., Yanagimachi, R., Perrault, S. D. y R. G. Kleinfield, Biology of Reproduction 44, 440-447 (1991); Perry AC, Wakayama T, Kishikawa H, Kasai T, Okabe M, Toyoda Y, Yanagimachi R.Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science. 1999 May 14;284(5417):1180-3.], o con ayuda de una unidad de microinyección piezoeléctrica (Piezo Impact Drive Unit de Prime Tech Ltd. ; Tsukuda, Ibaraki-Ken, Japón). Esta unidad utiliza el efecto piezoeléctrico para mover en vaivén, de forma controlada, la pipeta de inyección, pequeñas distancias, de aproximadamente 0.5 micrómetros. La unidad permite la regulación de la intensidad y la duración de cada pulso.
Para la inyección en el ovocito de un núcleo de espermatozoide mezclado con PVP o ácido hialuronico, la cola del espermatozoide, si es que tiene una, es aspirada primero en el capilar de inyección. Este capilar deberá tener una punta, de sección recta siempre que se utilice una unidad piezoeléctrica, con un diámetro interno en torno de los 6-8 \mum, dependiendo de la especie de que se trate. En algunas especies, como por ejemplo en el ratón, la inyección de la cabeza del espermatozoide es suficiente para un desarrollo embrionario normal, y esto simplifica el proceso de micromanipulación, por lo que se puede inyectar únicamente las cabezas que se separan durante el proceso de congelación-descongelación que son también las que probablemente más han sufrido en el proceso de congelación-fragmentación.
Durante la inyección intracitoplasmática, el ovocito es colocado mediante presión negativa y con ayuda de una pipeta de sujeción, con su placa metafásica distante del punto de penetración, a las 6 o 12 horas. La zona pelúcida es perforada por la aplicación de pulsos piezoeléctricos con una intensidad y velocidad suficientes. Después de expulsar el pedazo de zona que se queda en la punta de la pipeta de inyección, en la gota de micromanipulación o en el espacio perivitelino del ovocito, la cabeza del espermatozoide se aproxima de la abertura de la pipeta de inyección. Se avanza la pipeta de inyección, hasta dos tercios del diámetro del ovocito, y ahí , se aplica un único pulso de intensidad mínima para que su membrana se abra. La relajación de la membrana del ovocito indica su penetración. El espermatozoide es liberado con una cantidad mínima de fluido, no más de unos 6 picolitros, en el citoplasma del ovocito, transportando así el transgón de interés a su interior. La pipeta de inyección es posteriormente extraída del citoplasma del ovocito suavemente para evitar el riesgo de lisis celular. La microinyección se ejecuta lo más rápido posible, en grupos de 10 - 15 ovocitos, que, después de 10 - 15 minutos de recuperación en la gota de microinyección, se colocan en condiciones de cultivo (i. e. medio KSOM + aminoácidos para ovocitos de ratón, equilibrado a 5% CO_{2} y 37ºC).
Desarrollo de los embriones manipulados para producción de descendencia
Los embriones que se desarrollan in vitro hasta el estadio de 2-8 células, morula o blastocisto no eclosionado, son transferidos al oviducto o útero de una hembra pseudopreñada. En ratón, entre 15-20 embriones son transferidos por animal receptor.
En un experimento realizado en ratón, un total de 239 ovocitos han sido inyectados con espermatozoides resuspendidos en medio M2 suplementado con 10% PVP (n 115) o 80% HA (n124). Cuando ICSI ha sido ejecutada con HA, 29 de 35 blastocistos transferidos (83%) se implantaran. Esta proporción de implantación ha sido considerablemente superior (p < 0.05, Chi cuadrado) a la observada en el grupo de ICSI con PVP, en la cual apenas 19 de los 35 blastocistos transferidos (54%) lograran implantarse. Teniendo en cuenta estos resultados, se puede concluir que el uso de HA para ICSI en ratón, podrá ser mejor alternativa que PVP. Podrá aun ser más benéfico si la adhesividad de los espermatozoides en la micropipeta es eliminada y si tajas de implantación superiores a las conseguidas con PVP son mantenidas.
Ejemplo 2
La presencia de HAs en el medio de micromanipulación para hacer ICSI en ratón, previene la fragmentación nuclear de los espermatozoides
Como se puede observar en la metodología de ICSI en ratón, citada en el Ejemplo 1, los resultados de implantación son muy bajos, probablemente debido a la fragmentación que se produce en el DNA del espermatozoide durante la manipulación necesaria para la realización de la ICSI. Se ha descrito que el aumento de los radicales libres de oxigeno y la presencia de endonucleasas del espermatozoide, que se liberan como consecuencia del daño celular, producen la fragmentación del DNA del espermatozoide. Este espermatozoide con el DNA dañado no se puede reconocer fácilmente, por lo que se microinyecta en el ovocito, dando lugar a un embrión inviable o a una perdida fetal, dependiendo del grado de fragmentación nuclear. Se han procesado los espermatozoides de 5 ratones que iban ha ser inyectados (ICSI) en ovocitos con M2 en presencia de PVP o de HAs. Los espermatozoides son congelados y descongelados como se indica en el ejemplo 1. Después se mantienen 2 horas a 22ºC y se determina el grado de fragmentación del núcleo espermático; se puede observar que en ausencia de HAs había una media de 45% de fragmentación, mientras que en presencia de HAs estos porcentajes se redujeron al 25%.
Ejemplo 3
Sustitución del suero fetal de origen animal por FAG en el medio de cultivo y congelación de embriones bovinos
Embriones de vaca son producidos a partir de vacas superovuladas. Siete días después de la inseminación estos embriones son recogidos mediante el lavado del útero de 20 vacas utilizando dos medios, por una parte PBS suplementado con 5% de FCS, o con PBS suplementado con 0,3% de FAG. El porcentaje de recogida de embriones, calculado en función del total de embriones recogidos por cuerpos lúteos observados, es similar para los dos medios de lavado utilizados (Tabla 1).
Los embriones recogidos anteriormente se colocan en medio TCM-199, tamponado con hepes, y suplementado con 5% FCS o con 0,3% FAG. Después de 2 horas de exposición a 22ºC, los embriones se transfieren a gotas de cultivo y se introducen en estufas de cultivo a 39ºC con 5% CO_{2}, 5% O_{2} y 90% N_{2} Después de 24 y 48 horas se determina la proporción de embriones que se desarrollan hasta blastocisto y eclosionan correctamente (Tabla 2). No se observan diferencias en desarrollo entre los grupos de embriones 
\hbox{cultivados con
TCM-199 suplementados 5% FCS o con 0,3%
FAG.}
En un tercer experimento, embriones en dí as 7 de desarrollo se congelan para estudiar su criotolerancia. En primer lugar los embriones se mantienen a temperatura de 22ºC durante 1 hora en el medio conteniendo FCS o FAG. Posteriormente los embriones se equilibran durante 5 minutos a 22ºC, en 1,5 M de etilenglicol y 0,3% sucrosa en PBS suplementado con 0,5% BSA. Finalmente los embriones se introducen en pajuelas de 0,25 ml y se congelan utilizando procedimientos de equilibrado estándares. La descongelación se realiza en baño a 30ºC, y posteriormente se cuantifica el porcentaje de supervivencia pos-descongelación y posterior desarrollo in vitro (Tabla 3).
TABLA 1 Recuperación de embriones con PBS conteniendo FCS o FAG
Tratamiento Nº animales Nº total de CL Nº total de embriones Porcentaje de recogida
(%)
PBS + FCS 10 190 104 54.7
PBS + FAG 10 219 117 53.4
TABLA 2 Desarrollo de embriones bovinos de Día 7 en medio TCM-199 suplementado con FCS o FAG
Tratamiento Nº de blastocitos Nº embriones vivos Embriones eclosionados
48 h (%) 72 h (%)
TCM-199 + FCS 37 33/37 (89.2) 15/33 (45.4)
TCM-199 + FAG 41 38/41 (92.7) 16/38 (42.1)
TABLA 3 Supervivencia y desarrollo de embriones bovinos cultivados y congelados en medio conteniendo FCS o FAG
Tratamiento Nº embriones Nº embriones vivos Embriones
recuperados/congelados 48 h (%) eclosionados (%)
TCM-199+ FCS 25/25 18/25 (72.0) 7/18 (38.8)
TCM-199+ FAG 26/27 21/26 (80.7%) 9/21 (42.8)

Claims (9)

1. Suplementación para los medios de manipulación embrionaria y/o celular, tanto para la producción de animales transgálicos, para la producción animal, como para terapia celular o para reproducción asistida, caracterizada porque está constituida por uno o varios de los siguientes compuestos: hialurona sintética (HAs), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados obtenidos de semillas de soja (FAG), que evitan los potenciales daños y/o contaminaciones en lo referente, por ejemplo, a virus, priones o endotoxinas.
2. Suplementación para los medios de manipulación embrionaria y/o celular, según reivindicación 1ª, caracterizada porque combina la presencia de HAs y FAG en cualquier proporción.
3. Suplementación para los medios de manipulación embrionaria y/o celular, según reivindicaciones anteriores, caracterizada porque contempla cualquier combinación de las proporciones de fosfolípidos y ácidos grasos presentes en el FAG.
4. Suplementación para los medios de manipulación embrionaria y/o celular, según reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el suplemento del medio puede ser añadido a cualquier medio celular o embrionario, como por ejemplo a medios tamponados con bicarbonato, HEPES o MOPS.
5. Empleo de hialurona sintética (HAs), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados obtenidos de semillas de soja (FAG), de las reivindicaciones anteriores, para eliminar la adhesividad, y aumentar la viscosidad y fluidez para la producción y preparación de medios que permitan la manipulación in vitro de embriones antes de su implantación al útero.
6. Empleo de hialurona sintética (Has), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados (FAG), de las reivindicaciones anteriores, para eliminar la adhesividad, y aumentar la viscosidad y fluidez para la producción y preparación de medios que permitan la manipulación in vitro de células somáticas y embrionarias.
7. Empleo de hialurona sintética (Has), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados (FAG), según reivindicaciones anteriores, para proteger a los embriones/células de la acción de radicales libres de oxigeno y mejorar la supervivencia y la posterior implantación en el útero.
8. Empleo de hialurona sintética (Has), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados (FAG), según reivindicaciones anteriores, para inactivar endonucleasas celulares que degradan el DNA nuclear.
9. Empleo de hialurona sintética (Has), fosfolípidos o ácidos grasos insaturados (FAG), según reivindicaciones anteriores, para estandarizar las condiciones de cultivo con suplementos de macromoléculas con funciones biológicas.
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