JP6788381B2 - 酸化ストレス抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、例えば哺乳動物の組織や細胞を酸化ストレスから保護するための酸化ストレス抑制剤に関する。

酸素は哺乳動物にとって必要不可欠な物質であるが、分子状の酸素がエネルギー状態の変化を起こすと、過酸化水素やヒドロキシラジカルといった様々な活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）が発生し、哺乳動物の組織や細胞に対して酸化ストレスをもたらして障害を与えることが知られている。生体内においては、活性酸素種の発生を阻害したり発生した活性酸素種を消去したりする機能が存在するため、これらの機能によって組織や細胞は酸化ストレスから保護されている。しかしながら、生体から取り出された組織や細胞には、もはやこうした生体内の防御機構が働かないため、生体内に比べて酸化ストレスによる影響は大きいものとなる。従って、例えば哺乳動物の卵子や精子といった生殖細胞や、受精卵（初期胚）などの胚を体外培養する際、その品質や発生などに酸化ストレスが影響を及ぼすことから、生体から取り出された生殖細胞や胚を酸化ストレスからいかに保護するかは、これらの体外培養技術の発展に非常に重要なテーマであり、とりわけ受精卵の体外培養技術の進歩は、これからの生殖補助医療の質的向上のためになくてはならないものである。こうした事情に鑑み、哺乳動物の受精卵を体外培養する際に酸化ストレスから保護するための研究がこれまでにも行われており、例えば非特許文献１においてメラトニンを有効成分とする酸化ストレス抑制剤が提案されている。しかしながら、新規な酸化ストレス抑制剤の探索は、今なお意義深い状況にある。

Ａｓｇａｒｉ Ｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｌａｔｏｎｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｃｅｌｌ Ｊ．１４：２０３−２０８．

そこで本発明は、例えば哺乳動物の組織や細胞を体外培養する際、これらを酸化ストレスから保護するための新規な酸化ストレス抑制剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、これまで海洋生物であるオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａｃｅａ）に含まれる成分が有する薬理作用について精力的に研究を行ってきたが、今般、３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸がオキアミに含まれていること、この不飽和脂肪酸はＲＯＳ発生阻害作用を有し、酸化ストレス抑制剤の有効成分として有用であることを見出した。

上記の知見に基づいてなされた本発明の酸化ストレス抑制剤は、請求項１記載の通り、３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸もしくはそのアルキルエステルまたはこれらの薬学的に許容される塩を有効成分とする（ただし３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸は６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸または６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸である）。
また、請求項２記載の酸化ストレス抑制剤は、請求項１記載の酸化ストレス抑制剤において、哺乳動物胚の体外培養時における発育促進剤として用いられる。
また、本発明のＲＯＳ発生阻害剤は、請求項３記載の通り、３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸もしくはそのアルキルエステルまたはこれらの薬学的に許容される塩を有効成分とする（ただし３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸は６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸または６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸である）。
また、本発明の酸化ストレス抑制剤の調製方法は、請求項４記載の通り、オキアミからの抽出操作によって３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸を単離取得する工程を含む（ただし３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸は６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸または６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸である）。

本発明によれば、例えば哺乳動物の組織や細胞を体外培養する際、これらを酸化ストレスから保護するための新規な酸化ストレス抑制剤を提供することができる。

実施例１における、ＨＰＬＣによるオキアミからの６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸の単離取得の結果を示すチャートである（ピーク２）。 同、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸の単離取得の結果を示すチャートである（ピーク３−１）。 実施例２における、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸が酸化ストレス抑制作用を有することを示すグラフである。 実施例３における、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸がＲＯＳ発生阻害作用を有することを示すグラフである。 実施例４における、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸がヒト初期胚の体外培養時における発育促進作用を有することを示すグラフである。

本発明の酸化ストレス抑制剤は、３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸もしくはそのアルキルエステルまたはこれらの薬学的に許容される塩を有効成分とするものである。３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸としては、３個の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸（ヘキサデカトリエン酸）や４個の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸（ヘキサデカテトラエン酸）が例示される。ヘキサデカトリエン酸の具体例としては、３，６，９−ヘキサデカトリエン酸、５，８，１１−ヘキサデカトリエン酸、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸、７，１０，１３−ヘキサデカトリエン酸などが挙げられる。ヘキサデカテトラエン酸の具体例としては、３，６，９，１２−ヘキサデカテトラエン酸、５，８，１１，１４−ヘキサデカテトラエン酸、６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸などが挙げられる。これらは単一のものを用いてもよいし、複数種類が混合された状態で用いてもよい。なお、３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸には、種々のシス−トランス異性体が存在するが、本発明はそのいずれをも権利範囲に包含するものである。

本発明において３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸は、天然物から単離取得されたものであってもよいし、有機合成化学的手法によって合成されたものであってもよい。本発明者らの検討によれば、オキアミからの抽出操作により、３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸を単離取得することができる。原料として用いるオキアミは特に限定されるものではなく、三陸地方でイサダと呼ばれて食用に供されるツノナシオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ ｐａｃｉｆｉｃａ）の他、ナンキョクオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ ｓｕｐｅｒｂａ）などであってもよい。オキアミは生のものを用いてもよいし、凍結したものを用いてもよい。また、オキアミの乾物や塩蔵物を用いてもよい。抽出操作は例えばアルコール（メタノールやエタノールやイソプロパノールなど）やアセトンやアセトニトリルなどの水に可溶性の有機溶媒および／または水を用いて行うことができる。単離取得された化合物の精製度を高めるために、イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲルろ過クロマトグラフィー、活性炭やアルミナやシリカゲルなどの吸着剤によるクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを用いた分離操作の他、結晶化操作、減圧濃縮操作、凍結乾燥操作などの各種操作を単独または適宜組み合わせて行ってもよい。

本発明において３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸は、アルキルエステルの形態であってもよい。アルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、ブチルエステル、ヘキシルエステルなどの炭素数が１〜６の低級アルキルエステルが挙げられる。

本発明において３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸が塩の形態をとる場合、その薬学的に許容される塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムなどとの無機塩、低級アルキルアミン、低級アルコールアミンなどとの有機塩、リジン、アルギニン、オルニチンなどとの塩基性アミノ酸塩の他、アンモニウム塩などが挙げられる。

本発明の酸化ストレス抑制剤は、ＲＯＳ発生阻害作用を有し、例えば哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サルなど）の組織や細胞を体外培養する際、培地や培養液に添加しておくことで、組織や細胞を酸化ストレスから保護することができる。また、本発明の酸化ストレス抑制剤は、例えば哺乳動物胚の体外培養時における発育促進剤として用いることができる。こうした場合における本発明の酸化ストレス抑制剤の培地や培養液への添加濃度は、例えば０．０１μＭ〜１Ｍであってよい。

また、本発明の酸化ストレス抑制剤は、例えば医薬品や食品（サプリメントを含む）として哺乳動物に対して経口的に投与することで、生体内において組織や細胞を酸化ストレスから保護することができるので、酸化ストレスが発症に関与する疾患、例えば、糖尿病、高血圧、動脈硬化、癌などの予防や治療に有効である。その投与量は、ヒトの場合、例えば体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ〜１ｇであってよい。本発明の酸化ストレス抑制剤を哺乳動物に対して投与するために製剤化する場合、その方法は、エイコサペンタエン酸やドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸を製剤化するための公知の方法に準じることができる。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。

実施例１：オキアミからのヘキサデカトリエン酸とヘキサデカテトラエン酸の単離取得
（メタノール抽出）
三陸地方で漁獲されたイサダ（ツノナシオキアミ）の冷凍物を解凍した後、よく砕き、１０倍量（ｗ／ｖ）のメタノールを加えて２時間以上抽出した後、ペーパーフィルタで濾過してメタノール抽出液を得た。

（ＨＰ−２０による分画）
メタノール抽出液２００ｍＬに対して３０ｇの合成樹脂吸着剤ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社）を用いて行った。具体的には、まず、３０ｇのＨＰ−２０をクロマト管に充填し、１００％メタノール２００ｍＬで洗浄した後、３０％メタノール水溶液２００ｍＬで平衡化した。次に、メタノール抽出液２００ｍＬを蒸留水８００ｍＬで希釈してからアプライし、３０％メタノール水溶液２００ｍＬで洗浄した後、１００％メタノール２００ｍＬで溶出させてＨＰ−２０溶出液２００ｍＬを得た。

（ＨＰＬＣによる精製）
ＨＰ−２０溶出液をエバポレーションして得た黄色の油状物を１００ｍｇ／ｍＬでメタノールに溶解した後、以下の条件で行った。
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ−Ｃ１８（ＧＬサイエンス社）φ２０．０ｍｍ×２５０ｍｍ（５μｍ）
サンプル：１０ｍｇ／ｍＬ（１００ｍｇ／ｍＬストックを蒸留水で１０倍に希釈し濾過）
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：１ｍＬ（１０ｍｇ）
移動層：１５ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ：蒸留水＋０．２％ギ酸溶液、Ｂ：ＡｃＮ、（Ａ：Ｂ）４５：５５→４５ｍｉｎ、４５：５５ｔｏ１０：９０→２０ｍｉｎ、１０：９０→１０ｍｉｎ、４５：５５→１０ｍｉｎ
検出器：ＵＶ２１０ｎｍ
カラムオーブン：４０℃
結果を図１に示す。図１に示したピークのうち、ピーク２の成分を単離取得し、ピーク３の成分をさらにＨＰＬＣで精製した。

（ＨＰＬＣによるピーク３の成分のさらなる精製）
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ−Ｃ１８（ＧＬサイエンス社）φ２０．０ｍｍ×２５０ｍｍ（５μｍ）
サンプル：１ｍｇ／ｍＬ（１０％メタノール水溶液）（ピーク３の成分のフラクションをエバポレーションしたものをメタノールに溶解することで調製した１０ｍｇ／ｍＬストックを蒸留水で１０倍に希釈）
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：５００μＬ（５００μｇ）
移動層：６０％ＡｃＮ＋０．１％ギ酸溶液（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）１５ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ２１０ｎｍ
カラムオーブン：４０℃
結果を図２に示す。図２に示したピークのうち、ピーク３−１の成分を単離取得した。

ピーク２の成分とピーク３−１の成分を高速液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ／Ｑ−ＴＯＦＭＳ：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析したところ、ピーク２の成分は分子量が２４８．１７で分子式がＣ_１６Ｈ_２４Ｏ_２の化合物であり、ピーク３−１の成分は分子量が２５０．１７で分子式がＣ_１６Ｈ_２６Ｏ_２の化合物であることがわかった。さらにガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ／ＭＳ：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるＭＳスペクトル解析を行うことで、ピーク２の成分は６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸であり、ピーク３−１の成分は６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸であると同定した（二重結合の立体配置は未決定）。

実施例２：マウス初期胚育成に対する６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸の酸化ストレス抑制作用（過酸化水素処理後の胚盤胞発生率および脱出胚盤胞率）
（実験方法）
マウス前核期卵（ＡＲＫ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）を融解し、通常培地（Ｍ１６，ＳＩＧＭＡ、以下同じ）に、ＤＭＳＯに溶解した６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸を１０μＭの濃度になるように添加した培地（調整培地、以下同じ）で２時間の回復培養後、通常培地に過酸化水素（ＷＡＫＯ）を５０μＭの濃度になるように添加した培地で２０分間処理することで酸化ストレスを与え、その後、調整培地で培養し、胚盤胞発生率および脱出胚盤胞率を検討した。コントロールには非処理群、ネガティブコントロールの調整培地にはＤＭＳＯのみを添加した培地を使用した。なお、いずれの培養も、３７℃、５％ＣＯ_２環境下にて行った。

（実験結果）
図３に示す。図３から明らかなように、ＤＭＳＯのみを添加したネガティブコントロールの場合、８細胞期で過酸化水素処理による酸化ストレスの影響が認められた。一方、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸を添加した場合、８細胞期では酸化ストレスの影響は認められず、その後に酸化ストレスの影響は認められるが、ネガティブコントロールよりも明らかに遅延したものであった。以上の結果から、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸は酸化ストレス抑制作用を有することを確認できた。

実施例３：マウス初期胚育成に対する６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸の酸化ストレス抑制作用（ＲＯＳイメージング）
（実験方法）
マウス前核期卵（ＡＲＫ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）を融解し、通常培地（Ｍ１６，ＳＩＧＭＡ、以下同じ）に、ＤＭＳＯに溶解した６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸を１０μＭの濃度になるように添加した培地（調整培地、以下同じ）で２時間の回復培養後、通常培地に過酸化水素（ＷＡＫＯ）を５０μＭの濃度になるように添加した培地で２０分間処理することで酸化ストレスを与え、その後、通常培地にＣｅｌｌＲＯＸ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１０μＭの濃度になるように添加した培地で３０分間培養し、通常培地で洗浄後してからＣＶ１０００共焦点スキャナボックス（ＹＯＫＯＧＡＷＡ）を用いて６時間ごとのライブイメージング解析を実施した。コントロールには非処理群、ネガティブコントロールの調整培地にはＤＭＳＯのみを添加した培地を使用した。なお、いずれの培養も、３７℃、５％ＣＯ_２環境下にて行った。

（実験結果）
図４に示す。図４から明らかなように、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸は、過酸化水素処理によるＲＯＳの発生を効果的に阻害した。

実施例４：ヒト初期胚育成に対する６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸の発育促進作用
（実験方法）
ＪＩＳＡＲＴ（日本生殖補助医療標準化機関）倫理委員会の承認のもと、日本産科婦人科学会において受理された実験として、廃棄予定で研究同意を得たヒト４細胞期胚を融解し、通常培地（ＯＮＥＳＴＥＰ ｍｅｄｉｕｍ，ＮＡＫＡ ｍｅｄｉｃａｌ）に、ＤＭＳＯに溶解した６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸を１０μＭの濃度になるように添加した培地で培養し、胚盤胞発生率および脱出胚盤胞率を検討した。コントロールには非処理群を使用した。なお、いずれの培養も、３７℃、５％ＣＯ_２環境下にて行った。

（実験結果）
図５に示す。図５から明らかなように、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸を添加した場合、非処理群に比べて胚盤胞発生率および脱出胚盤胞率の上昇が認められた。以上の結果から、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸はヒト初期胚の体外培養時における発育促進作用を有することを確認できた。実施例２と実施例３の結果とあわせ考えると、この作用は６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸が有する酸化ストレス抑制作用に基づくと考察された。

実施例５：マウス初期胚育成に対する６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸の酸化ストレス抑制作用
実施例２と同様にして過酸化水素処理後の胚盤胞発生率および脱出胚盤胞率を調べたところ、６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸と同様の酸化ストレス抑制作用が認められた。

比較例１：マウス初期胚育成に対するエイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸の酸化ストレス抑制作用
エイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸（いずれもＮＡＣＡＬＡＩ ＴＥＳＱＵＥ）について実施例２と同様にして過酸化水素処理後の胚盤胞発生率および脱出胚盤胞率を調べたところ、いずれにも酸化ストレス抑制作用は認められなかった。

製剤例１：哺乳動物に酸化ストレス抑制剤として経口投与するためのカプセル剤
６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸２００ｍｇ、精製大豆油８０ｍｇ、ミツロウ１５ｍｇ、ビタミンＥ５ｍｇを４０℃に加温しながら十分に混合して均質な液状物とした。これをカプセル充填機に供給して１粒の内容量が３００ｍｇのゼラチン被覆カプセル剤を製造した。

本発明は、例えば哺乳動物の組織や細胞を体外培養する際、これらを酸化ストレスから保護するための新規な酸化ストレス抑制剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims (4)

1. ３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸もしくはそのアルキルエステルまたはこれらの薬学的に許容される塩を有効成分とする酸化ストレス抑制剤（ただし３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸は６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸または６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸である）。
2. 哺乳動物胚の体外培養時における発育促進剤として用いられる請求項１記載の酸化ストレス抑制剤。
3. ３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸もしくはそのアルキルエステルまたはこれらの薬学的に許容される塩を有効成分とする活性酸素種発生阻害剤（ただし３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸は６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸または６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸である）。
4. オキアミからの抽出操作によって３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸を単離取得する工程を含む酸化ストレス抑制剤の調製方法（ただし３個以上の二重結合を持つＣ１６不飽和脂肪酸は６，９，１２−ヘキサデカトリエン酸または６，９，１２，１５−ヘキサデカテトラエン酸である）。