WO2019059027A1 - ５－アミノレブリン酸を含むエビ目用組成物 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an orally administered composition for the order of the order including at least one selected from 5-aminolevulinic acid (5-ALA) or an ester thereof, or a salt thereof, a feed and a feed additive, more specifically
- the present invention relates to an orally administered composition for the prophylaxis or treatment of Early-stage Eribic Death Syndrome / Acute Hepatopancreatic Necrosis (EMS / AHPND), which comprises at least one selected from 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof.
- EMS / AHPND Early-stage Eribic Death Syndrome / Acute Hepatopancreatic Necrosis
- the present invention relates to a method comprising ingesting at least one selected from 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof to an organism of the ordershrimp, and more specifically, 5-ALA or an ester thereof, or those
- the present invention relates to a method for preventing and / or treating Early Stage Early Death Syndrome / Acute Hepatopancreatic Necrosis (EMS / AHPND), which comprises feeding at least one selected from the salts of the following to the order of the ordershrimp.
- EMS / AHPND Early Stage Early Death Syndrome / Acute Hepatopancreatic Necrosis
- Non-Patent Document 1 In shrimp farming, different from the natural environment, in general, it is reared at high density, and due to excessive stress and the like, occurrence of various diseases has been recognized in shrimp farms. Since the survival rate of aquaculture animals and animals greatly affects aquaculture management, appropriate response to disease is required in the aquaculture industry.
- EMS Early Mortality Syndrome
- This early death syndrome is also called EMS / AHPND (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) because symptoms such as discoloration appear in the hepatopancreas of shrimp in the EMS and become necrotic.
- EMS / AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease
- Patent Document 1 suggests Vibrio parahaemolyticus as a target bacterium, it is not disclosed specifically that a vaccine for Vibrio parahaemolyticus has been produced, and by no means this vaccine It is not at all clear that the therapy is effective in preventing and treating EMS / AHPND. Furthermore, it is clear that it would be desirable if there is a way to prevent / treat EMS / AHPND with cheap and easily available materials than specialized vaccines. In addition, it is more desirable if there is a substance that brings about an advantageous effect in shrimp culture other than the prevention / treatment of EMS / AHPND.
- 5-ALA is present in the mitochondria of cells, is biosynthesized in mitochondria in animals, and is an essential component for metabolism such as binding to iron to become a source of heme and cytochrome, and in plants, it is viable in chloroplasts. It is known that it is synthesized and combined with magnesium to become chlorophyll and is an essential component for photosynthesis.
- Patent Document 2 discloses a method for producing 5-ALA phosphate, and also describes that a method for synthesizing 5-ALA hydrochloride is already known. In addition, a method for producing 5-ALA by a microorganism is also known (Patent Document 3).
- Patent Document 4 describes a composition for preventing and treating infection of fish pathogenic microorganisms containing 5-ALA as an active ingredient, and further, as the fish pathogenic microorganism, Edwardsiella tarda bacteria ( Edwardsiella tarda ) , Streptococcus bacteria (Streptococcus sp.) Staphylococcus bacteria belonging to the genus (Staphylococcus sp.), Staphylococcus epidermidis bacteria (Staphilococcus epidermidis), bacteria belonging to the genus Pseudomonas (Pseudomonas sp.), or Vibrio Anguirarumu bacteria (Vibrio anguillarum) Is described.
- Edwardsiella tarda bacteria Edwardsiella tarda
- Streptococcus bacteria Streptococcus sp.
- Staphylococcus bacteria belonging to the genus Staphylococcus sp.
- Patent Document 4 does not discuss the influence of 5-ALA on organisms of the order Shrimp. Furthermore, because Vibrio anguillarum ( Vibrio anguillarum ) described in Patent Document 4 is different from Vibrio parahaemolyticus, which is the causative organism of EMS / AHPND in the order of the shrimp, it does not produce EMS / AHPND in the organism of the order Nematode . Therefore, from the description of Patent Document 4, the EMS / AHPND prevention / treatment effect of 5-ALA in a living order of the order shrimp can not be predicted at all. In addition, it is not known that 5-ALA promotes the growth of the order Eridiformes.
- JP 2015-137254 A Unexamined-Japanese-Patent No. 2006-182753 JP, 2005-333907, A JP, 2001-316255, A
- compositions for shrimp which are useful in the breeding and aquaculture of prawn-like organisms such as prawn and which are capable of preventing and treating EMS / AHPND.
- development of an orally administered composition for shrimp order that can not only prevent / treat EMS / AHPND of a shrimp order organism but also promote its growth has been desired.
- an orally administered composition for shrimps has not been realized.
- the inventors of the present invention conducted intensive studies on an orally administered composition for shrimps that could solve the above problems, and found that at least one selected from the group consisting of 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof. The composition containing it was found to be extremely useful, and based on this, the present invention was completed.
- the present invention is as follows.
- An orally administered composition for the order of the order comprising at least one selected from 5-aminolevulinic acid (5-ALA) or an ester thereof, or a salt thereof.
- EMS / AHPND Ebileria early death syndrome / acute hepatopancreatic necrosis disease
- EMS / AHPND Ebileria early death syndrome / acute hepatopancreatic necrosis disease
- EMS / AHPND Ebileria early death syndrome / acute hepatopancreatic necrosis disease
- EMS / AHPND Ebileria early death syndrome / acute hepatopancreatic necrosis disease
- a salt thereof Administration composition.
- [5] A method comprising ingesting at least one species selected from 5-aminolevulinic acid (5-ALA) or an ester thereof, or a salt thereof to an organism of the order Shrimp.
- Early-stage mortality syndrome / acute hepatopancreas necrosis disease which comprises causing at least one species selected from 5-aminolevulinic acid (5-ALA) or an ester thereof, or a salt thereof to be taken up by a shrimp order How to prevent / treat EMS / AHPND).
- a method for promoting the growth of a shrimp-like organism which comprises feeding it to a shrimp-like organism in an amount of 0.25 ⁇ g / g ⁇ day to 2.5 ⁇ g / g ⁇ day.
- the orally administered composition for shrimp order comprising at least one selected from 5-ALA or its ester of the present invention, or a salt thereof prevents or treats shrimp order EMS / AHPND in breeding and aquaculture of organisms of the order shrimp. It has the effect of being able to As a result, EMS / AHPND can be prevented and treated, which would cause the death rate to almost 100% in the past, which can bring about economic contribution in breeding and aquaculture of the order of the order Erididae.
- the orally administered composition for the order of the present invention has an advantageous effect of promoting growth when it is administered to organisms of the order of the predetermined dose. This advantageous effect is an effect that has not been known hitherto, and is an effect that was not expected by those skilled in the art of rearing and rearing organisms of the order shrimp.
- FIG. 16 is a graph showing hepatopancreas ATP levels of panacea nigra shrimp treated with 5-ALA for 2 weeks in comparison with a control group not administered 5-ALA.
- the gene expression of phenoloxidase precursor (proPO) in the hepatopancreas when treated with infection with the cause of EMS / AHPND ( Vibrio parahaemolyticus ) to the pan-fried shrimp with ALA treated with 5-ALA for 3 months It is a graph shown comparing with the control group which has not administered ALA. It is a graph which shows the gene expression of nuclear receptor E75 in the hepatopancreas of the pandora shrimp which administered 5-ALA over 3 months compared with the control group which has not received 5-ALA.
- One embodiment of the present invention is an orally administered composition for the order of the order comprising at least one selected from 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof.
- 5-aminolevulinic acid is a compound also referred to as ⁇ -aminolevulinic acid.
- “5-ALA or an ester thereof” is “5-ALA or 5-ALA ester” and may be represented by the following formula (I).
- “the salts thereof” in the description of "5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof” refers to a salt of 5-ALA or a salt of a 5-ALA ester.
- this salt for example, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, methyl phosphate, ethyl phosphate, phosphite, hypophosphite, nitrate, sulfate, acetate, Propionate, toluene sulfonate, succinate, oxalate, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate And acid addition salts such as malate, and metal salts such as sodium salt, potassium salt and calcium salt, ammonium salts, alkyl ammonium salts and the like, but not limited thereto.
- R 1 is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a cycloalkyl group, an aryl group or an aralkyl group.
- the formula (I) represents 5-ALA.
- the formula (I) represents a 5-ALA ester.
- the linear or branched alkyl group represented by R 1 is preferably an alkyl group having a carbon number of 1 to 18, and examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group and an n-butyl group.
- cycloalkyl group examples include not only cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group, cycloheptyl group, cyclooctyl group and the like, but also a cycloalkyl group having an alkyl substituent, for example, 1 carbon Also included are cycloalkyl groups having an alkyl substituent of -6, such as 3-methylcyclohexyl, 4-methylcyclohexyl, 4-ethylcyclohexyl, 2-methylcyclooctyl and the like.
- an alkyl group having 1 to 16 carbon atoms is more preferable, and a methyl group, an ethyl group, an n-butyl group, an n-hexadecyl group or a 2-ethylhexyl group is particularly preferable.
- Examples of the aryl group having 6 to 20 carbon atoms include a phenyl group and a naphthyl group.
- a benzyl group or a phenethyl group is preferable, and a benzyl group is particularly preferable.
- the aryl group of the aralkyl group is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms as described above, such as an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an n-butoxy group, an isobutoxy group, or a tert-butoxy group.
- the active ingredient used in the present invention may be any of 5-ALA, 5-ALA ester, 5-ALA salt, or a salt of 5-ALA ester.
- a combination of 5-ALA and a salt of 5-ALA ester may be used.
- At least one selected from 5-ALA or an ester or a salt thereof used in the present invention may be in a purified state, or in a crude purified state, or obtained by synthesis. It may be in the form of a mixture.
- 5-ALA salt is preferably used as an active ingredient, and more preferably 5-ALA hydrochloride and / or 5-ALA phosphate is used as an active ingredient.
- Ephiridiformes is one of crustacean taxonomic groups, also called decapoda ( Decapoda ), and is a living group including shrimp, crab and hermit crabs.
- the shrimp order organism is shrimp, and more preferably a kuruma shrimp order also referred to as Dendrobranchiata . More preferably, the order of the order of the order of the present invention is that of the Penaeidae .
- the organisms of the order Shrimp of the present invention are the spiny lobster shrimp ( Litopenaeus vannamei ), kuruma prawn ( Marsupenaeus japonicus ), beef prawn (black tiger) ( Penaeus monodon ), koi prawn (Taisho shrimp) ( Fenneropenaeus chinensis ), Futomizoebi (Melicertus latisulcatus), Metapenaeus Ensis (Metapenaeus ensis), Akaebi (Metapenaeopsis barbata), Kumaebi (Penaeus semisulcatus) is but are not limited to such.
- the shrimp-like organism targeted by the present invention is spiny lobster.
- the organism in the subject of the present invention is juvenile shrimp, and still more preferably, the organism in the subject of the present invention Is a juvenile prawn family.
- the composition for oral administration for shrimps is not particularly limited as long as it is a composition orally administered to organisms of shrimps.
- the orally administered composition of the present invention is preferably a feed for shrimps or It is a feed additive for shrimps.
- the shrimp order feed may contain any component as long as it is a component generally used for breeding and aquaculture of shrimp species and may be produced by any production method.
- almost the same raw materials as those for conventional shrimp feed can be used.
- squid meal, krill meal, white meal, soybean meal, corn gluten meal, etc. used for general shrimp feed Protein source, gluten, binders such as starch, other vitamin mixtures, mineral mixtures, and those containing trace metals, but are not limited thereto.
- the feed for shrimp according to the present invention may have any shape and size depending on the type and size of the living creature of the order shrimp.
- the feed for shrimp according to the present invention can be produced in various forms.
- the feed for shrimp according to the present invention may be a powdered feed obtained by mixing dry raw materials, a solidified feed obtained by solidifying powder, such as dry pellets, or a solidified feed containing water, such as paste. It may be feed or moist pellets and the like.
- general powdered shrimp aquaculture feed and at least one active ingredient selected from 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof, optionally mixed with a mixing medium such as water The mixture is molded, for example, the mixture is extruded from a 50 mL syringe, and the molded product is dried, for example, dried at 60 to 65 ° C. for about 2 hours to obtain 5-ALA of the present invention or its ester, Alternatively, a shrimp diet may be formed which contains at least one selected from the salts thereof.
- the form of feed, the degree of dryness and the like are not particularly limited as long as there is no inconvenience in administration.
- the active ingredient contained in the feed ie, the salt of 5-ALA, 5-ALA ester, 5-ALA which may be contained in the feed
- the salt of 5-ALA ester is preferably 1 to 100 ppm, more preferably 2 to 50 ppm, still more preferably 3 to 20 ppm in terms of 5-ALA phosphate.
- the total amount of the active ingredients contained in the feed is preferably 5 to 50 ppm, more preferably 10 to 40 ppm, in terms of 5-ALA phosphate, from the viewpoint of promoting the growth of the shrimp order organism. Still more preferably, it is 15 to 30 ppm.
- the composition for oral administration for shrimps may be a feed additive for shrimps.
- the feed additive here is not particularly limited as long as it is an additive that can be added to a common shrimp order feed.
- the feed additive in the present invention comprises at least one selected from 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof, and a spreading agent capable of causing the active ingredient to adhere to the feed for shrimp. It may be a medium that allows the active ingredient to be absorbed in the feed for the shrimp, or a medium that facilitates the mixing of the active ingredient into the feed for the feed for the shrimp It may be included.
- the feed additive of the present invention is preferably added to the feed so that the total amount of active ingredients contained in the feed falls within the above range.
- Another embodiment of the present invention is a method comprising ingesting at least one selected from 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof to an organism of the order Shrimp.
- Ingestion here is oral intake.
- the method is not particularly limited as long as at least one selected from the active ingredient 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof can be ingested by an organism of the order Shrimp.
- there is a method in which at least one selected from 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof is added in an environment where a shrimp-like organism is reared, and the active ingredient is ingested in the order of shrimp-like.
- Another embodiment of the present invention is to promote the growth of a shrimp order comprising ingesting at least one selected from a predetermined amount of 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof into a creature of the order shrimp. It is a way to In this embodiment, the total amount of at least one selected from the active ingredient 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof to be ingested by a shrimp order is preferably 5-ALA phosphate equivalent Per gram of the body weight of the shrimp order and per day, 0.25 ⁇ g / g ⁇ day to 2.5 ⁇ g / g ⁇ day, more preferably 0.5 ⁇ g / g ⁇ day to 2.0 ⁇ g / g ⁇ And even more preferably 0.75 to 1.5 ⁇ g / g ⁇ day.
- one of the mechanisms for promoting the growth of the shrimp order organisms in this embodiment of the present invention is the efficiency with which energy is extracted from the ingested food in the organisms of the shrimp order organisms. It seems that 5-ALA
- Another embodiment of the present invention is oral administration for the prophylaxis or treatment of Ebiraea early mortality syndrome / acute hepatopancreatic necrosis (EMS / AHPND) comprising at least one selected from 5-ALA or its ester, or a salt thereof It is a composition.
- Ebiraea early mortality syndrome / acute hepatopancreatic necrosis EMS / AHPND
- still another embodiment of the present invention includes an Ebidocerus Early Mortality Syndrome / Acute hepatopancreas, comprising causing at least one species selected from 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof to be taken up by an Ebidoptera organism. It is a method to prevent and treat necrosis disease (EMS / AHPND).
- prevention / treatment of "early death syndrome of the shrimp order / acute hepatopancreatic necrosis disease (EMS / AHPND)" is a serious cause of Vibrio parahaemolyticus , which is a serious problem in the cultivation of organisms of the order shrimp. It refers to the prevention and / or treatment of a disease of shrimp called early death syndrome / acute hepatopancreatic necrosis disease (EMS / AHPND).
- the prevention means suppressing the onset of EMS / AHPND under at least one administration selected from 5-ALA or its ester, or a salt thereof, that is, completely suppressing the onset or the onset rate
- treatment refers to curing the infection of the order Nematode which has been infected with Vibrio parahaemolyticus or who has developed EMS / AHPND and EMS / AHPND.
- This embodiment of the present invention has an advantageous effect that at least one selected from the active ingredient 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof can prevent and / or treat EMS / AHPND of this order It plays. This effect is clearly shown in the examples in the form of reduction in mortality after attack of the pathogen.
- the total amount of at least one selected from the active ingredient 5-ALA or an ester thereof, or a salt thereof to be fed to ashrimp order organism is 5-ALA phosphorus
- the amount is preferably 0.05 ⁇ g / g ⁇ day to 5 ⁇ g / g ⁇ day, and more preferably 0.1 ⁇ g / g ⁇ day to 2.5 ⁇ g, per 1 g body weight of the shrimp order in terms of acid salt and per day / G ⁇ day, even more preferably 0.15 to 1 ⁇ g / g ⁇ day.
- the present invention is also applicable to aquaculture in a large scale pond in Southeast Asia, etc.
- the present invention is also applicable to small-scale breeding in a water tank or the like.
- the present invention will be described in detail by way of examples, but the present invention is not limited to the scope of the examples.
- Example 1 Preparation of a feed containing 5-ALA For feed culture of panama shrimp in Thailand so that the concentration of 5-ALA phosphate (C 5 H 9 NO 3 ⁇ H 3 PO 4 ) is 15 ppm.
- the powder was mixed well with the common commercial feed used in (1), and the powder feed and an equal amount of distilled water were added and mixed well.
- the resulting mixture was then filled into a 50 mL syringe and extruded to make a spaghetti-shaped shaped feed. It was dried at 60 to 65 ° C. for about 2 hours. After drying, the spaghetti-shaped molded feed was crushed into small pieces for easy administration. The pellets were stored in the refrigerator until use.
- Example 2 The effect of 5-ALA on the survival rate of breaded prawns attacked by Vibrio parahaemolyticus The breaded prawn with a weight of about 2 g was used. Twenty panama shrimps were put in a 100 L water tank per group and kept for 28 days. In the 5-ALA dose group, the feed prepared in Example 1 was administered, and in the control group, the same feed was administered except that no 5-ALA was contained. The feeding amount was 5% of the weight of the shrimp, and feeding was performed 4 times a day using an automatic feeder.
- pansy shrimp was transferred to a 15 L water tank containing seawater containing Vibrio parahaemolyticus in an amount of 3 ⁇ 10 5 cfu / ml, and infection treatment of Vibrio parahaemolyticus was performed on pansy shrimp.
- the survival rate of pansy was confirmed for two more weeks after the infection treatment.
- FIG. 1 “Control” represents a control group, and “ALA” represents a 5-ALA administration group.
- Example 3 Breeding conditions for panama shrimp used in the following test: 400 panama shrimp with an average weight of 0.84 ⁇ 0.33 grams are divided into the following four groups of 100 per group, and each group is housed in a separate water tank did. At the start of breeding, and at 2 weeks and 3 months after the start of breeding, various items shown below were measured.
- A 15 ppm 5-ALA administration group administered with a feed containing 15 ppm 5-ALA.
- B A 30 ppm 5-ALA administration group administered with a feed containing 30 ppm 5-ALA.
- C 60 ppm 5-ALA administration group administered with a feed containing 60 ppm 5-ALA.
- D A control group to which a feed containing no 5-ALA was administered.
- the daily feed to the pan-fried shrimp was 5% of the average weight of the pan-fried shrimp. Feeding was given to the pansy radish shrimp in four divided doses (8:00, 13:00, 18:00 and 23:00) per day. The weight of the pansy shrimp was monitored by weighing the whole panacea shrimp in each group weekly and adjusting the daily food intake based on the measured body weight. Food and excrement left over was removed once a day. Water quality parameters were also monitored during breeding.
- a feed containing 15 ppm of 5-ALA was prepared as follows. 150 mg of 1% 5-ALA powder (containing 5-ALA phosphate (C 5 H 9 NO 3 ⁇ H 3 PO 4 )) is dissolved in 100 ml of water, and the resulting solution is 100 grams of shrimp powder The feed was mixed well with the feed (which was used as a powdered commercial feed commonly used for the cultivation of pandora shrimp in Thailand) to obtain a feed mixture. The feed mixture was then pelletized using a masher. The pellet was dried at 60 to 65 ° C. for about 2 to 3 hours in an incubator to obtain a feed containing 15 ppm of 5-ALA. The feed was stored at 4 ° C. in a refrigerator until use.
- a diet containing 30 ppm 5-ALA and a diet containing 60 ppm 5-ALA contained 15 ppm 5-ALA, except that the amount of 1% 5-ALA powder added was 300 mg and 600 mg, respectively. It was manufactured in the same way as the method of manufacturing feed.
- the feed containing no 5-ALA used in the control group was manufactured in the same manner as the method for producing a feed containing 15 ppm of 5-ALA, except that 1% 5-ALA powder was not added.
- the initial weight is the weight at the start of breeding (day 0)
- the final weight is the weight at 3 months
- the weight gain is the final weight-the initial weight
- the values of initial weight, final weight, weight gain, and SGR in the table are mean ⁇ standard deviation (mean ⁇ SD).
- the descriptions of 15 ppm, 30 ppm and 60 ppm in the table respectively indicate a 15 ppm 5-ALA administration group, a 30 ppm 5-ALA administration group and a 60 ppm 5-ALA administration group.
- the frequency of molting of panama shrimp is measured during a three month feeding period, and the cumulative frequency of molting is shown in FIG.
- the descriptions of 15 ppm, 30 ppm, and 60 ppm in FIG. 2 indicate a 15 ppm 5-ALA administration group, a 30 ppm 5-ALA administration group, and a 60 ppm 5-ALA administration group, respectively.
- the cumulative frequency of molting of each group is represented, assuming that the cumulative frequency of molting at week 12 of the 30 ppm 5-ALA administration group at which the cumulative frequency of molting was the highest was 100%. As shown in FIG.
- the cumulative frequency of molting was highest in the 30 ppm 5-ALA administration group, followed by the 15 ppm 5-ALA administration group, with the lowest frequency of molting in the control group . Since shrimps molt with growth, it is surmised that the improvement of the cumulative frequency of molting by 30 ppm and 15 ppm 5-ALA administration also indicates growth promotion of pan-fried shrimp by administration of 5-ALA.
- Example 5 Effect of 5-ALA on ATP Level of Hepatopancreas
- the ATP level in the pancreat of Pandora shrimp was measured. This ATP level measurement was performed on 3 panama shrimps per group.
- Samples for measuring ATP concentration were prepared as follows. About 10 mg of hepatopancreas were collected from each pan-fried shrimp. The harvested hepatopancreas was washed with phosphate buffered saline (1 ⁇ PBS). The washed hepatopancreas is homogenized in 100 ⁇ l of ice cold 2N perchloric acid (PCA), the homogenate is kept on ice for 30 minutes, then centrifuged at 13000 ⁇ g, 4 ° C.
- PCA ice cold 2N perchloric acid
- Example 6 The 5-ALA were examined on against Vibrio due to parahaemolyticus EMS / AHPND infection test Vibrio parahaemolyticus vannamei shrimp survival rate was attacked by.
- a 10 L water tank containing seawater containing Vibrio parahaemolyticus at a volume of 3 ⁇ 10 6 cfu / ml (high dose) and a 10 L water tank containing seawater containing Vibrio parahaemolyticus at a volume of 3 ⁇ 10 5 cfu / ml (low dose) Were prepared for each group.
- FIGS. 4 and 5 show the results of processing the panama shrimp.
- the descriptions of 15 ppm, 30 ppm and 60 ppm in FIGS. 4 and 5 respectively represent a 15 ppm 5-ALA administration group, a 30 ppm 5-ALA administration group, and a 60 ppm 5-ALA administration group.
- 5-ALA is an effective preventive / therapeutic agent against EMS / AHPND, which is caused by Vibrio parahaemolyticus in organisms of the ordershrimp.
- Example 7 The effect of 5-ALA on the whole blood cell count in the infection treatment with Vibrio parahaemolyticus
- the pansy shrimps three months after the start of breeding were treated with Vibrio parahaemolyticus (high dose) in the same manner as in Example 6.
- 200 ⁇ l of hemolymph (hemolymph) is collected from the ventral sinus (ventral sine) of pandora shrimp in three groups in each group, and 800 ⁇ l Diluted with anticoagulant solution.
- the complete blood count in the hemolymph was determined using a C-chip hemacytometer (NanoEntek, Germany). The descriptions of 15 ppm, 30 ppm and 60 ppm in FIG.
- FIG. 6 respectively represent a 15 ppm 5-ALA administration group, a 30 ppm 5-ALA administration group and a 60 ppm 5-ALA administration group.
- the total blood cell count was increased in all groups before and after the infection treatment as compared to the control group.
- the 60 ppm 5-ALA administration group at 6 hours after infection showed statistically significantly higher total blood cell counts compared to the other groups.
- the significant difference test used t test method.
- blood cells such as granulocytes play an important role as immunocompetent cells in shrimp, so one of the causes of the preventive and therapeutic effects on EMS / AHPND by 5-ALA administration is There is a possibility that activation of the innate immune system is caused by the increase of whole blood count by 5-ALA.
- Example 8 Vibrio parahaemolyticus in infection treatment with, Vibrio a vannamei of 3 months from the effects start of feeding of the 5-ALA on gene expression of heme oxygenase-1 and phenoloxidase precursor in the same manner as in Example 6 Infection was treated with parahaemolyticus (high dose). Before the infection treatment (0 hour), 6 hours after the infection treatment, and 12 hours after the infection treatment, hepatopancreas is collected from the pandora shrimp in each group of 5 mice, and using the RNAiso Plus reagent (Takara Bio, Japan), Total RNA was extracted from the hepatopancreas of each pansy shrimp according to the instructions of the reagent manufacturer.
- CDNA was synthesized from 1 ⁇ g of total RNA extract using the High-Capacity Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, USA) according to the manufacturer's instructions for the kit. Synthesized cDNA was diluted 5-fold and used as a template for qPCR. The gene expression of heme oxygenase-1 (HO-1) and phenol oxidase precursor (proPO) was measured by subjecting this cDNA to real time polymerase chain reaction (PCR) using SYBR green fluorescent dye. This measurement was performed using Thunderbird (registered trademark) SYBR qPCR Mix (Toyobo, Japan). Amplification reactions were performed using MicroAmp Optical 96-well reaction plates (Applied Biosystems, USA).
- HO-1 heme oxygenase-1
- proPO phenol oxidase precursor
- Each well contained 10 ⁇ l qPCR Mix, 0.6 ⁇ l each primer, 0.4 ⁇ l ROX reference dye, and 2 ⁇ l cDNA template.
- the cycle conditions were as follows. 1 minute at 95 ° C, then 40 cycles of 15 seconds at 90 ° C and 60 seconds at 60 ° C. At the end of each qPCR reaction, a dissociation analysis was performed to confirm that it was the detection of only one product. Using the 2- ⁇ Ct method (Livak and Schmittgen, 2001), relative changes in gene expression data by qPCR were determined. For the calculation of the Ct value (cycle threshold: Threshold Cycle), gene expression of EF1 ⁇ was measured as an internal standard. Normalized ratios were calculated using the relative expression of the control group.
- a forward primer with sequence 5 (5'-ATTGCCACACCGCTCACA-3 ') and a reverse primer with sequence 6 (5'-TCGATCTTGGTCAGCAGTTCA-3') were used.
- the results are presented in FIGS. 7-8.
- the mean value of the gene expression of the control group at each time point is taken as 0, and the gene expression of each group is a value relative to this mean value. Error bars in FIGS. 7-8 are standard deviations.
- the descriptions of 15 ppm, 30 ppm, and 60 ppm in FIGS. 7-8 represent the 15 ppm 5-ALA administration group, the 30 ppm 5-ALA administration group, and the 60 ppm 5-ALA administration group, respectively.
- Heme oxygenase-1 which is one of the heme proteins, is an enzyme involved in heme metabolism and is known to be a cytoprotective protein that protects cells from damage caused by oxidative stress.
- the phenol oxidase precursor recognizes the cell wall components of fungi and bacteria, and may be involved in the mechanism of linking the recognition result to the ligand formation of toll receptor.
- one of the causes of the preventive and therapeutic effects on EMS / AHPND by 5-ALA administration is the increase in gene expression of heme oxygenase-1 and phenol oxidase precursor by 5-ALA. There is a possibility that there is.
- Example 9 Effects of 5-ALA on Gene Expression of Nuclear Receptor E75 and Nitric Oxide Synthase
- hepatopancreas were collected from 3-4 pan-fried shrimps in each group, and each pan-fried shrimps
- the total RNA was extracted from the liver and pancreas of and the cDNA was synthesized from the total RNA.
- the gene expression of nuclear receptor gene E75 and nitric oxide synthase was measured by subjecting this cDNA to real time polymerase chain reaction (PCR) using SYBR green fluorescent dye.
- PCR real time polymerase chain reaction
- Ct values gene expression of EF1 ⁇ was measured as an internal standard.
- a forward primer with sequence 7 (5'-GCCTACAACAAAGCCCCATAA-3 ') and a reverse primer with sequence 8 (5'-GCCAGAGAGGAAGTCTGGTG-3') were used.
- the apparatus, conditions, etc. used for the measurement were the same as in Example 8.
- the results are presented in FIGS.
- the average value of gene expression of the control group is 0, and the gene expression of each group is a value relative to this average value.
- the error bars in FIGS. 9-10 are standard deviations.
- the descriptions of 15 ppm, 30 ppm, and 60 ppm in FIGS. 9 and 10 represent the 15 ppm 5-ALA administration group, the 30 ppm 5-ALA administration group, and the 60 ppm 5-ALA administration group, respectively.
- nuclear receptor E75 a protein required for ecdysone synthesis, contains heme as a prosthetic group, functions as a sensor for intracellular heme concentration, and senses nitric oxide as an intracellular signaling molecule It is known that there is a possibility.
- Nitric oxide synthase is known to be a heme protein, which is involved in the synthesis of nitric oxide necessary for the generation of peroxynitrite having strong antibacterial activity in bacterial infection and the like. Since E75 requires heme to stabilize its structure, it also serves as a sensor for heme concentration, and nitric oxide synthase itself is a heme protein, and by examining their expression, administration of 5-ALA is a shrimp. It may be an indicator to confirm that it is related to heme synthesis in the body.
- PCR real time polymerase chain reaction
- a forward primer with sequence 9 (5'-GGAAGACCCACGTCTGGAAG-3 ') and a reverse primer with sequence 10 (5'-TCGAGCGATCTCCTCTGAAGC-3') were used.
- the apparatus, conditions, etc. used for the measurement were the same as in Example 8. The results are presented in FIGS.
- the average value of gene expression of the control group is 0, and the gene expression of each group is a value relative to this average value.
- Error bars in FIGS. 11-12 are standard deviations.
- the descriptions of 15 ppm, 30 ppm and 60 ppm in FIGS. 11 to 12 respectively represent a 15 ppm 5-ALA administration group, a 30 ppm 5-ALA administration group, and a 60 ppm 5-ALA administration group.
- C-type lectins may induce the most important nodule response to the initial immune response. While not being bound by theory, C-type lectins play an important role in the nodule formation reaction, which is a response that allows granule cells to take up bacteria and further inhibit the spread of bacteria, which contributes to the effectiveness of EMS.
- Nitric oxide synthase is an enzyme involved in the synthesis of nitric oxide, which is a heme protein, and administration of 5-ALA promotes its synthesis.
- 5-ALA or an ester thereof or shrimp eyes for oral dosage composition containing at least one selected from the salts thereof, of the present invention can be used reared shrimp th organisms in aquaculture, Vibrio It is possible to effectively prevent and treat EMS / AHPND caused by parahaemolyticus .
- the composition for oral administration for Ebiphora containing at least one selected from 5-ALA of the present invention or an ester thereof, or a salt thereof can promote the growth of Eribaceous organisms at a predetermined dose. It is.
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Abstract
５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）を含むエビ目用経口投与組成物およびエビ目に５－アミノレブリン酸を摂取させることを含む方法。本エビ目用経口投与組成物は、エビ目の飼育、養殖に使用されることが可能であり、<u>Vibrio</u> <u>parahaemolyticus</u>を原因菌とする、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ（早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病）を有効に予防および治療することが可能である。また、本エビ目用経口投与組成物を所定の量で投与することにより、エビ目の成長を促進させることが可能である。
Description
本発明は、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物、飼料および飼料用添加剤に関し、より詳細には、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）の予防・治療用経口投与組成物に関する。また、本発明は５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む方法に関し、より詳細には、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）を予防・治療する方法に関する。
世界のエビの生産量は、平成４（１９９２）年の３０１万トンから平成２４（２０１２）年の７６８万トンへと急増している。このうち養殖による生産量の割合をみると、平成４（１９９２）年の３０％から平成２４（２０１２）年は生産量の過半数を超えて５６％になるなど、近年のエビの養殖の発展には目を見張るものがある（非特許文献１）。エビの養殖においては、天然の環境とは異なり、一般的に高密度で飼育され、過剰なストレスがかかるなどの理由から、エビの養殖場において様々な病気の発生が認められてきた。養殖水産動植物の生存率は養殖経営に大きく影響するため、養殖業においては病気への適切な対応が求められている。
近年、稚エビに発生し、死亡率がほぼ１００％となるＥＭＳ（Early Mortality Syndrome：早期死亡症候群）と呼ばれるエビの疾病により、一部の国においてエビ養殖業は危機的な状況に直面している。この疾病は２００９年に中国で最初に報告され、次いでベトナム、タイ、マレーシア等の東南アジアにも広がってきており、２０１３年にはメキシコでの発生が報告されている。ＥＭＳにおいては、エビの肝膵臓に変色等の症状が現れ、壊死してしまうので、この早期死亡症候群は、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ（Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease：急性肝膵臓壊死病）とも呼ばれている。そして、このＥＭＳ／ＡＨＰＮＤは特殊なタイプの腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）の感染によるものであることも知られている（非特許文献２）。
エビにおけるビブリオ感染に対してワクチンを使用するという方法が開発されている（特許文献１）。しかし、この特許文献１には、対象菌として腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）が示唆されているものの、具体的に腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）に対するワクチンを製造したことは開示されておらず、ましてやこのワクチン療法がＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療するのに有効であるかは全く不明である。さらに、特殊なワクチンよりも安価かつ簡単に入手できる物質によってＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療する方法があれば、その方が望ましいのは明らかである。また、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの予防・治療以外にもエビの養殖において有利な効果をもたらすような物質があればさらに望ましい。
５－ＡＬＡは、細胞のミトコンドリアに存在し、動物においてはミトコンドリアで生合成され、鉄分と結びついてヘムやシトクロムの原料となるなど代謝に必須の成分であり、植物においては、葉緑体で生合成され、マグネシウムと結びついてクロロフィルとなり光合成に必須の成分であることが知られている。そして、特許文献２には５－ＡＬＡリン酸塩の製造方法が開示されており、さらに５－ＡＬＡ塩酸塩の合成方法がすでに知られていたことも記載されている。また、微生物による５－ＡＬＡの製造方法も知られている（特許文献３）。
特許文献４には、５－ＡＬＡを有効成分として含有する魚類病原性微生物の感染予防および治療用組成物が記載されており、さらに前記魚類病原性微生物として、エドワードジエラタルダ細菌（Edwardsiella tarda）、ストレプトコッカス属細菌（Streptococcus sp.）スタフィロコッカス属細菌（Staphylococcus sp.）、スタフィロコッカスエピデルミディス細菌(Staphilococcus epidermidis)、シュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）、またはビブリオアングイラルム細菌（Vibrio anguillarum）が記載されている。しかし、特許文献４においては、エビ目の生物に対する５－ＡＬＡの影響については何ら検討されていない。さらに、特許文献４に記載されているビブリオアングイラルム（Vibrio anguillarum）はエビ目のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの原因菌である腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）とは異なるため、エビ目の生物においてＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを生じさせない。よって、特許文献４の記載からは、エビ目の生物における５－ＡＬＡによるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ予防・治療効果は何ら予想できない。また、５－ＡＬＡがエビ目の生物の成長を促進させることは知られていない。
平成２５年度水産白書、（６）世界の養殖業の生産状況
Mohammad Jalil Zorriehzahra, Reza Banaederakhshan; Early Mortality Syndrome (EMS) as new Emerging Threat in Shrimp Industry; Advances in Animal and Veterinary Sciences, March 2015, Volume 3, Special issue 2, Pages 64-72
従って、クルマエビ科をはじめとするエビ目の生物の飼育、養殖において有用な、特に、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療できるエビ目用経口投与組成物の開発が長年の間強く求められていた。また、エビ目の生物のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療できるだけでなく、その成長を促進させることもできるエビ目用経口投与組成物の開発も求められていた。しかし、このようなエビ目用経口投与組成物は実現されていなかった。
本発明者らは、上記問題点を解決できるようなエビ目用経口投与組成物について鋭意検討を行ったところ、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一種を含む組成物が極めて有用であることを見いだし、これに基づいて本発明を完成するに至った。
本発明者らは、上記問題点を解決できるようなエビ目用経口投与組成物について鋭意検討を行ったところ、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも一種を含む組成物が極めて有用であることを見いだし、これに基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物。
［２］５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）の予防・治療用経口投与組成物。
［３］エビ目がクルマエビ科である前記［１］または［２］に記載の組成物。
［４］組成物が飼料または飼料用添加剤である前記［１］～［３］のいずれか１つに記載の組成物。
［５］５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む方法。
［６］５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）を予防・治療する方法。
［７］エビ目がクルマエビ科である前記［５］または［６］に記載の方法。
［８］５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を、５－ＡＬＡリン酸塩換算でエビ目の生物の体重１ｇあたりかつ一日あたりで、０．２５μｇ／ｇ・日～２．５μｇ／ｇ・日の量で、エビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目の生物の成長を促進させる方法。
［１］５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物。
［２］５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）の予防・治療用経口投与組成物。
［３］エビ目がクルマエビ科である前記［１］または［２］に記載の組成物。
［４］組成物が飼料または飼料用添加剤である前記［１］～［３］のいずれか１つに記載の組成物。
［５］５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む方法。
［６］５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）を予防・治療する方法。
［７］エビ目がクルマエビ科である前記［５］または［６］に記載の方法。
［８］５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を、５－ＡＬＡリン酸塩換算でエビ目の生物の体重１ｇあたりかつ一日あたりで、０．２５μｇ／ｇ・日～２．５μｇ／ｇ・日の量で、エビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目の生物の成長を促進させる方法。
本発明の５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物は、エビ目の生物の飼育、養殖において、エビ目ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療できるという効果をもたらしうる。その結果、従来であれば死亡率がほぼ１００％となるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防・治療でき、エビ目の生物の飼育、養殖における経済的な寄与をもたらしうる。また、本発明のエビ目用経口投与組成物は、所定の投与量でエビ目の生物に投与した場合に、成長を促進させるという有利な効果をもたらす。この有利な効果は、従来知られていなかった効果であって、かつエビ目の生物の飼育、養殖の技術分野の当業者が予期していなかった効果である。
本発明の一実施態様は、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物である。
本発明において、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）はδ－アミノレブリン酸とも称される化合物である。本発明において、「５－ＡＬＡ若しくはそのエステル」とは、「５－ＡＬＡ若しくは５－ＡＬＡエステル」であり、下記式（Ｉ）で表されうる。本発明において、「５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩」の記載における「それらの塩」とは、５－ＡＬＡの塩、若しくは５－ＡＬＡエステルの塩をいう。この塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、メチルリン酸、エチルリン酸、亜リン酸塩、次亜リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩、及びナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩等が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明において、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）はδ－アミノレブリン酸とも称される化合物である。本発明において、「５－ＡＬＡ若しくはそのエステル」とは、「５－ＡＬＡ若しくは５－ＡＬＡエステル」であり、下記式（Ｉ）で表されうる。本発明において、「５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩」の記載における「それらの塩」とは、５－ＡＬＡの塩、若しくは５－ＡＬＡエステルの塩をいう。この塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、メチルリン酸、エチルリン酸、亜リン酸塩、次亜リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩、及びナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩等が挙げられるがこれらに限定されない。
前記式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である。Ｒ１が水素の場合には前記式（Ｉ）は５－ＡＬＡを表す。Ｒ１が直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である場合には、前記式（Ｉ）は５－ＡＬＡエステルを表す。
Ｒ１において示される直鎖若しくは分岐状のアルキル基は、好ましくは、炭素数が１～１８のアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、２－メチルブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基、３－メチルペンチル基、エチルブチル基、ｎ－ヘプチル基、２－メチルヘキシル基、ｎ－オクチル基、イソオクチル基、ｔｅｒｔ－オクチル基、２－エチルヘキシル基、３－メチルヘプチル基、ｎ－ノニル基、イソノニル基、１－メチルオクチル基、エチルヘプチル基、ｎ－デシル基、１－メチルノニル基、ｎ－ウンデシル基、１，１－ジメチルノニル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－トリデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基等が挙げられる。シクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基などが挙げられるだけでなく、アルキル置換基を有するシクロアルキル基、例えば、炭素数１～６のアルキル置換基を有するシクロアルキル基、例えば、３－メチルシクロヘキシル基、４－メチルシクロヘキシル基、４－エチルシクロヘキシル基、２－メチルシクロオクチル基等も挙げられる。直鎖若しくは分岐状のアルキル基としては、炭素数１～１６のアルキル基がより好ましく、メチル基、エチル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ヘキサデシル基又は２－エチルヘキシル基が特に好ましい。
Ｒ１において示されるアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。当該アリール基は、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロヘキシル基等の炭素数１～６のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基等の炭素数１～６のアルコキシ基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子、カルボキシ基等の置換基１～３個によって置換されていてもよい。
Ｒ１において示されるアラルキル基としては、炭素数１～６のアルキル基と炭素数６～２０のアリール基とから構成されるものが好ましい。炭素数１～６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロヘキシル基等が挙げられ、炭素数６～２０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。アラルキル基のうち、ベンジル基又はフェネチル基が好ましく、ベンジル基が特に好ましい。当該アラルキル基のアリール基は、上記記載の炭素数１～６のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基等の炭素数１～６のアルコキシ基、水酸基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子、カルボキシ基等の置換基１～３個によって置換されていてもよい。
本発明においては、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種が有効成分として使用されればよく、この有効成分は一種だけの使用であってもよいし、またはこの有効成分は複数種類の組み合わせの形態であってもよい。例えば、本発明において使用される有効成分は、５－ＡＬＡ、５－ＡＬＡエステル、５－ＡＬＡ塩、または５－ＡＬＡエステルの塩のいずれであってもよい。また、例えば、５－ＡＬＡと５－ＡＬＡエステルの塩の組み合わせなどであってもよい。本発明において使用される５－ＡＬＡ若しくはエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種は精製された状態のものであっても良いし、粗精製された状態のもの、または合成されて得られた混合物の状態のものであっても良い。本発明においては５－ＡＬＡ塩が有効成分として使用されるのが好ましく、より好ましくは５－ＡＬＡ塩酸塩および／または５－ＡＬＡリン酸塩が有効成分として使用される。
本発明において「エビ目」とは、十脚目（Decapoda）とも称される、甲殻類の分類群の一つであり、エビ・カニ・ヤドカリを含む生物群である。本発明の対象としては、好ましくはエビ目の生物はエビであり、より好ましくは、根鰓亜目（Dendrobranchiata）とも称されるクルマエビ亜目の生物である。より好ましくは、本発明の対象となるエビ目の生物は、クルマエビ亜目のクルマエビ科（Penaeidae）に属する生物である。さらにより好ましくは、本発明の対象となるエビ目の生物は、クルマエビ科のバナメイエビ（Litopenaeus vannamei）、クルマエビ（Marsupenaeus japonicus）、ウシエビ（ブラックタイガー）（Penaeus monodon）、コウライエビ（タイショウエビ）（Fenneropenaeus chinensis）、フトミゾエビ（Melicertus latisulcatus）、ヨシエビ （Metapenaeus ensis）、アカエビ（Metapenaeopsis barbata）、クマエビ（Penaeus semisulcatus）などが挙げられるがこれらに限定されない。また、さらにより好ましくは、本発明の対象となるエビ目の生物はバナメイエビである。また、エビ目ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤが稚エビに発生するという観点から、好ましくは、本発明の対象となるエビ目の生物は稚エビであり、さらにより好ましくは本発明の対象となるエビ目の生物はクルマエビ科の稚エビである。
本発明において、エビ目用経口投与組成物はエビ目の生物に経口投与される組成物であれば特に限定されない。例えば、有効成分である５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を水などの媒体に溶解してエビ目の生物が飼育されている環境に投与するような形態の組成物であってもよい。この場合、投与された環境中の有効成分がエビ目の生物に経口的に摂取されることにより、その効果がもたらされる。
５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をより効率的にエビ目の生物に摂取させるという観点から、本発明の経口投与組成物は、好ましくは、エビ目用飼料もしくはエビ目用飼料添加剤である。エビ目用飼料は通常エビ目の生物の飼育、養殖に使用される成分であれば任意の成分を含んでいて良く、任意の製造方法において製造されたものであっても良い。本発明の飼料においては、従来のエビ用飼料の原材料とほぼ同じものを用いることができ、例えば、一般のエビ用飼料に用いられるイカミール、オキアミミール、ホワイトミール、大豆油かす、コーングルテンミールなどのタンパク質源、グルテン、デンプンなどのバインダー類、その他ビタミン混合物，ミネラル混合物，微量金属を含有するものであっても良いが、これに限定されない。また、本発明のエビ目用飼料は、飼育されるエビ目の生物の種類および大きさなどに応じて任意の形状、大きさであってよい。また、本発明のエビ目用飼料は種々の形態に製造することができる。例えば、本発明のエビ目用飼料は、乾燥原料を混合、粉砕した粉末状飼料、粉体を固形化した固形化飼料、例えばドライペレット、または水分を含んだ固形化飼料、例えば、ペースト状の飼料、もしくはモイストペレットなどであってもよい。例えば、一般の粉末のエビ養殖用飼料と５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種の有効成分とを、任意に混合用の媒体、例えば、水などと共に混合し、この混合物を成形し、例えば、この混合物を５０ｍＬのシリンジから押し出し成形して、成形物を乾燥させ、例えば、６０～６５℃で２時間程度乾燥させることにより、本発明の５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用飼料が形成されうる。飼料の形、乾燥の程度などは、投与に不都合がない限りは、特に限定されるものではない。この有効成分の効果をエビ目の生物内で充分に発揮させるという観点から、飼料中に含まれる有効成分（すなわち、飼料中に含まれうる５－ＡＬＡ、５－ＡＬＡエステル、５－ＡＬＡの塩、および５－ＡＬＡエステルの塩）の合計量が５－ＡＬＡリン酸塩換算で、望ましくは１～１００ｐｐｍ、より望ましくは２～５０ｐｐｍ、更に望ましくは３～２０ｐｐｍである。特に、エビ目の生体の成長を促進させるとの観点からは、飼料中に含まれる有効成分の合計量は５－ＡＬＡリン酸塩換算で、望ましくは５～５０ｐｐｍ、より望ましくは１０～４０ｐｐｍ、更により望ましくは１５～３０ｐｐｍである。
また、エビ目用経口投与組成物はエビ目用飼料添加剤であってよい。ここでの飼料添加剤とは、通常のエビ目用の飼料に添加できる添加剤であればよく、特に限定されるものではない。例えば、本発明における飼料添加剤は、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種と、この有効成分をエビ目用飼料に付着させることができる展着剤などを含むものであってよいし、この有効成分をエビ目用飼料に吸収させるような媒体を含むものであってもよいし、またはこの有効成分をエビ目用飼料の原料に混合しやすくするような媒体を含むものであってもよい。本発明の飼料添加剤は、飼料中に含まれる有効成分の合計量が上述の範囲となるように飼料に添加されるのが好ましい。
本発明の別の実施態様は、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む方法である。ここでの摂取とは経口的な摂取である。有効成分である５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることができるのであればその方法は特に限定されない。例えば、エビ目の生物を飼育している環境下に５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を添加して、当該有効成分をエビ目に摂取させる方法がある。しかし、より効率的に有効成分である５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目に摂取させるという観点から、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩からから選択される少なくとも一種を含む飼料をエビ目の生物に摂取させるのが好ましい。
本発明の別の実施態様は、所定の量の５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目の生物の成長を促進させる方法である。この実施態様においては、エビ目の生物に摂取させる、有効成分である５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種の合計量は、好ましくは、５－ＡＬＡリン酸塩換算でエビ目の生物の体重１ｇあたりかつ一日あたりで、０．２５μｇ／ｇ・日～２．５μｇ／ｇ・日であり、より好ましくは０．５μｇ／ｇ・日～２．０μｇ／ｇ・日であり、更により好ましくは０．７５～１．５μｇ／ｇ・日である。理論に拘束されるものではないが、本発明のこの実施態様におけるエビ目の生物の成長促進のメカニズムの１つとしては、エビ目の生物の生体内において、摂取した餌からエネルギーを取り出す効率を５－ＡＬＡが高めていることが考えられる。
本発明の別の実施態様は５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）の予防・治療用経口投与組成物である。また、本発明のさらに別の実施態様は、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）を予防・治療する方法である。本発明における「エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）」の「予防・治療」とは、エビ目の生物の養殖において重大な問題となっている、Vibrio parahaemolyticusを原因菌とする、早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）と呼ばれるエビの疾病の予防および／または治療をいう。ここで、予防とは、５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種の投与下で、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの発症を抑制すること、すなわち発症を完全に抑制するかまたは発症率を低下させることをいう。また、治療とは、Vibrio parahaemolyticusに感染したか、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを発症したエビ目の生物の当該感染およびＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを治癒させることをいう。本発明のこの実施形態は、有効成分である５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種が、このエビ目のＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを予防および／又は治療できるという有利な効果を奏するものである。この効果は、実施例において、原因菌の攻撃後の死亡率の低減という形で明確に示されている。有効成分である５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種によりもたらされるこの有利な効果は従来知られていなかった効果であって、エビ目の飼育、養殖の技術分野の当業者が予期していなかった効果である。エビ目ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの予防・治療においては、エビ目の生物に摂取させる、有効成分である５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種の合計量は、５－ＡＬＡリン酸塩換算でエビ目の生物の体重１ｇあたりかつ一日あたりで、好ましくは０．０５μｇ／ｇ・日～５μｇ／ｇ・日であり、より好ましくは０．１μｇ／ｇ・日～２．５μｇ／ｇ・日であり、更により好ましくは０．１５～１μｇ／ｇ・日である。
本発明が適用されるエビ目の生物が飼育、養殖されている環境は特に限定されず、東南アジア等で大規模に行われている池での養殖にも本発明は適用可能であるし、また水槽などでの小規模での飼育においても本発明は適用可能である。
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
実施例１：５－ＡＬＡを含む飼料の作成
５－ＡＬＡリン酸塩（Ｃ５Ｈ９ＮＯ３・Ｈ３ＰＯ４）が濃度１５ｐｐｍとなるように、粉末飼料（タイ国でバナメイエビの養殖のために使用されている一般的な市販餌を粉末化して使用した）と良く混合し、粉末飼料と等量の蒸留水を添加し良く混合した。次いで、得られた混合物を５０ｍＬのシリンジに詰め、押し出すことによりスパゲッティー状の成型飼料を作成した。これを６０～６５℃で２時間程度乾燥した。乾燥後、投与しやすいようにスパゲッティー状の成型飼料小さく粉砕してペレット状にした。このペレットは使用まで冷蔵庫で保管した。
５－ＡＬＡリン酸塩（Ｃ５Ｈ９ＮＯ３・Ｈ３ＰＯ４）が濃度１５ｐｐｍとなるように、粉末飼料（タイ国でバナメイエビの養殖のために使用されている一般的な市販餌を粉末化して使用した）と良く混合し、粉末飼料と等量の蒸留水を添加し良く混合した。次いで、得られた混合物を５０ｍＬのシリンジに詰め、押し出すことによりスパゲッティー状の成型飼料を作成した。これを６０～６５℃で２時間程度乾燥した。乾燥後、投与しやすいようにスパゲッティー状の成型飼料小さく粉砕してペレット状にした。このペレットは使用まで冷蔵庫で保管した。
実施例２：Vibrio parahaemolyticusによる攻撃を受けたバナメイエビの生存率に対して５－ＡＬＡが及ぼす影響
体重約２ｇのバナメイエビを使用した。一群あたり２０匹のバナメイエビを１００Ｌの水槽に入れ、２８日間飼育を行った。５－ＡＬＡ投薬群においては実施例１で作成した飼料を投与し、対照群においては５－ＡＬＡを含まない以外は同じ飼料を投与した。給餌量はエビの体重の５％とし、給餌は１日に４回で、自動給餌器を使用して行った。
試験開始から２週間目に、バナメイエビをVibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量で含む海水を入れた１５Ｌ水槽に移し、バナメイエビに対するVibrio parahaemolyticusの感染処理を行った。感染処理からさらに２週間にわたってバナメイエビの生存率を確認した。結果を図１に示す。図１においては、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」が対照群を表し、「ＡＬＡ」が５－ＡＬＡ投薬群を表す。
体重約２ｇのバナメイエビを使用した。一群あたり２０匹のバナメイエビを１００Ｌの水槽に入れ、２８日間飼育を行った。５－ＡＬＡ投薬群においては実施例１で作成した飼料を投与し、対照群においては５－ＡＬＡを含まない以外は同じ飼料を投与した。給餌量はエビの体重の５％とし、給餌は１日に４回で、自動給餌器を使用して行った。
試験開始から２週間目に、バナメイエビをVibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量で含む海水を入れた１５Ｌ水槽に移し、バナメイエビに対するVibrio parahaemolyticusの感染処理を行った。感染処理からさらに２週間にわたってバナメイエビの生存率を確認した。結果を図１に示す。図１においては、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」が対照群を表し、「ＡＬＡ」が５－ＡＬＡ投薬群を表す。
図１に示されるように、５－ＡＬＡを投与していない対照群においては感染後７日目から生存率の顕著な低下を示し、感染後１３日目には全てのバナメイエビが死亡した。一方、５－ＡＬＡをあらかじめ投与していた投薬群においては、観察期間中、わずか１匹が死亡しただけであり、対照群に対して有意な生存率（ｐ値＜０．０００１）を示した。よって、５－ＡＬＡはエビ目の生物において、Vibrio parahaemolyticusを原因菌とする、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対して有効な予防・治療薬であることが明らかとなった。なお、実際のエビ養殖場でＥＭＳ／ＡＨＰＮＤが発生すると、ほぼ１００％のエビが死亡するので、実施例２の実験条件は実際のエビ養殖場でのＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ発生をシミュレートするものであると考えられる。よって、５－ＡＬＡは実際のエビ養殖場でのＥＭＳ／ＡＨＰＮＤの予防・治療に有効であると推察される。
実施例３：以下の試験で使用されたバナメイエビの飼育条件
平均体重０．８４±０．３３グラムのバナメイエビ４００匹を、１００匹ずつ以下の４群に分け、各群ごとに別の水槽で飼育した。飼育開始時、飼育開始から２週目および３ヶ月目に、以下に示される様々な項目を測定した。
（ａ）１５ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料を投与した、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群。
（ｂ）３０ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料を投与した、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群。
（ｃ）６０ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料を投与した、６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群。
（ｄ）５－ＡＬＡを含まない飼料を投与した対照群。
バナメイエビへの一日あたりの給餌量はバナメイエビの平均体重の５％とした。一日あたりの給餌量を４回（８：００、１３：００、１８：００および２３：００）に分けて、バナメイエビに飼料が与えられた。一週間ごとに、各群のバナメイエビ全体の重量を測定することにより、バナメイエビの体重をモニターし、測定した体重に基づいて一日当たりの給餌量を調節した。食べ残した飼料および排泄物は一日一回取り除かれた。飼育中は水質パラメータもモニターされた。
平均体重０．８４±０．３３グラムのバナメイエビ４００匹を、１００匹ずつ以下の４群に分け、各群ごとに別の水槽で飼育した。飼育開始時、飼育開始から２週目および３ヶ月目に、以下に示される様々な項目を測定した。
（ａ）１５ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料を投与した、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群。
（ｂ）３０ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料を投与した、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群。
（ｃ）６０ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料を投与した、６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群。
（ｄ）５－ＡＬＡを含まない飼料を投与した対照群。
バナメイエビへの一日あたりの給餌量はバナメイエビの平均体重の５％とした。一日あたりの給餌量を４回（８：００、１３：００、１８：００および２３：００）に分けて、バナメイエビに飼料が与えられた。一週間ごとに、各群のバナメイエビ全体の重量を測定することにより、バナメイエビの体重をモニターし、測定した体重に基づいて一日当たりの給餌量を調節した。食べ残した飼料および排泄物は一日一回取り除かれた。飼育中は水質パラメータもモニターされた。
１５ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料は以下のように作成された。１５０ｍｇの１％５－ＡＬＡ粉体（５－ＡＬＡリン酸塩（Ｃ５Ｈ９ＮＯ３・Ｈ３ＰＯ４）含有）を１００ｍｌの水に溶解し、得られた溶液が１００グラムのエビ用粉末飼料（タイ国でバナメイエビの養殖のために使用されている一般的な市販餌を粉末化して使用した）と良く混合され、飼料混合物を得た。次いで、マッシャーを用いて、飼料混合物がペレットにされた。このペレットをインキュベータ内で６０～６５℃で２～３時間程度乾燥させて、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料を得た。この飼料は使用まで冷蔵庫内で４℃で保管した。３０ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料は、添加された１％５－ＡＬＡ粉体の量がそれぞれ３００ｍｇおよび６００ｍｇであったこと以外は、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料の製造方法と同じ方法で製造された。対照群に使用された５－ＡＬＡを含まない飼料は、１％５－ＡＬＡ粉体が添加されなかったこと以外は、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料の製造方法と同じ方法で製造された。
実施例４：バナメイエビの成長に対する５－ＡＬＡの影響
実施例３に記載された条件下でのバナメイエビの飼育において、３ヶ月の飼育期間での体重増加を測定することにより、５－ＡＬＡによるバナメイエビの成長に及ぼす影響を検討した。飼育開始時および飼育開始から３ヶ月目に、各群のバナメイエビの個々の体重が測定された。結果が以下の表１に示される。表中、当初体重は飼育開始時（０日目）の体重であり、最終体重は３ヶ月目の体重であり、体重増加は最終体重－当初体重であり、ＳＧＲは瞬間成長率（Specific Growth Rate）（％）であって、ＳＧＲ＝［（ｌｎ最終重量－ｌｎ当初重量）／給餌日数］×１００の式から算出したものであり、ＦＣＲは飼料要求率（Feed Conversion Rate）であって、ＦＣＲ＝飼料消費／体重増加である。表中の当初体重、最終体重、体重増加、およびＳＧＲの数値は平均±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）である。表中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
実施例３に記載された条件下でのバナメイエビの飼育において、３ヶ月の飼育期間での体重増加を測定することにより、５－ＡＬＡによるバナメイエビの成長に及ぼす影響を検討した。飼育開始時および飼育開始から３ヶ月目に、各群のバナメイエビの個々の体重が測定された。結果が以下の表１に示される。表中、当初体重は飼育開始時（０日目）の体重であり、最終体重は３ヶ月目の体重であり、体重増加は最終体重－当初体重であり、ＳＧＲは瞬間成長率（Specific Growth Rate）（％）であって、ＳＧＲ＝［（ｌｎ最終重量－ｌｎ当初重量）／給餌日数］×１００の式から算出したものであり、ＦＣＲは飼料要求率（Feed Conversion Rate）であって、ＦＣＲ＝飼料消費／体重増加である。表中の当初体重、最終体重、体重増加、およびＳＧＲの数値は平均±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）である。表中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
表１に示されるように、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群および３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して体重増加および瞬間成長率（ＳＧＲ）が大きかった。このことから、バナメイエビへの１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与および３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与はバナメイエビの成長を促進させることが明らかとなった。また、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群および３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して飼料要求率（ＦＣＲ）が若干低下していた。このことから、理論に拘束されるものではないが、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群および３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群における５－ＡＬＡによるバナメイエビの成長促進の原因の１つが、バナメイエビ生体内での５－ＡＬＡによる飼料からのエネルギー取り出し効率の向上である可能性が推察される。
また、３ヶ月間の飼育期間中のバナメイエビの脱皮の頻度が測定され、その脱皮の累積的頻度が図２に示される。図２中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。図２においては、脱皮の累積的頻度が最も高かった３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群の１２週目における脱皮の累積的頻度を１００％として各群の脱皮の累積的頻度を表している。図２に示されるように、脱皮の累積的頻度は３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群において最も高く、次いで１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群であり、脱皮の頻度が最も低かったのは対照群であった。エビは成長に伴って脱皮するので、３０ｐｐｍおよび１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与による脱皮の累積的頻度の向上も、５－ＡＬＡ投与によるバナメイエビの成長促進を示していると推察される。
実施例５：肝膵臓のＡＴＰレベルに対する５－ＡＬＡの影響
飼育開始から２週間目に、バナメイエビの肝膵臓におけるＡＴＰレベルを測定した。このＡＴＰレベルの測定は、一群あたり３匹のバナメイエビについて行われた。ＡＴＰ濃度測定用サンプルは以下のように調製された。それぞれのバナメイエビから約１０ｍｇの肝膵臓が採取された。採取した肝膵臓がリン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）で洗浄された。洗浄された肝膵臓は氷冷した２Ｎの過塩素酸（ＰＣＡ）１００μｌ中でホモジナイズされ、ホモジネートが氷上に３０分間保持され、次いで１３０００×ｇ、４℃で、２分間遠心分離されて、上清を得た。この上清がＡＴＰアッセイバッファーで５００μｌに希釈された。次いで、希釈された上清に５０～１００μｌの氷冷ＫＯＨ（２Ｍ）が添加されて、過剰なＰＣＡを沈殿させた。必要に応じて、この上清に０．１ＭのＫＯＨまたはＰＣＡが添加されて、ｐＨが調整された。得られたサンプルは、次いで、１３０００×ｇで１５分間遠心分離され、上清が回収され、ＡＴＰ濃度測定用サンプルとして使用された。ＡＴＰ濃度測定には、ＡＴＰ比色分析キット（カタログ番号：ａｂ８３３５５：アブカム（Abcam）（登録商標）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）が使用された。ＡＴＰ濃度の測定は、当該キットの製造者の指示に従って行われた。結果が図３に示される。図３中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
飼育開始から２週間目に、バナメイエビの肝膵臓におけるＡＴＰレベルを測定した。このＡＴＰレベルの測定は、一群あたり３匹のバナメイエビについて行われた。ＡＴＰ濃度測定用サンプルは以下のように調製された。それぞれのバナメイエビから約１０ｍｇの肝膵臓が採取された。採取した肝膵臓がリン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）で洗浄された。洗浄された肝膵臓は氷冷した２Ｎの過塩素酸（ＰＣＡ）１００μｌ中でホモジナイズされ、ホモジネートが氷上に３０分間保持され、次いで１３０００×ｇ、４℃で、２分間遠心分離されて、上清を得た。この上清がＡＴＰアッセイバッファーで５００μｌに希釈された。次いで、希釈された上清に５０～１００μｌの氷冷ＫＯＨ（２Ｍ）が添加されて、過剰なＰＣＡを沈殿させた。必要に応じて、この上清に０．１ＭのＫＯＨまたはＰＣＡが添加されて、ｐＨが調整された。得られたサンプルは、次いで、１３０００×ｇで１５分間遠心分離され、上清が回収され、ＡＴＰ濃度測定用サンプルとして使用された。ＡＴＰ濃度測定には、ＡＴＰ比色分析キット（カタログ番号：ａｂ８３３５５：アブカム（Abcam）（登録商標）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）が使用された。ＡＴＰ濃度の測定は、当該キットの製造者の指示に従って行われた。結果が図３に示される。図３中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
図３に示されるように、バナメイエビの肝膵臓におけるＡＴＰレベルは対照群と比べて、全ての５－ＡＬＡ投与群において高かった。バナメイエビの肝膵臓におけるＡＴＰレベルは５－ＡＬＡの用量依存的に増大していた。３０ｐｐｍおよび６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群においては、対照群に対するＡＴＰレベルの上昇について統計的に有意差が認められた。有意差検定はｔ検定法を用い、図３におけるアスタリスクはｐ＜０．０５を表す。６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群においては、ＡＴＰレベルの上昇と体重増加は相関していなかった。理論に拘束されるものではないが、これは過剰な５－ＡＬＡにより電子伝達系が過剰に活性化され、電子伝達系へ還元力を供給するＴＣＡ回路により多量の脂質や炭水化物が消費された為と考えられる。しかし、１５ｐｐｍおよび３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群におけるＡＴＰレベルの上昇は、５－ＡＬＡによるバナメイエビの成長促進の原因の１つと推察されるバナメイエビ生体内での５－ＡＬＡによる飼料からのエネルギー取り出し効率の向上を支持するものである。
実施例６：Vibrio parahaemolyticusによるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ感染試験
Vibrio parahaemolyticusによる攻撃を受けたバナメイエビの生存率に対して５－ＡＬＡが及ぼす影響について検討した。
Vibrio parahaemolyticusを３×１０６ｃｆｕ／ｍｌの量（高用量）で含む海水を入れた１０Ｌ水槽、およびVibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量（低用量）で含む海水を入れた１０Ｌ水槽をそれぞれの群に対して準備した。飼育開始から３ヶ月目のバナメイエビを各群１０匹ずつ、これら水槽に移し、バナメイエビに対するVibrio parahaemolyticusの感染処理を行った。感染処理から２週間にわたって、感染処理前に投与されていたのと同じ飼料（１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍもしくは６０ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料、または５－ＡＬＡを含まない飼料）が各群のバナメイエビに給餌された。感染処理から２週間にわたって１日ごとに、各群および各Vibrio parahaemolyticus用量におけるバナメイエビの生存率を確認した。Vibrio parahaemolyticusを３×１０６ｃｆｕ／ｍｌの量（高用量）で含む海水でバナメイエビを処理した結果を図４に示し、Vibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量（低用量）で含む海水でバナメイエビを処理した結果を図５に示す。図４および図５中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
Vibrio parahaemolyticusによる攻撃を受けたバナメイエビの生存率に対して５－ＡＬＡが及ぼす影響について検討した。
Vibrio parahaemolyticusを３×１０６ｃｆｕ／ｍｌの量（高用量）で含む海水を入れた１０Ｌ水槽、およびVibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量（低用量）で含む海水を入れた１０Ｌ水槽をそれぞれの群に対して準備した。飼育開始から３ヶ月目のバナメイエビを各群１０匹ずつ、これら水槽に移し、バナメイエビに対するVibrio parahaemolyticusの感染処理を行った。感染処理から２週間にわたって、感染処理前に投与されていたのと同じ飼料（１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍもしくは６０ｐｐｍの５－ＡＬＡを含む飼料、または５－ＡＬＡを含まない飼料）が各群のバナメイエビに給餌された。感染処理から２週間にわたって１日ごとに、各群および各Vibrio parahaemolyticus用量におけるバナメイエビの生存率を確認した。Vibrio parahaemolyticusを３×１０６ｃｆｕ／ｍｌの量（高用量）で含む海水でバナメイエビを処理した結果を図４に示し、Vibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量（低用量）で含む海水でバナメイエビを処理した結果を図５に示す。図４および図５中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
図４に示されるように、Vibrio parahaemolyticusを３×１０６ｃｆｕ／ｍｌの量（高用量）で含む海水でバナメイエビを処理した場合には、６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群は対照群と比べてかなり高い生存率を示した。１５ｐｐｍおよび３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群は、６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群と比べて生存率は低かったが、対照群と比べて高い生存率を示した。Vibrio parahaemolyticusを３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの量（低用量）で含む海水でバナメイエビを処理した場合には、図５に示されるように、１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍおよび６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群は、いずれも、対照群と比べてかなり高い生存率を示した。よって、５－ＡＬＡはエビ目の生物において、Vibrio parahaemolyticusを原因菌とする、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対して有効な予防・治療薬であることが明らかとなった。
実施例７：Vibrio parahaemolyticusによる感染処理での、全血球数に対する５－ＡＬＡの影響
飼育開始から３ヶ月目のバナメイエビを実施例６におけるのと同じ方法でVibrio parahaemolyticus（高用量）によって感染処理した。感染処理前（０時間）、感染処理から６時間後、および感染処理から１２時間後に各群３匹ずつバナメイエビの腹部静脈洞（ventral sinus）から２００μｌの血リンパ（hemolymph）が採取され、８００μｌの抗凝固液で希釈された。Ｃ－チップ（C-chip）血球計（ナノエンテック（NanoEntek）、ドイツ国）を用いて、血リンパ中の全血球数を測定した。図６中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。図６に示されるように、感染処理前および感染処理後の全ての時点で、５－ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して全血球数が増大していた。感染処理から６時間後での６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群においては、他の群と比較して統計的に優位に高い全血球数を示した。有意差検定はｔ検定法を用いた。理論に拘束されるものではないが、エビにおいては顆粒球などの血球は免疫担当細胞として重要な役割を担っているので、５－ＡＬＡ投与によるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対する予防・治療効果の原因の１つが５－ＡＬＡによる全血球数の増大による自然免疫系の活性化であるという可能性が考えられる。
飼育開始から３ヶ月目のバナメイエビを実施例６におけるのと同じ方法でVibrio parahaemolyticus（高用量）によって感染処理した。感染処理前（０時間）、感染処理から６時間後、および感染処理から１２時間後に各群３匹ずつバナメイエビの腹部静脈洞（ventral sinus）から２００μｌの血リンパ（hemolymph）が採取され、８００μｌの抗凝固液で希釈された。Ｃ－チップ（C-chip）血球計（ナノエンテック（NanoEntek）、ドイツ国）を用いて、血リンパ中の全血球数を測定した。図６中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。図６に示されるように、感染処理前および感染処理後の全ての時点で、５－ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して全血球数が増大していた。感染処理から６時間後での６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群においては、他の群と比較して統計的に優位に高い全血球数を示した。有意差検定はｔ検定法を用いた。理論に拘束されるものではないが、エビにおいては顆粒球などの血球は免疫担当細胞として重要な役割を担っているので、５－ＡＬＡ投与によるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対する予防・治療効果の原因の１つが５－ＡＬＡによる全血球数の増大による自然免疫系の活性化であるという可能性が考えられる。
実施例８：Vibrio parahaemolyticusによる感染処理での、ヘムオキシゲナーゼ－１およびフェノール酸化酵素前駆体の遺伝子発現に対する５－ＡＬＡの影響
飼育開始から３ヶ月目のバナメイエビを実施例６におけるのと同じ方法でVibrio parahaemolyticus（高用量）によって感染処理した。感染処理前（０時間）、感染処理から６時間後、および感染処理から１２時間後に各群５匹ずつバナメイエビから肝膵臓を採取し、RNAiso Plus試薬（タカラバイオ、日本国）を用いて、当該試薬の製造者の指示に従って、それぞれのバナメイエビの肝膵臓から全ＲＮＡが抽出された。ハイキャパシティー逆転写キット（High-Capacity Reverse Transcription kit）（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、米国）を用いて、当該キットの製造者の指示に従って、１μｇの全ＲＮＡ抽出物からｃＤＮＡが合成された。合成されたｃＤＮＡが５倍に希釈され、ｑＰＣＲのためのテンプレートとして使用された。このｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーン蛍光色素を使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけることによって、ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）およびフェノール酸化酵素前駆体（ｐｒｏＰＯ）の遺伝子発現を測定した。この測定は、Thunderbird（登録商標）SYBR qPCR Mix（東洋紡、日本）を使用して行われた。増幅反応はMicroAmp Optical 96－ウェル反応プレート（アプライドバイオシステムズ、米国）を使用して行われた。各ウェルは１０μｌのｑＰＣＲ Ｍｉｘ、０．６μｌの各プライマー、０．４μｌのＲＯＸ参照色素、および２μｌのｃＤＮＡテンプレートを収容していた。サイクル条件は以下の通りであった。９５℃で１分、次いで、９０℃で１５秒および６０℃で６０秒を４０サイクル。各ｑＰＣＲ反応の終わりに、解離分析が行われて、１種類だけの生成物の検出であることを確認した。２－ΔΔＣｔ法（LivakおよびSchmittgen、２００１）を用いて、ｑＰＣＲによる遺伝子発現データの相対的な変化が決定された。Ｃｔ値（サイクル閾値：Threshold Cycle）の計算のために、内部標準としてＥＦ１αの遺伝子発現を測定した。対照群の相対的発現を用いて正規化された比率が計算された。データは分析の前に対数（底＝２）変換された。ヘムオキシゲナーゼ－１の発現を測定するために、配列１（５’－ＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＧＡＧ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列２（５’－ＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。フェノール酸化酵素前駆体の発現を測定するために、配列３（５’－ＧＧＡＡＴＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＴＣＡＧＣ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列４（５’－ＧＧＡＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＴＴ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。ＥＦ１αの発現を測定するために、配列５（５’－ＡＴＴＧＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＡＣＡ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列６（５’－ＴＣＧＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。結果は図７～８に表される。各時点での対照群の遺伝子発現の平均値が０とされ、各群の遺伝子発現はこの平均値に対する相対的な値である。図７～８におけるエラーバーは標準偏差である。図７～８中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
飼育開始から３ヶ月目のバナメイエビを実施例６におけるのと同じ方法でVibrio parahaemolyticus（高用量）によって感染処理した。感染処理前（０時間）、感染処理から６時間後、および感染処理から１２時間後に各群５匹ずつバナメイエビから肝膵臓を採取し、RNAiso Plus試薬（タカラバイオ、日本国）を用いて、当該試薬の製造者の指示に従って、それぞれのバナメイエビの肝膵臓から全ＲＮＡが抽出された。ハイキャパシティー逆転写キット（High-Capacity Reverse Transcription kit）（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、米国）を用いて、当該キットの製造者の指示に従って、１μｇの全ＲＮＡ抽出物からｃＤＮＡが合成された。合成されたｃＤＮＡが５倍に希釈され、ｑＰＣＲのためのテンプレートとして使用された。このｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーン蛍光色素を使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけることによって、ヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）およびフェノール酸化酵素前駆体（ｐｒｏＰＯ）の遺伝子発現を測定した。この測定は、Thunderbird（登録商標）SYBR qPCR Mix（東洋紡、日本）を使用して行われた。増幅反応はMicroAmp Optical 96－ウェル反応プレート（アプライドバイオシステムズ、米国）を使用して行われた。各ウェルは１０μｌのｑＰＣＲ Ｍｉｘ、０．６μｌの各プライマー、０．４μｌのＲＯＸ参照色素、および２μｌのｃＤＮＡテンプレートを収容していた。サイクル条件は以下の通りであった。９５℃で１分、次いで、９０℃で１５秒および６０℃で６０秒を４０サイクル。各ｑＰＣＲ反応の終わりに、解離分析が行われて、１種類だけの生成物の検出であることを確認した。２－ΔΔＣｔ法（LivakおよびSchmittgen、２００１）を用いて、ｑＰＣＲによる遺伝子発現データの相対的な変化が決定された。Ｃｔ値（サイクル閾値：Threshold Cycle）の計算のために、内部標準としてＥＦ１αの遺伝子発現を測定した。対照群の相対的発現を用いて正規化された比率が計算された。データは分析の前に対数（底＝２）変換された。ヘムオキシゲナーゼ－１の発現を測定するために、配列１（５’－ＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＧＡＧ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列２（５’－ＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。フェノール酸化酵素前駆体の発現を測定するために、配列３（５’－ＧＧＡＡＴＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＣＡＴＧＣＡＴＣＡＧＣ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列４（５’－ＧＧＡＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＴＴ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。ＥＦ１αの発現を測定するために、配列５（５’－ＡＴＴＧＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＣＡＣＡ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列６（５’－ＴＣＧＡＴＣＴＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。結果は図７～８に表される。各時点での対照群の遺伝子発現の平均値が０とされ、各群の遺伝子発現はこの平均値に対する相対的な値である。図７～８におけるエラーバーは標準偏差である。図７～８中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
図７に示されるように、感染処理から６時間後に、５－ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較してヘムオキシゲナーゼ－１の遺伝子発現が用量依存的に増大していた。図８に示されるように、感染処理から６時間後に、５－ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較してフェノール酸化酵素前駆体の遺伝子発現が増大していた。ヘム蛋白質の１種であるヘムオキシゲナーゼ－１はヘム代謝にかかわる酵素であると共に、細胞を酸化ストレスによる傷害から守る細胞保護タンパク質であることが知られている。フェノール酸化酵素前駆体は真菌や細菌の細胞壁成分を認識し、その認識結果をｔｏｌｌ受容体のリガンド生成につなげる仕組みに関与している可能性が示唆されている。よって、理論に拘束されるものではないが、５－ＡＬＡ投与によるＥＭＳ／ＡＨＰＮＤに対する予防・治療効果の原因の１つが５－ＡＬＡによるヘムオキシゲナーゼ－１およびフェノール酸化酵素前駆体の遺伝子発現の増大であるという可能性が考えられる。
実施例９：核内受容体Ｅ７５および一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現に対する５－ＡＬＡの影響
飼育開始から３ヶ月目に、各群３～４匹のバナメイエビから肝膵臓を採取し、それぞれのバナメイエビの肝膵臓から全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーン蛍光色素を使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけることによって、核内受容体遺伝子Ｅ７５および一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現を測定した。Ｃｔ値の計算のために、内部標準としてＥＦ１αの遺伝子発現を測定した。核内受容体遺伝子Ｅ７５の発現を測定するために、配列７（５’－ＧＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列８（５’－ＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。一酸化窒素合成酵素の発現を測定するために、配列９（５’－ＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列１０（５’－ＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＣ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。測定に使用された装置、条件などは実施例８におけるのと同じであった。結果は図９～１０に表される。対照群の遺伝子発現の平均値が０とされ、各群の遺伝子発現はこの平均値に対する相対的な値である。図９～１０におけるエラーバーは標準偏差である。図９および１０中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
飼育開始から３ヶ月目に、各群３～４匹のバナメイエビから肝膵臓を採取し、それぞれのバナメイエビの肝膵臓から全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーン蛍光色素を使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけることによって、核内受容体遺伝子Ｅ７５および一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現を測定した。Ｃｔ値の計算のために、内部標準としてＥＦ１αの遺伝子発現を測定した。核内受容体遺伝子Ｅ７５の発現を測定するために、配列７（５’－ＧＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列８（５’－ＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。一酸化窒素合成酵素の発現を測定するために、配列９（５’－ＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列１０（５’－ＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＣ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。測定に使用された装置、条件などは実施例８におけるのと同じであった。結果は図９～１０に表される。対照群の遺伝子発現の平均値が０とされ、各群の遺伝子発現はこの平均値に対する相対的な値である。図９～１０におけるエラーバーは標準偏差である。図９および１０中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
図９に示されるように、全ての５－ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して核内受容体Ｅ７５の遺伝子発現が統計的に有意に増大していた。有意差検定はｔ検定法を用いた。図１０に示されるように、５－ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現が増大していた。核内受容体Ｅ７５はエクダイソン合成に必要とされるタンパク質であって、ヘムを補欠分子族として含み、細胞内のヘム濃度のセンサーとして機能する他、一酸化窒素を細胞内シグナル伝達分子として感知する可能性があることが知られている。一酸化窒素合成酵素は細菌感染などにおいて強力な抗菌活性を有するパーオキシナイトライトの発生に必要となる一酸化窒素の合成に関与する酵素であって、ヘムタンパク質であることが知られている。Ｅ７５はその構造を安定させる為にヘムを必要とし更にヘム濃度のセンサーとなり、一酸化窒素合成酵素はそれ自体がヘム蛋白質であることからこれらの発現を調べることにより５－ＡＬＡの投与がエビの体内におけるヘム合成に関連していることを確認するための指標となる可能性がある。
実施例１０：一酸化窒素合成酵素およびＣ型レクチンの遺伝子発現に対する５－ＡＬＡの影響
飼育開始から２週間目に、各群３～４匹のバナメイエビから肝膵臓を採取し、それぞれのバナメイエビの肝膵臓から全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーン蛍光色素を使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけることによって、核内受容体遺伝子Ｅ７５および一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現を測定した。Ｃｔ値の計算のために、内部標準としてＥＦ１αの遺伝子発現を測定した。一酸化窒素合成酵素の発現を測定するために、配列９（５’－ＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列１０（５’－ＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＣ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。Ｃ型レクチンの発現を測定するために、配列１１（５’－ＣＡＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列１２（５’－ＧＴＣＧＡＡＣＴＣＧＧＣＧＴＴＡＴＣＧＧ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。測定に使用された装置、条件などは実施例８におけるのと同じであった。結果は図１１～１２に表される。対照群の遺伝子発現の平均値が０とされ、各群の遺伝子発現はこの平均値に対する相対的な値である。図１１～１２におけるエラーバーは標準偏差である。図１１～１２中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
飼育開始から２週間目に、各群３～４匹のバナメイエビから肝膵臓を採取し、それぞれのバナメイエビの肝膵臓から全ＲＮＡを抽出し、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをＳＹＢＲグリーン蛍光色素を使用するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけることによって、核内受容体遺伝子Ｅ７５および一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現を測定した。Ｃｔ値の計算のために、内部標準としてＥＦ１αの遺伝子発現を測定した。一酸化窒素合成酵素の発現を測定するために、配列９（５’－ＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列１０（５’－ＴＣＧＡＧＣＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＣ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。Ｃ型レクチンの発現を測定するために、配列１１（５’－ＣＡＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡ－３’）を有するフォワードプライマーおよび配列１２（５’－ＧＴＣＧＡＡＣＴＣＧＧＣＧＴＴＡＴＣＧＧ－３’）を有するリバースプライマーが使用された。測定に使用された装置、条件などは実施例８におけるのと同じであった。結果は図１１～１２に表される。対照群の遺伝子発現の平均値が０とされ、各群の遺伝子発現はこの平均値に対する相対的な値である。図１１～１２におけるエラーバーは標準偏差である。図１１～１２中の１５ｐｐｍ、３０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの記載は、それぞれ、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、３０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群、および６０ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群を表す。
図１１に示されるように、５－ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較して一酸化窒素合成酵素の遺伝子発現が用量依存的に増大していた。図１２に示されるように、１５ｐｐｍの５－ＡＬＡ投与群においては、対照群と比較してＣ型レクチンの遺伝子発現が増大していた。Ｃ型レクチンは初期の免疫応答に最も重要なノジュール反応を誘起する可能性が示唆されている。理論に拘束されるものではないが、Ｃ型レクチンは顆粒細胞が細菌を取り込み、更に細菌の拡散を阻止する反応であるノジュール形成反応において重要な役割を担うことからＥＭＳへの有効性の一因が５－ＡＬＡ投与によるＣ型レクチンの発現増加によるノジュール反応促進作用である可能性を示唆していると考えられる。一酸化窒素合成酵素は一酸化窒素の合成に関与する酵素であって、ヘムタンパク質であり、５－ＡＬＡの投与によりその合成が促進される。
本願発明の５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物は、エビ目の生物の飼育、養殖に使用されることが可能であり、Vibrio parahaemolyticusを原因菌とする、ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤを有効に予防および治療することが可能である。また、本願発明の５－ＡＬＡ若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物は、所定の投与量でエビ目の生物の成長を促進させることが可能である。
Claims (8)
- ５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目用経口投与組成物。
- ５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を含むエビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）の予防・治療用経口投与組成物。
- エビ目がクルマエビ科である請求項１または２に記載の組成物。
- 組成物が飼料または飼料用添加剤である請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
- ５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む方法。
- ５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種をエビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目早期死亡症候群／急性肝膵臓壊死病（ＥＭＳ／ＡＨＰＮＤ）を予防・治療する方法。
- エビ目がクルマエビ科である請求項５または６に記載の方法。
- ５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ)若しくはそのエステル、またはそれらの塩から選択される少なくとも一種を、５－ＡＬＡリン酸塩換算でエビ目の生物の体重１ｇあたりかつ一日あたりで、０．２５μｇ／ｇ・日～２．５μｇ／ｇ・日の量で、エビ目の生物に摂取させることを含む、エビ目の生物の成長を促進させる方法。
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