JP2001316255A - 魚類病原性微生物と寄生虫の感染予防および治療のためのδ−アミノレブリン酸の新規の用途｛Ｎｏｖｅｌｕｓｅｏｆｄｅｌｔａ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃａｃｉｄｆｏｒｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄｐａｒａｓｉｔｅ｝ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】魚類病原性微生物と寄生虫の感染予防及び治療
用組成物の提供。 【解決手段】δ−アミノレブリン酸を有効成分として含
有する魚類病原性微生物の感染予防及び治療用組成物魚
類に水槽投与又は経口投与する場合、魚類病原性細胞の
感染を予防及び治療できて抗生剤を用いなくても魚類を
養殖することができ、又、ウイルス感染魚類を治療する
効果があり、スクチカ寄生虫の感染に対しても予防及び
治療に優れた効果がある。図はδ−アミノレブリン酸濃
度による魚類株化細胞に対する細胞毒性効果を示すグラ
フである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はδ−アミノレブリン
酸（δ−aminolevulinic acid：ALA）を有効成分として
含有する魚類病原性微生物と寄生虫の感染予防および治
療用組成物に関する。より詳細には、δ−アミノレブリ
ン酸を飼育水槽に含有させて魚類を養殖したり、飼育に
混合して魚類に経口投与することにより、魚類の病原性
微生物と寄生虫の感染を予防したり、感染された魚類を
治療する組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近、魚類の人工種苗生産技術の開発と
共に海産魚類の養殖産業が急速に発達することにより、
ひらめ、くろそい，真鯛、すずき、ふぐ等の高級魚種が
主な養殖対象種として脚光を受けている。このような養
殖業の急速な伸長に因り、我が国の沿岸海水を含む周囲
環境は、魚類疾病の主要病因性ウイルスヘルパースウイ
ルス（Herpersvirus）、バーナウイルス（Birnaviru
s）、ラブドウイルス（Rhabdovirus）等とエドワードジ
エラ属（Edwardsiella sp.）、ビブリオ属（Vibrios
p.）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus sp.）、
ストレプトコッカス（Streptococcus）およびフレキシ
バター属（Flexibater sp.）等の病原性細菌らにより
汚染されている蓋然性のため、常にウイルスと細菌によ
る疾病発生のおそれがあり（Cheung, R. J. ,Nigelli,
R.F. and Ruggieri, G. D. 1980. Studies on the mo
rphology og uronema with a description of the infe
ction inmarine fishes, J. Fish Disease, 3; 295;
Drolet M., Peloguin Ｌ.，EscelardＹ., Cousineau
Ｌ.，and Sasarman A., 1989. Isolation and nucleo
tide sequence of the hemA gene of E. coli K-12, Mo
l. Gen.Genet, 216; 347:Ellen, N.L, and Kaplan S.,
1993. 5-Aminolevulinic acid availability andcontro
l of spectral complex formation in hemA and hemT m
utant of R. spharoides, J. Bacteriol., 175; 230
4）,このような病原体の感染により魚類養殖業は深刻な
被害を受けている実情である。特に、病原性細菌とウイ
ルスの感染被害は種苗生産が成魚養殖の場合より甚だし
い状態であり、その被害もまた年毎に増加している。
このような細菌性疾病の治療と予防の目的で現在は獣医
用抗生剤を用いている実情である。同定にならない病原
菌が起こす疾病を治療するために適切でない抗生剤を過
多投与するのは養殖漁家の費用だけを増加させ、新たな
抗生剤耐性を付与することにより、新たな薬剤耐性を有
する細菌の出現を招くおそれがあり、実験に所要される
時間が長引くため、迅速に処理することができなくなる
ことにより、養殖魚類の斃死が増加するので、養殖魚類
の活力または免疫能を増加させるための飼料補助剤が開
発されている。

【０００３】国内で発病する海産魚類疾病のうち、前述
した通り、微生物およびウイルスの外に特にその被害が
莫甚な疾病は、寄生虫により発病するものとしては繊毛
虫類の一種である白点虫（Ichthiophthirius）感染症で
ある白点病とスカチコシリアチダ（Scuticosiliatida）
によるスクチカ感染症が代表的である。日本の場合、寄
生性疾病の防除法として多く用いられるホルマリン薬浴
法に対する研究が行われたが、外部に露出した虫体の場
合、１００ｐｐｍ程の薬浴濃度でその活性が減少された
との報告（Yoshinaga, T. and Nakazoe, J. 1993. Isol
ation and in vitro cultivation of an unidentified
ciliate causing scuticociliatoisis in Japanese flo
under, Fish Pathol.. 28 ;131）に基づき養殖現場防疫
チームによる現場適用結果、その効果が全然現われなか
った結果は、実験実績である結果の現場適用が難しいこ
とを立証している（Mizuno, Y. , 1993. Control metho
dsof diseased flounder used in fish farm in Japan,
J. Fish Pathol. , 6 ;219）。そして、実験室内で細
胞培養法を利用したスクチカ増殖方法に成功して、培養
細胞上のスクチカ虫を利用した病原性を直接ひらめに適
用してその病原性を確認し、試験管内で虫体の不活性化
のための方法としてプレジルおよびエキテシンを用いて
その活性を除去するに成功したが、魚体内における感染
虫体を不活性化させる研究はなされていない（Yoshimiz
u, M. , Hyuuga, S. , Oh, M.-J. ,Ikoma, Ｍ. , Kimur
a , T. , Mori, T. , Nomura, T. , and Ezura，Y. 1
993. Scuticociliatida infection of cultured hirame
-characteristics, drug sensitivity and pathogenici
ty of cultured Scuticociliatida, J. Fish Pathol. ,
6 ; 205）。韓国内で養殖ひらめ稚魚および中間育成魚
を利用して治療効果試験を行った結果、その効果が現わ
れなかった。体内の治療効果がなかった理由としては、
Mizuno（Mizuno, Y. , 1993. Control methods of dise
ased flounder used in fish farm in Japan, J. Fish
Pathol., 6; 219）とYoshimizu (Yoshimizu, M., Hyuug
a, S., Oh, M.-J., Ikoma, M., Kimura, T., Mori, T.,
Nomura, T., and Ezura. Y., 1993. Scuticociliatida
infection of cultured hirame-characteristics, dru
g sensitivity and phathogenicity of cultured Scuti
cociliatida, J. Fish Pathol.,6; 205)の研究における
と同様に、ホルマリン処理の場合のように水系に露出し
たプロットモント系のスクチカ虫の除去は可能である
が、体内にまで一連の実験薬剤が浸透しないため、その
効果を発揮しえないと判断された。そして、薬剤の値段
が一般水産用薬剤に比べて非常に高いため、水系内に放
出された虫体だけを除去する場合において安価なホルマ
リンに比べて非経済的である。本寄生虫の感染による病
理学的研究は韓国内でも行われて（Lee, H.-S. and Sin
skey, A. J. 1994. Molecular characterization of a
ceB, agene encoding malate synthase in Corynebacte
rium glutamicum, J. Microbiol. Biotechnol., 4; 25
6）、虫体の感染は表皮およびえらを通過して血流に乗
って体内の神経系まで進入して致命的な損傷を与えるも
のと確認された。そのような病理的現象は、ひらめの稚
魚（Cheung, R. J. , Nigrelli, R. F. and Ruggieri,
G. D. 1980. Studies on the morphology of uronema
with a description of the infection in marine fish
es, J. Fish Disease, 3; 295）と淡水魚類18 ( Hoffma
n, G.L. 1955. A disease of freshwater fishes caus
ed by tetrahymena and a key for identification of
holotrich ciliates of freshwater fishes, J. Parasi
tol., 61;217 ) の研究結果と類似である。

【０００４】最近、化学合成殺虫剤および除草剤の過多
使用に因る有毒性によって環境汚染の問題が台頭するこ
とにより、生物学的、特に微生物根源の新素材の発掘が
要求されている。このような観点からδアミノレブリン
酸は全ての生物においてヘム（heme）、バクテリオクロ
ロフィル（bacteriochlorophyll）、コリノイド（corri
noid）等のテトラピロール（tetrapyrrole）化合物らの
生合成前駆体であり、現在まで知られた唯一の生物素材
であるフォトダイナミック（photodynamic）物質であっ
て除草剤、殺虫剤、植物成長促進剤および癌治療剤とし
てその効果が広く報告されている（Hua, Z. Scott, L.
G. Thomas, H. F., and Russell, H.,1995, Effectiven
ess of delta-aminolevulinic acid induced protoporp
hyrinas a photosensitizer for photodynamic therapy
in Vivo, Cancer Research,55; 1723; Matsumoto, T.
H., Usui, K., and Ishizuka, K. 1992, Basis of Diff
erential Tolerance of Plant Species to delta-Amino
levulinic Acid, WeedResearch, 37; 60; Matumoto,
H., Tanida, Y., and Ishizuka, K. 1994. Porphyrin I
ntermediate Involved in Herbicidial Action of delt
a-Aminolevulinic Acid on Duckweed, Pesticide Bioch
emistry, 48; 214; Rebeiz, C. A. Juvik, J. A. and R
eibez, C. C. 1988. Porphyric insecticides: Concep
and phenomenology, Pestic. Bchem. Physiol., 30; 1
1; Tanaka, T., Takahashi, K., Hotta, Y., Takeuchi,
Y., and Konnai, M., 1992. 5-aminolevulinic acid a
s Plant growth stimulator, Eur. Pat. Appl. EP 514
776）。

【０００５】また、δ−アミノレブリン酸は、自然で容
易に分解されるため、環境親和的な除草・殺虫剤とみな
されて来た。しかし、微生物から生産されるδ−アミノ
レブリン酸の量は、その濃度が低く、化学的合成による
生産もまた複雑な合成段階（Beale, S. I., Gold, M.
H. and Granick, S., 1979, Chemical synthesis of
4,5,-dioxavaleric acid and its non-enzymatic trans
amination to 5-aminolevulinic acid, Phytochemistr
y,18; 441）に因り産業化が難しいため、現在は毒性が
強いジフェニールエーテル（diphenyl ether; DPEs）お
よびオキサジアゾール（oxadiazole）等のような合成フ
ォトダイナミック（photodynamic）除草剤を化学的合成
により生産している。このような合成フォトダイナミッ
ク除草剤の動物と人体への有害性と遅い分解速度に因る
環境汚染の問題が提起されており、その例としてゴルフ
場における除草剤濫用に因る上水道源の汚染と隣近農民
達の被害が社会問題として台頭している実情である。

【０００６】ロドバクター（Rhodobacter）から特に多
く生産されるδ−アミノレブリン酸（δ-aminolevulini
c acid; ALA）は、植物に撒布されると双子葉植物にの
み選択的に作用して太陽光線により強力な酸化物質であ
るピクリド（pichlide）が形成され、この物質による一
連の酸化反応が起こり葉の燐脂質が破壊されて葉が枯死
する除草活性を示す。故に、δ−アミノレブリン酸は、
人と動物および農作物には被害を与えないながらも雑草
を選択的に枯死（Rebeiz, C. A., Montazer-Zouhoor,
A., Hopen,H., and Wu, S. M., 1984. Photodynamic he
rbicides. Concep and Phenomology, Enzyme Microb.
Technol., 6; 390）させるため、環境親和性の除草剤と
して報告されている（Rebeiz, C. A., Juvik, J. A., a
nd Reibez , C. C. 1988. Porophyric insecticides: C
oncep and phenomenology, Pestic. Biochem. Physiol.
, 30; 11）。

【０００７】しかし、現在δ−アミノレブリン酸は、諸
段階の複雑な過程を経て有機合成をしなければならない
ため、生産単価が高く生産性がないので、現在利用され
ている除草剤の大部分は、人体毒性および土壌残留毒性
等が高い問題点がある（Beale, S. I., Gold, M. H.,
and Granick, S., 1979, Chemical synthesis of 4,5-d
ioxavaleric acid and its non-enzymatic transaminat
ion to 5-aminolevulinic acid, Phytochemistry, 18;
441）。

【０００８】食品は栄養・味および安全性の順に重要視
された従来の概念が国民所得の増大と健康に対する関心
のため、却って食品の安全性が最も重要視されている。
このような食品の安全性は、食品中に汚染または混入さ
れている病原性微生物、重金属、農薬および抗生物質ら
が最も頻繁に台頭しており、養殖魚類の場合、抗生物質
の過量投与に因る魚類の組織内に残留する抗生物質は、
食品の安全性に違背する可能性がある。沿岸の汚染と養
殖場の密集に因り細菌性疾病が多発し、これの治療のた
めに薬剤を無分別に投与することにより薬剤耐性がある
新たな病原性微生物が生じるようになり、このような結
果は新しい抗生物質の開発を要求している。医学と同様
に魚類疾病を治療するためにより多様で広汎な抗生物質
の開発は、養殖魚類の生産性を向上させることができる
が、組織中に残留する抗生物質に因り食品に安全性にお
いて問題をひきおこすことがある。従って、養殖魚類の
種苗生産場から成魚養殖場に至るまで病原性微生物によ
り発病する疾病を広汎に予防または治療効果がある物質
の開発が要求される。

【０００９】本発明者達は、前記のような点を勘案して
δ−アミノレブリン酸を魚類の配合飼料に含有させて魚
類に供給したり、飼育水槽に一定量を供給して魚類を養
殖するする場合、抗生剤の使用なく病原性微生物と寄生
虫の感染を効果的に予防することができ、既に感染され
た魚類の場合は治療効果を得られることを確認して本発
明を完成した。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、δ−アミノレブリン酸を有効成分として含有する魚
類病原性微生物と寄生虫の感染予防および治療用組成物
を提供することにある。本発明の別の目的は、前記組成
物を魚類に経口投与したり、飼育時に水槽投与して、魚
類の病原性微生物と寄生虫の感染を予防および治療する
方法を提供することにある。

【００１１】本発明のまた別の目的は、δ−アミノレブ
リン酸を有効成分として含有する魚類養殖用飼料を提供
することにある。

【００１２】本発明の前記目的は、δ−アミノレブリン
酸が魚類に及ぼす細胞毒性効果を調査した後、細胞毒性
を及ぼさないδ−アミノレブリン酸の濃度を決定し、こ
の濃度のδ−アミノレブリン酸をin vitroで多様な種類
の魚類病原性微生物とウイルスに処理してδ−アミノレ
ブリン酸が魚類病原性微生物とウイルスの増殖を抑制す
ることを確認し、次いでin vivoでδ−アミノレブリン
酸を魚類に予め水槽投与または経口投与した後、多様な
種類の魚類病原性微生物を感染させて時間経過による斃
死率を調査して、δ−アミノレブリン酸の魚類病原性微
生物感染予防効果を確認し、また予め多様な魚類病原性
微生物を感染させた魚類にδ−アミノレブリン酸を水槽
投与または経口投与して時間経過による斃死率を調査し
て、δ−アミノレブリン酸の魚類病原性微生物感染治療
効果を確認し、同じ方法で魚類にスクチカ寄生虫感染予
防および治療効果を確認することにより達成した。以
下、本発明の構成を説明する。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は３種の魚類株化
細胞に多様な濃度のδ−アミノレブリン酸溶液とＭＴＴ
溶液を添加して培養した後、細胞増殖度を測定し、δ−
アミノレブリン酸が細胞系に及ぼす細胞毒性効果を調査
して、δ−アミノレブリン酸が細胞毒性を及ぼさない濃
度範囲を決定する段階；３種の魚類に多様な濃度の−ア
ミノレブリン酸溶液を注射したり、飼育海水に一定濃度
に溶解させ、前記３種の魚類を飼育しながら時間経過に
よる生存率を測定して、δ−アミノレブリン酸が魚類に
及ぼす細胞毒性濃度を決定する段階；魚類養殖場から分
離された病原性細菌液を市販用δ−アミノレブリン酸と
混合し、６２０ｎｍでＥＬＩＳＡreaderで細菌成長を２
４時間観察して、δ−アミノレブリン酸が魚類病原性細
菌の増殖を抑制する効果があることを確認し、ＭＩＣ検
索により海産魚養殖場から分離された病原性細菌液の増
殖抑制効果を確認する段階；ウイルス培養液とδ−アミ
ノレブリン酸希釈液を混合した反応液を培養細胞に接種
した後、ウイルス感染程度を測定し、ウイルス液のみ接
種した対照区とその値を比較して、δ−アミノレブリン
酸が魚類病原性ウイルスに対する駆除効果があることを
確認する段階；一定濃度のδ−アミノレブリン酸を維持
する飼育水槽に魚類を飼育したり、一定の濃度のδ−ア
ミノレブリン酸を含有する飼料を魚類に経口投与して斃
死率を調査して、δ−アミノレブリン酸が魚類に及ぼす
細胞毒性効果を調査する段階；震盪培養したエドワード
ジエラタルダ細菌をδ−アミノレブリン酸が水槽投与ま
たは経口投与された魚類に腹腔注射した後、飼育中の斃
死率を調査して、δ−アミノレブリン酸がエドワードジ
エラタルダ細菌の感染予防効果があることを確認する段
階；魚類病原性細菌エドワードジエラタルダの感染予防
効果調査と同様の方法によりδ−アミノレブリン酸を水
槽投与または経口投与した魚類にストレプトコッカス細
菌を腹腔注射で人為感染させた後、飼育中の斃死率を調
査して、δ−アミノレブリン酸がストレプトコッカス細
菌の感染予防効果があることを確認する段階；魚類病原
性細菌エドワードジエラタルダの感染予防効果調査と同
様の方法によりδ−アミノレブリン酸を水槽投与または
経口投与した魚類にスタフィロコッカスエピデルミディ
ス細菌を腹腔注射で人為感染させた後、飼育中の斃死率
を調査して、δ−アミノレブリン酸がスタフィロコッカ
スエピデルミディス細菌の感染予防効果があることを確
認する段階；魚類病原性細菌エドワードジエラタルダ感
染予防効果と同様の方法によりδ−アミノレブリン酸を
水槽投与または経口投与した魚類にシュードモナス属細
菌を腹腔注射で人為感染させた後、飼育中の斃死率を調
査して、δ−アミノレブリン酸がシュ−ドモナス属細菌
の感染予防効果があることを確認する段階；魚類病原性
細菌エドワードジエラタルダ感染予防効果と同様の方法
によりδ−アミノレブリン酸を水槽投与または経口投与
した魚類にビブリオアングイルジアルムを腹腔注射して
人為感染させた後、飼育中の斃死率を調査して、δ−ア
ミノレブリン酸がビブリオアングイルジアルム細菌の感
染予防効果があることを確認する段階；δ−アミノレブ
リン酸が多様な濃度に含まれた飼育水槽に魚類病原性細
菌を感染させた魚類を飼育しながら魚類の生存率を調査
して、δ−アミノレブリン酸が魚類疾病を治療する効果
があることを確認する段階；養殖場でイリドウイルスに
感染されたものと判定された魚体を多様な濃度のδ−ア
ミノレブリン酸で処理し、時間経過による斃死率を調査
して、実際δ−アミノレブリン酸がウイルス感染治療効
果があることを確認する段階；養殖場で大量がエドワー
ドジエラタルダ細菌に感染された魚体に一定濃度のδ−
アミノレブリン酸を処理して生存状態を観察することに
より、実際δ−アミノレブリン酸が養殖場内で魚類病原
性細菌に感染された魚類を治療することができることを
確認する段階；スクチカ寄生虫培溶液にδ−アミノレブ
リン酸の希釈液を混合して培養しながら時間経過による
スクチカ寄生虫の数を計数して、δ−アミノレブリン酸
のスクチカ虫の死滅効果を調査する段階；一定濃度のδ
−アミノレブリン酸を水槽投与したり経口投与した魚類
にスクチカ虫体を人為感染させた後、時間経過による魚
類斃死率を観察して、δ−アミノレブリン酸のスクチカ
虫人為感染予防効果を調査する段階；およびスクチカ虫
感染が発生して販売が中断された種苗生産場のひらめ稚
魚にδ−アミノレブリン酸を処理し、斃死率を観察し
て、実際δ−アミノレブリン酸がスクチカ虫感染魚類を
治療する効果があることを確認する段階から構成され
る。

【００１４】本発明のδ−アミノレブリン酸は、養殖す
る全ての種類の魚類に適用可能であり、特に海産魚に効
果が優れている。

【００１５】本発明でδ−アミノレブリン酸の投与方式
は、魚類養殖中に養殖水槽に添加する水槽投与方式また
は魚類養殖に用いられる通常の飼料に配合して経口投与
する方式の全てに可能である。

【００１６】本発明では海産養殖魚のうち、ひらめ、く
ろそい、真鯛等を用いてδ−アミノレブリン酸の魚類病
原性微生物の感染予防・治療、ウイルス感染治療および
スクチカ虫の予防および治療効果が優れることを確認し
たが、これは本発明の一実施例に過ぎない。

【００１７】本発明でδ−アミノレブリン酸は液状で通
常の魚類養殖飼料に噴霧して添加したり、粉末状に製造
して飼料製造時に配合することができる。

【００１８】かくして、本発明は、１．δ−アミノレブ
リン酸（δ−aminolevulinic acid：ALA）を有効成分と
して含有する魚類病原性微生物の感染予防および治療用
組成物。２．前記魚類病原性微生物がエドワードジエラ
タルダ細菌（Edwardsiella tarda）、ストレプトコッカ
ス属細菌（Streptococcus sp.）スタフィロコッカス属
細菌（Staphylococcus sp.）、スタフィロコッカスエピ
デルミディス細菌 (Staphilococcus epidermidis) 、
シュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）、またはビ
ブリオアングイラルム細菌（Vibrio anguillarum）であ
ることを特徴とする前項１記載の魚類病原性微生物の感
染予防および治療用組成物。３．前記魚類病原性微生物
の感染予防および治療用組成物を魚類養殖飼育水槽に
０.１〜１００ｐｐｍの濃度で添加して水槽投与した
り、通常の魚類養殖試料に１.０〜１００ｐｐｍを添加
して経口投与することにより、魚類病原性微生物の感染
を予防したり治療することを特徴とする前項１または２
記載の魚類病原性微生物の感染予防および治療方法。
４．δ−アミノレブリン酸（δ−aminolevulinic aci
d）を有効成分として含有するイリドウイルス（irido v
irus）感染治療用組成物。５．前記イリドウイルス感染
治療用組成物を魚類養殖飼育水槽に０.１〜１０ｐｐｍ
の濃度で添加して水槽投与することにより、イリドウイ
ルス感染を治療することを特徴とする前項４記載のイリ
ドウイルス感染治療方法。６．δ−アミノレブリン酸
（δ−aminolevulinic acid）を有効成分として含有す
るスクチカ虫感染予防および治療用組成物。７．前記ス
クチカ虫感染予防および治療用組成物を魚類養殖飼育水
槽に０.１〜１００ｐｐｍの濃度で添加して水槽投与し
たり、通常の魚類養殖飼料に１.０〜１００ｐｐｍを添
加して経口投与することにより、スクチカ虫感染予防お
よび治療をすることを特徴とする前項６記載のスクチカ
虫感染予防および治療方法。８．δ−アミノレブリン酸
（δ−aminolevulinic acid）を通常の魚類養殖飼料に
１.０〜１００ｐｐｍを含有させることを特徴とする魚
類養殖用飼料。からなる。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の具体的な方法を実
施例により詳細に説明するが、本発明の権利範囲はこれ
ら実施例にのみ限定されるのではない。

【００２０】実施例１： 魚類株化細胞に対するδ−ア
ミノレブリン酸の細胞毒性 本実施例では海産養殖魚に莫大な被害を与える数種の魚
類病原性細菌、ウイルスおよびスクチカ虫感染の予防お
よび治療剤として用いようとするδ−アミノレブリン酸
の魚類体内毒性有無を確認するための基礎実験であっ
て、魚類由来株化細胞３種を対象としてin vitro状にお
ける細胞系内毒性を調査してδ−アミノレブリン酸処理
安全濃度および毒性濃度を確認し、直接的な露出による
δ−アミノレブリン酸の魚類に対する毒性実験のために
魚類細胞に影響を及ぼさないδ−アミノレブリン酸濃度
を確立すべく行った。δ−アミノレブリン酸試料は、
１.０Ｍ濃度（０.１６７ｇ／１ｍＬ ＨＢＳＳ）で調剤
して１０倍希釈法で希釈し、９６wellマイクロプレート
に２.５×１０５cells／ｍＬに懸濁された魚類株化細胞
液をそれぞれ１００μＬずつ入れた後、δ−アミノレブ
リン酸希釈液を希釈単位当り４wellずつそれぞれ１００
μＬずつ添加して実験を行った。δ−アミノレブリン酸
の細胞毒性実験に用いられた魚類株化細胞は、日本北海
道大学水産学部の吉水教授（Dr. M. Yoshimizu）から分
譲を受けたＲＴＧ−２（Rainbow trout gonad）、ＦＨ
Ｍ（Fathead minnow epithelioma）およびＣＨＳＥ−２
１４（Chinook salmon embryo）である。実験用細胞は
１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（Sigma）、１００μｇ／
ｍＬのストレプトマイシン（Sigma）および５％ＦＢＳ
が添加されたＭＥＭ（Gibco）細胞培養用培地を用い
た。９６wellマイクロプレートに培養した細胞を１５℃
の培養基で３時間培養した後、０ｍＭ，１.０ｍＭ，１
０ｍＭ，５０ｍＭおよび１００ｍＭのδ−アミノレブリ
ン酸液を１００μＬずつ添加した後、１８℃で２４時間
培養した。対照区はδ−アミノレブリン酸の代わりにＨ
ＢＳＳを同量入れた。培養後にＭＴＴ溶液［3-(4,5-dim
ethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide
(DOJＩＮＤＯ Lot ZY903, Japan)をＰＢＳに５ｍｇ／ｍ
Ｌを溶かしてフィルター（０.４５μｍ）した後、実験
に用いた］を各wellに１００μＬずつ入れた後、０.０
４Ｎ ＨＣｌ−isopropanolを１００μＬずつ入れてELIS
A readerで５７０ｎｍで吸光度を測定した。実験結果、
図１に示した通り、実験に用いられた3種の株化細胞全
て１ｍＭ，１０ｍＭのδ−アミノレブリン酸で処理した
とき、対照区と比較して類似の細胞増殖度を示した反
面、５０ｍＭと１００ｍＭのδ−アミノレブリン酸を処
理したときには対照区と比較して半分程の低い細胞増殖
度を示した。結果的に、細胞培養条件のwell内に反応条
件を勘案してその毒性安定範囲は１０ｍＭ以下と現わ
れ、実験適正濃度基準を設定することができた。また、
生物体内のδ−アミノレブリン酸の適用による毒性濃度
の設定のための基礎資料により物質の体内吸収および代
謝過程による目的臓器または細胞単位までの伝達経路を
推定したとき（一般的に魚体内物質の吸収率は１０〜２
０％）、本物質の魚体処理濃度を５０ｍＭ以下とすれ
ば、直接的な毒性は魚体内で発現しないことが分かっ
た。

【００２１】実施例2： 魚類に対するδ−アミノレブリ
ン酸の細胞毒性 前記実施例１でδ−アミノレブリン酸の細胞単位におけ
る毒性実験結果、２４時間の露出による細胞への毒性が
５０ｍＭ以下の濃度で安定したことが分かった。本実施
例ではδ−アミノレブリン酸の体内投入による魚体の毒
性確認のために注射法を利用した直接投与と、一般的に
魚類養殖場で多数の魚体を対象とした疾病治療用薬剤の
投与法として最も容易に適用されている浸漬法の二つの
方法により魚類に及ぼす毒性を確認した。

【００２２】実験に用いた魚類は、ひらめ（３ｇ）、真
鯛（１.５ｇ）およびくろそい（５ｇ）の稚魚を対象と
して毒性効果を検査し、δ−アミノレブリン酸の処理濃
度および方法は、５００ｍＭ，１００ｍＭ、５０ｍＭお
よび１０ｍＭのδ−アミノレブリン酸溶液を製造して体
内注射法で各魚体に１００μＬずつ腹腔内に注射して飼
育水槽に入れて１週間観察した。また、浸漬法による実
験のためにδ−アミノレブリン酸を３０Ｌ飼育海水に
５、０２８ｇを溶かして１６７.６ｐｐｍの濃度に作っ
た。同じ方法で１０倍および１００倍の希釈濃度である
１６.７６ｐｐｍおよび１.６７６ｐｐｍのδ−アミノレ
ブリン酸を含有する実験海水を製造して、各実験水槽に
実験魚を１０分、 ３０分、６０分、１２０分および１
８０分間露出した後、各経過時間毎に露出魚をそれぞれ
２０匹ずつ採取してδ−アミノレブリン酸無添加飼育水
槽に移し、１週間生存率を測定した。実験結果、表１に
示した通り、腹腔内注射法によるδ−アミノレブリン酸
処理実験群は全ての魚体および魚種にδ−アミノレブリ
ン酸処理濃度と関係なく生存率の変化が現われなかっ
た。浸漬法によるδ−アミノレブリン酸処理実験群は、
表２に示した通り、全ての処理実験区および対照区の生
存率が１００％で魚種間処理濃度間、浸漬時間間の差異
が現われなかった。結果的に、δ−アミノレブリン酸を
魚類に直接適用するための現場使用形態および経済性を
勘案した適用可能濃度範囲で魚体に対する直接的な毒性
はなかった。即ち、腹腔内に注射する場合、ひらめの場
合、５０ｍＭ以下の濃度で体重の３.３％以下で注射す
る場合、毒性が確認されなく、真鯛とくろそいの場合、
５０ｍＭ以下の濃度で体重の２.０％以下で注射する場
合、毒性が確認されなかった。そして、ひらめ、真鯛お
よびくろそいを１６７ｐｐｍの濃度で１８０分間まで浸
漬（薬浴）する場合、実験魚種に毒性が現われなかった
ため、魚類疾病治療剤または予防剤としての使用時に前
記の濃度以下ではひらめ、真鯛およびくろそいに無害で
あることが分かった。

【００２３】

【表１】

【００２４】

【表２】

【００２５】実施例３： in vitro 状でδ−アミノレブ
リン酸による魚類病原性微生物の増殖抑制効果 実験例１： 魚類病原性細菌の増殖抑制効果 本実験例に用いられた病原性指標細菌は麗水隣近の海産
魚養殖場で分離されたエドワードジエラタルダ細菌（Ed
wardsiella tarda）、ストレプトコッカス属細菌（Stre
ptococcus sp.）、スタフィロコッカス属細菌（Staphyl
ococcus sp.）、スタフィロコッカスエピデルミディス
細菌（Staohylococcus epidermidis）、シュ−ドモナス
属細菌（Pseudomonas sp.）、およびビブリオアングイ
ラルム細菌（Vibrio anguillarum ）を用いた。固体培
養時に０.２％ＮａＣｌが添加されたＴＳＡ（triptic s
oy agar）平板培地で培養し、液体培養時にはＢＨＩbro
th に２４時間培養して０.Ｄ値を１.０に調整して
実験に用いた。実験に用いたδ−アミノレブリン酸は、
市販用（Sigma）および本発明者が製造したδ−アミノ
レブリン酸（韓国特許出願番号１９９８―４１８９８）
でそれぞれ滅菌蒸留水１.０ｍＬにδ−アミノレブリン
酸０.１６７ｇを溶かしたものを原液（１.０Ｍ）として
用いた。１.０Ｍδアミノレブリン酸は、ＢＨＩbrothで
２倍率ずつ段階的に６４倍まで希釈して病原性細菌の増
殖阻害効果のための試験溶液に調剤した。 ９６wellマ
イクロプレートに段階的に希釈したδ−アミノレブリン
酸と細菌懸濁液を１：１比率で混合し、２５℃で６２０
ｎｍに設定された ELISA readerに入れ２４時間δ−ア
ミノレブリン酸濃度による細菌の成長を観察した。対照
区はδ−アミノレブリン酸の代わりにBHI brothと細菌
懸濁液を１：１にで混合して実験区と同じ方法で行っ
た。海産養殖魚の主要病原性細菌であるエドワードジエ
ラタルダ細菌、ストレプトコッカス属細菌、ストレプト
コッカス属細菌、スタフィロコッカスエピデルミディス
細菌、シュードモナス属細菌およびビブリオアングイラ
ルム細菌に対するδ−アミノレブリン酸のＭＩＣ検索
は、平板薬剤ディスク法で行った。それぞれの細菌培養
液１００μＬを一定量のtop agarと混合してＴＳＡagar
に塗抹した後、１.０Ｍδ−アミノレブリン酸溶液をＰ
ＢＳで２倍率希釈して各希釈液１０μＬを滅菌したディ
スクに吸湿させた後、２３〜２５℃の培養基で２〜３日
間培養して clear zoneの大きさ（ｍｍ）を測定して抗
菌力で示した。対照区はδ−アミノレブリン酸希釈液の
代わりにＰＢＳを同量ディスクに吸湿させて測定した。
また、本発明者が製作したδ−アミノレブリン酸を利用
した実験でエドワードジエラタルダ細菌とストレプトコ
ッカス属細菌のδ−アミノレブリン酸による増殖阻害効
果と共に韓国の海産魚養殖場に頻繁に検出されて飼育魚
類の大量斃死を誘発するストレプトコッカス属、スタフ
ィロコッカスエピデルミディス、ビブリオアングイラル
ムおよびシュードモナス属を追加的に確保して、ＭＩＣ
検索によるδ−アミノレブリン酸による病原性細菌の増
殖阻害を測定した。この際、ＭＩＣ検索用細菌をＢＨＩ
brothに接種して２３〜２５℃に調整した培養基で２〜
３日間培養した。培養された細菌を６００ｎｍで吸光度
を測定して、０.Ｄ値を１.０に調整した細菌懸濁液を製
造して用いた。但し、シュードモナス属細菌の０.Ｄ値
は０.６に調整した懸濁液を製造して用いた。ＭＩＣ実
験は細菌培養液１００μＬを一定量のtop agarと混合し
てＴＳＡagarに塗抹した後、１.０Ｍδ−アミノレブリ
ン酸溶液をＰＢＳで２倍率希釈して、各希釈液１０μＬ
を滅菌したディスクに吸湿させた後、２３〜２５℃の培
養基で２〜３日間培養して、clear zoneの大きさ（ｍ
ｍ）を測定して抗菌力で示した。対照区はδ−アミノレ
ブリン酸希釈液の代わりにＰＢＳを同量ディスクに吸湿
させて測定した。実験結果、市販用δ−アミノレブリン
酸を利用した実験でδ−アミノレブリン酸濃度による病
原性細菌の増殖阻害効果は、図２（エドワードジエラタ
ルダ細菌）、図３（ストレプトコッカス属細菌）に示し
た通りである。δ−アミノレブリン酸の希釈率が１／３
２倍（３１ｍＭ）以下では二つの細菌全て増殖が抑制さ
れたが、１／６４倍（１６ｍＭ）以上の希釈率では対照
区と目立つ差異がなかった。本発明者が製作したδ−ア
ミノレブリン酸の実験結果は表３に示した。市販用δ−
アミノレブリン酸とその効果面に差異をみせなかった。

【００２６】

【表３】

【００２７】実験例２： 魚類病原性ウイルスの駆除効
果 本実験例では主要海産魚養殖魚種であるひらめ、くろそ
い、すずき等に感染して大量斃死原因として作用する海
洋バーナウイルス（marine birnavirus,MAVB）を対象と
してδ−アミノレブリン酸処理によるウイルス感染価の
変動を魚類株化細胞を利用したＴＣＩＤ５０ 法で確認
した。実験に用いられたウイルスは麗水隣近の養殖場の
ひらめから分離報告された種であって、先ず、ＣＨＳＥ
−２１４細胞でウイルス感染価を確認し、それを実験ウ
イルス液として用いた。反応はウイルス培養液とδ−ア
ミノレブリン酸希釈液（８ｍＭ）を同量混合して３０分
間反応させた後、培養細胞に接種し、２０℃で培養しな
がら経時的なウイルス感染価の変動をＨＢＳＳ反応ウイ
ルス液（対照区）のウイルス感染価の変動と比較した。
実験結果、表４に示した通り、培養細胞内におけるδ−
アミノレブリン酸処理によりＭＡＢＶが不活性化された
ことを確認することができた。

【００２８】δ−アミノレブリン酸処理によるＭＡＶＢ
ウイルス感染価の変動

【表４】

【００２９】実施例４： in vivo状でδ−アミノレブリ
ン酸による魚類病原性微生物の増殖抑制効果 実験例１： 水槽投与および経口投与による毒性調査 ２５ｇ前後のひらめ２０匹を二つの実験区と一つの対照
区に設定して循環濾過システムで飼育した。実験区１は
実験開始日から飼育水に３日に１回ずつδ−アミノレブ
リン酸を投与して飼育水中のδ−アミノレブリン酸濃度
を０.１〜１０ｐｐｍに維持させながら１〜３週間飼育
し（水槽投与）、実験区２は飼料として用いられる人工
配合飼料（ＥＰ、魚体重量の３％：１５ｇ）１ｋｇに対
しδ−アミノレブリン酸溶液を噴霧して０.１〜１００
ｐｐｍの濃度で添加した後、乾燥して投与しながら１〜
３週間飼育した(経口投与)。実験期間実験区１と無処理
区は実験区２の飼料量と同量の市販人工配合飼料をδ−
アミノレブリン酸処理なくそのまま用いた。使用した魚
類病原性細菌らはBrain heart Infusion（ＢＨＩ）brot
h培地１Ｌを２Ｌ三角フラスコに取り滅菌した後、それ
ぞれのフラスコにエドワードジエラタルダ細菌、ストレ
プトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌、スタ
フィロコッカスエピデルミス細菌、シュ−ドモナス属細
菌およびビブリオアングイラルム細菌を接種して３時間
震盪培養して魚類病原菌らを製造した。病原性細菌の人
為感染は実験飼育３週後に施行し、人為攻撃方法は培養
菌を生理食塩水で希釈して魚類１匹当り１０５ＣＦＵで
直接的な腹腔注射法(注射量３００μＬ／fish)で行っ
た。人為感染された各実験区別実験魚は観察用水槽に移
して２週間その感染および感染による斃死を観察した。
実験全期間の水温は２０℃（±２℃）に維持した。実験
結果、表５に示した通り、飼育水中のδ−アミノレブリ
ン酸濃度を１０ｐｐｍに維持した実験区１と飼料１ｋｇ
当り０.１〜１００ｐｐｍのδ−アミノレブリン酸を添
加して飼育した実験区２はδ−アミノレブリン酸が含有
されていない対照区と同様に飼育中の斃死は起こらなか
った。このような結果は、δ−アミノレブリン酸が魚類
株化細胞に毒性を示さないとの結果と一致した。

【００３０】

【表５】

【００３１】実験例２： 魚類病原性細菌であるエドワ
ードジエラタルダ細菌感染予防効果 前記実験例１と同じ方法で実験区と対照区の魚類を準備
し、魚類１匹当りエドワードジエラタルダ１０５ＣＦで
直接的な腹腔注射法で人為感染させた後、それぞれの実
験魚を観察用水槽に移し、感染による斃死を２週間観察
し、２週後の生存率を調査した。実験結果、表６に示し
た通り、δ−アミノレブリン酸を投与しなかった無投与
対照区の場合、実験魚の生存率は５〜１０％と現われた
反面、浸漬法と経口投与法によりδ−アミノレブリン酸
を処理した処理区の生存率は度外れに高く現われた。

【００３２】

【表６】

【００３３】実験例３： 魚類病原性細菌ストレプトコ
ッカス属細菌の感染予防効果 実験例１と実験例２で実施した魚類の飼育、δ−アミノ
レブリン酸の処理および人為感染と同じ方法でひらめと
くろそいに腹腔注射法によりストレプトコッカス属細菌
を人為感染させた後、それぞれの実験魚を観察用水槽に
移し、感染による斃死を２週間観察した。表２に示した
通り、δ−アミノレブリン酸を投与しなかった無投与対
照区の場合、実験魚の生存率は５〜１０％と現われた反
面、水槽投与法と経口投与法によりδ−アミノレブリン
酸を処理した処理区の生存率は６５％以上で、前記実験
例２のエドワードジエラタルダ攻撃による生存率に比べ
てやや低いが、これまた生存率は高い方であった。

【００３４】

【表７】

【００３５】実験例４： 魚類病原性細菌であるスタフ
ィロコッカスエピデルミディス細菌感染予防効果 実験例１と実験例２で実施した魚類の飼育、δ−アミノ
レブリン酸の処理および人為感染と同じ方法でひらめと
くろそいに腹腔注射法によりスタフィロコッカスエピデ
ルミディス細菌を人為感染させた後、それぞれの実験魚
を観察用水槽に移して感染による斃死を２週間観察し
た。表８に示した通り、δ−アミノレブリン酸を投与し
なかった無投与対照区の場合、くろそい実験魚の生存率
は５％程と現われた反面、水槽投与法と経口投与法によ
りδ−アミノレブリン酸を処理した処理区の生存率は高
く現われた。

【００３６】δ−アミノレブリン酸処理飼育ひらめとく
ろそいのスタフィロコッカスエピデルミディスの人為感
染に対する予防効果

【表８】

【００３７】実験例５： 魚類病原性細菌であるスタフ
ィロコッカス属細菌感染予防効果 実験例１と実験例２で実施した魚類の飼育、δ−アミノ
レブリン酸の処理および人為感染と同じ方法でひらめと
くろそいに腹腔注射法によりスタフィロコッカス属細菌
を人為感染させた後、それぞれの実験魚を観察用水槽に
移して感染による斃死を２週間観察した。実験結果、表
９に示した通り、δ−アミノレブリン酸を投与しなかっ
た無投与対照区の場合、実験魚の生存率は５％程と現わ
れた反面、水槽投与法と経口投与法によりδ−アミノレ
ブリン酸を処理した実験区の生存率は５５％以上と現わ
れた。

【００３８】

【表９】

【００３９】実験例６： 魚類病原性細菌であるシュー
ドモナス属細菌感染予防効果 実験例１と実験例２で実施した魚類の飼育、δ−アミノ
レブリン酸の処理および人為感染と同じ方法でひらめと
くろそいに腹腔注射法によりシュードモナス属細菌を人
為感染させた後、それぞれの実験魚を観察用水槽に移し
て感染による斃死を２週間観察した。実験結果、表１０
に示した通り、δ−アミノレブリン酸を投与しなかった
無投与対照区の場合、実験魚の生存率は５〜１５％程と
現われた反面、水槽投与法と経口投与法によりδ−アミ
ノレブリン酸を処理した処理区の生存率は度外れに高く
現われた。

【００４０】

【表１０】

【００４１】実験例７： 魚類病原性細菌であるビブリ
オアングイラルム細菌感染予防効果 実験例１と実験例２で実施した魚類の飼育、δ−アミノ
レブリン酸の処理および人為感染と同じ方法でひらめと
くろそいに腹腔注射法によりビブリオアングイラルム細
菌を人為感染させた後、それぞれの実験魚を観察用水槽
に移して感染による斃死を２週間観察した。表１１に示
した通り、δ−アミノレブリン酸を投与しなかった無投
与対照区の場合、実験魚の生存率は１０〜１５％程と現
われた反面、水槽投与法と経口投与法によりδ−アミノ
レブリン酸を処理した処理区の生存率は度外れに高く現
われた。

【００４２】

【表１１】

【００４３】実施例５： in vivoでδ−アミノレブリン
酸の養育による病原菌感染魚類治療効果 本実施例で実験魚としてひらめとくろそいの稚魚（平均
体重２ｇ）を各実験区に５０匹ずつ飼育水槽に収容し１
週間予備飼育して安定化させた。人為感染は魚類病原性
細菌６種（Edwardsiella tarda, Streptococcus sp., S
taphylococcussp., Staphylococcus epidermidis, Pseu
domonas sp. およびVibrio anguillarum ）を感染病原
体として用い、人為感染方法は浸漬法で行った。即ち、
飼育水槽に感染病原体を入れて病原体の濃度を１０４Ｃ
ＦＵ／ｍＬになるように調整した海水にそれぞれ１時間
浸漬して感染させた。治療条件は人為的な感染後に感染
魚体を飼育水槽に移し、３日間感染させた後、感染４日
目にδ−アミノレブリン酸を飼育水槽水に０.１、１.
０、５および１０ｐｐｍになるように処理して換水せず
に１〜２４時間通気条件で飼育した後、清い海水で換水
して２週間飼育しながら感染による魚の斃死を確認し
た。対照実験区は各細菌らを浸漬法により同一に感染処
理した後、δ−アミノレブリン酸無処理条件で飼育しな
がらそれぞれの細菌感染によるひらめとくろそいの斃死
を確認した。実験結果、ひらめ（表１２〜１５）とくろ
そい（表１６〜１９）全てδ−アミノレブリン酸処理区
の生存率が高かった。

【００４４】

【表１２】

【００４５】

【表１３】

【００４６】

【表１４】

【００４７】

【表１５】

【００４８】

【表１６】

【００４９】

【表１７】

【００５０】

【表１８】

【００５１】

【表１９】

【００５２】実施例６： δ−アミノレブリン酸経口投
与による病原菌感染魚類治療効果 本実施例では実験魚としてひらめとくろそいの稚魚（平
均体重２ｇ）を各実験区に５０匹ずつ飼育水槽に収容し
て１週間予備飼育して安定化させた。人為感染は魚類病
原性細菌６種（Edwardsiella tarda, Streptococcus s
p. Staphylococcus sp., Staphylococcus epidermidis,
Pseudomonas sp. およびVibrio anguillarum）を感染
病原体として用い、人為感染方法は浸漬法により行っ
た。即ち、飼育水槽に感染病体を入れて病原体の濃度を
１０４ＣＦＵ／ｍＬになるように調整した海水にそれぞ
れ１時間浸漬して感染させた。治療条件は人為的な感染
後に感染魚を飼育槽に移して３日間感染期間を与えた
後、感染４日目に飼料に０.１〜５０ｐｐｍのδ−アミ
ノレブリン酸を添加して清い海水で換水して２週間飼育
しながら感染による魚の斃死を確認した。対象実験区は
各細菌らを浸漬法により同一に感染処理した後、δ−ア
ミノレブリン酸を含有していない市販配合飼料で飼育し
ながらそれぞれの細菌感染によるひらめとくろそいの斃
死を確認した。実験結果、ひらめ（表２０〜２３）とく
ろそい(表２４〜２７)全てδ−アミノレブリン酸処理区
の生存率が高かった。

【００５３】

【表２０】

【００５４】

【表２１】

【００５５】

【表２２】

【００５６】

【表２３】

【００５７】病原性細菌感染くろそいに対する０.１ｐ
ｐｍのδ−アミノレブリン酸処理による治療効果

【表２４】

【００５８】

【表２５】

【００５９】病原性細菌感染ひらめに対する１０ｐｐｍ
のδ−アミノレブリン酸処理による治療効果

【表２６】

【００６０】

【表２７】

【００６１】実施例７： ウイルス感染魚類治療効果 本実施例では実施例３の実験例２で実験した通り、in v
itro条件でδ−アミノレブリン酸処理によるウイルスの
感染抑制効果が確認された実験結果に照らして実際ウイ
ルスの感染により疾病が進行している魚類を対象として
δ−アミノレブリン酸を処理したとき、感染魚の斃死率
の現象を確認した。麗水隣近の養殖場でＰＣＲ法により
診断されたイリドウイルス（irido virus）感染魚群に
含まれた真鯛を各３０匹ずつ三つの水槽に隔離収容し、
本発明者が製作したδ−アミノレブリン酸を利用してδ
−アミノレブリン酸処理Ａ群（１０ｐｐｍ）、δ−アミ
ノレブリン酸処理Ｂ群（１.０ｐｐｍ）、δ−アミノレ
ブリン酸処理Ｃ群（０.１ｐｐｍ）およびδ−アミノレ
ブリン酸無処理対照群に分けて経時的な斃死率の変化を
確認した。δ−アミノレブリン酸処理各実験区を３日間
隔で３回処理し、１０日目までの結果を示した。実験結
果、表２８の感染魚実験結果からみられる通り、本ウイ
ルスの感染による斃死率は実際養魚場の場合７０％に至
るが、本実験条件では感染個体を無処理した状態の場
合、１０日が経過するまで５０％の累積斃死率を示し
た。しかし、δ−アミノレブリン酸を処理した区の場
合、実験観察１０日間に亘ってＡ，ＢおよびＣの実験条
件で１７％、１７％、および２７％の低い斃死率を示し
た。このような点からδ−アミノレブリン酸がウイルス
疾病に対し治療効果を示すことにより、δ−アミノレブ
リン酸処理による感染魚の生存率が向上された。

【００６２】

【表２８】

【００６３】実施例８： エドワード細菌感染魚類治療 本実験例では陸上水槽式養殖場で飼育中のひらめ（平均
体重１１ｇ）が自然発生的な発病により斃死している養
殖場があり、その養殖場の感染魚を調査した結果、感染
源はエドワードタルダ細菌が主要原因であって、斃死発
生後５日程が経過する間に飼育タンク当り３０〜４０％
の累積斃死が生じ、δ−アミノレブリン酸処理当時にも
エドワード感染による典型的な症状である腹部膨満およ
び肛門の脱腸等の病変を示す固体が観察されて、病の進
行が非常に深刻に起こっている状況であるのを確認し、
養殖場の水槽にδ−アミノレブリン酸を処理した。二つ
の飼育水槽を対象として水槽に初日０.１ｐｐｍのδ−
アミノレブリン酸で２時間薬浴処理し、２日と３日目に
０.０１ｐｐｍの濃度で２時間−アミノレブリン酸で薬
浴処理した後に換水して生存状態を観察した。δ−アミ
ノレブリン酸で薬浴処理した水槽（薬３、０００匹）の
場合、投与後１週間の累積斃死率が４０％を維持したの
に反し、δ−アミノレブリン酸無処理水槽の場合には６
０%以上の斃死と継続的な病の進行が観察され、以後に
も約２０％程の斃死がもっと生じたのが確認された。結
果的に、無処理区の場合、約８０％の累積斃死を記録し
たのに比べて発病中に−アミノレブリン酸で薬浴処理し
た処理区の場合、その斃死率が約４０％を示し、健康度
の比較においても卓越な状態が観察された。

【００６４】実施例９： δ−アミノレブリン酸の魚類
病原寄生虫類スクチカ虫に対する抑制効果 実験例１： in vitroで魚類寄生虫であるスクチカ虫死
滅効果 本実験例に用いられたスクチカ虫は寄生虫に感染された
ひらめの表皮粘液を一定量取ってＨＢＳＳに懸濁させた
後、浮遊液を作り３０分間室温に放置し、８００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離して上澄液を捨て、沈澱物をＭＥＭ
−１０（minimumessential medium, 10%FBS, streptomy
cin, penicillin）に懸濁させて３０分間放置後、同一
に遠心分離して上澄液を除去し虫体のみを得て、血球計
数器で計数して一定数の虫体懸濁液を製造した。製造さ
れた虫体懸濁液を実験室内で継代培養して一定数（２.
５×１０５cells／mL）を予め準備して置いたＦＨＭ細
胞に接種して１７℃で培養した。次いで、実験前にδ−
アミノレブリン酸濃度別、反応時間別によるスクチカ虫
の死滅効果を測定してスクチカ虫の駆除のための最適δ
−アミノレブリン酸濃度と処理時間を検討した。ＦＨＭ
cell lineに培養されたスクチカ培養液を３０００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離して殺虫液を捨てＰＢＳを添加し３
回洗滌して実験に用いた。滅菌した３次蒸留水で作った
１.０Ｍδ−アミノレブリン酸溶液を原液として２倍ず
つ希釈して１００倍（１.０ｍＭ）まで希釈した。９６
ウェルマイクロプレート（well microplates）にスクチ
カを各ウェルに５０μＬずつ入れ、２段階で希釈された
δ−アミノレブリン酸溶液を加えて１２０分間培養しな
がらスクチカ虫の生存状態を観察した。 １２０分間の
培養中各濃度におけるスクチカ虫の死滅時間を10分間隔
で測定した。接種間毎に5分は攪拌（stirring）し、5分
は放置した。反応が終わった後、生体検査染色液である
１％トリパンブルー（trypan blue）を各ウェルに１０
０μＬずつ同一に添加して混合した後、δ−アミノレブ
リン酸希釈液と共に培養されたスクチカ虫を時間帯別に
血球計算盤を利用して寄生虫の数を測定した。実験結
果、表29に示した通り、δ−アミノレブリン算の濃度が
５００〜６０ｍＭの場合、処理後10分以内に完全に死滅
し、３０〜１５ｍＭの濃度範囲では処理時間20分でスク
チカ虫を完全に死滅させることができ、実際濃度８ｍＭ
範囲では60分以上の処理条件で完全に死滅し、60分以内
の処理により５０％以上のスクチカが死滅した。実際処
理濃度２ｍＭの濃度条件である場合、1時間の処理で５
０％程のスクチカ虫が死滅した。実際濃度５００〜２ｍ
Ｍの濃度範囲の処理条件で最小限2時間の処理により９
０％以上のスクチカ虫が死滅することにより、δ−アミ
ノレブリン惨によるスクチカ虫の駆除が可能であること
が分かった。

【００６５】

【表２９】

【００６６】実験例２： in vivoでスクチカ虫の魚体人
為感染に対する予防効果 ２５ｇ前後のひらめ２０匹を二つの実験区と１個の対照
区に設定して循環濾過システムで飼育した。実験区１は
実験開始日から飼育水に３日に１回ずつ δ−アミ
ノレブリン酸を投与して飼育水中のδ−アミノレブリン
酸濃度を０.１〜５０ｐｐｍに維持させながら１〜３週
間飼育し（水槽投与）、実験区２は飼料として用いられ
る人工配合飼料（ＥＰ， 魚体重量の３％：１５ｇ）１
ｋｇに対しδ−アミノレブリン酸溶液を噴霧して１.０
〜１００ｐｐｍの濃度で添加した後、乾燥して投与しな
がら１〜３週間飼育した（経口投与）。実験期間中実験
区１と無処理区は実験区２の飼料量と同一の量で市販さ
れる人工配合飼料をδ−アミノレブリン酸処理なくその
まま用いた。感染はＦＨＭ細胞上で純粋培養されたスク
チカ虫体を利用して人為的な感染実験を行った。虫体の
人為感染は実験飼育３週後に施行し、人為攻撃方法は培
養虫液（１０００個体／ｍ）に直接浸漬して暴気状態で
３０分間露出する方法で行った。人為感染後、それぞれ
の実験区別実験魚を観察用水槽に移し、２週間感染およ
び感染による斃死を観察した。人為感染された各実験区
別実験魚は観察用水槽に移し、２週間その感染および感
染による斃死を観察した。実験全前期間中の水温は２０
℃（＋２℃）に維持した。実験結果、表３０に示した通
り、飼育水中のδ−アミノレブリン酸濃度を１０ｐｐｍ
に維持した実験区１と飼料１ｋｇ当り１００ｐｐｍの濃
度でδ−アミノレブリン酸を添加して飼育した実験区２
は、δ−アミノレブリン酸が含有されていない対照区と
同様に飼育中の斃死は起こらなかった。このような結果
はδ−アミノレブリン酸が魚類株化細胞に毒性を示さな
いとの結果と一致した。また、人為的な攻撃によりスク
チカ虫に感染された実験魚を観察用水槽に移し、感染に
よる斃死を2週間観察し２週後の生存率を表31に示し
た。表31に示した通り、δ−アミノレブリン酸を投与し
なかった無投与対照群の場合、実験魚の生存率は４０〜
４５％と現われた反面、水槽投与法と経口投与法により
δ−アミノレブリン酸を処理した処理区の生存率は度外
れに高く現われた。

【００６７】δ−アミノレブリン酸処理によるひらめと
くろそいの飼育実験結果

【表３０】

【００６８】

【表３１】

【００６９】実験例３： スクチカ感染種苗生産場に適
用 ひらめ種苗生産場で種苗を生産して販売段階（体長５〜
６ｃｍ）にスクチカ虫の感染が発生して販売を中断して
いる種苗生産場のひらめ稚魚を対照として本発明者が製
造したδ−アミノレブリン酸で処理した、種苗生産場で
選別して感染魚だけを集めて置いた水槽に収容されてい
る重症魚が治療対象であった。初日ホルマリン３０ｐｐ
ｍを処理し、二日および三日１ｐｐｍの濃度で２時間ず
つδ−アミノレブリン酸を処理し、換水して状態を観察
した。実験結果、処理魚の活力が処理した翌日から目立
って良くなり、引き続いた斃死が著しく減る傾向をみせ
た。その以後、飼育用水中の病原体管理が可能なオゾン
処理システムを適用している飼育場の飼育水槽に収容し
て飼育した結果、正常的な飼育が可能であった。２週間
の飼育期間後、魚体のサンプリングによる魚体内のスク
チカ虫の感染を調査したところ、その感染が確認されな
かった。

【００７０】

【発明の効果】以上、前記実施例により説明した通り、
δ−アミノレブリン酸を魚類に水槽投与または経口投与
する場合、魚類病原性細菌の感染を予防および治療でき
ることにより、抗生剤を用いなくても海産魚を養殖する
ことができる優れた効果があり、またウイルス感染魚類
を治療する効果があり、スクチカ寄生虫の感染も予防し
治療する優れた効果があるため、魚類養殖産業上非常に
有用な発明である。

【００７１】

【図面の簡単な説明】

【図１】δ−アミノレブリン酸濃度による魚類株化細胞
に対する細胞毒性効果を示すグラフである。

【図２】

【図３】市販用δ−アミノレブリン酸濃度による魚類病
原性細菌エドワードジエラタルダ細菌（図２）とスタフ
ィロコッカス属（図３）増殖阻害効果を示す図面であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 １７１ Ａ６１Ｐ 31/04 １７１ 33/00 １７１ 33/00 １７１ (71)出願人 501023270 呉 明柱 大韓民国 全羅南道麗水市新月洞 錦湖ア ハ゜ト12棟1504号 (72)発明者 金亨洛 大韓民国 釜山広域市南区大淵３洞 三益 ク゛リーンアハ゜ト102棟403号 (72)発明者 金在豪 大韓民国 忠清北道清酒市斜川洞 新東亜 アハ゜ト５棟103号 (72)発明者 呉明柱 大韓民国 全羅南道麗水市新月洞 錦湖ア ハ゜ト12棟1504号 (72)発明者 卞大石 大韓民国 釜山広域市蓮堤区蓮山８洞 鮮 京アハ゜ト103棟202号 Ｆターム(参考） 2B005 GA01 MB07 2B104 AA01 BA13 BA14 EF11 2B150 AA08 AB10 DA32 4C206 AA01 AA02 FA47 MA04 MA72 NA14 ZB33 ZB35 ZB39 ZC61 4H011 AA02 AA04 AC01 BB06 DD01 (54)【発明の名称】 魚類病原性微生物と寄生虫の感染予防および治療のためのδ−アミノレブリン酸の新規の用途｛ Ｎｏｖｅｌｕｓｅｏｆｄｅｌｔａ−ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃａｃｉｄｆｏｒｐｒｅｖｅｎ ｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｉｃｒ ｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄｐａｒａｓｉｔｅ｝

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】δ−アミノレブリン酸（δ−aminolevulin
   ic acid：ALA）を有効成分として含有する魚類病原性微
   生物の感染予防および治療用組成物。
2. 【請求項２】前記魚類病原性微生物がエドワードジエラ
   タルダ細菌（Edwardsiella tarda）、ストレプトコッカ
   ス属細菌（Streptococcus sp.）スタフィロコッカス属
   細菌（Staphylococcus sp.）、スタフィロコッカスエピ
   デルミディス細菌 (Staphilococcus epidermidis) 、
   シュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）、またはビ
   ブリオアングイラルム細菌（Vibrio anguillarum）であ
   ることを特徴とする請求項１記載の魚類病原性微生物の
   感染予防および治療用組成物。
3. 【請求項３】前記魚類病原性微生物の感染予防および治
   療用組成物を魚類養殖飼育水槽に０.１〜１００ｐｐｍ
   の濃度で添加して水槽投与したり、通常の魚類養殖試料
   に１.０〜１００ｐｐｍを添加して経口投与することに
   より、魚類病原性微生物の感染を予防したり治療するこ
   とを特徴とする請求項１または２記載の魚類病原性微生
   物の感染予防および治療方法。
4. 【請求項４】δ−アミノレブリン酸（δ−aminolevulin
   ic acid）を有効成分として含有するイリドウイルス（i
   rido virus）感染治療用組成物。
5. 【請求項５】前記イリドウイルス感染治療用組成物を魚
   類養殖飼育水槽に０.１〜１０ｐｐｍの濃度で添加して
   水槽投与することにより、イリドウイルス感染を治療す
   ることを特徴とする請求項４記載のイリドウイルス感染
   治療方法。
6. 【請求項６】δ−アミノレブリン酸（δ−aminolevulin
   ic acid）を有効成分として含有するスクチカ虫感染予
   防および治療用組成物。
7. 【請求項７】前記スクチカ虫感染予防および治療用組成
   物を魚類養殖飼育水槽に０.１〜１００ｐｐｍの濃度で
   添加して水槽投与したり、通常の魚類養殖飼料に１.０
   〜１００ｐｐｍを添加して経口投与することにより、ス
   クチカ虫感染予防および治療をすることを特徴とする請
   求項６記載のスクチカ虫感染予防および治療方法。
8. 【請求項８】δ−アミノレブリン酸（δ−aminolevulin
   ic acid）を通常の魚類養殖飼料に１.０〜１００ｐｐｍ
   を含有させることを特徴とする魚類養殖用飼料。