KR20010102752A - 어류 병원성 세균과 바이러스의 감염 예방 및 치료를 위한δ-아미노레불린산의 신규한 용도 - Google Patents

어류 병원성 세균과 바이러스의 감염 예방 및 치료를 위한δ-아미노레불린산의 신규한 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid:ALA)을 유효성분으로 함유하는 어류 병원성 미생물의 감염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 δ-아미노레불린산을 어류에 수조투여 또는 경구투여할 경우 어류 병원성 세균의 감염을 예방 또는 치료함으로써 항생제를 사용하지 않고도 어류를 양식할 수 있는 뛰어난 효과가 있고 또 바이러스 감염 어류를 치료하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

어류 병원성 세균과 바이러스의 감염 예방 및 치료를 위한 δ-아미노레불린산의 신규한 용도{Novel use of delta-aminolevulinic acid for the prevention and treatment of infection by pathogenic microorganism}
본 발명은 δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid:ALA)을 유효성분으로 함유하는 어류 병원성 미생물과 기생충의 감염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, δ-아미노레불린산을 사육수조에 함유시켜 어류를 양식하거나 사료에 혼합하여 어류에 경구투여함으로써 어류의 병원성 미생물과 기생충의 감염을 예방하거나 감염된 어류를 치료하는 조성물에 관한 것이다.
최근, 어류의 인공종묘생산 기술개발과 더불어 해산어류의 양식산업이 급속히 발달됨으로써 넙치, 조피볼락, 참돔, 농어, 복어 등의 고급어종이 주된 양식 대상종으로 각광받고 있다. 이러한 양식업의 급속한 신장으로 말미암아 우리나라의 연안해수를 포함한 주위환경은 어류질병의 주요한 병인성 바이러스 헤르퍼스바이러스(Herpersvirus), 버나바이러스(Birnavirus), 랩도바이러스(Rhabdovirus) 등과 에드와드지엘라속(Edwardsiella sp.), 비브리오속(Vibriosp.), 스타필로코쿠스속 (Staphylococcussp.), 스트렙토코쿠스속(Streptococcus)및 플렉시바터속 (Flexibatersp.) 등의 병원성 세균들에 의해 오염되어 있을 개연성 때문에 항상 바이러스와 세균에 의한 질병발생의 위험을 안고 있으며(Cheung, R.J., Nigrelli, R.F. and Ruggieri, G.D. 1980. Stidies on the morphology og uronema with a description of the infection in marine fishes,J. Fish Disease, 3; 295;Drolet M., Peloguin L., Escelard Y., CousineauL., and Sasarman A., 1989. Isolation and nucleotide sequence of the hemA gene ofE. coli K-12,Mol. Gen. Genet, 216; 347:Ellen, N.L, and Kaplan S., 1993. 5-Aminolevulinic acid availability and control of spectral complex formation in hemA and hemT mutant of R. spharoides,J. Bacteriol., 175; 2304.)이러한 병원체의 감염에 의해 어류양식업은 심각한 피해를 받고 있는 실정이다. 특히, 병원성 세균과 바이러스의 감염피해는 종묘생산이 성어양식의 경우 보다 심한 상태이며 그 피해 또한 해마다 증가하고 있다. 이러한 세균성 질병의 치료와 예방 목적으로 현재는 수의용항생제를 사용하고 있는 실정이다. 동정이 되지 않은 병원균이 일으킨 질병을 치료하고자 적절치 못한 항생제를 과다투여하는 것은 양식어가의 비용만을 증가시키고 새로운 항생제내성을 부여함으로서 새로운 약제내성을 지닌 세균의 출현을 초래케할 위험성이 있으며 실험에 지체되는 시간이 길어져 신속히 처치할 수 없게됨에 따라 양식어류의 폐사가 증가하는 관계로 양식어류의 활력 또는 면역능을 증가시키기 위한 사료보조제가 개발되고 있다.
최근, 화학 합성 살충제 및 제초제의 과다한 사용으로 인한 유독성으로 환경오염의 문제가 대두됨에 따라 생물학적, 특히 미생물 근원의 신소재의 발굴이 요구되고 있다. 이러한 관점에서 δ-아미노레불린산은 모든 생물에서 헴(heme), 박테리오클로로필(bacteriochlorophyll), 코리노이드(corrinoid) 등 테트라피롤 (tetrapyrrole) 화합물들의 생합성 전구체로서, 현재까지 알려진 유일한 생물소재인 포도다이나믹(photodynamic) 물질로서 제초제, 살충제, 식물 성장촉진제 및 암 치료제로서 그 효과가 널리 보고되어 있다 (Hua, Z., Scott, L.G., Thomas, H.F., and Russell, H., 1995, Effectiveness of delta-aminolevulinic acid induced protoporphyrin as a photosensitizer for photodynamic therapyin Vivo, Cancer Research, 55; 1723;Matsumoto, T.H., Usui, K., and Ishizuka, K. 1992, Basis of Differential Tolerance of Plant Species to delta-Aminolevulinic Acid,Weed Research, 37; 60;Matsumoto, H., Tanida, Y., and Ishizuka, K. 1994. Porphyrin Intermediate Involved in Herbicidal Action of delta-Aminolevulinic Acid on Duckweed,Pesticide Biochemistry, 48; 214;Rebeiz, C.A, Juvik, J.A., andReibez, C.C. 1988. Porphyric insecticides: Concep and phenomenology,Pestic. Biochem. Physiol., 30; 11;Tanaka, T., Takahashi, K., Hotta, Y., Takeuchi, Y., and Konnai, M., 1992. 5-aminolevulinic acid as plant growth stimulator,Eur. Pat. Appl. EP514 776,) 또한 δ-아미노레불린산은 자연에서 쉽게 분해되므로 환경 친화적인 제초, 살충제로서 간주되어 왔다. 그러나 미생물에서 생산되는 δ-아미노레불린산의 양은 그 농도가 낮고 화학적 합성에 의한 생산 또한 복잡한 합성단계(Beale, S.I., Gold, M.H., and Granick, S., 1979, Chemical synthesis of 4,5,-dioxavaleric acid and its non-enzymatic transamination to 5-aminolevulinic acid,Phytochemistry, 18; 441.)로 인하여 산업화가 어려우므로 현재는 독성이 강한 디페닐 에테르(diphenyl ether ;DPEs) 및 옥사디아졸(oxadiazole) 등과 같은 합성 포토다이나믹(photodynamic) 제초제를 화학적 합성을 통하여 생산하고 있다. 이러한 합성 포토다이나믹 제초제의 동물과 인체에의 유해성과 느린 분해속도로 인한 환경오염의 문제가 제기되고 있으며, 그 예로 골프장에서의 제초제 남용으로 인한 상수도원의 오염과 인근 농민들의 피해가 사회문제로 대두되고 있는 점이다.
로도박터(Rhodobacter)로부터 특히 많이 생산되는 δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid;ALA)은 식물에 살포되면 쌍자엽식물에만 선택적으로 작용하여 태양광선에 의해서 강력한 산화물질인 피클리드(pchlide)가 형성되고, 이 물질에 의한 일련의 산화반응이 일어나 잎의 인지질이 파괴되어 잎이 고사되는 제초활성을 나타낸다. 그러므로 δ-아미노레불린산은 사람과 동물 그리고 농작물에는 피해를주지 않으면서 잡초를 선택적으로 고사(Rebeiz, C.A., Montazer-Zouhoor, A., Hopen, H., and Wu, S.M., 1984. Photodynamic herbicides. Concep and phenomology,Enzyme Microb. Technol., 6; 390.)시키므로 환경친화성의 제초제로서 보고되고 있다(Rebeiz, C.A, Juvik, J.A., and Reibez, C.C. 1988. Porphyric insecticides: Concep and phenomenology,Pestic. Biochem. Physiol., 30; 11.). 그러나 현재 δ-아미노레불린산은 여러 단계의 복잡한 과정을 거쳐 유기합성을 하여야하므로 생산단가가 높아 채산성이 없으므로 현재 이용되고 있는 제초제의 대부분은 인체독성 및 토양잔류독성 등이 높아 문제점을 안고 있다(Beale, S.I., Gold, M.H., and Granick, S., 1979, Chemical synthesis of 4,5,-dioxavaleric acid and its non-enzymatic transamination to 5-aminolevulinic acid,Phytochemistry, 18; 441.)
식품은 영양, 맛 및 안전성의 순으로 중요시되던 종래의 개념이 국민소득의 증대와 건강에 대한 관심 때문에 오히려 식품의 안전성이 가장 중요시되고 있다. 이러한 식품의 안전성은 식품 중에 오염 또는 혼입되어 있는 병원성 미생물, 중금속, 농약 및 항생물질들이 가장 빈번하게 대두되고 있으며, 양식어류의 경우 항생물질의 과량투여로 인한 어류의 조직내에 잔류하는 항생물질은 식품의 안전성에 위배될 가능성이 있다. 연안의 오염과 양식장의 밀집으로 말미암아 세균성 질병이 다발케되고 이의 치료를 위하여 약제를 무분별하게 투여함에 따라 약제내성이 있는 새로운 병원성 미생물이 생겨날 것이며, 이러한 결과는 새로운 항생물질의 개발을 요구하고 있다. 의학과 마찬가지로 어류질병을 치료하고자 보다 다양하고 광범위한항생물질의 개발은 양식어류의 생산성을 향상시킬 수는 있으나 조직중에 잔류하는 항생물질로 말미암아 식품의 안정성에 있어서 문제를 야기시킬 수 있다. 따라서 양식어류의 종묘 생산장에서부터 성어 양식장에 이르기까지 병원성 미생물에 의해 발병되는 질병을 광범위하게 예방 또는 치료효과가 있는 물질의 개발이 요구된다.
본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 δ-아미노레불린산을 어류의 배합사료에 함유시켜 어류에 공급하거나 사육수조에 일정량 공급하여 어류를 양식할 경우 항생제의 사용없이 병원성 미생물을 효과적으로 예방할 수 있고 이미 감염된 어류의 경우는 치료효과를 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid:ALA)을 유효성분으로 함유하는 어류 병원성 미생물에 의한 감염 예방 및 치료용 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 어류에 경구투여하거나 사육시 수조투여하여 어류의 병원성 미생물에 의한 감염을 예방 및 치료하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 δ-아미노레불린산을 유효성분으로 함유하는 어류 양식용 사료를 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid:ALA)이 어류에 미치는 세포독성 효과를 조사한 후 세포독성을 미치지 않는 δ-아미노레불린산의 농도를 결정하고 이 농도의 δ-아미노레불린산을in vitro에서 다양한 종류의 어류 병원성 미생물과 바이러스에 처리하여 δ-아미노레불린산이 어류 병원성 미생물과 바이러스의 증식을 억제함을 확인하고, 이어서in vivo에서 δ-아미노레불린산을 어류에 미리 수조투여 또는 경구투여한 후 다양한 종류의 어류 병원성 미생물을 감염시키고 시간경과에 따른 폐사율을 조사하여 δ-아미노레불린산의 어류 병원성 미생물 감염 예방효과를 확인하고, 또 미리 다양한 어류 병원성 미생물을 감염시킨 어류에 δ-아미노레불린산을 수조투여 또는 경구투여하고 시간경과에 따른 폐사율을 조사하여 δ-아미노레불린산의 어류 병원성 미생물 감염 치료효과를 확인함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 설명한다.
도 1은 δ-아미노레불린산 농도에 따른 어류 주화세포에 대한 세포독성효과를 나타낸 그래프이다.
도 2a와 도 2b는 시판용 δ-아미노레불린산 농도에 따른 어류 병원성 세균 에드와드지엘라 타르다 세균(Edwardsiella trada)과 스타필로코쿠스속 세균(Staphylococcussp.)의 증식저해 효과를 나타낸다.
본 발명은 3종의 어류주화세포에 다양한 농도의 δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid:ALA) 용액과 MTT 용액을 첨가하고 배양한 후 세포증식도를 측정하여 δ-아미노레불린산이 세포계에 미치는 세포독성효과를 조사하여 δ-아미노레불린산이 세포독성을 미치지 않는 농도범위를 결정하는 단계; 3종의 어류에 다양한 농도의 δ-아미노레불린산 용액을 직접 주사하거나 사육해수에 일정농도로 용해시켜 상기 3종의 어류를 사육하면서 시간경과에 따른 생존율을 측정하여 δ-아미노레불린산이 어류에 미치는 세포독성 농도를 결정하는 단계; 어류 양식장에서 분리된 병원성 세균액을 시판용 δ-아미노레불린산과 혼합하여 620nm에서 ELISA reader로 세균성장을 24시간 동안 관찰하여 δ-아미노레불린산이 어류 병원성 세균의 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인하고 MIC 검색에 의해 해산어 양식장에서 분리된 병원성 세균액 증식억제 효과를 확인하는 단계; 바이러스 배양액과 δ-아미노레불린산 희석액을 혼합한 반응액을 배양세포에 접종한 후 바이러스 감염정도를 측정하고 바이러스 액만 접종한 대조구와 그 값을 비교하여 δ-아미노레불린산이 어류 병원성 바이러스에 대한 구제효과가 있음을 확인하는 단계; 일정농도의 δ-아미노레불린산을 유지하는 사육수중에 어류를 사육하거나 일정농도의 δ-아미노레불린산을 함유하는 사료를 어류에게 경구투여하고 폐사율을 조사하여 δ-아미노레불린산이 어류에 미치는 세포독성 효과를 조사하는 단계; 진탕배양한 에드와드지엘라 타르다 세균(Edwardsiella tarda)을 δ-아미노레불린산이 수조투여 또는 경구투여된 어류에 복강주사한 후 사육중 폐사율을 조사하여 δ-아미노레불린산이 에드와드지엘라 타르다 세균의 감염 예방효과가 있음을 확인하는 단계; 어류 병원성 세균 에드와드지엘라 타르다의 감염 예방효과 조사와 동일한 방법으로 δ-아미노레불린산을 수조투여 또는 경구투여한 어류에 스트렙토코쿠스 세균(Streptococcussp.)을 복강주사로 인위감염시킨 후 사육중 폐사율을 조사하여 δ-아미노레불린산이 스트렙토코쿠스 세균의 감염 예방 효과가 있음을 확인하는 단계; 어류 병원성 세균 에드와드지엘라 타르다 감염 예방효과 조사와 동일한 방법으로 δ-아미노레불린산을 수조투여 또는 경구투여한 어류에 스타필로코쿠스 에피더미디스 세균을 복강주사로 인위감염시킨 후 사육중 폐사율을 조사하여 δ-아미노레불린산이 스타필로코쿠스 에디더미디스 세균(Staphylococcus epidermidis)의 감염 예방효과가 있음을 확인하는 단계; 어류 병원성 세균 에드와드지엘라 타르다 감염 예방효과와 동일한 방법으로 δ-아미노레불린산을 수조투여 또는 경구투여한 어류에 슈도모나스속 세균(Pseudomonassp.)을 복강주사로 인위감염시킨 후 사육 중 폐사율을 조사하여 δ-아미노레불린산이 슈도모나스속 세균의 감염 예방효과가 있음을 확인하는 단계; 어류 병원성 세균 에드와드지엘라 타르다 감염 예방효과와 동일한 방법으로 δ-아미노레불린산을 수조투여 또는 경구투여한 어류에 비브리오 안구일지아룸을 복강주사하여 인위감염시킨 후 사육중 폐사율을 조사하여 δ-아미노레불린산이 비브리오 안구일리아룸 세균의 감염 예방효과가 있음을 확인하는 단계; δ-아미노레불린산이 다양한 농도로 포함된 사육수조에 어류병원성 세균을 감염시킨 어류를 사육하면서 어류의 생존율을 조사하여 δ-아미노레불린산이 어류질병을 치료하는 효과가 있음을 확인하는 단계; 양식장에서 이리도바이러스(iridovirus)에 감염된 것으로 판정된 어체를 다양한 농도의 δ-아미노레불린산로 처리하고 시간경과에 따른 폐사율을 조사하여 실제 δ-아미노레불린산이 바이러스 감염치료 효과가 있음을 확인하는 단계; 양식장에서 대량으로 에드와드지엘라 타르다 세균에 감염된 어체에 일정농도의 δ-아미노레불린산을 처리하여 생존상태를 관찰함으로써 실제 δ-아미노레불린산이 양식장내에서 어류 병원성 세균에 감염된 어류를 치료할 수 있음을 확인하는 단계로 구성된다.
본 발명 δ-아미노레불린산은 양식되는 모든 종류의 어류에 적용가능하며 특히 해산어에 효과가 뛰어나다.
본 발명에서 δ-아미노레불린산의 투여방식은 어류 양식중에 양식 수조에 첨가하는 수조투여방식 또는 어류 양식에 사용되는 통상의 사료에 배합하여 경구투여하는 방식 모두 가능하다.
본 발명에서는 해산 양식어 중에서 넙치, 조피볼락, 참돔 등을 사용하여 δ-아미노레불린산의 어류 병원성 미생물의 감염 예방, 치료 및 바이러스 감염 치료 효과가 우수함을 확인하였으며 이는 본 발명의 일 실시예에 불과하다.
본 발명에서 δ-아미노레불린산은 액상으로 통상의 어류 양식사료에 분무하여 첨가하거나 분말형태로 제조하여 사료 제조시에 배합할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 어류주화세포에 대한 δ-아미노레불린산의 세포독성
본 실시예에서는 해산 양식어에 막대한 피해를 끼치는 수 종류의 어류 병원성 세균들과 바이러스 감염에 대한 예방 및 치료제로 사용하고자 하는 δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid:ALA)의 어류체내 독성유무를 확인하기 위한 기초 실험으로, 어류 유래 주화세포 3종을 대상으로in vitro상에서의 세포계내 독성을 조사하여 δ-아미노레불린산처리 안정농도 및 독성농도를 확인하고, 직접적인 노출에 의한 δ-아미노레불린산의 어류에 대한 독성실험을 위하여 어류세포에 영향을 미치지 않는 δ-아미노레불린산 농도를 확립하고자 행하였다.
δ-아미노레불린산 시료는 1.0 M 농도(0.167g/1 mL HBSS)로 조제하여 10배희석법으로 희석하고, 96 well 마이크로플레이트에 2.5 × 105cells/mL로 현탁된 어류 주화세포액을 각각 100 ㎕ 씩 넣은 후, δ-아미노레불린산 희석액을 희석 단위당 4 well 씩 각각 100 ㎕ 씩 첨가하여 실험을 행하였다. δ-아미노레불린산의 세포독성실험에 사용된 어류 주화세포는 일본 북해도대학 수산학부의 요시미주 교수(Dr. M. Yoshimizu)로 분양받은 RTG-2 (Rainbow trout gonad), FHM (Fathead minnow epithelioma) 및 CHSE-214 (Chinook salmon embryo)이다. 실험용 세포는 100 U/mL의 페니실린(Sigma사제), 100 μg/mL의 스트렙토마이신(Sigma사제) 및 5 FBS가 첨가된 MEM (Gibco사제) 세포배양용 배지를 사용하였다. 96 well 마이크로플레이트에 배양한 세포를 15℃의 배양기에서 3시간 동안 배양한 후, 0 mM, 1.0 mM, 10 mM, 50 mM 및 100 mM의 δ-아미노레불린산 용액을 100㎕씩 첨가한 후 18℃에서 24시간동안 배양하였다. 대조구는 δ-아미노레불린산 대신에 HBSS를 동량으로 넣었다. 배양 후 MTT 용액 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide (DOJINDO Lot ZY903, Japan)를 PBS에 5 mg/mL를 녹여 필터(0.45㎛) 멸균한 후 실험에 사용]을 각 well에 100㎕씩 넣은 후 0.04 N HCl-isopropanol을 100㎕씩 넣고 ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 실험에 사용된 3종의 주화세포 모두 1 mM, 10 mM의 δ-아미노레불린산로 처리하였을 때, 대조구와 비교하여 비슷한 세포증식도를 나타낸 반면, 50 mM과 100 mM의 δ-아미노레불린산을 처리하였을 때는 대조구와 비교하여 절반정도의 낮은 세포증식도를 나타내었다. 결과적으로 세포배양조건의 well 내에 반응조건을 감안하여 그 독성안정범위는 10 mM 이하로 나타나, 실험 적정 농도기준을 설정할 수 있었다. 또 생물체내의 δ-아미노레불린산의 적용에 따른 독성농도의 설정을 위한 기초자료로서 물질의 체내흡수 및 대사과정에 의한 목적장기 또는 세포단위까지의 전달경로를 추정하였을 때 (일반적으로 어체내 물질의 흡수율은 10 ∼ 20), 본 물질의 어체 처리농도를 50 mM 이하로 한다면 직접적인 독성은 어체내에서 발현되지 않음을 알 수 있었다.
실시예 2: 어류에 대한 δ-아미노레불린산의 세포독성
상기 실시예 1에서 δ-아미노레불린산의 세포단위에서의 독성 실험결과 24시간의 노출에 의한 세포에의 독성이 50 mM 이하 농도에서 안전한 점을 알 수 있었다. 본 실시예에서는 δ-아미노레불린산의 체내 투입에 의한 어체의 독성 확인을 위하여 주사법을 이용한 직접투여와, 일반적으로 어류 양식장에서 다수의 어체를 대상으로 한 질병치료용 약제의 투여법으로 가장 쉽게 적용되어지고 있는 침지법의 두 가지 방법으로 어류에 미치는 독성을 확인하였다.
실험에 사용한 어류는 넙치 (3g), 참돔 (1.5g) 및 조피볼락 (5g) 치어를 대상으로 독성 효과를 검사하였고 δ-아미노레불린산의 처리농도 및 방법은 500 mM, 100 mM, 50 mM 및 10 mM의 δ-아미노레불린산 용액을 제조하여 체내 주사법으로 각 어체에 100 ㎕씩 복강내 주사하여 사육수조에 넣고 1주일간 관찰하였다. 또한 침지법에 의한 실험을 위하여 δ-아미노레불린산을 30 L 사육해수에 5.028 g을 녹여 167.6 ppm의 농도로 만들었다. 같은 방법으로 10배 및 100배 희석농도인 16.76 ppm및 1.676 ppm의 δ-아미노레불린산을 함유하는 실험해수를 제조하여 각 실험수조에 실험어를 10분, 30분, 60분, 120분 및 180분 노출한 후 각 경과 시간마다 노출어를 각각 20미씩 채취하여 δ-아미노레불린산 무첨가 사육수조에 이동시키고 1주일간 생존율을 측정하였다. 실험결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 복강내 주사법에 의한 δ-아미노레불린산 처리 실험군은 모든 어체 및 어종에서 δ-아미노레불린산 처리농도와 관계없이 생존율의 변화가 나타나지 않았다. 침지법에 의한 δ-아미노레불린산 처리 실험군은 표 2에 나타낸 바와 같이 모든 처리 실험구 및 대조구의 생존율이 100로써 어종간, 처리농도간, 침지시간 간의 차이가 나타나지 않았다. 결과적으로 δ-아미노레불린산을 어류에 직접 적용하기 위한 현장 사용형태 및 경제성을 감안한 적용가능 농도 범위에서 어체에 대한 직접적인 독성은 없었다. 즉, 복강내 주사를 할 경우 넙치의 경우 50 mM 이하의 농도로 체중의 3.3이하로 주사할 경우 독성이 확인되지 않았으며, 참돔과 조피볼락의 경우 50 mM 이하의 농도로 체중의 2.0이하로 주사할 경우 독성이 확인되지 않았다. 그리고 넙치, 참돔 및 조피볼락을 167 ppm의 농도로 180분까지 침지(약욕)할 경우 실험 어종에 대하여 독성이 나타나지 않았으므로 어류 질병 치료제 또는 예방제로서의 사용시 상기의 농도이하에서는 넙치, 참돔 및 조피볼락에 대하여 무해함을 알 수 있었다.
넙치 및 조피볼락 치어의 δ-아미노레불린산 복강주사법에 따른 생존율(생존율, )
어종 50mM 10mM 5mM 1mM 대조군
넙치 100 100 100 100 100
참돔 100 100 100 100 100
조피볼락 100 100 100 100 100
넙치, 참돔 및 조피볼락 치어의 δ-아미노레불린산 침지법에 따른 생존율(생존율, )
어종 167ppm10 ~ 180분 16.7ppm10 ~ 180분 1.67ppm10 ~ 180분 0.167pp10 ~ 180분
넙치 100 100 100 100
참돔 100 100 100 100
조피볼락 100 100 100 100
실시예 3: in vitro 상에서 δ-아미노레불린산에 의한 어류 병원성 미생물의 증식억제 효과
실험예 1: 어류병원성 세균에 대한 증식억제 효과
본 실험예에 사용된 병원성 지표세균은 여수인근의 해산어 양식장에서 분리된 에드와드지엘라 타르다 세균(Edwardsiella tarda),스트렙토코쿠스속 세균(Streptococcussp.), 스타필로코쿠스속 세균(Staphylococcussp.), 스타필로코쿠스 에디더미디스 세균(Staphylococcus epidermidis), 슈도모나스속 세균(Pseudomonassp.), 및 비브리오 안구일라룸 세균(Vibrio anguillarum)을 사용하였다. 고체 배양시 0.2NaCl이 첨가된 TSA(tryptic soy agar) 평판배지에서 배양하였으며, 액체 배양시에는 BHI broth에 24시간 배양하여 O.D값을 1.0으로 조정하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 δ-아미노레불린산은 시판용(Sigma) 및 본 발명자가 제조한 δ-아미노레불린산(국내 특허출원 1998-41898호)로 각각을 멸균증류수 1.0 mL에 δ-아미노레불린산 0.167g 녹인 것을 원액(1.0 M)으로 사용하였다. 1.0 M δ-아미노레불린산은 BHI broth로 2배율씩 단계적으로 희석시켜 64배까지 희석하여 병원성 세균의 증식저해 효과를 위한 시험용액으로 조제하였다. 96 well 마이크로플레이트에 단계적으로 희석한 δ-아미노레불린산과 세균현탁액을 1:1 비율로 혼합하여 25℃에서 620 nm로 설정된 ELISA reader에 넣고 24시간동안 δ-아미노레불린산 농도에 따른 세균의 성장을 관찰하였다. 대조구는 δ-아미노레불린산 대신에 BHI broth와 세균 현탁액을 1:1로 혼합하여 실험구와 같은 방법으로 하였다. 해산 양식어의 주요 병원성 세균인 에드와드지엘라 타르다 세균(Edwardsiella tarda),스트렙토코쿠스속 세균(Streptococcussp.), 스트렙토코쿠스속 세균(Staphylococcussp.), 스타필로코쿠스 에피데르미디스 세균(Staphylococcus epidermidis), 슈도모나스속 세균(Pseudomonassp.) 및 비브리오 안구일라룸 세균(Vibrio anguillarum)에 대한 δ-아미노레불린산의 MIC 검색은 평판 약제 디스크법으로 행하였다. 각각의 세균 배양액 100 ㎕를 일정량의 top agar와 혼합하여 TSA agar에 도말한 후, 1.0 M δ-아미노레불린산 용액을 PBS로 2배율 희석하여 각 희석액 10 ㎕를 멸균된 디스크에 흡습시킨 후, 23∼25℃의 배양기에서 2∼3일 배양한 다음 clear zone의 크기(mm)를 측정하여 항균력으로 나타내었다. 대조구는 δ-아미노레불린산 희석액 대신에 PBS를 동량으로 디스크에 흡습시켜 측정하였다. 또 본 발명자 의해 제작된 δ-아미노레불린산을 이용한 실험에서 에드와드지엘라 타르다 세균와 스트렙토코쿠스속 세균의 δ-아미노레불린산에 의한 증식저해 효과와 더불어 우리나라 해산어 양식장에 빈번하게 검출되어 사육어류의 대량 폐사를 유발하는 스트렙토코쿠스속, 스타필로코쿠스 에디데르미디스, 비브리오 안구일라룸 및 슈도모나스속를 추가적으로 확보하여 MIC 검색에 의한 δ-아미노레불린산에 의한 병원성 세균의 증식저해를 측정하였다. 이때, MIC 검색용 세균을 BHI broth에 접종하여 23 ∼ 25℃로 조정된 배양기에서 2 ∼ 3일간 배양하였다. 배양된 세균을 600 nm에서 흡광도를 측정하여, O.D 값을 1.0으로 조정된 세균 현탁액을 제조하여 사용하였다. 단, 슈도모나스속 세균의 O.D값은 0.6으로 조정된 현탁액을 제조하여 사용하였다. MIC 실험은 세균 배양액 100 ㎕를 일정량의 top agar와 혼합하여 TSA agar에 도말한 후, 1.0 M δ-아미노레불린산 용액을 PBS로 2배율 희석하여 각 희석액 10 ㎕를 멸균된 디스크에 흡습시킨 후, 23∼25℃의 배양기에서 2∼3일 배양한 다음 clear zone의 크기(mm)를 측정하여 항균력으로 나타내었다. 대조구는 δ-아미노레불린산 희석액 대신에 PBS를 동량으로 디스크에 흡습시켜 측정하였다. 실험결과, 시판용 δ-아미노레불린산을 이용한 실험에서 δ-아미노레불린산 농도에 따른 병원성 세균의 증식저해 효과는 도 2a(에드와드지엘라 타르다 세균), 도 2b(스트렙토코쿠스속 세균)에 나타낸 바와 같았다. δ-아미노레불린산의 희석율이 1/32배(31 mM) 이하에서는 두 세균 모두 증식이 억제되었으나, 1/64배(16 mM) 이상의 희석율에서는 대조구와 뚜렷한 차이가 없었다. 본 발명자가 제작한 δ-아미노레불린산의 실험결과는 표 3에 나타냈으며 시판용 δ-아미노레불린산과 그 효과 면에서 차이를 보이지 않았다.
δ-아미노레불린산에 의한 해산 양식어 병원성 세균의 MIC 시험 결과
세 균 MIC
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 56.0㎍/mL
스트렙토코쿠스속(Staphylococcussp.) 72.9㎍/mL
스타필로코쿠스속(Staphylococcus sp.) 59.6㎍/mL
스타필로코쿠스 에디데르미디스(Staphylococcus epidermidis) 62.0㎍/mL
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 42.2㎍/mL
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 29.9㎍/mL
실험예 2: 어류병원성 바이러스에 대한 구제효과
본 실험예에서는 주요 해산어 양식 어종인 넙치, 조피볼락, 농어 등에 감염되어 대량 폐사 원인으로 작용하는 해양 버나바이러스 (marine birnavirus, MABV)를 대상으로 δ-아미노레불린산 처리에 따른 바이러스 감염가의 변동을 어류 주화세포를 이용한 TCID50법으로 확인하였다. 실험에 사용된 바이러스는 여수 인근 양식장의 넙치에서 분리 보고되어진 종으로 우선 CHSE-214세포에서 바이러스 감염가를 확인하고 그것을 실험 바이러스액으로 사용하였다. 반응은 바이러스 배양액과 δ-아미노레불린산 희석액(8 mM)을 동량씩 혼합하여 30분간 반응시킨 후, 배양세포에 접종하고 20℃에서 배양하면서 경시적인 바이러스 감염가의 변동을 HBSS반응 바이러스액 (대조구)의 바이러스 감염가의 변동과 비교하였다. 실험결과, 표 4에 나타낸바와 같이 배양 세포계내에서의 δ-아미노레불린산처리에 의해 MABV가 불활성화됨을 확인할 수 있었다.
δ-아미노레불린산 처리에 따른 MABV 바이러스 감염가의 변동
실험구 접종 후 시간경과(일)
0 1 3 5 7
δ-아미노레불린산 처리구(8mM) 4.3* 3.8 3.5 2.3 <1.8
대조구(HBSS) 4.5 4.8 6.8 8.5 8.8
[주] Log TCID50/mL
실시예 4: in vivo 상에서 δ-아미노레불린산에 의한 어류병원성 미생물의 증식억제 효과
실험예 1: 수조투여 및 경구투여에 의한 독성조사
25 g 전후의 넙치 20미를 2개의 실험구와 1개의 대조구로 설정하여 순환여과 시스템에서 사육하였다. 실험구 1은 실험개시 일부터 사육수에 3일에 1회씩 δ-아미노레불린산을 투여하여 사육수중의 δ-아미노레불린산 농도를 0.1 ∼ 10 ppm으로 유지시키면서 1 ∼ 3주간 사육하였고(수조투여), 실험구 2는 사료로 사용되는 인공배합사료(EP, 어체중량의 3: 15 g) 1kg에 대하여 δ-아미노레불린산용액을 분무하여 0.1 ∼ 100 ppm의 농도로 첨가한 후 건조시켜 투여하면서 1 ∼ 3주간 사육하였다(경구투여). 실험기간 동안 실험구 1과 무처리구는 실험구 2의 사료량과 동일한 양으로 시판되는 인공배합사료를 δ-아미노레불린산 처리없이 그대로 사용하였다. 사용한 어류 병원성 세균들은 Brain heart Infusion (BHI) broth 배지 1 L을 2 L 삼각플라스크에 취하여 멸균한 후 각각의 플라스크에 에드와드지엘라 타르다 세균(Edwardsiella tarda), 스트렙토코쿠스속 세균(Streptococcussp.), 스타필로코쿠스속 세균(Staphylococcussp.), 스타필로코쿠스 에피더미스 세균 (Staphylococcus epidermis),슈도모나스속 세균(Pseudomonassp.) 및 비브리오 안쿠일라룸 세균(Vibrio anguillarum)을 접종하여 3일간 진탕 배양하여 어류 병원세균들을 제조하였다. 병원성 세균의 인위감염은 실험사육 3주 후에 시행하였고, 인위공격 방법은 배양균을 생리식염수로 희석하여 어류 1 미당 105CFU로 직접적인 복강주사법 (주사량 300ul/fish)으로 행하였다. 인위 감염된 각 실험구별 실험어는 관찰용 수조로 옮겨 2주간 그 감염 및 감염에 따른 폐사를 관찰하였다. 실험 전기간 동안의 수온은 20oC(±2oC)로 유지하였다. 실험결과, 표 5에 나타낸바와 같이 사육수중의 δ-아미노레불린산 농도를 10 ppm으로 유지한 실험구 1과 사료 1 kg당 0.1 ∼ 100 ppm의 δ-아미노레불린산을 첨가하여 사육한 실험구 2는 δ-아미노레불린산이 함유되지 않은 대조구와 마찬가지로 사육중의 폐사는 일어나지 않았다. 이러한 결과는 δ-아미노레불린산이 어류주화세포에 독성을 나타내지 않는다는 결과와 일치하였다.
δ-아미노레불린산처리에 따른 넙치와 조피볼락의 사육실험 결과
δ-아미노레불린산 투여방법 어종 어체수 사육중폐사 생존율()
수조투여 넙치 20미 0 100
조피볼락 20미 0 100
경구투여 넙치 20미 0 100
조피볼락 20미 0 100
무투여대조구 넙치 20미 0 100
조피볼락 20미 0 100
실험예 2: 어류병원성 세균인 에드와드지엘라 타르다 세균감염 예방효과
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실험구와 대조구 어류를 준비한 후 어류 1 미당 에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 105CFU로 직접적인 복강주사법으로 인위 감염 후 각각의 실험어를 관찰용 수조로 옮겨 감염에 따른 폐사를 2주간 관찰하였으며 2주후의 생존율을 조사하였다. 실험결과, 표 6에 나타낸바와 같이 δ-아미노레불린산을 투여하지 않은 무투여 대조구의 경우 실험어의 생존율은 5 ∼ 10로 나타난 반면, 침지법과 경구투여법에 의해 δ-아미노레불린산을 처리한 처리구의 생존율은 월등히 높게 나타났다.
δ-아미노레불린산처리 사육넙치와 조피볼락의 에드와드지엘라 타르다 인위 감염에 대한 예방효과
투여방법 δ-아미노레불린산 농도 어종 어체수 사육중 폐사 생존율()
수조투여 10ppm 넙치 20미 2 90
10ppm 조피볼락 20미 3 85
1.0ppm 넙치 20미 3 85
1.0ppm 조피볼락 20미 2 90
0.1ppm 넙치 20미 5 75
0.1ppm 조피볼락 20미 5 75
경구투여 100ppm 넙치 20미 1 95
100ppm 조피볼락 20미 2 90
10ppm 넙치 20미 3 85
10ppm 조피볼락 20미 3 85
1.0ppm 넙치 20미 6 70
1.0ppm 조피볼락 20미 4 80
무투여대조구 넙치 20미 19 5
조피볼락 20미 18 10
실험예 3: 어류병원성 세균 스트렙토코쿠스속 세균의 감염 예방효과
실험예 1과 실험예 2에서 실시한 어류의 사육, δ-아미노레불린산의 처리 및 인위감염과 동일한 방법으로 넙치와 조피볼락을 복강주사법으로 스트렙토코쿠스속 세균(Streptococcussp.)으로 인위감염 후 각각의 실험어를 관찰용 수조로 옮겨 감염에 따른 폐사를 2주간 관찰하였다. 표 7에 나타난바와 같이 δ-아미노레불린산을 투여하지 않은 무투여 대조구의 경우 실험어의 생존율은 5 ∼ 10로 나타난 반면, 수조투여법과 경구투여법에 의해 δ-아미노레불린산을 처리한 처리구의 생존율은 65이상으로 상기 실험예 2의 에드와드지엘라 타르다공격에 따른 생존율에 비하여 약간 낮았으나 역시 생존율을 높은 편이었다.
δ-아미노레불린산처리 사육넙치와 조피볼락의 스트렙토코쿠스속 인위 감염에 대한 예방효과
투여방법 δ-아미노레불린산 농도 어종 어체수 사육중 폐사 생존율()
수조투여 10ppm 넙치 20미 3 85
10ppm 조피볼락 20미 4 80
1.0ppm 넙치 20미 5 75
1.0ppm 조피볼락 20미 3 85
0.1ppm 넙치 20미 7 65
0.1ppm 조피볼락 20미 7 65
경구투여 100ppm 넙치 20미 3 85
100ppm 조피볼락 20미 2 90
10ppm 넙치 20미 4 80
10ppm 조피볼락 20미 3 85
1.0ppm 넙치 20미 7 65
1.0ppm 조피볼락 20미 6 70
무투여대조구 넙치 20미 19 5
조피볼락 20미 19 5
실험예 4: 어류병원성 세균인 스타필로코쿠스 에피더미디스 세균 감염 예방효과
실험예 1과 실험예 2에서 실시한 어류의 사육, δ-아미노레불린산의 처리 및 인위감염과 동일한 방법으로 넙치와 조피볼락을 복강주사법으로 스타필로코쿠스 에피더미디스 세균(Staphylococcus epidermidis)으로 인위감염시킨 후 각각의 실험어를 관찰용 수조로 옮겨 감염에 따른 폐사를 2주간 관찰하였다. 표 8에 나타낸바와 같이 δ-아미노레불린산을 투여하지 않은 무투여 대조구의 경우 조피볼락 실험어의 생존율은 5가량으로 나타난 반면, 수조투여법과 경구투여법에 의해 δ-아미노레불린산을 처리한 처리한 처리구의 생존율은 높게 나타났다.
δ-아미노레불린산처리 사육넙치와 조피볼락의 스타필로코쿠스 에피더미디스의 인위감염에 대한 예방효과
투여방법 δ-아미노레불린산 농도 어종 어체수 사육중 폐사 생존율()
수조투여 10ppm 넙치 20미 5 75
10ppm 조피볼락 20미 4 80
1.0ppm 넙치 20미 7 65
1.0ppm 조피볼락 20미 4 80
0.1ppm 넙치 20미 7 65
0.1ppm 조피볼락 20미 9 55
경구투여 100ppm 넙치 20미 4 80
100ppm 조피볼락 20미 4 80
10ppm 넙치 20미 6 70
10ppm 조피볼락 20미 5 75
1.0ppm 넙치 20미 9 55
1.0ppm 조피볼락 20미 10 50
무투여대조구 넙치 20미 19 5
조피볼락 20미 19 5
실험예 5: 어류병원성 세균인 스타필로코쿠스속 세균 감염 예방효과
실험예 1과 실험예 2에서 실시한 어류의 사육, δ-아미노레불린산의 처리 및 인위감염과 동일한 방법으로 넙치와 조피볼락을 복강주사법으로 스타필로코쿠스속 세균(Staphylococcussp.)로 인위감염 후 각각의 실험어를 관찰용 수조로 옮겨 감염에 따른 폐사를 2주간 관찰하였다. 실험결과, 표 9에 나타난바와 같이 δ-아미노레불린산을 투여하지 않은 무투여 대조구의 경우 실험어의 생존율은 5가량으로 나타난 반면, 수조투여법과 경구투여법에 의해 δ-아미노레불린산을 처리한 실험구의 생존율은 55이상을 나타내었다.
δ-아미노레불린산처리 사육넙치와 조피볼락의 스타필로코쿠스속 세균 인위 감염에 대한 예방효과
투여방법 δ-아미노레불린산 농도 어종 어체수 사육중 폐사 생존율()
수조투여 10ppm 넙치 20미 1 95
10ppm 조피볼락 20미 2 90
1.0ppm 넙치 20미 2 90
1.0ppm 조피볼락 20미 1 95
0.1ppm 넙치 20미 5 75
0.1ppm 조피볼락 20미 7 65
경구투여 100ppm 넙치 20미 2 90
100ppm 조피볼락 20미 2 90
10ppm 넙치 20미 1 95
10ppm 조피볼락 20미 2 90
1.0ppm 넙치 20미 7 65
1.0ppm 조피볼락 20미 9 55
무투여대조구 넙치 20미 19 5
조피볼락 20미 19 5
실험예 6: 어류병원성 세균인 슈도모나스속 세균 감염 예방효과
실험예 1과 실험예 2에서 실시한 어류의 사육, δ-아미노레불린산의 처리 및 인위감염과 동일한 방법으로 넙치와 조피볼락을 복강주사법으로 슈도모나스속 세균(Pseudomonassp.)으로 인위감염 후 각각의 실험어를 관찰용 수조로 옮겨 감염에 따른 폐사를 2주간 관찰하였다. 실험결과, 표 10에 나타낸바와 같이 δ-아미노레불린산을 투여하지 않은 무투여 대조구의 경우 실험어의 생존율은 5 ∼ 15가량으로 나타난 반면, 수조투여법과 경구투여법에 의해 δ-아미노레불린산을 처리한 처리구의 생존율은 월등히 높게 나타났다.
δ-아미노레불린산처리 사육넙치와 조피볼락의 슈도모나스 속 인위 감염에 대한 예방효과
투여방법 δ-아미노레불린산 농도 어종 어체수 사육중 폐사 생존율()
수조투여 10ppm 넙치 20미 2 90
10ppm 조피볼락 20미 2 90
1.0ppm 넙치 20미 2 90
1.0ppm 조피볼락 20미 3 85
0.1ppm 넙치 20미 6 70
0.1ppm 조피볼락 20미 9 55
경구투여 100ppm 넙치 20미 2 90
100ppm 조피볼락 20미 3 85
10ppm 넙치 20미 2 90
10ppm 조피볼락 20미 3 85
1.0ppm 넙치 20미 9 55
1.0ppm 조피볼락 20미 8 60
무투여대조구 넙치 20미 19 5
조피볼락 20미 17 15
실험예 7: 어류병원성 세균인 비브리오 안구일라룸 세균 감염 예방효과
실험예 1과 실험예 2에서 실시한 어류의 사육, δ-아미노레불린산의 처리 및 인위감염과 동일한 방법으로 넙치와 조피볼락을 복강주사법으로 비브리오 안구일라룸 세균(Vibrio anguillarum)으로 인위감염 후 각각의 실험어를 관찰용 수조로 옮겨 감염에 따른 폐사를 2주간 관찰하였다. 표 11에 나타난바와 같이 δ-아미노레불린산을 투여하지 않은 무투여 대조구의 경우 실험어의 생존율은 10 ∼ 15가량으로 나타난 반면, 수조투여법과 경구투여법에 의해 δ-아미노레불린산을 처리한 처리구의 생존율은 월등히 높게 나타났다.
δ-아미노레불린산처리 사육넙치와 조피볼락의 비브리오 안구일라룸 세균 인위감염에 대한 예방효과
투여방법 δ-아미노레불린산 농도 어종 어체수 사육중 폐사 생존율()
수조투여 10ppm 넙치 20미 3 85
10ppm 조피볼락 20미 2 90
1.0ppm 넙치 20미 2 80
1.0ppm 조피볼락 20미 1 85
0.1ppm 넙치 20미 7 65
0.1ppm 조피볼락 20미 8 60
경구투여 100ppm 넙치 20미 2 90
100ppm 조피볼락 20미 2 90
10ppm 넙치 20미 3 85
10ppm 조피볼락 20미 4 80
1.0ppm 넙치 20미 9 55
1.0ppm 조피볼락 20미 7 65
무투여대조구 넙치 20미 18 10
조피볼락 20미 17 15
실시예 5: in vivo 에서 δ-아미노레불린산의 약욕에 의한 병원균 감염 어류 치료효과
본 실시예에서 실험어로 넙치와 조피볼락 치어(평균체중 2 g)를 각 실험구 50미씩 사육수조에 수용하여 1 주일간 예비사육을 행하여 안정화시켰다. 인위감염은 어류 병원성 세균 6종 (Edwardsiella tarda, Streptococcussp.,Staphylococcussp.,Staphylococcus epidermis, Pseudomonassp. 및Vibrio anguillarum) 을 감염병원체로서 사용하였으며 인위감염방법은 침지법으로 행하였다. 즉, 사육수조에 감염병원체를 가하여 병원체의 농도를 104CFU/mL이 되게 조정된 해수에 각각을 1시간 동안 침지하여 감염시켰다. 치료조건은 인위적인 감염 후 감염 어체를 사육조로 옮겨서 3일간 감염기간을 준 후, 감염 4일째 되는 날에 δ-아미노레불린산을 사육수조수량에 0.1, 1.0, 5 및 10 ppm되게 처리하여 환수하지 않고 1시간 ∼ 24시간 동안 통기조건으로 사육 후, 깨끗한 해수로 환수하여 2주일간 사육하면서 감염에 따른 어체의 폐사를 확인하였다. 대조실험구는 각 세균들을 침지법에 의해 동일하게 감염 처리한 후, δ-아미노레불린산 무처리 조건으로 사육하면서 각각의 세균 감염에 따른 넙치와 조피볼락의 폐사를 확인하였다. 실험결과, 넙치(표 12 ∼ 표 15)와 조피볼락(표 16 ∼ 표 19) 모두 δ-아미노레불린산 처리구가 생존율이 높았다.
병원성 세균 감염 넙치에 대하여 0.1 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 54
대조구 50미 4
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 46
대조구 50미 14
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 42
대조구 50미 36
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 54
대조구 50미 6
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 50
대조구 50미 16
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 56
대조구 50미 40
병원성 세균 감염 넙치에 대하여 1.0 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 76
대조구 50미 4
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 64
대조구 50미 14
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 66
대조구 50미 36
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 66
대조구 50미 6
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 70
대조구 50미 16
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 66
대조구 50미 40
병원성 세균 감염 넙치에 대하여 5.0 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 86
대조구 50미 4
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 84
대조구 50미 14
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 80
대조구 50미 36
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 84
대조구 50미 6
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 80
대조구 50미 16
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 84
대조구 50미 40
병원성 세균 감염 넙치에 대하여 10 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 84
대조구 50미 4
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 90
대조구 50미 14
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 84
대조구 50미 36
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 84
대조구 50미 6
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 84
대조구 50미 16
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 80
대조구 50미 40
병원성 세균 감염 조피볼락에 대하여 0.1 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 60
대조구 50미 10
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 50
대조구 50미 24
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 40
대조구 50미 16
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 50
대조구 50미 14
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 40
대조구 50미 20
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 50
대조구 50미 20
병원성 세균 감염 조피볼락에 대하여 1.0 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 80
대조구 50미 10
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 76
대조구 50미 24
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 70
대조구 50미 16
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 76
대조구 50미 14
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 76
대조구 50미 20
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 74
대조구 50미 20
병원성 세균 감염 조피볼락에 대하여 5.0 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 84
대조구 50미 10
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 86
대조구 50미 24
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 66
대조구 50미 16
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 84
대조구 50미 14
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 86
대조구 50미 20
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 84
대조구 50미 20
병원성 세균 감염 조피볼락에 대하여 10 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 94
대조구 50미 10
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 86
대조구 50미 24
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 84
대조구 50미 16
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 86
대조구 50미 14
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 84
대조구 50미 20
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 86
대조구 50미 20
실시예 6: δ-아미노레불린산 경구투여에 의한 병원균 감염 어류 치료효과
본 실시예에서는 실험어로 넙치와 조피볼락 치어(평균체중 2 g)를 각 실험구 50미씩 사육수조에 수용하여 1 주일간 예비사육을 행하여 안정화시켰다. 인위감염은 어류 병원성 세균 6종 (Edwardsiella tarda, Streptococcussp.,Staphylococcussp.,Staphylococcus epidermis, Pseudomonassp. 및Vibrio anguillarum)을 감염병원체로서 사용하였으며 인위감염방법은 침지법으로 행하였다. 즉, 사육수조에 감염병원체를 가하여 병원체의 농도를 104CFU/mL이 되게 조정된 해수에 각각을 1시간 동안 침지하여 감염시켰다. 치료조건은 인위적인 감염 후 감염어체를 사육조로 옮겨서 3일간 감염기간을 준 후, 감염 4일째 되는 날에 사료에 대하여 0.1 ∼ 50 ppm의 δ-아미노레불린산을 첨가하여 깨끗한 해수로 환수하여 2주일간 사육하면서 감염에 따른 어체의 폐사를 확인하였다. 대조실험구는 각 세균들을 침지법에 의해 동일하게 감염 처리한 후, δ-아미노레불린산을 함유하지 않는 시판 배합사료로 사육하면서 각각의 세균 감염에 따른 넙치와 조피볼락의 폐사를 확인하였다. 실험결과, 넙치(표 20 ∼ 표 23)와 조피볼락(표 24 ∼ 표 27) 모두 δ-아미노레불린산 처리구가 생존율이 높았다.
병원성 세균 감염 넙치에 대하여 0.1 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 42
대조구 50미 4
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 36
대조구 50미 10
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 42
대조구 50미 30
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 42
대조구 50미 8
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 42
대조구 50미 14
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 44
대조구 50미 32
병원성 세균 감염 넙치에 대하여 1.0 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 68
대조구 50미 4
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 74
대조구 50미 10
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 68
대조구 50미 30
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 72
대조구 50미 8
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 68
대조구 50미 14
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 72
대조구 50미 32
병원성 세균감염 넙치에 대하여 10ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 82
대조구 50미 4
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 86
대조구 50미 10
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 86
대조구 50미 30
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 86
대조구 50미 8
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 82
대조구 50미 14
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 88
대조구 50미 32
병원성 세균 감염 넙치에 대하여 50 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 92
대조구 50미 4
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 90
대조구 50미 10
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 94
대조구 50미 30
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 92
대조구 50미 8
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 88
대조구 50미 14
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 90
대조구 50미 32
병원성 세균 감염 조피볼락에 대하여 0.1 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 52
대조구 50미 8
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 44
대조구 50미 18
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 36
대조구 50미 28
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 48
대조구 50미 12
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 52
대조구 50미 12
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 50
대조구 50미 28
병원성 세균 감염 넙치에 대하여 1.0 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 62
대조구 50미 8
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 66
대조구 50미 18
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 63
대조구 50미 28
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 70
대조구 50미 12
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 78
대조구 50미 12
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 74
대조구 50미 28
병원성 세균 감염 넙치에 대하여 10 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 68
대조구 50미 8
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 72
대조구 50미 18
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 64
대조구 50미 28
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 78
대조구 50미 12
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 86
대조구 50미 12
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 84
대조구 50미 28
병원성 세균 감염 넙치에 대하여 50 ppm의 δ-아미노레불린산처리에 따른 치료효과
병원성균 어체수 생존율()
에드와드지엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 처리구 50미 88
대조구 50미 8
스트렙토코쿠스속(Streptococcussp.) 처리구 50미 82
대조구 50미 18
스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 처리구 50미 86
대조구 50미 28
스타필로코쿠스속(Staphylococcussp.) 처리구 50미 88
대조구 50미 12
슈도모나스속(Pseudomonassp.) 처리구 50미 84
대조구 50미 12
비브리오 안구일라룸(Vibrio anguillarum) 처리구 50미 86
대조구 50미 28
실시예 7: 바이러스 감염 어류 치료효과
본 실시예에서는 실시예 3의 실험예 2에서 실험한 바와 같이in vitro조건에서 δ-아미노레불린산처리에 의한 바이러스의 감염 억제효과가 확인된 실험결과에 비추어 실제 바이러스의 감염에 의해 질병이 진행되고 있는 어류를 대상으로 δ-아미노레불린산을 처리하였을 때 감염어체의 폐사율의 감소를 확인하였다. 여수 인근의 양식장에서 PCR법으로 진단된 이리도바이러스(iridovirus) 감염 어군에 포함된 참돔을 각 30미씩 3개의 수조에 격리수용하고, 본 발명자 의해 제작된 δ-아미노레불린산을 이용하여 δ-아미노레불린산처리 A군(10 ppm), δ-아미노레불린산처리 B군(1.0 ppm), δ-아미노레불린산 처리 C군(0.1 ppm) 및 δ-아미노레불린산 무처리 대조군으로 나누어 경시적인 폐사율의 변화를 확인하였다. δ-아미노레불린산 처리 각 실험구를 3일 간격으로 3회 처리하고 10일째까지의 결과를 나타내었다. 실험결과, 표 28의 감염어 실험결과에서 보는 바과 같이 본 바이러스의 감염에 의한 폐사율은 실제 양어장의 경우 70에 이르지만 본 실험조건에서는 감염개체를 무처리한 상태의 경우 10일 경과에 이르기까지 50의 누적폐사율을 나타내었다. 하지만 δ-아미노레불린산을 처리한 구의 경우 실험 관찰 10일간에 걸쳐 A, B 및 C의 실험 조건에서 17, 17및 27의 낮은 폐사율을 나타내었다. 이러한 점으로 δ-아미노레불린산이 바이러스 질병에 대하여 치료효과를 나타냄으로써 δ-아미노레불린산처리에 의한 감염어체의 생존율이 향상되었다.
이리도바이러스 감염 참돔의 δ-아미노레불린산 처리에 따른 생존추이
δ-아미노레불린산 농도 처리 후 경과일수에 따른 생존 마리수
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
10ppm 30 28 26 26 26 26 26 25 25 25 25
1.0ppm 30 28 26 26 26 25 25 25 25 25 25
0.1ppm 30 25 25 23 23 23 23 22 22 22 22
0ppm 30 23 22 19 17 17 17 16 16 16 16
실시예 8: 에드와드 세균 감염 어류 치료
본 실시예에서는 육상수조식 양식장에서 사육중인 넙치(평균 체중 11 g)가 자연 발생적인 발병에 의하여 폐사되고 있는 양식장이 있어 그 양식장의 감염어를 조사한 결과 감염원은 에드와드 타르다 세균이 주요 원인이었고, 폐사가 발생된지 5일정도가 경과되어 그간 사육 탱크당 약 30 ∼ 40의 누적폐사가 있었으며, δ-아미노레불린산 처리 당시에도 에드와드 감염에 의한 전형적인 증상인 복부팽만 및 항문의 탈장 등 병변을 나타내는 개체가 관찰되어 병의 진행이 매우 심각하게 일어나고 있는 상황임을 확인하고 양식장의 수조에 δ-아미노레불린산을 처리하였다. 두개의 사육수조를 대상으로 수조에 첫째날 0.1 ppm의 δ-아미노레불린산로 2시간동안 약욕처리하고, 둘째 날과 3째날 0.01 ppm의 농도로 2시간동안 δ-아미노레불린산로 약욕 처리 후 환수시키며 생존상태를 관찰하였다. δ-아미노레불린산로 약욕처리한 수조 (약 3,000 미)의 경우 투여 후 1주일간의 누적 폐사율이 40를 유지한데 반하여, δ-아미노레불린산 무처리 수조의 경우 60이상의 폐사와 계속적인 병의 진행이 관찰되었으며, 이후에도 약 20정도의 폐사가 더 일어난 것으로 확인되었다. 결과적으로 무처리구의 경우 약 80의 누적폐사를 기록한데 비하여 발병 중에 δ-아미노레불린산로 약욕 처리한 처리구의 경우 그 폐사율이 약 40를 나타내었으며, 건강도의 비교에서도 탁월한 상태로 관찰되었다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid:ALA)을 어류에 수조투여 또는 경구투여할 경우 어류 병원성 세균의 감염을 예방 및 치료함으로써 항생제를 사용하지 않고도 양식어를 사육할 수 있는 뛰어난 예방효과와 치료효과가 있고 또 바이러스 감염 어류를 치료하는 효과가 있으므로 어류 양식산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (6)

  1. δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid:ALA)을 유효성분으로 함유하는 어류 병원성 미생물의 감염 예방 및 치료용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 어류 병원성 미생물이 에드와드지엘라 타르다 세균(Edwardsiella tarda), 스트렙토코쿠스속 세균(Streptococcus sp.), 스타필로코쿠스속 세균(Staphylococcus sp.), 스타필로코쿠스 에디더미디스 세균 (Staphylococcus epidermidis), 슈도모나스속 세균(Pseudomonas sp.) 또는 비브리오 안구일라룸 세균(Vibrio anguillarum)임을 특징으로 하는 어류 병원성 미생물의 감염 예방 및 치료용 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항의 상기 어류 병원성 미생물의 감염 예방 및 치료용 조성물을 어류 양식 사육수조에 0.1 ∼ 100ppm의 농도로 첨가하여 수조투여하거나 통상의 어류양식 사료에 1.0 ∼ 100ppm으로 첨가하여 경구투여함으로써 어류병원성 미생물의 감염을 예방하거나 치료하는 것을 특징으로 하는 어류 병원성 미생물의 감염예방 및 치료방법.
  4. δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid)을 유효성분으로 함유하는 이리도바이러스(irido virus) 감염 치료용 조성물.
  5. 제 4 항의 상기 이리도바이러스 감염 치료용 조성물을 어류 양식 사육수조에 0.1 ∼ 10ppm의 농도로 첨가하여 수조투여함으로써 이리도바이러스 감염을 치료하는 것을 특징으로 하는 이리도바이러스 감염 치료방법.
  6. δ-아미노레불린산(δ-aminolevulinic acid)을 통상의 어류양식 사료에 1.0 ∼ 100ppm으로 함유시킴을 특징으로 하는 어류양식용 사료.
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