KR100451906B1 - 키토산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 어류 양식장에서 어병의 림포바이러스증 예방제 - Google Patents

Abstract

(목적) 양식어류의 어병균에 의한 림포바이러스증 예방제를 제공함을 목적으로 한다.

(구성) 사료에 키토산 올리고당 유도체를 혼합하여 이를 양식어류에 급이하여서 됨을 특징으로 하는 키토산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 림포바이러스의 예방제이다.

Description

키토산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 어류 양식장에서 어병의 림포바이러스증 예방제 {A remedy for prevention against fish disease, reinforcement of immune vitality and promotion of growth in a fish farm based on active component of chitosan and oligosaccharide}

본원 발명은 천연 고분자 키토산을 효소로 가수분해시켜 만든 수용성 키토산 올리고당 유도체인 키토산 올리고당 유도체[세원화성(주)]가 무독성이며 해수(넙치, 우럭, 돔류, 농어류....) 및 담수(뱀장어, 향어, 송어...) 양식장에서 어병의 림포바이러스증 예방제를 제공함을 목적으로 한다.

해산이나 담수산의 어류 양식에서 성패를 좌우하는 것은 최적의 환경 하에서 각종 질병(바이러스성, 세균성, 기생충성)에 감염되지 않게 건강하면서 빠른 성장조건으로 키우는 것이 무엇보다 중요하다고 할 수 있다. 그러나 현재 우리 나라 양식산업은 양적 팽창에 따른 양식장의 무분별한 난립과 각종 살균소독제(포르말린, 과산화수소수)의 다량사용으로 수 환경 악화 등에 의한 환경적 요인과 외국으로부터 새로운 어종(넙치, 돔류 및 뱀장어류)의 도입으로 인한 이차적인 어병균의 유입 및 출현(예, 스쿠티카증), 각종 항생제의 남용에 따른 내성균의 출현 등 생물학적 요인 등으로 인해 고수온기 뿐만 아니라 사시사철 돌발적인 대량 폐사를 일으켜 결국 양식장의 도산이라는 상황에 직면하는 피해가 속출하고 있다. 이 중에서도 우리 나라 양식산업의 주 어종인 넙치 양식에서 종묘장에서 치어(1∼20cm)시기에 초기먹이생물의 세균성(비브리오) 질병에 의한 오염으로 20일 령에서 자주 발생되는 장관백탁증, 체내외에 기생하는 스쿠티카증 등은 대량 패사를 유발하는 질병으로 감염발병 시 적절하고도 근본적인 구제수단이 없어서 종묘장 및 육성장에서 막대한 피해를 주고 있다. 또한 여름에 종묘를 하는 치어에서는 항상 에드와드균이 겨울동안 포낭 형태로 잠재해 있으므로써 다음해 고수온기에 복수증 등으로 집중발병을 하는 것으로 보고되어 있다. 따라서 현재 이들 병원성 세균 및 기생충은 양식현장에서는 심각한 어병으로 분류하고 있으며, 이들의 치료는 다양한 항생제 투여나 단순히 포르말린이나 과산화수소수에 의한 약욕 처리에 의한 소독 차원에서 행하여지고 있으며 어느 정도는 효과를 보고 있는 실정이다. 그러나 이러한 치료수단들은 어체의 안전성이라는 문제 외에 국민 건강의 차원에서 심각한 문제로 대두 될 수 있는 소지를 많이 내포하고 있다고 할 수 있다. 예를 들면 스쿠티카증 치료로 포르말린을 투여할 경우 외부기생성 스쿠티카에만 제한적인 효과가 인정될 뿐 뇌, 간, 신장 및 근육조직 등 내부 침입 스쿠티카는 구제할 수 없어 다시 약욕처리 후 재 발생하는 악순환을 되풀이하고 있을 뿐 아니라 발암물질인 포르말린처리 고기가 식탁에 올라왔을 때는 그에 따른 2차적 피해는 엄청날 것으로 생각된다. 또한 과산화수소수 약욕 시 간조직에 단 시간내에 수포가 차는 공변증 현상으로 말미암아 어류에는 치명적인 해를 미칠 수 있다. 또한, 각종 항생제의 남용은 우리 양식어류의 수출산업을 제한하고, 어류를 먹은 사람들에게도 간접적으로 항생제를 복용하는 결과를 초래해 장기적으로 양식산업의 퇴조를 초래하게 될 것으로 전망된다.

현재 어류 양식장에서 어병균과 스쿠티카증을 예방할 수 있는 동물약품은 매우 제한적이며, 단지 예방차원에서 선별 후 물리적인 상처를 통하여 어병균의 차단의 방편으로 감염예방과 해수에 존재하는 세균이나 기생충의 숫자를 줄이고자 인공합성 항균제들인 옥시테트라 사이클린(OTC) 또는 설파제 계열의 항생제를 주기적으로 사용하고 있는 실정이다. 그러나 이들 약제의 사용에도 불구하고 사육 수조에서 항생제 내성 어병균과 변형 스쿠티카증의 병변이 병어에 출현 시에는 대량 폐사가 나타나고 있는 실정이다. 따라서 근본적으로 이들 어병균 및 스쿠티카 기생충에 대한 양식장의 피해를 막기 위해서는 넙치양식장내 사용되는 해수내에 어병균과 스쿠티카 섬모충을 조기에 발견하여 처치하는 예방적 조치가 필요하다고 할 수 있다. 또한 감염이 이미 되어버린 양식어류의 경우 효과적인 치료제의 적용으로 단 시간에 치료하는 것이 좋으나 기존 구제법으로는 내부감염 시 전혀 효과가 없을 뿐 만 아니라 외부 병변 조직에서도 표피 내 점액질 속으로 스쿠티카가 숨어 들어가 있기 때문에 효과적이지 못하다. 더구나 포르말린의 경우 다량 사용 시 병어자체의 감수성이 약한 조직(아가미)등의 약해로 먹이섭취의 불량 및 약물 독성 등의 부작용을 낳고 있다.

면역력을 증강시키는 몇 가지 제품들이 시중에 나와 있다. 그러나 이들의 특징들은 오직 면역력에 초점이 되어있으며, 키토산 올리고당 유도체처럼 항균력을 보유한다거나 하는 복합적 기능은 없다.

위와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 양식어류의 어병균에 의한 림포바이러스증 예방제를 제공함을 목적으로 한다.

도1은 본원 키토산 올리고당 유도체의 약욕처리에 의한 스쿠티카 섬모충에 대한 유효 사멸 농도 및 사멸 시간을 나타낸 그래프이다.

도2는 본원 키토산 올리고당 유도체의 사료첨가 급이 시 넙치 내부 장기조직에서 스쿠티카 섬모충의 구제효과를 나타낸 그래프이다.

도3은 본원 키토산 올리고당 유도체의 장기간 사료첨가 급이 시 스쿠티카증의 내병성 효과를 보인 그래프이다.

도4는 본원 키토산 올리고당 유도체에 의한 스쿠티카 섬모충의 사멸과정을 나타낸 사진이다.

도5는 양식현장에서 치어시기에 본원제제의 사료 급이 시 에드와드 포낭의 구제 효과를 나타낸 그래프이다.

도6은 본원 키토산 올리고당 유도체의 급이 전과 급이 후의 간세포의 변화 사진이다.

도7은 현장에서 본원 키토산 올리고당 유도체의 급이 전과 급이 후 림포바이러스의 발병율과 예방효과를 나타낸 그래프이다.

도8은 각종 어병균과 스쿠티카에 오염된 초기먹이생물인 로티퍼와 알티미어의 본원 키토산 올리고당 유도체의 영양강화 후 항균력 및 항기생충성 효과를 나타낸 그래프이다.

도9는 실지렁이를 키토산 올리고당 유도체의 수욕액에 침지시킨 후 뱀장어 급이 시의 항균력 보유를 나타낸 그래프이다.

도10은 본원 키토산 올리고당 유도체의 장기간 급이 시 성장률에 대한 그래프이다.

위와 같은 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제를 해결하기 위해서, 사료에 키토산 올리고당 유도체를 혼합하여 이를 양식어류에 급이하여서 됨을 특징으로 하는 키토산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 림포바이러스의 예방제이다.

(실시예)

실시예 1. 키토산 올리고당 유도체의 농도에 따른 해수내 스쿠티카 섬모충의 사멸농도 및 사면시간

본 발명은 키토산 올리고당 유도체를 주성분으로 한 액상화되어 있는 제품을 사용하였다.

먼저 해수를 4L 비이커에 스쿠티카 섬모충과 혼합하여 넣은 후 이에 키토산 올리고당 유도체를 0.01%, 0.1%, 0.3% 및 0.5% 첨가하여 스쿠티카의 사멸 농도와 경과 시간에 따른 스쿠티카의 사멸율을 광학 현미(400배)관찰한 결과 표1과 같다. 실험실조건에서 가장 적정한 스쿠티카 사멸농도는 0.01%이상이였다. 도1 및 표1은 투여 후 시간경과에 따른 해수에서 스쿠티카 출연 개체수를 표시하였으며, 환부에서 출연율도 조사하였다. 키토산 올리고당 유도체를 투여 직후 활발했던 스쿠티가의 운동성이 급격히 저하되면서 시간이 경과됨에 따라 수축포가 확장됨과 아울러 유선형체에서 원형체로 변화하였고 약 30∼1시간 경과 후에는 스쿠티카가 완전히 파괴되었다.

표1

실시예 2. 스쿠티카에 감염된 넙치에 실시예1의 키토산 올리고당 유도체를 사료에 첨가 급이 시 넙치 장기조직에서 스쿠티카 섬모충의 구제효과와 사멸율 시험

양식현장의 넙치 육성장(완도 P 수산)에서 스쿠티카에 병변이 보이는 치어(7∼15cm)를 조사한 결과 98%의 내부감염과 이중 50% 이상의 외부감염 흔적인 병변 및 흑화를 확인하고, 펠렛 사료에 키토산 올리고당 유도체의 적정농도(100cc/4kg)로 흡착시켜 일일 3회의 7일동안 급이 후 뇌, 간, 심장 및 근육에 감염된 스쿠티카충의 존재여부를 시간경과에 따라 해부하여 현미경하에서 조사하였다. 넙치의 육상 축양장에서 근육괴사 및 비정상적인 유영 등의 전형적인 스쿠티카 섬모충의 감염 증세를 나타내는 넙치의 근육 및 뇌 조직 적출물로 부터 현미경 검사로 그 감염여부를 확인하였다. 구제효과 평가 어군은 스쿠티카가 발생한 넙치 병어군으로써 평균체중이 23g, 평균체장은 8∼15cm인 약 4만 수 였다.

내부조직에 감염되어 있는 스쿠티카의 사멸율을 조사한 결과 최초 처리 후 7일이 경과하였을 때 폐사 수가 급격히 감소하였으며 이에 대한 결과를 제2도에 나타내었다.

이들 결과 내부감염의 95% 이상이 치유되었으며 전체 개체수 중 외부 병변(괴양)이 보이는 개체 약 20%가 치유되었다. 따라서 키토산 올리고당 유도체를 급이 시 내부 감염된 스쿠티카의 치료에 탁월한 효능이 있음을 알 수 있다.

실시예 3. 키토산 올리고당 유도체를 장기 급이 후 어병균과 스쿠티카증에 대한 내병성

어병균과 스쿠티카증에 전혀 감염되지 않은 정상적인 넙치 치어(7∼15cm)군에 일정 농도(100cc/20kg)의 키토산 올리고당 유도체를 30일 동안 사료에 첨가하여 급이 후 어병균인 에드와드, 비브리오, 연쇄구균, 및 스쿠티카 섬모충을 인공 감염시켰다. 인공감염은 어병균의 경우 50마리 이상의 넙치를 무작위로 선정하여 복강으로 10⁵∼10⁶CFU/ml의 농도로 주사하였으며, 스쿠티카는 이미 발생한 병어를 현미경으로 확인한 후 키토산 올리고당 유도체를 급이한 넙치(표시함)를 외부상처를 유발시킨 후 사육 수조에 혼합시켜 사육하였거나 스쿠티카충이 관찰되는 해수를 역시 키토산 올리고당 유도체를 급이한 넙치 사육 어군 내 급수하여 인공감염도 시도하였다. 사료(20kg)에 키토산 올리고당 유도체 100cc를 첨가하여 급여한 넙치 군에 대하여 어병균과 스쿠티카충의 감염정도를 시간 경과에 따라 병변의 출현 및 폐사량을 조사하였는데 이에 대한 결과는 표1 제3도에 나타내었다.

그 결과 에드와드균과 비브리오균을 인공감염 시 키토산 올리고당 유도체 투여군은 70∼80%의 생존율을 나타냈으나 키토산 올리고당 유도체 무 투여군은 24시간이내에 전부 폐사하였다. 또한 스쿠티카 감염 적용에서도 무투여군에서 7일 경과 후 70% 이상의 감염증상을 보였으나 키토산 올리고당 유도체 투여군에서는 전혀 스쿠티카증에 감염되지 않았다. 이들 결과들은 장기간 사료에 키토산 올리고당 유도체를 혼합 급이 하였을 때 내병성이 증가되는 것으로 판정된다. 스쿠티카가 감염되어있는 인접 수조에서 55만미를 키토산 올리고당 유도체(100cc/ 20 kg 펠렛사료) 투여군에서도 전혀 감염되지 않았다.

표2

실시예 4. 키토산 올리고당 유도체의 어류에 대한 안정성

키토산 올리고당 유도체를 해수에 첨가하거나 또는 경구투여 하였을 때 어체에서 나타날 수 있는 세포학적 조직손상(약해) 없이 급이 또는 약욕 가능한 농도와 안정성을 조사하기 위하여 0.2톤 순환식 간이수조에 0.1톤의 해수를 입수시킨 후 키토산 올리고당 유도체(5%)를 최종농도를 0.02, 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 5.0 및 10.0%(w/v)로 조제한 다음 공시어로서 넙치 체장 2∼3cm, 5∼7cm, 10∼13cm 및 15∼18cm의 넙치 100마리씩을 0.2톤 간이수조에 각각 투입하였다. 1시간, 3시간, 24시간, 240(10일)시간 경과 후 약해의 정도를 조사하였다. 치자어용 사료(천하제일 초기사료)에 혼합하여 사용하였고 모든 실험 군의 공시어에 이들 사료를 1일 3회씩 급이하였다.

실시예 1∼ 3로부터 스쿠티카충에 대한 키토산 올리고당 유도체의 스쿠티카에 대한 항기생충 및 내병성에 대한 효과가 발효되는 시점을 기준으로 약욕 및 경구투여 시 안정한 적용 농도를 산출하였다. 키토산 올리고당 유도체의 약욕에 따른 폐사는 고농도(10,000ppm) 조건에서도 전혀 폐사가 나타나지 않았다. 또한 경구투여 시에도 전혀 약해를 받지 않았다. 결국 키토산 올리고당 유도체를 사료에 혼합하여 경구 투여하였을 때 경구투여 하지 않은 군에 비하여 왕성한 활력을 나타내었고 먹이 손실도 거의 없는 것으로 관찰되어 경구투여에 의한 약해는 전혀 없는 것으로 판정할 수 있었는데 이들 결과는 표3에 나타내었다.

표3

- : 약해없음, ±: 10∼20% 약해, + : 50% 약해, + + : 80% 이상 약해(섭이 불량)

표3은 키토산 올리고당 유도체의 약욕 및 경구투여 급이 시 약해 유무의 도표이다.

실시예 5. 키토산 올리고당 유도체에 의한 스쿠티카 섬모충의 사멸 기작

키토산 올리고당 유도체의 스쿠티카 섬모충의 사멸 기작은 치료 차원의 설명에 매우 중요하다. 포르말린은 스크티카섬모충외에 어류 조직을 고정화시키는 기작이 있는 반면 과산화수소수처럼 막을 산화시키는 작용도 있다. 그러나 천연물질인 키토산 올리고당 유도체는 이 들과는 다른 기작으로 스쿠티카를 사멸시킨다는 것을 현미경을 통하여 확인하였다. 제 5도는 이들 스쿠티카충의 사멸과정과 기작을 시간경과에 따라 나타낸 사진이다. 이 사진(도4)에서 보는 바와 같이 키토산의 흡착효과가 단세포인 스쿠티카 섬모충의 막에 작용하여 막 수송에 관여하는 물질의 교란하여 삼투압체계를 파괴하여 사멸시키는 것으로 판단된다.

실시예 6. 양식현장에서 치어에 키토산 올리고당 유도체를 혼합한 사료를 급이 시 에드와드 포낭의 구제 효과

표4는 55만 가량의 넙치 치어에 키토산 올리고당 유도체를 100cc/20kg 사료를 혼합 급이 후 시간 경과예 따른 에드와드 포낭의 제거율을 나타내었다.

그 결과 사료에 키토산 올리고당 유도체 혼합 금이 후 30이 경과 후 60%의 치료율을 75일 경과 후에는 100%의 에드와드 포낭을 제거할 수 있었다. 이것은 키토산 올리고당 유도체가 겨울철 에드와드 포낭을 가지고 있는 넙치 치어에서 에드와드 포낭을 치료함으로서 고수온기에 대량 발병하는 복수증을 예방할 수 있는 획기적인 물질임을 증명한다.

실시예 7. 키토산 올리고당 유도체 급이 전과 급이 후의 간세포의 변화

키토산 올리고당 유도체의 여러 가지 생리적 기작 중 하나는 간 기능 개선의 효과이다. 키토산 올리고당 유도체를 사료에 혼합 급이 시 안전성은 평가되었으나, 이들의 가시적인 효과를 보기 위하여 우럭과 넙치에 각각 30일, 15일 경과 후 간 조직의 변화 유무를 확인하였다. 먼저 키토산 올리고당 유도체를 투여하기 전에 항생제에 해를 받은 양식어류를 선정하였으며, 양식현장에서 우럭은 5만, 넙치는 7만미에 급이시켰다. 그 결과 외형상 관찰에서 키토산 올리고당 유도체 투여군은 사료 섭이력이 증가되었으며 또한 사료효율이 상승하고, 양식어류의 활력이 증강되었으며, 증체율을 확인할 수 있었다. 이러한 원인들이 어디에 있는지를 알아보고자 세포학적인 조직 검사를 시행하였다. 도7은 키토산 올리고당 유도체 투여군과 무 투여군의 일정기간 경과 후 간 조직의 변화를 나타낸 것으로 키토산 올리고당 유도체 급이 후에 항생제에 의한 약해를 받았던 간 조직이 정상적으로 회복되는 것을 알 수 있었다.

실시예 8. 양식 현장에서 키토산 올리고당 유도체 급이 시 림포바이러스의 발병율 변화

3년 동안 양식하는 현장에서 항상 3∼4월에 전체어류의 30∼50% 이상이 림포바이러스에 감염되는 양식장을 선정하여 림포바이러스가 발병되기 4달 전인 11월 말 부터 키토산 올리고당 유도체를 100cc/20kg 사료 비율로 장기 급이 하였을 때 12만을 키우는 양식장에서 0.1% 미만의 발병율을 보였으며(대조연도 97년 20% 또는 36%, 98년도 23% 또는 44%) 이는 예년(30∼50%)에 비해 획기적으로 림포바이러스를 예방하는 효과가 있다. 도7은 림포바이러스의 예방 효과를 전년과 비교한 그래프이다.

실시예 9. 각종 어병균과 스쿠티카에 오염된 초기먹이생물인 로티퍼와 알티미어의 영양강화 시 키토산 올리고당 유도체의 항균력 및 항기생충성 효과

키토산 올리고당 유도체의 넙치 및 우럭 종묘장으로 여수 돌산소재 H수산을 선정하여 장관백탁증 및 스쿠티카증의 예방목적으로 초기먹이생물의 영양강화 시 키토산 올리고당 유도체를 투여하였다. 초기먹이생물의 영양강화 시 키토산 올리고당 유도체를 100cc/1톤 함량으로 2∼3시간 영양강화 한 후 먹이로 공급하였을 때 초기 20일 령에서 장관백탁증을 예방할 수 있었다. 또한 로티퍼에 기생하는 스쿠티카 섬모충을 완전히 구제하였다. 도8은 이들 결과에 대한 그래프이다.

실시예 10. 뱀장어 초기먹이 붙임 시 실지렁이의 영양강화 후 항균력 효과

치어의 먹이 붙임 시 실지렁이를 키토산 올리고당 유도체 0.3%에 2∼3시간 동안 침지 후, 이를 사료로 급이 시 현저한 어병균의 발병율을 떨어뜨릴 수 있다. 키토산 올리고당 유도체 도9는 침지 후 투여군과 무 투여군에서의 어병균의 발병 자료이다.

실시예 11. 키토산 올리고당 유도체의 장기간 급이 시 증체율 향상

12만을 키우는 양식현장(장흥 회진 I수산)에서 키토산 올리고당 유도체를 100cc/20 kg비로 사료에 혼합 급이 시 항생제의 사용량은 현저하게 줄이면서도, 양식어류의 증체 효과를 확인 할 수 있었다. 도10은 키토산 올리고당 유도체 투여군과 무투여군의 계절별 성장그래프를 표시하였다.

본 결과 키토산 올리고당 유도체 투여군에서 무투여군에 비하여 20∼30% 이상의 증체율을 확인할 수 있었다.

표4

양식어류의 림포바이러스의 예방 등의 효과가 있다.

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5. 사료에 키토산 올리고당 유도체를 혼합하여 이를 양식어류에 급이하여서 됨을 특징으로 하는 키토산 올리고당 유도체를 유효성분으로 하는 림포바이러스의 예방제.
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