SE449003B - Sett att in vitro avskilja spermier med egen rorelseformaga medelst penetrationsmedium i vilket ingar hyaluronsyrasalt - Google Patents

Description

449 nos: test av denna typ, p g a att cervixsekretets kvalitet varierar mellan olika kvinnor och hos samma kvinna dessutom under menstruationscykeln. Cervixsekret är dessutom svär- åtkomligt och innehåller komponenter, som gör det olämpligt -för in vitro förfaranden. Det har dålig hållbarhet och är svårt att sterilisera och medför risk för överföring av smitta. H För att undvika nackdelarna med det naturliga penetrations- mediet för spermier (d v s cervixsekret) har man övergått till att använda substitut härför bestående av lösningar av diverse ämnen i vatten. I det följande och i kraven kallas- ett sådant substitut för ett vattenhaltigt, artificiellt penetrationsmedium för spermier (eller endast penetrations- medium eller medium) till skillnad från ovannämnda naturliga penetrationsmedium för spermierna. Olika utformningar av ett sådant artificiellt medium är tidigare beskrivna. De fysiolog- I iska saltlösningar, som använts för detta ändamål, har innehàllit lågmolekylära ämnen och ibland också makramole- kylära ämnen såsom albumin. Sådana lösningar ges pH-värden inom ett för spermierna lämpligt och fysiologiskt fördragbart intervall (t ex genom tillsats av en fysiologiskt fördragbar buffert) och de kan innehålla för spermierna fysiologiskt fördragbara ämnen, t ex salter, näringsämnen, aktiverande ämnen, kapaciteringpåverkande ämnen, spårelement o s v) Exempel härpå är sådana ämnen som förekommer i blodplasma goch blodserum (serum är en lämplig tillsats till sådana medier). Genom tillsatser kan också lösningarnas osmotiska tryck regleras till för spermierna lämpliga värden. De kan också innehålla tillsatser för att förhindra att_mikroorga- nismer väàer i mediet, tvex antibiotika. Det finnes en omfattande litteratur beträffande lämpliga lösningar i vilka spermierna kan överleva och bevara sin rörelseförmàga och befruktningsförmàga och som kan användas som penetrations- medium. I 449 on: _ g__ Det kan exempelvis vara välkända fysiologiska medier, vilka har för fackmannen välkända lösningsbenämningar såsom Ringer, Krebs-Ringer, Thyrode, BWW, Ham, HAT, Baker, Eagle,* Earl o s v och vilka eventuellt är modifierade t ex genom ytterligare tillsatser t ex av buffertsubstanser, albumin "eller serum. (Några exempel härpà lämnas i följande referenser: Ericsson et al, Nature'24§ (1973) 421 - 424, Lopata et al, .fertility and steriiity 27 (1976) 'G71 - 684, Kap-er et al, Br. J. Urology 51 (1979) 587 f 590, Wolf et al, J. Andrology' 3 (1982) 445 f 451, Beernik et al. Fertility and sterility 38 (1982) 493 ~ 495 och Prasad Int. J. Andrology 7 (1984) 5-22.) i' 'i ' När de selekterade spermierna skall användas för fertilise- ' ring är det speciellt viktigt att_de ej är defekta. De bör då vara befruktningsdugliga och uppvisa en god egen rörelse- :förmåga och ha en intakt enzymproduktion, t ex av hyaluroê nidas och de bör då föreligga i ett medium, som är gynnsamt för ägget. l 7 ' Selekteringen av spermier med tillfredsställande egen rörelseförmàga med tillhjälp av ett skikt av ett penetra- tionsmedium i vilket spermierna får vandra in kan arrangeras 'pà olika sätt. Vanligtvis lagras ett skikt av penetrations- . mediet ovanpå vätskeprovet, som innehåller spermier, var- efter spermier med egen rörelseförmåga får simma upp i det ovanliggande skiktet. Man kan även arrangera selekteringen t ex så att ett skikt av penetrationsmediet lagras under vätskeprovet, som innehåller spermier, varefter spermier får simma ned i det underliggande skiktet. Densiteten för mediet och densiteten för vätskeprovet väljes härvid på lämpligt sätt. Vanligtvis utgör skiktet av penetrationsmediet en helt homogen fas. Det är dock möjligt att arrangera det så att I spermierna får vandra igenom flera skikt, som uppvisar något olika sammansättning, eller genom ett skikt som uppvisar en koncentrationsgradient för ett eller flera ämnen i mediet. _- . w... _ .V , ._ _ ~_.L.....__....-- V. »w-í-w-...N _.. _..._... _ ... ........_............- *p44è 003 Selekteringen av spermierna vid deras vandring in i det* artificiella penetrationsmediet kan utnyttjas i diagnostiskt syfte. Man kan härvid t ex studera antalet spermier som vandrar i skiktet och deras_rörelsehastigheter. Förfarandet kan också användas för att selektera spermier med god egen rörelseförmàga för.användning vid fertilisering. Härvid avskiljes spermier, som vandrat in i skiktet av penetra- tionsmediet och vid behov koncentreras den uttagna sper- miesuspensionen t ex genom centrifugering och resuspendering i en mindre vätskevolym av samma medium eller ett annat medium.

Exempelvis beskriver Wolf och Sokoloski (Journal of Andrology 3 (1982) sid 445 - 451) och Prasad (Journal of Andrology 7. (1984) sid 5 - 22) ett förfarande där en bestämd mängd sädesvätska på botten av ett provrör kontaktas med ett albumininnehâllande medium, vilket_försiktigt skiktats över det undre mediet. Röret lutas därefter något så att kontakt- ytan mellan medierna ökas varefter penetrationen får ske under ca 1 timme vid 37 OC. Supernatanten avlägsnas ochf 'spermierna däri koncentreras genom centrifugering och tvättas därefter genom ett upprepat resuspenderings-centri- fugeringsförfarande. Den slutliga spermieklumpen resuspenderas i ett lämpligt medium och mängden spermíer bestämsÅ' Vid in vitro fertilisering är dock det vanligaste förfarandet fortfarande att sädesvätska, utspädd med ett albumininne- hàllande medium, centrifugeras ner i ett provrör varefter supernatanten avlägsnas och klumpen av fast material på rörets botten resuspenderas. Detta förfaringssätt upprepas ev några gånger.för effektiv tvättning. Det är värt att notera att denna metod ej medför att livsdugliga spermier med egen rörelseförmåga avskiljes från defekta spermier utan egen rörelseförmâga och andra olösliga komponenter i det ursprungliga provet. 449 003 Då tidigare använd teknik ej är helt tillfredsställande föreligger_ett väsentligt behov av ett förbättrat, enkelt, reprodueerbart och skonsamt förfarande för selektering av spermier med egen rörelseförmàga från defekta spermier och andra komponenter med tillhjälp av ett penetrationsmedium för spermier. Ett förbättrat förfarande är önskvärt såväl för kvantitativ och kvalitativ analys av spermiemotiliteten m m som för preparerande av spermiematerial för såväl in vitro som in vivo ferti1isering.; Vi har nu funnit att sättet att selektera spermier med egen rörelseförmága med tillhjälp av ett penetrationsmedium enligt vad som beskrivits ovan kan avsevärt förbättras genom att nämnda penetrationsmedium innehåller en tillsats av ett vattenlösligt, för spermierna fysiologiskt fördragbart salt av hyaluronsyra, som således föreligger i lösning i mediet.

En komplettering av det vattenhaltiga, artificiella penetra- tionsmediet för spermier så att det även innehåller ett vattenlösligt, fysiologiskt fördragbart salt av hyaluronsyra har överraskande visat sig vara mycket gynnsamt§ Det förß bättrade penetrationsmediet är i första hand avsett för selektering av humana spermier men kan även användas för selektering av andra spermier t ex från husdjur.- Föreliggande uppfinning avser således: Sätt att in vitro från ett vattenhaltigt prov innehållande spermier avskilja spermier med egen rörelseförmåga genom att provet bringas i kontakt med ett skikt av ett vattenhaltigt, artificiellt penetrationsmedium för spermier, varvid spermier med egen rörelseförmåga får vandra in i nämnda skikt från provet innehållande spermier kännetecknat av att i nämnda penetra- tionsmedium har införlivats ett vattenlösligt, fysiologiskt fördragbart salt av hyaluronsyra.

Uppfinningen omfattar också sätt enligt ovanstående känne- tecknat av att spermier, som vandrat i skiktet av penetra- tionsmediet, tillvaratages, t ex för fertilisering, exempel~ vis för in vitro fertilisering. 449 003- . .

Sättet enligt uppfinningen möjliggör också att man kan-e avskilja spermier med olika rörelsehastigheter från varandra genom att spermierna hinner vandra olika långt i penetrations- mediumskiktet på en viss tid. Man kan när så önskas taga ut spermieprover på olika nivåer i skiktet eller låta spermier vandra in i ytterligare ett vätskeskikt där de tillvaratages.

Uppfinningen omfattar givetvis även denna utföringsform.

Hyaluronsyra med dess salter (hyaluronat) är en_po1ysackarid med mycket speciella egenskaper, som kan erhållas t ex ur tuppkammar eller genom odling av vissa mikroorganismer.

Denna polysackarids biologiska, kemiska och fysikalisk-kemiska ~egenskaper medför att en inkorporering av ett vattenlösligt, fysiologiskt fördragbart salt av polysyran hyaluronsyra (d v s ett vattenlösligt, fysiologiskt fördragbart hyaluronat) i penetrationsmediet för spermier gör_detta speciellt gynnsamt för sitt ändamål. Som vattenlösligt, fysiologiskt fördragbart salt av_hyaluronsyra utnyttjas i första hand natriumsaltet (natriumhyaluronat) men även andra vatten- lösliga, fysiologiskt fördragbara salt kan ifrägakomma.

Saltet ifråga kan även vara ett blandsalt d v s två eller flera positiva joner föreligger som motjoner till hyaluron- syrans karboxylgrupper. Härvid kan det t ex vara två eller flera av de positiva joner, som förekommer i blodplasma och i kristalloida ersättningslösningar härför och som brukar ingå i penetrationsmedium för spermier. De inbördes propor- tionerna mellan dessa joner kan t ex väljas så att de storleksordningsmässigt motsvarar de fysiologiska inbördes proportionerna för dessa joner i blodplasma, vilket innebär mest natriumjoner och mindre mängd kaliumjoner o s v. Som saltbildare kan även tänkas fysiologiskt fördragbara organiska aminer. Företrädesvis låter man dock hyaluronsyran i mediet föreligga som natriumsalt eller huvudsakligen som natriumsalt I och i jämnvikt med de joner som föreligger i penetrationsmediet.

Lämpligtvis innehåller mediet fysiologiska koncentrationer . av natrium- och kaliumjoner. 044.9 003 - 7 Vattenlösligt, fysiologiskt fördragbart salt av hyaluronsyra -kan erhâl1as_med medelmolekylvikter (HW) inom ett vidsträckt intervall beroende på ursprung, prepareringsförfarande och eventuell fraktionering. Medelmolekylvikten (fiw) kan exempel- vis vara högre än 10 000, t ex högre än 50 000, såsom högre än 100 000 och även högre än 500 000 och den kan exempelvis vara lägre än 20 000 000, t ex lägre än 10 000 000, såsom lägre än 5 000 000 och t ex även lägre än 1 000 000. Före- trädesvis väljes en högmolekvlär produkt med en medelmolekyl- vikt (Üfi), som är högre än 50 000, t ex högre än 100 000 eller högre än 500 000. MW kan därvid exempelvis vara-lägre 'än 20 000 000, t ex lägre än 10 000 000 eller 5 000 000.~ Genom tillsatsen av hyaluronatet kan även uppnås att penetra- tionsmediet erhåller en viskositet, som är lämplig för penetrationsmediet och som kan varieras på önskvärt sätt beroende på försöksbetingelserna och syftet med spermiepene- trationen. Exempelvis kan penetrationsmediet ges ett viskosi- tetsvärde som är högre än Ä cP (centiPoises) vid 370 C, t ex högre än 5 cP, såsom högre än 10 cP och som är lägre än 300 cP, t ex lägre än 100 cP, såsom lägre än 50 cP, exempel- vis lägre än 30 cP. Ju högre medelmolekylvikt man väljer för produkten ju mindre tillsats behöves givetvis för att uppnå önskad viskositet.

Beroende pà försöksbetingelserna och syftet med spermiepene- trationen kan man välja en medelmolekylvikt och en koncentra- tion för hyaluronatet, som är gynnsammast för det aktuella fallet. Koncentrationen av hyaluronatet i penetrationsmediet kan exempelvis vara högre än 0,01 mg, t ex högre än 0,05 mg, såsom högre än 0,1 mg, exempelvis högre än 0,2 mg per ml och koncentrationen av hyaluronatet kan exempelvis vara lägre än 20 mg, t ex lägre än 10 mg, såsom lägre än 5 mg, exempelvis lägre än 1 mg eller 0,5 mg per ml. Exempelvis väljes en koncentration inom intervallet 0,05 till 5 mg per ml. 449 003 _ gi- Vad som i inledningen sagts om sättet att avskilja rörliga spermier och om det vattenhaltiga, artificiella penetrationsF mediet för spermier, vilket användes härför, gäller även för sättet och för det förbättrade vattenhaltiga, artificiella penetrationsmediet för-spermier enligt föreliggande uppfinning.

Exempelvis ges således även det förbättrade mediet enligt uppfinningen pH-värden inom ett för spermierna lämpligt och - fysiologiskt fördragbart intervall (t ex genom tillsats av en fysiologiskt fördragbar buffert, t ex en fosfatbuffert eller bikarbonatbuffert, exempelvis en natriumfosfatbuffert till fysiologiskt normalt pH-värde) och det kan innehålla fysiologiskt fördragbara ämen (t ex ett eller flera ämnen valda ur en eller flera av grupperna: salter såsom klorider, _acetat laktat o s v av natrium, kalium och kalcium, varvid företrädesvis väljes fysiologiska koncentrationer av de positiva Éonerna; näringsämnen såsom glukos, fruktos; protein såsom albumin: serum som lämpligtvis är värmeinak- tiverat vid 56 OC under 3Q min; ev jämviktning med luft innehållande C02 (t ex 5 %); o-s v) såsom redogjorts för i inledningen, varvid också mediets osmotiska tryck kan regleras till-för spermierna lämpliga värden.

Genom att i ovan beskrivet vattenhaltigt, artificiellt penetrationsmedium för spermier införliva ett vattenlösligt, fysiologiskt fördragbart salt av hyaluronsyra kan mediet för användning enligt uppfinningen framställas. (Härvid kan hyaluronatets medelmolekylvikt och koncentration och mediets viskositet väljas som ovan beskrivits.) Den ordning i vilken komponenterna tillsättes vid beredningen av vattenlösningen kan naturligtvis varieras utan att man därför fràngår uppfinningsidên. Penetrationsmediet innehållande önskad koncentration hyaluronat kan beredas aseptiskt eller steri- liseras när så är önskvärt. Mediet kan föreligga i enhets- förpackningar för engångsbruk eller i större förpackningar, med en-större volym medium, som räcker för utförande av flera selekteringar av spermier. n, 449 nos Med sättet enligt denna uppfinning uppnås mycket tillför- litliga och reproducerbara resultat vid undersökning av spermier. Mediet är gynnsamt för spermierna och långa' ~överlevnadstider för spermierna, som vandrat i mediet, kan erhållas, t ek mer än 2 timmar, exempelvis mer än 4 timmar.

När spermierna, som vandrat i mediet, användes för fertili- sering erhålles en hög fertiliseringsgrad. Mediet är oèkså skonsamt för ägget. 0 Uppfinningen belyses ytterligare genom nedanstående exempel, vilka dock ej begränsar uppfinningens omfattning.

Exempel 1 a) 10 volymer Ham's F10 medium (finns kommersiellt till- gängligt och finns beskrivet t ex i en artikel avg R.G. Ham i Exptl. Cell. Res; 39 (1963) 515) komplet- terat med 0,5 mg/ml natriumhyaluronat (fiw cirka 4 000 000) och pH justerat till 7,4 försätts med 0,75 volymer humant serum, som värmeinaktiverats vid 56 °C under 30 minuter. (När så är önskvärt kan detta_pene; trationsmedium hållas under luft innehållande 5 % C02 under t ex en halv timme vid 37 °C före användningen.) b) Samma medium som i exempel 1.a) men med 0,3 mg/ml natriumhyaluronat. c) Samma medium som i exempel l a) men med 0,8 mg/ml natriumhyaluronat. d) “Samma medium som i exempel 1 a) men utan tillsats av serum men med 5 mg/ml humant serumalbumin.

I detta exempel kan Ham's medium ersättas med andra medier som används vid spermiepenetrationsprov. _. __..__..._ _ _... ___... . _. ._.____...-.-_-..-._..___. , .___ .___ .__.,._._ _ 449 oas _ 19 _ Exempel 2 dFör spermiepenetrationsförsök kan tlex användas ett kapillär- rör (t ex 4 - 7 cm långt och rymmande 10 /ul). Kapillärröret fylls med det förbättrade penetrationsmediet enligt upp- s s finningen (t ex medium enligt exempel li. Övre öppningen på kapillärröret försluts och nedre delen av kapillärröret införes i en liten behållare innehållande ett ejakulatprov.

Spermiepenetrationen in i kapillärröret får ske vid 37 °C t ex i 1 timme. (När så är önskvärt kan det ske under luft innehållande 5 %aC02.) Spermiepenetrationen kan avläsas í- mikroskop.varvid man mäter den sträcka spermierna vandrat och härur beräknar deras vandringshastighet (lämpligtvis i /um/sekl. Härvid kan man exempelvis beräkna vandringshastig- heten för de spermier som vandrat längst (s k toppvärden) och även för huvuddelen av de spermier som vandrat in i mediet (s k basvärde). Vidare kan man estimera mängden spermier, som vandrat med en hastighet nära toppvärdet.

Exempelvis kan toppvärdet vara 9,6 /um/sek och basvärdet kan t ex vara 4~6 /um/sek. Vid parallellförsök erhålls väl reproducerbara värden. Penetrationsförsöket kan utnyttjas t ex för diagnostiskt ändamål.

Exempel 3 _". _ 1 Korta pastörpipetter försluts i spetsen genom hopsmältning. 0,25 ml prov av ejakulat tillförs till botten av det för- slutna pipettröret som hålls i vertikalt läge. 0,25 ml av det förbättrade penetrationsmediet enligt uppfinningen (t ex enligt exempel 1) skiktas försiktigt ovanpå bottenfasen som innehåller spermier. Penetrationen av spermier från botten- fasen till det överliggande skiktet av penetrationsmediet får äga rum vid 37 OC. (När så är önskvärt kan det ske under luft innehållande 5 % C02.) När spermier vandrat upp i övre delen av penetrationsskiktet t ex efter 60 minuter avsugs 449 003 '~ 11 -e försiktigt den övre delen av penetriationsskiktet, motsvàr- ande t ex 2./ 3 av detta skikt. Det xittagna provet innehåller spermier med egen rörelseförmåga. Spermierna i det uttagna i provet kan utnyttjas för -fertiliseríng (t ex för in vitro fertiiisering) på 1 och för sig känt sätt. '

Claims (1)

1. 449ïonst e _ 12 _ Patentkrav . Sätt att in vitro från ett vattenhaltigt prov innehållande spermier avskilja spermier med egen rörelseförmåga genom att provet bringas i kontakt med ett skikt av ett vattenhaltigt, artificiellt penetrationsmedium för spermier, varvid spermier med egen rörelseförmåga far vandra in i nämnda skikt från provet ínnehållande_ spermier k ä n n e t e c k n a t a v att i nämnda -penetrationsmedium har införlivats ett vattenlösligt, fysiologiskt fördragbart salt av hyaluronsyra. Sätt enligt krav 1 k ä n n e t e c k n a t a v att spermier, som vandrat i skiktet av penetrationsmediet, tillvaratages. Sätt enligt krav 2 k ä n n e t e c k n a t a v attt spermier, som vandrat í.skiktet av penetrationsmediet, tillvaratages för fertilisering. Sätt enligt krav 3 k ä n n e t e c k n a t a V att spermier, som vandrat i skiktet av penetrationsmediet, tillvaratages för in vitro fertilisering. f, _. _. ,.,_ _, ...__-.......__......, n.. _ __.. .___....____._.__. _ ,. _ . . ._,.._.._. wx få