NO881819L

NO881819L - Forenklet fremgangsmaate for fremstilling av humane lymfokinaktivate drepeceller.

Info

Publication number: NO881819L
Application number: NO881819A
Authority: NO
Inventors: George Franks Dunn Jr; Joseph David Irr; Lise Nadine Halpern
Original assignee: Du Pont; Haemonetics Corp
Priority date: 1987-04-27
Filing date: 1988-04-26
Publication date: 1988-10-28
Also published as: IL86177A0; PT87335A; KR880012751A; KR900004422B1; DE3872588T2; CA1304306C; EP0289896B1; DE3872588D1; JPS63295510A; FI881952A; DK226288D0; AU1520088A; EP0289896A1; US4808151A; NO881819D0; JPH0657147B2; HU205380B; ZA882948B; NZ224379A; ES2051790T3

Description

Foreliggende oppfinnelse angår adoptiv immunoterapi, nærmere bestemt in vitro-utvikling av humane lymfokine, aktiverte dreperceller for anvendelse ved slik behandling.

Adoptiv immunoterapi har nylig gitt lovende kliniske resultater mot enkelte former av cancer. Se artikler i Wall Street Journal, 9. april 1987 og Time Magazine, 20. april 1987. Behandlingen innbefatter å fjerne perifert blod fra en pasient, fjerning av røde blodceller (RBC) fra blodet under dannelse av en lymfocyttholdig hvit blodcelle(WBC)-fraksjon, inkubering av blodfraksjonen i kulturmedium med interleukin-2 (IL-2) under dannelse av aktiverte, tumor-ødeleggende lymfocytter kalt LAK-celler, og injisering av LAK-cellene og ytterligere IL-2 i pasienten. I enkelte til-feller injiseres IL-2 i pasienten før fjerning av blodet for å stimulere produksjonen av lymfocytter.

En innvending mot adoptiv immunoterapi er at den er meget kostbar. En grunn til at den er kostbar, er at den nåværende prosedyre for fremstilling av LAK-celler er arbeidskrevende og tidskrevende. Denne prosedyre er beskrevet i Muul et al., "Large scale production of human lymphokine activated killer cells for use in adoptive immunotherapy", Journal of Immunological Methods, 88:265-275 (1986). Som beskrevet i Muul et al., ble ca. 2 x 10<11>lymfocytter, erholdt ved 10 suksessive leukafereser av perifert blod, nødvendig for å utvikle tilstrekkelig LAK-celler for en enkelt behandling. I hver leukaferese ble ca. 10-12 1 helblod bearbeidet i en automatisert celleseparator i et tidsrom på 4 timer under dannelse av en 400-500 ml leuko-cyttfraksjon. Denne fraksjon ble fortynnet med 2 deler av en saltløsning, ble deretter helt over i 50 ml kone sentrifugerør (40 ml/rør, ca. 30-40 rør) og underlagt med 10 ml Ficoll-Hypaque-løsning. Innholdet ble sentrifugert, hvilket bevirket separering i et blodplaterikt supernatantlag, et lymfocyttrikt lag, et Ficoll-Hypaque-lag, et granulocyttlag og et RBC-lag. Supernatanten ble fjernet fra hvert rør og kastet. Den lymfocyttrike fraksjon som fløt oppå Ficoll-Hypaque, ble fjernet fra hvert rør, og disse fraksjoner ble samlet og vasket tre ganger ved suspensjon i saltløsning og sentrifugering. Da disse trinn må gjentas for hver leukaferese, må 300-400 rør håndteres for en enkelt behandling.

Haemonetics Corporation, Braintree, Massachusetts, markedsfører en automatisert blodcelleseparator kjent som Haemonetics V-50, som gjør bruk av en konisk formet sentrifugeskål med to åpninger, lik den skål som er beskrevet i U.S. patentskrift 3 145 713. V-50 kan opereres iht. en standardleukafereseprotokoll eller iht. en Surge lymfocyto-fereseprotokoll. Den sistnevnte prosedyre, som beskrevet i U.S. patentskrifter 4 464 167 og 4 416 654, innbefatter intermitterende slemming med på forhånd separert plasma og er i stand til å tilveiebringe mer nøyaktige fraksjoner av blodplater, WBC og RBC enn hva som kan oppnås med standard-leukaf erese, og angis i det etterfølgende som slemmingsleukaferese.

For LAK-cellebearbeidelse anbefaler Haemonetics anvendelse av V-50 for å separere en Buffycoat sammensatt hoved-sakelig av blodplater og WBC, etterfulgt av en sekundær separering under anvendelse av Ficoll-Hypaque for å frem-bringe en densitetsgradient i samme sentrifugeskål for isolering av mononukleære celler (lymfocytter og monocytter) fra Buffycoaten. Selv om denne prosedyre er meget mindre tidskrevende og arbeidskrevende enn den standard-ficoll-sentrifugering som er beskrevet i Muul et al., ville det være ønskelig å eliminere ficoll-separeringstrinnet fordi det bidrar til kostnadene og kan forårsake et redusert utbytte av lymfocytter. Hittil er det blitt betraktet som essensielt av fagmannen å utføre en ficoll-separering for å oppnå en lymfocyttfraksjon tilstrekkelig fri for RBC og granulocytter for å være anvendbar for produksjon av LAK-celler. Det var antatt at RBC og granulocytter ville urimelig interferere med aktiveringen av lymfocyttene.

Det er nå funnet at trinnet med ficoll-densitets-gradientsentrifugering kan elimineres uten urimelig å interferere med lymfocyttaktivering. Foreliggende oppfinnelse er således en forbedring av metoden for fremstilling av LAK-celler in vitro, som omfatter å fjerne RBC fra helblod under dannelse av en lymfocytthoIdig WBC-rik fraksjon, og inkuber ing av den WBC-rike fraksjon i kulturmedium med IL-2 for å aktivere lymfocyttene. Forbedringen omfatter anvendelse av den lymfocyttholdige WBC-rike fraksjon uten mellomliggende separering av lymfocytt- og monocyttlag på en ficoll-gradient.

Ved den forbedrede fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan RBC fjernes på forskjellige måter. Disse innbefatter standardleukaferese, slemmingsleukaferese og sentrifugering uten anvendelse av ficoll. Ficoll er et syntetisk vannløse-lig polysaccharid som har en vektmidlere molekylvekt på 400.000 og som er vidt anvendt for fremstilling av densi-tetsgradienter. Det er tilgjengelig som sådant og i blanding med andre substanser under registrerte varemerker slik som Ficoll-Paque, Ficoll-Hypaque og Ficoll-Isopaque. Leukaferese angir en fremgangsmåte hvori perifert blod trekkes ut fra en pasient eller giver, en WBC-rik fraksjon separeres ut, og andre blodfraksjoner (plasma, blodplater og RBC) returneres til kilden. Standardsentrifugering anvendes for å separere blod fra givere i plasma, WBC-rike og RBC-fraksjoner som lagres for senere bruk. (Uttrykket "Buffycoat" som anvendt heretter, refererer spesifikt til den WBC-rike fraksjon erholdt ved standard sentrifugering, selv om uttrykket også anvendes innen faget for å angi en blodplate-rik, WBC-rik fraksjon erholdt ved leukaferese).

De forskjellige metoder for fjerning av RBC gir WBC-rike fraksjoner med varierende mengder av rest-RBC og varierende differensialer. (Uttrykket "differensial" eller "diff" angir det prosentvise antall av lymfocytter, monocytter eller granulocytter basert på det totale antall av disse tre celletyper i en WBC-rik fraksjon). Sammensetninger av de forskjellige fraksjoner vil også variere, avhengig av kilden. Eksempelvis kan en pasient som er blitt behandlet med IL-2, ha et meget høyt lymfocyttantall. Typiske områder for de WBC-rike fraksjoner erholdt ved de forskjellige metoder, er sammenlignet med typiske områder for helblod i etterfølgende tabell.

Fra den ovenfor angitte tabell kan det ses at lymfocyttholdige WBC-rike fraksjoner som er anvendbare ifølge oppfinnelsen, kan ha RBC/WBC-forhold på fra 0,2 til 300 og granulocyttinnhold fra ca. 1 % til ca. 50 %. Som en praktisk løsning vil Buffycoat prinsipielt kunne anvendes for screening for å bestemme hvorvidt en pasient er i stand til å utvikle LAK-celler. For utvikling av LAK-celler for anvendelse ved adoptiv immunoterapi vil leukafereseproduk-tene med RBC-vol.% på ca. 1-20 og RBC/WBC-forhold på 0,2-250 være foretrukne.

For tiden foretrekkes det å anvende slemmingsleukafereseprodukter fordi de er mer lik de ficoll-separerte produkter både når det gjelder RBC- og granulocyttinnhold, og vil derfor sannsynligvis lettere bli akseptert av fagfolk innen området. I tillegg synes det som at slemmingsleukafereseprodukter kan dyrkes til en noe høyere celledensitet (eksempelvis 1 x 10^/ml eller høyere) enn standardleukafereseprodukter på en rutinemessig basis. Fra den ovenfor angitte tabell kan det ses at slemmingsleukafereseproduktene typisk har et RBC/WBC-forhold på ca. 0,2-50, en RBC-vol.% på ca. 1-6 og et granulocyttinnhold på 1-5. Mer typiske områder er RBC/WBC på ca. 0,5-25 og RBC-vol.% på 2-4.

Standardleukaferese kan utføres under anvendelse av instrumenter tilgjengelig fra forskjellige fabrikanter, inn-befattende Haemonetics, Fenwall og Cobe, og ved å følge fabrikantens instruksjoner. Det eneste instrument som nå er tilgjengelig for utførelse av slemmingsleukaferese, er Haemonetics V-50. Ved å følge den lære som er beskrevet i U.S. patentskrifter 4 464 167 og 4 416 654 eller instruk-sjonene gitt av Haemonetics, kan V-50 anvendes for å tilveiebringe en WBC-rik fraksjon med lavt RBC- og granulocyttinnhold.

Monocyttinnhold av den WBC-rike fraksjon kan reduseres under de angitte tall vist i tabellen ved behandling av leukafereseprodukter med en L-aminosyre-lavere alkylester eller hydrogenkloridsalt derav, eksempelvis methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl eller t-butylester av fenylalanin, glutaminsyre, glutamin eller tyrosin. Fenyl alaninmethylester er foretrukket. Ytterligere detaljer er gitt i U.S. patentsøknad 868 697, innlevert 30. mai 1986, og i de etterfølgende eksempler.

Aktivering av lymfocyttene ved inkubering med IL-2 utføres ifølge oppfinnelsen på samme måte som ifølge den kjente teknikk. Beholdere, slik som konvensjonelle kolber og rulleflasker, kan anvendes, men de foretrukne beholdere er 0,2-5 liters vevdyrkingsposer fremstilt fra fleksible kopolymere filmmaterialer som beskrevet i U.S. patentsøknad 008 273, innlevert 29. januar 1987. Mest foretrukket er en pose fremstilt av en kopolymer av 97 mol% ethylen og 1-octen. Ethvert egnet dyrkingsmedium kan anvendes, men det foretrukne dyrkingsmedium er RPMI 1640, som er beskrevet i "Culture of Animal Cells", Freshney, 72-73, Alan R. Liss, Inc., NY, supplert med serum. Startcellekonsentrasjoner på opptil 1 x IO<7>celler/ml kan anvendes med et slemmings-leukafereseprodukt, og opptil 1 x IO<7>celler/ml med et standardleukafereseprodukt. En konsentrasjon på minst 1 x 10^ celler/ml bør anvendes av økonomiske grunner. Foretrukne områder vil være 5 x IO<6>til IO<7>celler/ml for slemmingsleukafereseprodukter, og 1-5 x IO<6>celler/ml for standardleukafereseprodukter. Cellene inkuberes med IL-2 i 2-7 dager, fortrinnsvis 3-5 dager, ved en temperatur på 35-39°C, fortrinnsvis 37°C.

"Interleukin-2" (IL-2) som anvendt her betegner humant IL-2. Det innbefatter naturlig og rekombinant IL-2 (rIL-2) og biologiske funksjonelle ekvivalenter derav, slik som de rIL-2-muteiner beskrevet i U.S. patentskrift 4 518 584. Fortrinnsvis er IL-2 en rIL-2-sammensetning bestående hoved-sakelig av vann, rIL-2 og eventuelt en polyol som beskrevet i U.S. patentsøknad 825 133, innlevert 31. januar 1986. Fortrinnsvis er IL-2-konsentrasjonen i dyrkingsmediet i området fra 5 x IO<2>til 5 x IO<4>pM, fortrinnsvis 1000-2000 pM.

LAK-cellene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan suspenderes i en farmasøytisk akseptabel bærer slik som saltvann, saltvann inneholdende 5 % normalt humant serumalbumin, eller Hanks balanserte saltløsning, under dannelse av en samensetning som kan infuseres i en pasient rammet av tumor. Pasienten behandles samtidig med rIL-2 som ytterligere beskrevet av Rosenburg et al., The New England Journal of Medicine 313, 1485-1492 (1985). På denne måte tas pasientens blod ut, underkastes leukaferese, og høstede celler dyrkes umiddelbart i 3 dager for å utvikle LAK-celler. LAK-cellene infuseres deretter i pasienten. Typisk infuseres 3 x IO1<0>til 14 x IO1<0>LAK-celler i 4-9 doser. Interleukin-2 administreres hver 8. time i doser slik som 10.000, 30.000 eller 100.000 enheter pr. kg kropps-vekt. Behandlingen består av et 2-ukers system av leukaferese og reinfusjon og en generell repetisjon som starter den 3. uke. Rekombinant IL-2 kan innbefattes i LAK-cellepreparatet.

Cytotoksisitets( LAK)- bestemmelse

I de etterfølgende eksempler, med mindre annet er angitt, ble en 4 timers 53-Cr frigivelsesbestemmelse anvendt for å måle cytotoksisitet av LAK-celler overfor tumorceller (LAK-aktivitet). Tumorceller i en konsentrasjon på ca. 2 x IO<6>til 10 x IO<6>pr. ml ble inkubert med 100 y.Ci av Na25^-Cr04 i 0,4 ml tris-fosfatbufret saltvann i 1 time ved 37°C. Cellene ble vasket tre ganger med RPMI 1640 inneholdende 5 % eller 10 % kalvefosterserum (FCS) og ble resuspendert til IO<5>celler/ml i RMPI-20 % FCS eller RPMI-10 % FCS. Effektorcellene (LAK-cellene) ble suspendert til forskjellige konsentrasjoner, og 0,1 ml ble tilsatt til brønner i rundbunnede mikroliterplater. De ^Cr-merkede målceller (0,1 ml) ble tilsatt til alle brønner. Etter 4 timers inkubering ved 37°C ble platene sentrifugert, og 0,1 ml av den resulterende supernatant ble fjernet fra hver brønn og tellet i en gammateller. Prosent cytolyse ble beregnet fra følgende formel:

Hver variabel ble testet in triplo, og de resulterende data er uttrykt som % cytolyse. Denne cytotoksisitetstest er ytterligere beskrevet i "Selected Methods in Cellular Immunology", Mishell og Shiigi, utg., 124-137, W.H. Freeman og Co., San Francisco (1980).

I andre forsøk er resultatene av bestemmelsene uttrykt som "lytiske enheter" (LU eller LU30), som er antall målceller pr. 100 effektorceller når 30 % av målcellene ble drept når LAK-celler og målceller ble inkubert sammen i 4 timer ved 37°C. Beregningen av LU er basert på metoden ifølge Pross et al., Journal of Immunological Methods 68, 235-249 (1984). Jo større tallet for LU er, jo større er styrken av LAK-cellepreparatet.

Alle patenter, patentsøknader og andre trykte publika-sjoner angitt i foreliggende søknad, er inkorporert ved referanse, spesielt beskrivelsen i U.S. patentskrifter 4 464 167 og 4 416 654 angående fremstilling av en WBC-rik fraksjon ved slemmingsleukaferese under anvendelse av på forhånd separert plasma som slemmingsmiddel (elutriant).

Eksempel 1

Formål:

1) Å studere LAK-aktiviteten av celler erholdt fra en Haemonetics V-50 under anvendelse av slemmingsteknikken under dannelse av hvite blodceller. 2) Å studere effekten av fenylalaninmethylester (øALA)-behandling og picoll-behandling på LAK-aktiviteten av celler erholdt ved Haemonetics V-50-slemmingsteknikken.

Celler:

Humane lymfocytter (erholdt fra Haemonetics Corporation under anvendelse av V-50-slemmingsteknikk). Raji-celler.

Materialer:

1) Celledyrkingsmedium (CCM) = RPMI 1640 med 10 %

FBS, L-glutamin og gentamicin

2) Fosfatbufret saltvann (PBS) 1 x uten Ca<++>og Mg<++>

3) Ficoll-Hypaque (ficoll)

4) øAla

5) Unopette for WBC-telling

6) Ethylenbuten-kopolymerpose for celledyrking

7) T25 vevdyrkingskolber

8) 1 % NP 40

9) 2 x TD-buffer

10)<51>Cr (som natriumkromat)

11) Rekombinant interleukin-2, 10 enheter/ml i 0,5 M glukose (IL-2)

12) 96-brønns u-bunnet vevdyrkingsplate

13) SCS høstingssystem (Skatron)

14) Beckman Gamma 4000-teller

15) Trypanblått.

Prosedyre:

A) Fremstilling av celler

1) Totalt 250 ml av en hvit blodcellefraksjon ble oppsamlet fra en Haemonetics V-50-maskin under anvendelse av slemmingsprosedyren som beskrevet i U.S. patentskrifter 4 416 654 og 4 464 167. 2) En WBC-telling ble utført under anvendelse av en Unopette. Fraksjonen inneholdt 1,36 x IO<7>WBC/ml og ble beregnet til å inneholde ca. 3 vol.% RBC. 3) Cellene ble deretter brakt til en kosentrasjon på

1 x IO<7>WBC/ml (totalt volum = 340 ml).

4) 40 ml celler ble direkte brakt i dyrking (som beskrevet nedenfor). 5) De gjenværende 300 ml ble behandlet med øAla (som beskrevet nedenfor).

B) øAla- behandling

1) Anbring 300 ml celler i T150-kolbe

2) Tilsett 30 ml øAla til cellene

3) Bland grundig (forsiktig)

4) Inkuber ved romtemperatur i 40 min.

5) Separer blod i 2 aliquoter, hver inneholdende 165 ml etter inkubering.

a) aliquot 1 ble brakt til dyrking

b) aliquot 2 ble lagt oppå ficoll (som beskrevet nedenfor) og ble deretter brakt til dyrking.

C) Dyrkingsoppsett

1) Celler direkte fra V- 50 ( ikke noe ficoll; ikke noe øAla) a) anbring 40 ml celler i et 50 ml sentrifugerør b) sentrifuger cellene i 10 min. ved 1200 omdr./min.

c) kast supernatant

d) resuspender cellene i CCM til et totalt volum på

40 ml

e) anbring ønsket mengde av celler i T25-kolber f) tilsett CCM til kolbene og bring hvite celler til ønsket konsentrasjon g) tilsett 5 y.1 IL-2 til hver kolbe (sluttkonsentra-sjon 10 enheter/ml) h) anbring kolbene i 37°C inkubator med 5 % C02- 2) Aliquot 1 • » celler fra V- 50 ( øAla og ikke noe ficoll) a) anbring 165 ml øAla-behandlede celler i et 250 ml sentrifugerør

b) sentrifuger i 10 min. ved 1200 omdr./min.

c) kast supernatant

d) resuspender cellene i 50 ml CCM

e) utfør celletelling under anvendelse av Unopette;

WBC-antallet var 1,9 x IO<7>pr. ml

f) sett opp kulturer i poser og kolber iht. ønsket cellekonsentrasjon g) anbring kulturene i 37°C inkubator med 5 % CO2. Oppsett 2 - kulturer: T25-kolber 5 x IO<6>celler/ml Pose 9 x IO<6>celler/ml

3) Aliquot 2 - > celler fra V- 50 ( øAla og ficoll)

a) anbring 40 mløAla-behandlede celler i et 4-50 ml sentrifugerør

b) anbring blod oppå 10 ml ficoll

c) sentrifuger i 30 min. ved 1900 omdr./min.

d) oppsaml grenseflatelag med en steril pasteurpipett og anbring cellene i et sterilt 50 ml sentrifugerør e) bring volumet i røret opp til 50 ml under anvendelse av PBS

f) sentrifuger i 10 min. ved 1200 omdr./min.

g) kast supernatant

h) resuspender pelleten i 50 ml CCM

i) sentrifuger i 10 min. ved 1200 omdr./min.

j) resuspender i 5 ml CCM

k) utfør celletelling under anvendelse av trypanblått 1) sett opp kulturer i poser og kolber iht. ønsket

cellekonsentrasjon

m) anbring kulturene i 37°C inkubator med 5 % CO2.

Bemerk: Ikke noe grenseflatelag oppstod etter trinn 3; cellene ble derfor resuspendert, lagt oppå ficoll og resentrifugert. Etter dette ble cellene i grenseflatene oppsamlet.

Oppsett 3 - kulturer: T25-kolber 5 x IO<6>celler/ml T25-kolber 10 x IO<6>celler/ml Pose 1,9 x IO<6>celler/ml

D) LAK- bestemmelse

LAK-bestemmelsen ble utført etter at cellene var dyrket i 4 dager, iht. den ovenfor angitte prosedyre.

Bemerk: På grunn av overflod av røde blodceller inneholdt i prøvene, ble tre prøver behandlet med lysebuffer før LAK-bestemmelsen. Lyseløsning: 0,83 g ammoniumklorid,

200 ml destillert H20.

1) resuspender cellepelleten i 10 ml lyseløsning

2) inkuber i 20 min. ved romtemperatur

3) sentrifuger i 10 min. ved 1200 omdr./min.

4) kast supernatant

5) resuspender i 1 ml CCM

6) utfør celletelling

7) sett opp E:T-forhold som beskrevet i LAK-bestem-melsesprosedyren.

Preparer for celler for øAla-behandling (bring alle celler til IO<7>celler/ml)

Ta av 40 ml og anbring i kultur.

Tilsett 30 ml øAla til de gjenværende celler og inkuber i 40 min. ved romtemperatur.

Eksempel 2

Protokoll:

Følgende diagram oppsummerer protokollen for dette eksempel.

Prosedyre:

A) Separering av celler

1) Celler ble oppsamlet via slemmingsteknikken på Haemonetics V-50. 2) En celletelling ble utført = 1,3 x IO<7>celler/ml i 442 ml. 5,8 x IO<9>totale celler. 3) Cellevolumet ble delt i to for bearbeidelse.

B) LAB ficoll

1) 221 ml celler ble blandet med PBS og lagt på ficoll. 2) Sentrifugering i 30 min. ved 2000 omdr./min. 3) Cellene ble deretter vasket og tellet: 256 celler var levedyktige

99 % levedyktighet

1 ikke-levedyktig celle

5,1 x IO<8>ml celler

2 x 10<9>/40 ml 4) Sett opp celler i kultur for LAK @ 1 x IO<6>

5) Sett opp resten av disse celler lagt over ficoll for øAla

a) V-lC-l = v<2c2>

(40 ml) (5,1 x IO<7>) = V2(lx IO<7>)

# ml totalt = V2= 200 ml # ml medium = V2-V1= 160

# ml øAla = V2/9 = 200/9 = 22,2 ml øAla

b) Inkuber i 40 min., vask deretter.

c) Utfør celletelling og bring cellene i kultur for LAK

Levedyktige celler = 229

Ikke-levedyktige = 6

% levedyktighet = 97 % Celler/ml = 4,6 x IO<7>

d) Sett opp celler for kultur

Prøve Ønsket

C) LAK direkte fra V-50

1) Den andre halvpart av celler ble anvendt denne gang. Mengden av celler nødvendig for å ha kulturer til en konsentrasjon på 1 x 10^, 5 x 10^ og 1 x IO<7>ble anvendt, og de gjenværende celler ble fortynnet og behandlet med fenylalaninmethylester.

Prøve Ønsket

<*>10 ml prøve - sentrifugert - fjernet 5 ml plasma; tilsatt 5 ml medium. Fortynnet cellene til 1 x IO<7>.

D) øAla uten ficoll

øAla-celler uten separering med ficoll først ClV2= c2v2

(200 ml) (1,2 x IO<7>) = (k) (1 x IO<7>) = x = 260 # ml medium = 6 0 ml

# ml øAla = 29 ml

Inkuber i 40 min.

Vask.

Utfør celletelling og bring i kultur

Levedyktige 240

% levedyktighet 93 %

Celler/ml = 4,8 x IO<7>

Totalt = 1,9 x 10<9>/40 ml

Alle kulturer ble inkubert i tre dager ved 37°C og 5 % C02. LAK-^cr-frigivelse ble utført. I tabellene som følger, betyr % REL % frigivelse, som er det samme som % cytolyse, beregnet som ovenfor angitt. E:T betyr forholdet mellom effektor (LAK-celler) og mål(tumor)celler.

Celletellinger ble utført på alle kulturer.

Eksempel 3

Et standardleukafereseprodukt inneholdende 225 ml humane leukocytter fremstilt fra 3600 ml helblod oppsamlet i 550 ml antikoagulant ACD-B, ble erholdt fra Biological Specialty Corporation, Lansdale, PA. Følgende prosedyrer ble utført under anvendelse av dette produkt. 1) Sett opp en Unopette (WBC) og en differensial.

Differensial:

90 % lymfocytter

6 % monocytter

4 % granulocytter

Direkte = 165 celler

3.3x IO<7>celler/ml

7.4 x IO<9>celler/225 ml

2) Sett opp celler i kultur for LAK

@lx IO<6>= 0,30 ml celler + 9,70 ml medium +

5 ul IL-2

@ 5 x IO<6>= 1,52 ml celler + 8,48 ml medium +

5 ul IL-2

@ lx IO<7>= 3,04 ml celler + 6,96 ml medium +

5 ul IL-2

Inkuber @ 37°C, 5 % C02i fire dager.

3) 20 ml celler ble deretter fjernet fra de gjen værende celler og blandet med 20 ml PBS uten Ca<++>og Mg<++>. 40 ml av denne blanding ble lagt oppå 40 ml ficoll og sentrifugert i en halv time. Mononukleærcellelaget ble fjernet, og disse celler ble vasket tre ganger. Det ble utført en 90 minutters monocyttadherens. Det ble foretatt ytterligere to vaskinger, og det ble utført celletelling, og disse ble brakt i kultur for LAK.

Dette er standardprøven.

Standard telleantall:

Levedyktige = 155

Ikke-levedyktige = 1

% levedyktighet = 99 %

Celler/ml = 3,1 x 10<7>/ml

Totalt = 7,7 x 10<8>/25 ml.

Fortynning for cellekonsentrasjonen på 1 x 10^ =

0,32 ml celler + 9,68 ml medium + 5 ul (IL-2).

4) De gjenværende celler (200 ml) ble deretter fortynnet med 460 ml CCM for å bringe celleantallet til 1 x 10<7>/ml, og ble behandlet med 73 ml øAla.

Inkubert ved romtemperatur i 40 min.

Celler levret under inkubering.

Fjernet så mye ulevret suspensjon som mulig -

vasket og tellet celler med WBC Unopette.

26 celler levedyktige

1 celle ikke-levedyktig

96 % levedyktighet

5,2 x IO<6>celler/ml

1,04 x 10<9>celler/200 ml.

Anbring celler i en pose til 5 x 10^ = 48 ml celler + 2 ml medium + 25 ul IL-2.

Inkuber ved 37°C, 5 % C02i fire dager for LAK.

E:T-forhold 20:1, 10:1, 5:1, 2,5:1

Fortynninger

2 x IO<6>

Standard 0,41 ml celler + 0,59 ml medium Direkte 1 x IO<6>0,38 ml celler + 0,62 ml medium Direkte 5 x IO<6>0,95 ml celler + 0,05 ml medium Direkte 11 x IO<7>0,42 ml celler + 0,58 ml medium øAla 0,53 ml celler + 0,47 ml medium Raji 0,12 ml celler + 19,88 ml medium Resultater:

Eksempel 4

Et standardleukafereseprodukt inneholdende 230 ml humane leukocytter fremstilt fra 3600 ml helblod oppsamlet i 520 ml antikoagulant ACD-B, ble erholdt fra Biological Specialty Corporation, Lansdale, PA. Følgende prosedyrer ble utført under anvendelse av dette produkt.

1) Fjernet 10 ml celler

A)

1) Tok 5 ml av dette blod og blandet med 5 ml PBS

2) La under 10 ml ficoll

3) Sentrifugerte i 30 min. @ 2000 omdr./min.

4) Vasket og tellet

5) Dette var standarden @ 1,5 x 10^ celler/ml i

10 ml kolbe.

Standard

Levedyktige =49

Ikke-levedyktige = 0

% levedyktighet = 100 %

Celler/ml = 9,8 x 10<6>/ml

Totalt = 1,96 x 10<8>/20 ml.

Fortynning: 1,5 ml celler + 8,5 ml medium + 1 y.1 IL-2.

B)

1) De andre 5 ml ble anvendt for direkte testing 2) En WBC (via Unopette) og differensial ble utført:

3) WBC 4,5 x 10<7>/ml

2,25 x 10<8>/5ml

Diff. 72 % lymfocytter

22 % granulocytter

6 % monocytter.

4) Celler ble deretter brakt i kultur til 1,5 x 10<6>/ml og 5 x 10<6>/ml i 10 ml kolber 1,5 x 10<6>/ml = 0,33 ml/celler + 9,67 ml medium + 1 Ul IL-2 5 x 10<6>/ml = 1,11 ml/celler + 8,89 ml medium +

1 ul IL-2

Cellene ble inkubert i fire dager; krom- frigivelsesbestemmelse ble utført.

Celletelling:

3) Lak- bestemmelse

E:T-forhold 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2,5:1, 1,25:1 Cellene ble fortynnet til 4 x IO<6>

Rajis ble fortynnet til 1 x 10^

Fortynninger

Standard 0,5 ml celler + 0,5 ml medium Direkte 1,5 x 10^ 0,5 ml celler + 0,5 ml medium Direkte 5 x IO6 0,83 ml celler + 0,17 ml medium Raji 0,25 ml celler + 19,75 ml medium Resultater:

Eksempel 5

Materialer:

Buffycoatcoat - 52 ml av blod Celleantall - 4,3 x IO<7>celler/ml (totalt WBC)

1,8 x IO<7>neutrofiler/ml (42 %)

(est.) 1-2 x IO<7>lymfocytter/ml (20-50 %)

(est.) 5 x IO<9>RBC/ml

(est.) 0,5-1 x IO<7>monocytter/ml Ficoll-Hypaque (Ficoll)

CCM - 5 % FCS - RPMI

Prosedyrer:

1) Ingen Ficoll

a) Tilsett til 10,5 ml Buffycoat 215 ml CCM. Celleantall 2 x IO<6>celler/ml (totalt WBC)

b) Tilsett 10 ul/ml IL-2

c) Anbring 112 ml kulturblanding i kolbe

d) Anbring 112 ml kulturblanding i pose

e) Inkuber ved 37°C i 20 dager

f) Ta ut ved 3., 6., 12., 17. og 20. dag for celletelling og ^Cr-frigivelsesbestemmelse (LAK).

2) Ficoll

a) Anbring 42 ml Buffycoat i 50 ml sentrifugerør

b) Sentrifuger ved 800 g i 10 min.

c) Kast supernatant, fjern mononukleært WBC-lag (lymfocytter og monocytter) som flyter på ficoll-laget, vask tre ganger. 300 x 10^ totale mononukleære celler isolert d) Tilsett CCM til en mononukleær cellekonsentrasjon på 2 x 106/ml

e) Anbring 7 5 ml i kolbe

f) Anbring 75 ml i pose

g) Inkubert ved 37°C i 20 dager

h) Ta ut prøver ved 3., 6., 12., 17. og 20. dag for

celletelling og ^^Cr-frigivelsesbestemmelse (LAK).

Sammendrag av celletellinger (# x 10^/ ml

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av LAK-celler in vitro ved fjerning av RBC og plasma fra helblod under dannelse av en lymfocyttholdig WBC-rik fraksjon og inkubering av den WBC-rike fraksjon i kulturmedium med IL-2, karakterisert ved at RBC og plasma fjernes, og at den WBC-rike fraksjon anvendes uten mellomliggende separering av lymfocytter på en Ficoll-gradient.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at RBC fjernes ved leukaferese, og at volumprosenten av RBC i den WBC-rike fraksjon er i området på 1-20.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at RBC/WBC-forholdet i den WBC-rike fraksjon er i området på 0,2-250.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at RBC fjernes ved slemmingsleukaferese, og at volumprosenten av RBC i den WBC-rike fraksjon er i området på 1-6.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at RBC/WBC-forholdet i den WBC-rike fraksjon er i området på 0,2-50.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at WBC-differensialet er 80-85 % lymfocytter, 10-20 % monocytter og 1-5 % granulocytter .

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at volumprosenten av RBC i den WBC-rike fraksjon er i området på 2-4, RBC/WBC-forholdet i den WBC-rike fraksjon er i området på 0,5-25.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at monocyttene fjernes ved behandling med fenylalaninmethylester før inkubering av den WBC-rike fraksjon.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den WBC-rike fraksjon vaskes med saltlø sning før inkubering for å inhibere sammen-klumping.

10. Fremgangsmåte for utvikling av LAK-celler ved inkubering av en lymfocyttholdig WBC-rik fraksjon i kulturmedium med IL-2, karakterisert ved at det anvendes en lymfocyttholdig WBC-rik fraksjon med et RBC/WBC-antallforhold i området på 0,2-300 og en RBC-volumprosent på 1-50.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at RBC/WBC-forholdet er i området på 0,2-250, og RBC-volumprosenten er i området på 1-20 i den WBC-rike fraksjon.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at RBC/WBC-forholdet er i området på 0,2-50, og RBC-volumprosenten er i området på 1-6 i den WBC-rike fraksjon.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at differensialet av den WBC-rike fraksjon er 1-5 % granulocytter, 0-20 % monocytter og mer enn 80 % lymfocytter.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at RBC/WBC-forholdet er i området fra 0,5-25, og RBC-voluminnholdet er 2-4 i den WBC-rike fraksjon.