HU205380B - Simplified process for producing killer cells activated with human lymphokine - Google Patents

Simplified process for producing killer cells activated with human lymphokine Download PDF

Info

Publication number
HU205380B
HU205380B HU882123A HU212388A HU205380B HU 205380 B HU205380 B HU 205380B HU 882123 A HU882123 A HU 882123A HU 212388 A HU212388 A HU 212388A HU 205380 B HU205380 B HU 205380B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
cell
average
ficoll
blood cells
Prior art date
Application number
HU882123A
Other languages
English (en)
Inventor
George Franks Dunn
Joseph David Irr
Lise Nadine Halpern
Original Assignee
Du Pont
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Du Pont filed Critical Du Pont
Publication of HU205380B publication Critical patent/HU205380B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A leírás terjedelme: 20 oldal
HU 205 380 Β
A találmány adaptív immunterápiára vonatkozik, különösen a humán Iímfokinnel aktivált ölősejtek in vitro kialakítására.
Az adaptív immunterápia a rák bizonyos formái ellen reményt keltó klinikai eredményeket mutat (lásd ezzel kapcsolatban az alábbi közleményeket: Wall Street Journal, 1987. április 9.; és Time Magaziné, 1987. április 20.). A terápia abban áll, hogy a betegtől perifériás vért vesznek, a vörösvérsejteket (RBC) eltávolítják a vérből, így limfocitatartalmú, fehérvérsejt (WBC) frakciót állítanak elő, a vérfrakciót interleukin2-vel (IL-2) inkubálják, így aktivált, tumorroncsoló Iimfocítákat állítanak elő, amelyeket LAK-sejteknek neveznek, és aLAK-sejteket és további IL-2-t injektálják a betegnek. Bizonyos esetekben IL-2-t injektálnak a betegbe, mielőtt a vért eltávolítják, abból a célból, hogy stimulálják a limfociták termelését.
Az adaptív immunterápia egyik hátrána az, hogy nagyon drága. Ennek az egyik oka az, hogy a jelenlegi eljárás a LAK-sejtek előállítására idő- és munkaigényes. Ezt az eljárást Muul és munkatársai írják le [„Large scale production of humán lymphokine activated killer cells fór use in adaptive immuntherapy” (Humán limfokinnal aktivált ölősejtek nagyléptékű termelése adaptáló immunterápiában való felhasználáshoz), Journal of Immunological Methods, 88, 265-275 (1986)].
Amint Muul és munkatársai leírják, egy egyszeri kezeléshez elegendő LAK-sejt képzéséhez 2·10Η limfocitát nyernek a perifériás vér 10 egymás utáni leukaferézisével. (Aleukaferézis során a teljes vérből eltávolítják a vérlemezkéket, vörösvérsejteket és a plazmát, így fehérvérsejtben gazdag frakciót kapnak.) Az egyes leukaferézisekben mintegy 10-12 liter teljes vért dolgoznak fel automatikus sejtszeparátorban 4 óra alatt, hogy 400-500 ml Ieukocitafrakciót kapjanak. Ezt a frakciót hígítják két rész sóoldattal, majd 50 ml-es kúpos centrifiigacsövekbe öntik (40 ml/cső, mintegy 30-40 cső), és alárétegzik 10 ml Ficoll-Hypaque-oldattal. A cső tartalmát centrifugálják, így elkülönítik a vérlemezkékben gazdag felülúszó réteget, a limfocitában gazdag réteget, a Ficoll-Hypaque-réteget, a granulocitaréteget és az RBC- (vörösvérsejt) réteget. A felülúszót minden csőből eltávolítják és eldobják. A limfocitában gazdag frakciót, amely a Ficoll-Hypaque tetején úszik, mindegyik csőből összegyűjtik és háromszor mossák sőoldatban szuszpendálva, majd centrifugálják. Mivel ezeket a lépéseket mindegyik leukaferézisben ismételni kell, egyetlen kezeléshez 300-400 csövet kell kézbe venni.
AHaemonetics Corporation of Braintree cég (Massachussets) egy automatizált vérsejtszeparátort forgalmaz, amely Haemonetics V-50-ként ismert, amely egy 2 nyílású, kúp alakú, centrifugaserleget alkalmaz, ez hasonló ahhoz a serleghez, amelyet a 3 145 713 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek. A V-50-et standard leukaferézis vagy Surge limfocitoferézis munkamenet szerint lehet működtetni. Az utóbbi eljárás szerint, amelyet a 4 464 167 és a 4 416 654 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetnek, előzetesen elkülönített plazmával szakaszosan mosást végeznek, így az eljárás a vérlemezkék, WBC és RBC pontosabb frakcionálását eredményezi, mint amilyet a standard leukaferézissel el lehet érni. Ezt az eljárást ezután mosással kombinált leukaferézisnek nevezzük.
A LAK-sejtek feldolgozásához a Haemonetics javasolja a V-50 alkalmazását a jórészt vérlemezkékből és WBC-ből álló buffy coat frakció elkülönítésére, majd egy másodlagos elkülönítést végeznek, Ficoll-Hypaque-t alkalmazva, így sűrűséggradienst alakítanak ki ugyanabban a centrifugaserlegben a mononukleáris (egymagvú) sejtek izolálásához (limfociták és monociták) a buffy coat frakcióból. Bár ez az eljárás kevésbé idő- és munkaigényes, minta standard Ficoll-centrifugálás, amelyet Muul és munkatársai leírtak, kívánatos lenne kiküszöbölni a Ficoll-elkülönítési lépést, mivel ez sokat tesz ki a költségekből és a limfocitatermelés csökkenését okozhatja. Mostanáig a szakterületen jártas szakemberek alapvetően fontosnak tekintették a Ficollal végzett szeparálást abból a célból, hogy olyan limfocitafrakciót kapjanak, amely megfelelőén mentes az RBC-tőI és a granulocitáktól, így alkalmas legyen LAK-sejtek előállításához. Azt feltételezték, hogy az RBC és a granulociták túlságosan zavarják a limfociták aktiválását
Felfedeztük, hogy a Ficoll-sűrűséggradiens centrifugálást ki lehet küszöbölni anélkül, hogy ezáltal a limfociták aktiválásában zavart okoznánk. így a találmányunk a LAK-sejtek in vitro előállításának javított módszere, amelynek során az RBC-t eltávolítjuk a teljes vérből, így limfocitatartalmú, WBC-ben gazdag frakciót kapunk, és a WBC-ben gazdag frakciót tenyésztő tápközegben IL-2-vei inkubáljuk, így a limfocitákat aktiváljuk. A javítás abban áll, hogy a limfocítatartalmú, WBC-ben gazdag frakciót alkalmazzuk a limfocita- és monocitaréteg Ficoll-gradiensen végzett közbenső elkülönítése nélkül.
A találmány szerinti javított módszerben az RBC-t különböző módokon távolíthatjuk el. így például standard leukaferézissel, mosással kombinált leukaferézissel, és Ficoll alkalmazása nélkül végzett centrifugálással. A Ficoll szintetikus, vízoldható poliszacharid, amelynek átlagos molekulatömege 400 000, és amelyet széles körben alkalmaznak sűfűséggradiens előállításához. Önmagában vagy más anyagokkal képzett elegye formájában kapható, bejegyzett márkaneveken, mint pl. Ficoll-Paque, Ficoll-Hypaque és Ficoll-Isopaque. A Jeukaferézis során perifériás vért vesznek egy betegtől vagy egy donortól, a WBC-ben gazdag frakciót elkülönítik, és a többi vérfrakciót (plazma, vérlemezkékés RBC) visszavezetik. Standard centrifugálással különítik el a donortól származó vérplazma WBCben gazdag és RBC-frakcióját, amelyeket a későbbi felhasználásig tárolnak. (A „buffy coat kifejezés speciálisan arra a WBC-ben gazdag frakcióra vonatkozik, amelyet a standard centrifugálással kapunk, bár a kifejezést a szakterületen a vérlemezkékben gazdag, WBCben gazdag, leukaferézissel kapott frakcióra is alkalmazzák.
HU 205 380 Β
Az RBC eltávolításának különböző módszereivel a WBC-ben gazdag frakciók különböző mennyiségű maradék RBC-vel és különböző „differenciár’-okkal állíthatók elő (a „differenciál” vagy „diff” kifejezés a limfociták, monociták és granulociták százalékos arányára 5 vonatkozik, ennek a három sejttípusnak a teljes számára alapozva a WBC-ben gazdag frakcióban). A különböző frakciók összetétele függ a forrástól is. így pl. egy olyan beteg, aki ©-2-vel volt előkezelve, nagyon nagy limfocitaszámmal rendelkezhet. A különböző módszerekkel kapott WBC-ben gazdag frakciók tipikus tartományait összehasonlítjuk a teljes vér tipikus tartományaival a következő táblázatban.
RBC száma WBC száma L Differenciál Μ G
Standard leukaferézis, 240 ml-es csomagonként RBC-térfogat%: 10-20 10π-5·10π 2·109-10π 60-80 5-25 5-25
Mosással kombinált leukaferézis, 400 ml-es csomagonként RBC-térfogat%: 1-6 2·1010-10π 2·109-10π 80-85 10-20 1-5
Buffy coat 40 ml-es csomagonként, RBC-térfogat%: 40-50 10π-3·1011 108-2·1010 20-50 10—30 20-50
Normál teljes vér, 450 ml-es egység 1,6-2,4-1012 2,3-4,6-109 25-40 4-10 50-65
A fenti táblázatból látható, hogy a találmányban alkalmazható limfocitatartalmú, WBC-ben gazdag 30 frakciók 0,2 és 300 közti RBC/WBC aránnyal rendelkezhetnek, és a granulocitatartalom 1% és 50% között lehet. Gyakorlati okokból a buffy coat-ot főleg annak meghatározására alkalmazzuk, hogy egy beteg képes-e kifejleszteni LAK-sejteket. LAK-sejtek kialakításához, 35 adaptív immunterápiában való felhasználáshoz, a mintegy 1-20 térfogat% RBC-vel és mintegy 0,2-250 RBC/WBC aránnyal bíró leukaferézis termékek az előnyösek.
Előnyösen a mosással kombinált leukaferézis termékét alkalmazzuk, mivel ez sokkal hasonlóbb a Ficollal elkülönített termékekhez mind az RBC-, mind a granulocitatartalomban, és ezért valószínűleg könnyebben elfogadják a szakterületen dolgozók. Ezenkívül úgy tűnik, hogy a mosással kombinált leukaferézis termé- 45 keket valamivel nagyobb sejtsűrűséggel lehet tenyészteni (pl. blO’/ml vagy nagyobb) mint ahogyan ez a standard leukaferézis termékeknél lehetséges rutinszerűen. A fenti táblázatból látható, hogy a mosással kombinált leukaferézis termékek tipikusan 0,2-50 RBC/WBC aránnyal bírnak, az RBC térfogatszázalék mintegy 1-6, és a granulocitatartalom 1-5 térf%. Tipikusabb tartomány a 0,5-25 RBC/WBC arány és mintegy 2-4 térf% RBC.
A standard leukaferézist a különböző gyártóknál 55 kapható berendezésekkel, a gyártók útmutatásait követve lehet végrehajtani, beleértve a Haemonetics, Fenwall és Cobe berendezéseket. Az egyetlen berendezés, amely a mosással kombinált leukaferézishez jelenleg rendelkezésre áll, a Haemonetics V-50. A 4 464167 és a 4 416 654 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások kitanítását vagy a Haemonetics által nyújtott instrukciókat követve a V-50-t alkalmazhatjuk arra, hogy alacsony RBC- és granulocitatartalommal rendelkező, WBC-ben gazdag frakciót kapjunk.
A WBC-ben gazdag frakció monocitatartalmát a táblázatban bemutatott értékek alá csökkenthetjük úgy, hogy a leukaferézis termékét valamely L-aminosav kis szénatomszámú alkil-észterével vagy ennek hidroklorid sójával, pl. fenil-alanin, glutaminsav, glutamin vagy 40 tirozin metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutilvagy terc-butil-észterével kezeljük. Előnyösen fenilalanin-metil-észtert alkalmazunk. További részletek találhatók a párhuzamos 868 697 sorozatszámú, 1986. május 30-án bejelentett amerikai egyesült államokbeli bejelentésben, és az alábbi példákban.
A limfociták aktiválását ©-2-vel végzett inkubálással a találmány szerinti eljárásban ugyanúgy hajtjuk végre, ahogyan ez a technika állásából ismert. Tartóedényként, pl. hagyományos lombikokat és gördülőpa50 lackokat alkalmazhatunk, de az előnyös tartőedények 0,2-5 literes szövettenyésztő zsákok, amelyek rugalmas kopolimer filmanyagból készülnek, amelyeket pl. a párhuzamos 008 273 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (a bejelentés napja: 1987. január 29.) ismertet. A legelőnyösebb az olyan zsák, amely 97 mól% etilénből és 3 mól% 1-okténból álló kopolimerből készül. Bármilyen alkalmas tenyésztőközeg alkalmazható, de az előnyös tenyésztő tápközeg a szérummal kiegészített RPMI 1640 [amelynek 60 összetétele megtalálható az alábbi irodalmi helyen:
HU 205 380 Β
Freshney „Culture of Animál Cells” (Állati sejtek tenyésztése). Alán R. Liss, Inc. (kiadó), New York]. Kezdeti sejtkoncentrációként mintegy max. 1·107 sejt/ml-t alkalmazhatunk mosással kombinált leukafeiézis terméknél és max. 1·107 sejt/ml-t standard leukaferézis terméknél. Gazdaságossági okokból legalább 1·105 sejt/ml koncentrációt alkalmazunk. Az előnyös tartomány mosással kombinált leukaferézis termékeknél 5»106-107 sejt/ml, míg a standard leukaferézis termékeknél (1-5)·106 sejt/ml. A sejteket IL-2-vel mintegy 2-7 napig, előnyösen. 3-5 napig inkubáljuk 35-39 °C, előnyösen 37 °C hőmérsékleten.
Az „interleukin-2” (IL-2), ahogyan itt használjuk, humán IL-2-t jelent. Ez magában foglalja a természetes és rekombináns IL-2-t (rIL-2) és ezek biológiailag funkcionális ekvivalenseit, pl. az rIL-2 muteineket, amelyek a 4 518 584 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban vannak ismertetve. Előnyösen az IL-2 olyan rIL-2 kompozíció, amely lényegében vízből, rIL-2-ből és kívánt esetben poliolból áll, ilyen kompozíciót ismertet a párhuzamos 825 133 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (bejelentés napja: 1986. január 31.). Az IL-2 koncentráció a tenyésztő tápközegben előnyösen 5·102-5·104 pM tartományban, legelőnyösebben 1000-2000 pM között van.
A találmány szerinti eljárással készült LAK-sejtek gyógyászatilag elfogadható hordozóban, pl. fiziológiás sőoldatban, 5% normál humán-szérumalbumint tartalmazó fiziológiás sőoldatban, vagy Hank féle kiegyensúlyozott sóoldatban szuszpendálhatók, így olyan kompozíciót kapunk, amely infúzió formájában tumorban szenvedő betegeknek adagolható. A betegeket egyidejűleg rIL-2-vel kezeljük, amint ez Rosenburg és munkatársai a The New England Journal of Medicine 313, 1485-1492 (1985) irodalmi helyen ismertetik. Ebben a módozatban a betegek vérét kivonjuk, leukaferézisnek vetjük alá, és a kinyert sejteket azonnal 3 napon át tenyésztjük, hogy LAK-sejteket hozzunk létre. A LAKsejteket azután infúzióval juttatjuk a betegekbe. Tipikusan 3·1010-14·1010 LAK-sejtet adunk be infúzióval 4-9 adagban. InterIeukin-2-t adunk be minden 8 órában, 10 000, 30 000 vagy 100 000 egység/testtömeg kg-os adagokban. A kezelés kéthetes leukaferézis-vérvisszaömlesztésből áll, amit a harmadik héttől általában megismételünk. A LAK-sejtkompozíció rekombináns IL-2-t is tartalmazhat.
Citotoxicitás (LAK) mérés
Az ezután következő példákban, hacsak másképpen nem jelezzük, 4 órás 51Cr kibocsátással mértük a LAKsejtek tumor sejtekre kifejtett (LAK-aktivitás) citotoxicitásáL Tumorsejteket mintegy 2«106-10«106/ml koncentrációban 100 pCi Na2 slCrO4-gyel 0,4 ml trisz-foszfáttal pufferolt sóoldatban 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltunk. A sejteket háromszor mossuk 5% vagy 10% borjúembrió szérumot (FCS) tartalmazó RPMI 1640-nel, és újra szuszpendáljuk 105 sejt/ml koncentrációra RPMI-20% FCS-ben vagy RPMI-10% FCS-ben. Az effektor sejteket (LAK-sejtek) különböző koncentrációkra szuszpendáljuk, és 0,1 ml-t adunk a kerekfenekű mikrotitráló lemezek üregeibe. Az 51Cr-mal jelzett célsejteket (0,1 ml) hozzáadjuk az összes üreghez. 4 órás, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a lemezeket centrifugáljuk, és az ilyen módon létrejött felülúszóból 0,1 ml-t eltávolítunk az egyes üregekből, és mérjük gamma-számlálóban. A százalékos citolízist a következőképlettel számítjuk ki (cpm=beütés/perc):
„ . „ . kísérleti cpm-spontán cpm ... összes cpm-spontán cpm
Az egyes változókat három párhuzamossal vizsgáljuk, és az így létrejött adatokat fejezzük ki %-os citolízisként. Ezt a citotoxicitási vizsgálatot leírják még az alábbi irodalmi helyen: Mishell és Shiigi (szerkesztők) „Selected Methods in Cellular Immunology” (Válogatott módszerek a sejtimmunológiához) Freemann W. H. andCo. (kiadók), San Francisco, 124-137 oldal.
A további kísérletekben a vizsgálatok eredményeit „lítikus egységeként (LU vagy LU30) adjuk meg, amely a célsejtek azon számát jelenti 100 effektor sejtre vonatkoztatva, ahol a célsejtek 30%-a elpusztul, amikor a LAK-sejteket és a célsejeteket együtt inkubáljük 4 órán át 37 °C hőmérsékleten. Az LU kiszámítása Pross és munkatársai módszerén alapul [Journal of ünmunological Methods, 68, 235-249 (1984)]. Minél nagyobb az LU száma, annál nagyobb a LAK-sejtkészítmény potenciálja.
A találmány szerinti eljárást a kővetkező/ példákkal szemléltetjük.
1. példa
A példa célja
1. Haemonetics V-50-ből nyert sejtek LAK-aktivitásának tanulmányozása, a fehérvérsejtek kinyerésére mosásos technikát alkalmazva.
2. Fenil-alanin-metil-észterrel (F Alá) és Ficollal végzett kezelés hatásának tanulmányozása a Haemonetics V-50 mosásos technikával kapott sejtek LAK aktivitására.
Sejtek: Humán limfociták (amelyeket a Haemonetics Corporationtól kapunk, V-50 mosásos technikát alkalmazva). Raji sejtek (ATCCCCL 86).
Anyagok
1. Sejttenyésztő tápközeg (CCM)-RPMI 1640 10% FBS-sel, L-glutaminnal és gentamicinnel
2. Foszfáttal pufferolt fiziológiás sőoldat (PBS), 1szeres, CA4* és Mg++ nélkül
3. Ficoll-Hypaque (Ficoll)
4. F Alá (fenil-alanin-metil-észter)
5. Unopette® a WBC-számoláshoz (Becton-Dickinson, Ruthesford, New Jersey, USA gyártmány)
6. Etilén-butén-kopolimer, zsák a sejttenyésztéshez
7. T25 szövettenyésztő lombik
8. l%NP40
9. 2-TD-puffer (1,6% NaCl; 0,076% KC1; 0,6% trisz-bázis; 0,02% NaH2PO4; HC1 pH«7,4-ig)
10.51Cr (nátrium-kromátként)
HU 205 380 Β
11. Rekombináns interleukin-2, 10 egység/ml 0,5 mól/literes glükózban (IL-2)
12.96 üreges laposfenekű szövettenyésztő lemez
13. SCS Harvesting System (Skatron)
14. Beckman Gamma 4000 Counter 5
15. Triptánkék
Eljárás
A) A sejtek előállítása
1. Összesen 250 ml fehérvérsejt-frakciót gyűjtünk a 10 Haemonetics V-50 berendezésből, mosásos technikát alkalmazva, amint ez a 4 416 654 és 4 464 167 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban le van írva,
2. WBC-számlálást végzünk Unepotte berendezést 15 alkalmazva. A frakció 1,36407 WBC/ml-t és becslés szerint mintegy 3 térfogat% RBC-t tartalmaz.
3. A sejteket ezután 1·107 WBC/ml koncentrációra állítjuk be (teljes térfogat-340 ml).
4. 40 ml sejtet viszünk közvetlenül tenyészetbe 20 (amint ezt alább leírjuk).
5. A megmaradó 300 ml-t F Ala-val kezeljük (amint ezt alább leírjuk).
B) F Alá kezelés
1.300 ml sejtet T150 lombikokba helyezünk 2.30 ml F Ala-t adunk a sejtekhez
3. Alaposan (de szelíden) összekeverjük
4. Szobahőmérsékleten inkubálunk 40 percen át
5. Inkubálás után a vért két alikvotra választjuk szét, ezek mindegyike 165 ml-t tartalmaz:
a) az 1. alikvotot a tenyészetbe visszük;
b) a 2. alikvotot alárétegezzük Ficollal (amint alább leírjuk), majd tenyészetbe visszük.
C) A tenyészet összeállítása
1. Sejtek közvetlenül V-50-ből (Ficoll nélkül;
F Alá nélkül)
a) 40 ml sejtet helyezünk 50 ml-es centrifugacsőbe;
b) a sejteket 10 percig 1200 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk;
c) a felülúszót eldobjuk;
d) a sejteket újra szuszpendáljuk CCM-ben 40 ml teljes térfogatban;
e) a kívánt mennyiségű sejtet T25 lombikokba helyezzük;
f) CCM-et adunk a lombikokba a fehér vérsejtek a kívánt koncentrációra állítására;
g) 5 μΐ IL-2-t adunk minden egyes lombikba (végső koncentráció 10 egység/ml);
h) a lombikokat 37 °C hőmérsékletű, 5% CO2-ot tartalmazó inkubátorba helyezzük.
összeállítás - T25 lombikok
1Ί06 WBC/ml 5*10* WBC/ml 1Ί07 WBC/ml zsák:
1 ml sejt 5 ml sejt 10 ml sejt 5405
9 ml tápközeg 5 ml tápközeg 5 μΐ IL-2 6,8407
(CCM) (CCM)
5 μΐ IL-2 5plIL-2 60
9,260 ml tápközeg (CCM) 5μ1Η-2
2.1. alikvot->SejtekV-50-ből (F-Ala; ésFicoll nélkül)
a) 165 ml F Ala-val kezelt sejtet helyezünk egy 250 ml-es centrifugacsőbe;
b) 10 percig 1200 fordulat/perccel centrifugálunk;
c) a felülúszót eldobjuk;
d) a sejteket újra szuszpendáljuk 50 ml CCM-ben;
e) sejtszámlálást végzünk, Unopette-t alkalmazva; a WBC-szám l,9407/ml;
f) tenyészeteket állítunk össze zsákokban és lombikokban a kívánt sejtkoncentrációk szerint;
g) a tenyészeteket 37 °C hőmérsékletű 5% CO2-ot tartalmazó inkubátorba helyezzük,
A 2. tenyészet összeállítása:
T25 lombik: 5406 sejt/ml zsák: 9406 sejt/ml ——-0,26040-2,6 ml sejt Λ
7,4 ml tápközeg (CCM) > 5 μΐ IL-2 ^^-0,474400-47,4 ml sejt Ί
T25 lombikban
52,6 ml tápközeg (CCM) f zsákban 50 μΐ IL-2 J
3. 2. alikvot-$Sejtek V-50-ből (F-Ala és Ficoll)
a) 40 ml, F Ala-val kezelt sejtet 4-50 ml-es centrifu2θ gacsővekbe helyezünk;
b) a vért alárétegezzük 10 ml Ficollal;
c) 30 percig centrifugálunk 1900 fordulat/perccel;
d) a határfelületi réteget steril Pasteur-pipettával összegyűjtjük és a sejteket steril, 50 ml-es centrifuga25 csőbe helyezzük;
e) a térfogatot PBS-sel 50 ml-re állítjuk be;
f) 10 percig centrifugálunk 1200 fordulat/percnél;
g) a felülúszót eldobjuk;
h) az üledéket újra szuszpendáljuk 50 ml CCM-ben;
i) 10 percig centrifugálunk 1200 fordulat/percnél;
j) újra szuszpendálunk 5 ml CCM-ben;
k) sejtszámlálást végzünk triptonkéket alkalmazva; majd
l) tenyészeteket állítunk össze zsákokban és lombl45 kokban a kívánt sejtkoncentráció szerint;
m) a tenyészeteket 37 °C hőmérsékletű, 5% C02-ot tartalmazó inkubátorba helyezzük.
Megjegyzés: Határfelületi réteg nem keletkezik a 3. lépés után, ezért a sejteket újra szuszpendáljuk, újból
5Q alárétegezzük Ficollal, és újra centrifugáljuk. Ezután a sejteket a határfelületről összegyűjtjük.
A 3. tenyészet összeállítása: T25 lombik: 5406 sejt/ml T25 lombik: 10· 106 sejt/ml 1,9406 sejt/ml 0,074*10=0,740 ml sejt
T25 lombikban
HU 205 380 B
8»107=Q,147*10=1’471111 Sejt 8,53 ml tápközeg (CCM) 5plIL-2
1,9-106
6,8*10’ =0,0279-100=2,79 ml sejt
97,21 ml tápközeg (CCM) 50plIL-2
T25 lombikban
125 lombikban
D) LAK-mérés
A LAK-mérést akkor hajtjuk végre, miután a sejtek 4 napig tenyészetben voltak, a fentebb megadott eljárás szerint.
Megjegyzés: A mintákban lévő vörösvérsejtek túlságos bősége miatt 3 mintát lízis pufferral kezelünk a LAK-vizsgálat előtt.
Lizálóoldat 0,83 g ammónium-klorid 5 200 ml desztillált víz.
1. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk 10 ml lizálóoldatban;
2.20 percig inkubálunk szobahőmérsékleten;
3.10 percig 1200 fordulat/perccel centrifugálunk;
4. a felülúszót eldobjuk;
5. újra szuszpendálunk 1 ml CCM-ben;
6. sejtszámlálást végzünk;
7. beállítjuk az E:T arányt, amint ezt a LAK-méiési eljárásnál leírjuk.
ADATOK
Sejtszámok
Minta Számlálás Sejtek Összes sejtek
Közvetlenül V-50-ből 68 1,36*10’ 3,4*107250 ml
F Alá után 97 1,9*10’ 9,7* 10750 ml
F Alá és Ficoll után 344 6,8-107 3,4*1075 ml
Sejtek készítése F Alá kezeléshez (az összes sejtet l*107-re állítjuk be).
i ^3^7-0,735*340=250 ml sejt
1,36*10' ml CCM
Kiveszünk 40 ml-t és tenyészetbe visszük. Hozzáadunk 30 ml F Ala-t a megmaradó sejtekhez, és 40 percig, szobahőmérsékleten inkubálunk.
4. nap - 51Cr kibocsátási adatok
Minta Élő Nem élő %Élő Sejt/ml Sejtek ml-e Tápközeg ml-e Összes sejt
Közvetlenül V-50-bó'L *1*10® lombik 39 3 92% 7,8*10® 0,256 0,744
*5*10® lombik 113 44 87% 2,2*10’ 0,091 0,909
F 1*10® lombik 136 2,7*10’ 0,074 0,926 5,4*10’
F Alá, Ficoll nélkül *5*10® lombik 44 2 95% 8,8*10® 0,228 0,772
F 9* 10® zsák 92 1,8*10’ 0,111 0,889 3,6*10’
F Alá és Ficoll 5*10® lombik 154 21 88% 3*10’ 0,067 0,933
10*10® lombik 158 30 84% 3,2*10’ 0,063 0,937 6,4*10’
1,9*10® zsák 48 2 92% 9,6*10« 0,208 0,792
Raji 82 5 94% 1,6*10’ 0,240 39,760
Közvetlenül V-50-böl
1*10® lombik -0,256
5* 10® lombik -0,091
10*10® lombikéi-0,074
F Alá, Ficoll nélkül
5-10^^^-0,228
HU 205 380 Β
9406 zsák
2406
1,8407 =0,111
F Alá és Ficoll
1406 lombik =0,067 3,240' ο» 1
10406 lombik-^- =0,063 3,2407 , 2406
1,9406 zsák =0,208 9,6406
Raji= =0,006·40=0,240 miséje θ 39,760 ml tápközeg * minták, amelyek lizálóoldattal voltak kezelve a LAK-vizsgálat előtt θ F: Unopette módszert alkalmazva számolt minták.
4. nap - 51Cr kibocsátási adatok
Maximális (teljes) kibocsátás=2011 2215 2361
Átlag: 2196 cpm
Spontán kibocsátás=463 21,0%
469 21,3% t 573 26,0%
Átlag 502 cpm 22,8%
Sejtek közvetlenül V-50-ből - F Alá nélkül és Ficoll nélkül
Hígítás Lombik 1406 Lombik 5406 Lombik 1407
CPM% Citolízis CPM% Citolízis CPM% Citolízis
20:1 1011 30,1 1102 35,4 1222 42,5
978 28,1 1143 37,9 1437 55,2
1078 33,4 1142 37,8 1321 48,4
átlag 30,5 átlag 37,0 átlag 48,7
10:1 821 18,9 752 ' 14,8 1014 30,2
736 13,8 861 21,2 1072 33,7
758 15,1 861 21,1 1361 50,7
átlag 15,9 átlag 19,1 átlag 38,2
5:1 613 6,6 757 15,1 907 23,9
638 8,0 719 12,8 874 22,0
591 53 747 14,5 815 18,5
átlag 6,6 átlag 14,1 átlag 21,5
2,5:1 512 0,6 635 7,9 584 4,9
548 2,7 699 11,6 629 7,5
495 ^4 592 5^3 1012 30,1
átlag 1,0 átlag 8,3 átlag 14,2
F Alá; és Ficoll nélkül
Hígítás Lombik 5406 CPM% Citolízis Zsák9406 CPM% Citolízis
20:1 838 19,9 670 9,9
716 12,7 962 27,2
727 13,3 1158 38,7
átlag 15,3 átlag 25,3
10:1 624 7,2 811 18,3
550 2,9 723 13,1
636 7,9 764 15,5
átlag 6,0 átlag . 15,6
HU 205 380 Β
Hígítás Lombik 5·105 Zsák9«106
CPM% Citolízis CPM' % Citolízis
5:1 541 2,3 719 12,8
506 0,3 713 12,5
654 9.0 822 18,9
átlag 3,9 átlag. 14,7
2,5:1 476 -1,5 709 12,2
488 -0,8 713 12,5
405 -5,7 727 13,3
- átlag -2,7 átlag 12,7
F Alá; és FicoII nélkül
Hígítás Lombik 1·10δ Lombik 5· 106 Lombik 1·107
CPM% citolízis CPM% citolízis CPM% citolízis
20:1 1030 31,2 1239 43,5 1498 58,8
1010 30,0 1200 41,2 1227 42,8
1069 33,5 1288 46,4 1187 40,5
átlag 31,6 átlag 43,7 átlag 47,4
10:1 769 15,8 982 28,4 1125 36,8
781 16,5 999 29,4 1188 40,5
745 14,4 939 25,8 1261 44,8
átlag 15,5 átlag 27,8 átlag 40,7
5:1 623 7,2 876 22,1 1127 36,9
624 7,2 755 15,0 953 26,6
676 10,3 759 15,2 1326 48,7
átlag 8,2 átlag 17,4 átlag 37,4
2,5:1 422 -4,7 627 7,4 983 28,4
464 -2,2 556 3,2 940 25,9
426 -4.5 563 32 894 23,2
átlag -3,8 átlag 4,8 átlag 25,8
2. példa
Munkamenet Ennek a példának a munkamenetét a következő ábra foglalja össze.
V-50
#1 l»I06F #3 I-IO’B #4 MO5 #8 l«106F #9 5*10sB #10 1·107Β
F-T25 lombik
B»Tenyésztőzsák
I
HU 205 380 Β
Eljárás
A) A sejtek elkülönítése
1. Sejteket gyűjtünk mosásos technikával Haemonetícs V-50-ben.
2. Sejtszámlálást végzünk=l,3*107 sejt/ml 442 miben. 5,8·109 összes sejt.
3. A sejttérfogatot a feldolgozáshoz kettéosztjuk.
B) LÁB Ficoll
1. 221 ml sejtet összekeverünk PBS-sel, és Ficollra ré tegezzük.
2. 30 percig centrifugálunk 2000 fordulat/percnél.
3. Ezután a sejteket mossuk, és szuszpendáljuk:
256 élő sejt
99%-os életképesség 1 nem élő sejt 5,l*108 sejt/ml 2*10740 ml
4. Sejteket tenyészetben LAK-l *106-ra állítjuk be.
Mintakód « Kívánt koncentráció Számítás ml sejt + ml tápközeg + μΐ IL-2
#4 l*106 1Ί06 5,1*10’ = 0,2 ml + 9,8 ml + 5μ1
5. Ezeknek a Ficollra rétegezett sejteknek a maradékát beállítjuk F Ala-hoz:
a) ViCi=V2C2 (40ml)(5,l*107)- V2(l*107) összes ml- V2-200ml tápközeg ml- Vr-Vi-lőOml
F Alá ml- V2/9-200/9-22,2 ml F Alá
b) 40 percig inkubálunk, majd mosunk.
c) Sejtszámlálást hajtunk végre, és a sejteket LAK-hoz szolgáló tenyészetbe visszük.
Élő sejtek- 229 Nem élő sejtek- 6 % életképesség- 97%
Sejt/ml- 4,6*107
d) A sejteket beállítjuk a tenyésztéshez.
Mintakód Kívánt koncentráció ml sejt + ml tápközeg + μ1Ι1-2
#1 l*106 0,20 ml + 9,8 ml + 5 μΐ
#2 5*106 10,9 ml + 89,1 ml + 50 μΐ
#3 1*10’ 21,8 ml + 78,2 ml + 50 μΐ
C) LAK közvetlenül V-50-ből szükséges, hogy l*106, 5*106 és l*107 koncentrációjú
1. A sejtek második felét alkalmazzuk ekkor. A sej- tenyészetekkel rendelkezzünk, és a megmaradó sejteteknek azt a mennyiségét alkalmazzuk, amely ahhoz 4U két hígítjuk és fenil-alanin-metil-észterrel kezeljük.
Mintakód Kívánt koncentráció ml sejt + ml tápközeg + μ1Η-2
5 1·106 0,76 ml + 9,2 ml + 5 μΐ
6 5-106 3,9 ml + 6,1 ml + . 50 μ!
Ί 1-107 7,7 ml + 2,3 ml + 50 μΐ
*7Α 1·107 7,7 ml + 2,3 ml + 50 μΐ
* 10 ml minta - centrifugálás - 5 ml plazma eltávolítása; 5 ml tápközeg hozzáadása. A sejtek hígítása l*107-re.
D) F Alá; Ficoll nélkül Sejtszámlálást hajtunk végre, és tenyészetbe visz-
F Alá sejtek Ficollal végzett elkülönítés nélkül: először szük át.
C,Vi- C2V2 Élő 240
(200 ml)(l,2*107)= (k)(l*107)=x=260 55 % Élő 93%
tápközeg ml- 60 ml Sejt/ml- 4,8 *107
F Alá ml- 29 ml Összes- 1,9*10740 ml
Inkubálunk 40 percig
Mosunk
60
HU 205 380 Β
Mintakód Kívánt koncentráció ml sejt + ml tápközeg + plH-2 #8 #9 #10
1-106
5*10® l*107
Az összes tenyészetet 3 napon át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, 5% CO2 jelenlétében. LAK-51Cr kibocsátás-mérést hajtunk végre. Az ezután következő táblázatokban a % REL jelentése %-os kibocsátás, amely ugyanaz, mint a %-os citolízis a fenti módon számolva. E:T jelentése az effektor (LAK) sejtek és a cél (tumor) sejtek aránya.
A sejtszámlálást az összes tenyészetnél végrehajtjuk.
Minta Élő Nem élő % Élő Összes
A 33 4 88 6,5-10® ml
B 99 8 93 2,0-108/10ml
C 236 17 93 4,7-108/10ml
D 7 0 100 1,4-106/ml
*E 22 1 96 4,4-10®/ml
F 45 5 91 l,8-107/2ml
G 38 4 90 7,6-10®/ml
H 75 6 93 1Λ·108/ΐ0πι1
J 141 15 90 2,8-108/10 ml
K 31 4 89 6,2-10®/ml
#1 34 1 97 6,8-10®/ml
2 162 8 95 3,2-lOVlO ml
3 375 20 94 7,5-108/10ml
4 41 2 95 8, l-lOVml
5 27 2 93 8,4-10®/ml
6 43 1 98 l,7-107/2ml
7 121 17 88 4,8-107/2ml
7A 149 9 94 6,0*1072 ml
8 57 0 100 l-107/ml
9 113 5 96 2,3-10710 ml
10 424 47 90 8,5*10710 ml
* Az E betűvel jelölt minta erőteljes fibrinalvadással bír a centrifugálás után. Raji tumorsejteket állítunk elő célsejtekként. Az életképesség 100% 3,6-10^1111 koncentrációnál.
0,2 ml + 9,8 ml + 5 pl
10,4 ml + 89,6 ml + 50 pl
20,8 ml + 72,2 ml + 50 pl
E:T CPM% REL
10 2,5 198 8,39
2,5 196 8,05
15 E:T #2,5-10® CPM% REL
20 607 77,01
20 478 55,37
20 480 55,70
20 10 471 54,19
10 527 63,59
10 512 61,07
5 383 39,43
5 317 28,36
25 5 393 41,11
2,5 338 31,88
2,5 271 20,64
2,5 242 15,77
30 E:T #3,1-107 CPM% REL
20 603 76,34
35 20 647 83,72
20 571 70,97
10 546 66,78
10 408 43,62
10 405 43,12
40 5 351 34,06
5 333 31,04
5 324 29,53
2,5 265 19,63
2,5 217 11,58
45 2,5 271 20,64
E:T LabFicoll-FAIa #1, 1-10® CPM% REL
20 500 59,6
20 501 59,23
20 470 54,03
10 377 38,42
10 372 37,58
10 326 29,87
5 233 14,26
5 288 23,49
5 253 17,62
2,5 197 8,22
50 STD Ficoll - F Alá nélkül #4,1*10®
E:T CPM% REL
20 565 69,97
20 507 60,23
20 529 62,42
55 10 483 56,21
10 400 42,98
10 462 52,68
5 276 21,48
5 255 17,95
60 5 291 23,99
HU 205 380 Β
E:T ο CPM% REL
2,5 288 23,49
2,5 263 19,30
2,5 235 14,60
Mosás - Ficoll nélkül és F Ala nélkül #5, l»106
E:T CPM % REL
20 588 73,83
20 496 58,39
20 466 53,36
10 305 26,34
10 296 24,83
10 339 32,05
5 285 22,99
5 281 22,32
5 228 13,42
2,5 211 10,57
2,5 229 13,59
2,5 237 14,93
E:T #6,5-106 CPM% REL
20 759 102,52
20 626 80,20
20 512 61,07
10 543 66,28
10 533 64,60
10 521 62,58
5 373 37,75
5 474 54,70
5 408 43,62
2,5 224 12,75
2,5 341 32,38
2,5 266 19,80
E:T #7, MO7 CPM % REL
20 . 314 27,85
20 288 23,49
20 312 27,52
10 203 9,23
10 186 6,38
10 206 9,73
5 187 6,54
5 185 6,21
5 177 4,87
2,5 157 1,51
2,5 190 7,05
2,5 167 3,19
E:T #7A, MO’ CPM % REL
20 481 55,87
20 308 26,85
20 297 25,00
10 249 16,95
10 281 22,32
10 252 17,45
5 197 8,22
5 144 -0,67
5 167 3,19
2,5 160 2,01
2,5 197 8,22
2,5 164 2,68
Mosás - F Ala; Ficoll nélkül
E:T #8, MO6 CPM % REL
20 592 74,50
20 574 71,48
20 463 52,85
10 377 38,42
10 438 48,66
10 425 46,48
5 257 18,29
5 228 13,42
5 431 47,48
2,5 207 9,90
2,5 217 11,58
2,5 211 10,57
E:T #9,5406 CPM % REL
20 687 90,44
20 573 71,31
20 598 75,50
10 636 81,88
10 609 77,35
10 647 83,72
5 255 17,95
5 284 22,82
5 352 34,23
2,5 264 19,46
2,5 346 33,22
2,5 315 28,02
E:T #10, MO’ CPM% REL
20 572 71,14
20 586 73,49
20 493 57,89
10 349 33,72
10 288 23,49
HU 205 380 Β
E:T CPM% REL
10 254 17,79
5 183 5,87
5 204 9,40
5 233 14,26
2,5 205 9,56
2,5 214 11,07
2,5 195 7,89
3. példa
550 ml ACD-B antikoagulánsban összegyűjtött 3600 ml teljes vérből készített, 225 ml humán leukocitát tartalmazó standard, leukaferézis terméket a Biolo- 15 gical Speciality Corporationtól (Landsdale, Pennsylvania) szerzünk be. Ezt a terméket alkalmazva a következő eljárásokat hajtjuk végre.
1. Összeállítunk egy Unopette-t (WBC) és egy differenciált.
Differenciál:
90% limfocita,
6% monocita,
4% granulocita.
KőzveÜen-165 sejt 3,3·107 sejt/ml 7,4409 sejt/225 ml.
2. LAK tenyésztését állítjuk össze
1406- 0,30 ml sejt+9,70 ml tápközeg+5 pl IL-2 5»10ő«l,52 ml sejt+8,48 ml tápközeg+5 pl IL-2
1407- 3,04 ml sejt+6,96 ml tápközeg+5 pl IL-2 ' Inkubálunk 37 °C hőmérsékleten, 5% CO2 jelenlétében 4 napon át.
3. Ezután 20 ml sejtet távolítunk el a megmaradó sejtekből és összekeverjük 20 ml PBS -sel, amely nem tartalmaz Ca^-ot és Mg^-ot. Ennek akeveréknek 40 ml-ét 40 ml Ficollra rétegezzük és centrifugáljuk 1/2 órán át. A mononukleáris sejtréteget eltávolítjuk, és ezeket a sejteket háromszor mossuk; 90 perces monocita agglutinációt végzünk. Kétszer mossuk, sejtszámlálást végzünk, és LAK-tenyészetbe visszük. Ez a standard minta.
Standard sejtszám:
Élő- 155
Nemélő= 1 % Életképesség- 99%
Sejt/ml- 3,1407/ml Összes- 7,740725 ml.
Hígítás 1Ί06 sejtkoncentrációra-0,32 ml sejt+
9,68 ml tápközeg+5 pl (IL-2).
4. A maradék sejteket (200 ml) ezután 460 ml CCMmel hígítjuk, így a sejtszámot l«107-re állítjuk, és 73 ml F Ala-val kezeljük.
Szobahőmérsékleten 40 percig inkubálunk.
Olyan sok meg nem alvadt szuszpenziót távolítunk el, amennyit csak lehetséges
- a sejteket mossuk és WBC számlálást végzünk Unopette-vel.
sejt élő 1 sejt nem élő
96% életképesség 5,2· 106 sejt/ml 1,04409 sejt/200 ml
A sejteket zsákba visszük át a következőképpen: 5406-48 ml/sejt + 2 ml tápközeg + 25 pl IL-2
Inkubálunk 37°C hőmérsékleten, 5% C02-nál 4 napon át LAK céljából.
5. Sejtszámlálás inkubálás után
Élő Nem élő % Életképesség Sejt/ml Összes
Standard 25 1 96 4,9406
Közvetlen, 1406 27 1 96 5,3406
Közvetlen, 5406 11 1 92 2,1406 1,14075 ml
Közvetlen, ΙΊ07 24 5 83 4,8406 4,840710 ml
FAla,5406 19 0 100 3,8406
Raji 85 7 92 1,7407
E:T arány 20:1,10:1,5:1,2,5:1 Közvetlen, 5406 0,95 ml sejt+0,05 ml tápközeg
Hígítások 50 Közvetlen, 11407 0,42 ml sejt+0,58 ml tápközeg
2406 FAla 0,53 ml sejt+0,47 ml tápkőzeg
Standard 0,41 ml sejt+0,59 ml tápközeg Raji 0,12 ml sejt+19,88 ml tápközeg
Közvetlen, 1405 0,38 ml sejt+0,62 ml tápközeg
Eredmények: Összes és spontán CPM
E:T Pozíciókód CPM % citolízis
Vak 1BLAN -5,9 0,0
2BLAN -8,6 0,0
3BLAN 10,3 0,0
0 ÁTLAG -8,3 0,0
HU 205 380 Β
E:T Pozíciókód CPM. % citolízis
Max. kibocsátás 4T0TA 823,0 100,0
5TOTA 700,9 100,0
6T0TA 896,9 100,0
0 ÁTLAG 806,9 100,0
Spontán kibocsátás 7REFR 104,5 13,0
8REFR 97,5 12,1
9REFR 109,3 13,5
10 ÁTLAG 103,8 12,6
20:1 10 UNKS Standard Ficoll, 1·106 276,5 24,6
11 UNKS 287,2 26,1
12 UNKS 309,1 29,2
0 ÁTLAG 291,0 26,6
10:1 13 226,2 17,4
14 212,4 15,4
15 255,8 21,6
0 ÁTLAG 231,4 18,2
5:1 16 174,4 10,0
17 180,4 10,9
18 162,4 8,3
0 ÁTLAG 172,4 9,8
2,5:1 19 134,2 4,3
20 124,8 3,0
21 99,6 -0,6
0 ÁTLAG 119,5 2,2
20:1 22 Közvetlen - Ficoll nélkül, 1· 106 490,6 55,0
23 436,6 47,3
24 423,7 45,5
0 ÁTLAG 450,3 49,3
10:1 25 484,5 54,1
26 526,7 60,1
27 495,8 55,8
0 502,4 56,7
5:1 28 391,6 40,9
29 395,3 41,5
30 432,2 46,7
0 ÁTLAG 406,4 43,0
2,5:1 31 236,5 18,9
32 298,4 27,7
33 220,7 16,6
0 ÁTLAG 251,9 21,1
20:1 34 Közvetlen - Ficoll nélkül, 5· 106 409,2 43,4
35 370,9 38,0
36 361,2 36,6
0 ÁTLAG 380,5 39,3
HU 205 380 Β
E:T Pozíciókód CPM % citolízis
10:1 37 352,4 35,4
38 409,3 43,3
39 364,4 37,1
0 ÁTLAG 375,3 38,6
5:1 40 313,3 29,8
41 293,3 27,0
42 292,4 24,0
- 0 ÁTLAG 293,1 26,9
2,5:1 43 194,5 12,9
44 227,2 17,6
45 194.9 13,0
0 ÁTLAG 205,5 14,5
20:1 46 Közvetlen - Ficoll nélkül, 1· 107 245,6 20,2
47 193,2 12,7
48 195,7 13,1
0 ÁTLAG 211,5 15,3
10:1 49 191,3 12,4
50 188,6 12,1
51 232,2 18,3
0 ÁTLAG 204,1 14,3
5:1 52 174,1 10,0
53 166,8 9,0
54 161,8 8,2
0 ÁTLAG 167,6 .9,1
2,5:1 55 136,0 4,6
56 149,8 65
57 114,9 L6
0 ÁTLAG 133,6 4,2
20:1 58 FAla.5406 278,1 24,8
59 221,1 16,7
60 226,6 17,5
0 ÁTLAG 241,9 19,6
10:1 61 206,5 14,6
62 188,9 12,1
63 195,9 13,1
0 ÁTLAG 197,1 13,3
5:1 64 1864 11,8
65 199,8 13,7
66 173,3 9£
0 ÁTLAG 186,5 11,8
2,5:1 67 199,2 13,6
68 175,1 10,1
69 212,7 15,5
0 ÁTLAG 195,7 13,1
HU 205 380 Β
4. példa
520 ml ACD-B antikoaguláns ACD-B-ben összegyűjtött 3600 ml teljes vérből készített, 250 ml humán leukocitát tartalmazó standard leukaferézis terméket a Biological Speciality Corporationtól (Landsdale, 5 Pennsylvania) szerzünk be. Az alábbi eljárásokat végezzük el ezt a terméket alkalmazva.
1. Eltávolítunk 10 ml sejtet
A) 10
1. Ebből a vérből 5 ml-t összekeverünk 5 ml PBS-sel;
2. Alárétegezünk 10 ml Ficollt;
3.30 percig 2000 fordulat/percnél centrifugálunk;
4. Mosunk, és számlálást végzünk;
5. Ez a standard: 1,5406 sejt/ml 10 ml-es lombikban. 15 Standard
Élő- 49 Nemélő= 0 %Élő= 100%
Sejt/ml- 9,8»106/ml 20
Összesen- 1,9640^201111
Hígítás: 1,5 ml sejt+8,5 ml tápközeg+1 μΐ IL-2
B) 25
1. A második 5 ml-t közvetlen vizsgálathoz alkalmazzuk;
2. WBC-számlálást (Unopette segítségével) és differenciál mérést hajtunk végre;
3. WBC: 4,5407/ml
2,25»108/5 ml Diff.: 72% limfocita
22% granulocita 6% monocita
4. A sejteket 10 ml-es lombikokban l,5406/ml és 5· lO^ml kezdeti sejtszámmal tenyészetbe visszük.
1,5· 10s/ml*=0,33 ml sejt+9,67 ml tápközeg+1 μΐ DL-2 5·10®/ιη1=1,11 ml sejt+8,89 ml tápközeg+1 pl JL-2
A sejteket 4 napig inkubáljuk, majd krómkibocsátási mérést hajtunk végre.
Sejtszámlálás:
Élő Nem élő %Élő Sejt/ml
Standard 1,5406 40 3 93 8·106
Közvetlen, 1,5·106 40 2 94 8406
Közvetlen, 5406 24 1 96 4,8406
Raji 40 6 87 8406
3. LAK-mérés
E:T arány 40:1; 20:1; 10:1; 5:1; 2,5:1; 1,25:1.
A sejteket 440®-ra hígítjuk.
A Raji sejteket 1405-re hígítjuk.
Hígítások:
Standard 0,5 ml sejt+0,5 ml tápközeg Közvetlen, 1,5406 0,5 ml sejt+0,5 ml tápközeg Közvetlen, 5406 0,83 ml sejt+0,17 ml tápközeg Raji 0,25 ml sejt+19,75 ml tápközeg
Eredmények: Összes és spontán CPM
E:T Vak Helyzetkód 1BLAN 2BLAN 3BLAN 0 ÁTLAG CPM -11,0 -10,6 -10,6 -10,7 % Citolízis 0,0 0,0 0£ 0,0
Maximális 4TOTA 576,9 100,0
kibocsátás 5TOTA 564,6 100,0
6TOTA 584,6 100.0
0 ÁTLAG 575,4 100,0
Spontán 7REFR 139,7 24,3
kibocsátás 8REFR 140,6 24,4
9REFR 152,3 26,5
0 ÁTLAG 144,2 Standard, 1,5· 106 25,1
40:1 10UNKS 540,1 91,8
11UNKS 547,0 93,4
12UNKS 518,3 86,8
0 ÁTLAG 535,2 90,7
20:1 13 459,5 73,1
14 503,2 83,3
15 458,0 72,8
0 ÁTLAG 473,6 76,4
HU 205380 Β
E:T 10:1 Helyzetkód 16 17 18 0 ÁTLAG CPM 404,5 410,8 439.1 418.1 % Citolízis 60.4 61,8 68.4 63.5
5:1 19 320,5 40,9
20 279,1 31,3
21 275,0 30,3
0 ÁTLAG 291,0 34,2
2,5:1 22 222,1 18,1
23 253,0 25,2
24 232,1 20,4
0 ÁTLAG 235,7 21,2
1,25:1 25 175,7 7,3
26 205,6 14,2
27 207,9 14,8
0 ÁTLAG 196,4 12,1
Közvetlen. -Ficoll nélkül, 1.5U06
80:1 28 415,5 62,9
29 393,0 57,7
30 461,8 73,7
0 ÁTLAG 423,4 64,8
40:1 31 417,7 63,4
32 404,2 60,3
33 405,6 60,6
0 ÁTLAG 409,2 61,5
20:1 34 381,1 55,0
35 407,0 60,9
36 447,9 70,4
0 ÁTLAG 412,0 62,1
10:1 37 430,5 66,4
38 407,4 61,0
39 442,6 69,2
0 ÁTLAG 426,8 65,5
5:1 40 337,5 44,8
41 357,4 49,5
42 358,0 49,6
0 ÁTLAG 351,0 48,0
2,5:1 43 240,8 22,4
44 270,9 29,4
45 262,1 27,3
0 ÁTLAG 257,9 26,4
1,25:1 46 186,9 9,9
47 194,1 11,6
48 182,2 8,9
0 ÁTLAG 187,9 10,1
Közvetlen - Ficoll nélkül 5U06
40:1 49 391,0 57,2
50 392,1 57,5
HU 205 380 Β
E:T Helyzetkód 51 0 CPM 399,6 394,2 % Citolízis 59,2 58,0
20:1 52 386,3 56,2
53 381,1 54,9
54 377,0 54,0
0 381,5 55,0
10:1 55 346,0 46,8
56 346,0 46,8
57 325,5 42,0
0 339,2 45,2
5:1 58 296,5 35,3
59 236,6 21,4
60 239,0 22,0
0 257,4 26,2
2,5:1 61 190,6 10,8
62 172,8 6,6
63 190,5 10,7
0 184,6 9,4
1,25:1 64 151,7 1,7
65 172,5 6,6
66 203,8 13,8
0 ÁTLAG 176,0 7,4
5. példa Anyagok
Buffy coat - 52 ml vérből
Sejtszám - 4,3407 sejt/ml (összes WBC)
1,8407 neutrofil/ml (42%)
1-2· 107 limfocita/ml
5-109RBC/ml 0,5-1· 107 monocita/ml Ficoll-Hypaque (Ficoll)
CCM-5 % FCS-RPMI
Eljárások 1. Ficoll nélkül
a) 10,5 ml buffy coat-hoz hozzáadunk 215 ml CCM-et.
Sejtszám: 2406 sejt/ml (összes WBC)
b) Hozzáadunk 10 μΐ/ml IL-2-t;
c) 112 ml tenyésztőkeveréket helyezünk lombikba;
d) 112 ml tenyésztőkeveréket helyezünk zsákba;
e) Inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 20 napon át;
f) A 3., 6., 12., 17. és 20. napon mintákat veszünk sejtszámláláshoz és 51Cr kibocsátási (LAK) vizsgálathoz.
2. Ficoll
a) 42 ml buffy coat-ot helyezünk 50 ml-es centrifugacsőbe;
b) 800 g-nél 10 percig centrifugálunk;
c) A felülúszót eldobjuk, a mononukleáris WBC-réteget (limfociták és monociták), amely a Ficoll rétegen úszik, kinyerjük, és háromszor mossuk;
300· 106 összes mononukleáris sejtet izolálunk;
d) CCM hozzáadásával a mononukleáris sejtkoncentrációt 240^1 értékre állítjuk;
e) 75 ml-t lombikba helyezünk;
f) 75 ml-t zsákba helyezünk;
g) 37 °C hőmérsékleten 20 napon át inkubálunk;
h) Mintát veszünk a 3., 6., 12., 17., és 20. napon sejtszámláláshoz és 51Cr kibocsátási (LAK) vizsgálathoz.
A sejtszámlálások összegzése (x’lO’/ml)
A tenyésztési napok száma Lombik Zsák
Ficoll Ficoll nélkül Ficoll Ficoll nélkül
0 2406 2406 2406 2406
3 1,5406 0,9-106 2,1406 0,7406
6 2406 0,4406 2406 0,8406
12 2,5406 1,4406 2,7406 2406
17 1,6-106 1,2406 1,9406 1,1406
20 1,1-106 0,6406 2,4406 1,2406
HU 205 380 Β
ALAK aktivitásmérések összefoglalása 3 LUw
A tenyésztési napok száma Lombik Zsák
Ficoll Ficoll nélkül Ficoll Ficoll nélkül
3 10 40 5 20
6 5 100 5 14
12 2,5 1 2 <1
17 - 7 <1 7 1
20 7 2 2,5 1
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (9)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás LAK tumorroncsolő Iimföciták (LAK) sejtek in vitro előállítására teljes vérből, amelynek során a vérből a vörösvérsejteket és a plazmát eltávolítjuk, így 20 fehérvérsejtekben gazdag, limfocitatartalmú frakciót kapunk, és a fehérvérsejtekben gazdag frakciót tenyészközegben IL-2-vel inkubáljuk, azzal jellemezve, hogy a vörösvérsejtek és a plazma eltávolításával kapott 0,2300 vörösvérsejt/fehérvérsejt arányú és 1-50 térf% vö- 25 rösvérsejt-tartalmú, fehérvérsejtben gazdag frakciót alkalmazunk a Iimföciták Ficoll-gradiensen végzett közbenső elkülönítése nélkül.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vörösvérsejteket leukaferézissel távolítjuk el, és 30
    1-20 térf% vörösvérsejt-tartalmű, fehérvérsejtben gazdag frakciót alkalmazunk.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,2-250 vörösvérsejt/fehérvérsejt arányú, fehérvérsejtben gazdag frakciót alkalmazunk. 35
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezye, hogy a vörösvérsejteket mosással kombinált leukaferézissel távolítjuk el, és 1-6 térf% vörösvérsejt-tartalmű, fehérvérsejtben gazdag frakciót alkalmazunk.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,2-50 vörösvérsejt/fehérvérsejt arányú, fehérvérsejtben gazdag frakciót alkalmazunk.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább 80 térf% limfocita, 0-20 térf% monocita és 1-5 térf% granulocita összetételű differenciállal rendelkezőfrakciót alkalmazunk.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2-4 térf% vörösvérsejt-tartalmű, 0,5-25 vörösvérsejt/fehérvérsejt arányú, fehérvérsejtben gazdag frakciót alkalmazunk.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezye, hogy a fehérvérsejtben gazdag frakciót az inkubálás előtt fenil-alanin-metil-észterrel kezeljük.
  9. 9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezye, hogy a fehérvérsejtben gazdag frakciót az inkubálás előtt sóoldattal mossuk.
HU882123A 1987-04-27 1988-04-27 Simplified process for producing killer cells activated with human lymphokine HU205380B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/042,998 US4808151A (en) 1987-04-27 1987-04-27 Simplified method for the preparation of human lymphokine activated killer cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU205380B true HU205380B (en) 1992-04-28

Family

ID=21924902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU882123A HU205380B (en) 1987-04-27 1988-04-27 Simplified process for producing killer cells activated with human lymphokine

Country Status (17)

Country Link
US (1) US4808151A (hu)
EP (1) EP0289896B1 (hu)
JP (1) JPH0657147B2 (hu)
KR (1) KR900004422B1 (hu)
AT (1) ATE78053T1 (hu)
AU (1) AU612086B2 (hu)
CA (1) CA1304306C (hu)
DE (1) DE3872588T2 (hu)
DK (1) DK226288A (hu)
ES (1) ES2051790T3 (hu)
FI (1) FI881952A (hu)
HU (1) HU205380B (hu)
IL (1) IL86177A0 (hu)
NO (1) NO881819L (hu)
NZ (1) NZ224379A (hu)
PT (1) PT87335B (hu)
ZA (1) ZA882948B (hu)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7873187A (en) * 1986-08-08 1988-02-24 University Of Minnesota Method of culturing leukocytes
AU4485089A (en) * 1988-10-21 1990-05-14 Brigham And Women's Hospital Activation and growth of human tumor-infiltrating lymphocytes using antibodies to cd3 or tcr
WO1990004412A1 (en) * 1988-10-27 1990-05-03 Regents Of The University Of Minnesota Liposome immunoadjuvants containing il-2
US5484396A (en) * 1988-11-17 1996-01-16 Naficy; Sadeque S. Method and device for treatment of HIV infections and AIDS
HU902289D0 (en) * 1989-02-21 1991-11-28 Du Pont Process for the generating of proliferative cd4 lymphocytes
US5843728A (en) * 1991-03-07 1998-12-01 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US6753162B1 (en) 1991-03-07 2004-06-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US5912170A (en) * 1991-03-07 1999-06-15 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras
US5851828A (en) * 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
AU663711B2 (en) * 1991-04-05 1995-10-19 Regents Of The University Of Minnesota Method of enhancing the immunotherapeutic activity of immune cells by depletion/positive selection of cell subsets
US5725855A (en) * 1991-04-05 1998-03-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of treating tumors with CD8+ -depleted or CD4+ T cell subpopulations
IE922233A1 (en) * 1991-07-10 1993-01-13 Augusto C Ochoa Short-term anti-cd3 stimulation of lymphocytes to increase¹their in vivo activity
EP0624095B2 (en) * 1991-12-31 2005-07-20 Zymogenetics, Inc. Methods and compositions for reducing blood loss
US6053856A (en) * 1995-04-18 2000-04-25 Cobe Laboratories Tubing set apparatus and method for separation of fluid components
EP1847283B1 (en) * 1995-04-18 2010-07-14 CaridianBCT, Inc. Particle separation method
US5674173A (en) * 1995-04-18 1997-10-07 Cobe Laboratories, Inc. Apparatus for separating particles
US6022306A (en) * 1995-04-18 2000-02-08 Cobe Laboratories, Inc. Method and apparatus for collecting hyperconcentrated platelets
US5951877A (en) * 1995-04-18 1999-09-14 Cobe Laboratories, Inc. Particle filter method
US20020182730A1 (en) * 1995-07-26 2002-12-05 Micheal L. Gruenberg Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease
US6051146A (en) * 1998-01-20 2000-04-18 Cobe Laboratories, Inc. Methods for separation of particles
US6153113A (en) 1999-02-22 2000-11-28 Cobe Laboratories, Inc. Method for using ligands in particle separation
US6334842B1 (en) 1999-03-16 2002-01-01 Gambro, Inc. Centrifugal separation apparatus and method for separating fluid components
US6354986B1 (en) 2000-02-16 2002-03-12 Gambro, Inc. Reverse-flow chamber purging during centrifugal separation
FR2821947B1 (fr) * 2001-03-12 2003-05-16 Canon Kk Procede et dispositif de validation de parametres definissant une image
US20030134341A1 (en) * 2001-09-19 2003-07-17 Medcell Biologics, Llc. Th1 cell adoptive immunotherapy
US20030134415A1 (en) * 2001-09-19 2003-07-17 Gruenberg Micheal L. Th1 cell adoptive immunotherapy
DE60230997D1 (de) * 2001-12-05 2009-03-12 Caridianbct Inc Verfahren und vorrichtung zur trennung von blutbestandteilen
US20030173274A1 (en) * 2002-02-01 2003-09-18 Frank Corbin Blood component separation device, system, and method including filtration
US20030175272A1 (en) * 2002-03-07 2003-09-18 Medcell Biologics, Inc. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
CA2642653A1 (en) * 2002-04-16 2003-10-30 Gambro Bct, Inc. Blood component processing system, apparatus and method
CN1291231C (zh) 2003-12-08 2006-12-20 胡军 活化淋巴细胞特异性的检测方法
US20080035585A1 (en) * 2006-08-10 2008-02-14 Gambro Bct, Inc. Method and Apparatus for Recirculating Elutriation Fluids
DE102011106914B4 (de) 2011-07-08 2015-08-27 Zellwerk Gmbh Mäander- Bioreaktor und Verfahren zu dynamischen Expansion, Differenzierung und Ernte von hämatopoetischen Zellen
WO2014127122A1 (en) 2013-02-18 2014-08-21 Terumo Bct, Inc. System for blood separation with a separation chamber having an internal gravity valve
WO2017209498A1 (ko) * 2016-06-03 2017-12-07 주식회사 젬백스앤카엘 항암 치료용 사이토카인 유도 살해세포의 생산 방법

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3145713A (en) * 1963-09-12 1964-08-25 Protein Foundation Inc Method and apparatus for processing blood
US4197847A (en) * 1977-03-31 1980-04-15 Isaac Djerassi Method and apparatus for collecting transfusable granulocytes
US4185629A (en) * 1977-10-18 1980-01-29 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Method and apparatus for processing blood
US4151844A (en) * 1977-11-11 1979-05-01 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Method and apparatus for separating whole blood into its components and for automatically collecting one component
US4285464A (en) * 1979-01-22 1981-08-25 Haemonetics Corporation Apparatus for separation of blood into components thereof
US4401756A (en) * 1981-04-14 1983-08-30 Immunex Corporation Process for preparing human interleukin 2
US4464166A (en) * 1981-06-12 1984-08-07 Frederic A. Bourke, Jr. Method for externally treating the blood
US4416654A (en) * 1981-09-03 1983-11-22 Haemonetics Corporation Pheresis apparatus
US4464167A (en) * 1981-09-03 1984-08-07 Haemonetics Corporation Pheresis apparatus
JPS5998015A (ja) * 1982-11-27 1984-06-06 Microbial Chem Res Found 免疫賦活剤
US4613322A (en) * 1982-12-08 1986-09-23 Edelson Richard Leslie Method and system for externally treating the blood
US4683889A (en) * 1983-03-29 1987-08-04 Frederic A. Bourke, Jr. Method and system for externally treating the blood
US4675383A (en) * 1983-11-15 1987-06-23 The Salk Institute For Biological Studies Purification of T-cell growth factor
US4578056A (en) * 1984-10-29 1986-03-25 Extracorporeal Medical Specialties, Inc. Patient photopheresis treatment apparatus and method
US4690915A (en) * 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans

Also Published As

Publication number Publication date
US4808151A (en) 1989-02-28
IL86177A0 (en) 1988-11-15
DE3872588D1 (de) 1992-08-13
ATE78053T1 (de) 1992-07-15
NZ224379A (en) 1990-12-21
FI881952A (fi) 1988-10-28
KR880012751A (ko) 1988-11-29
FI881952A0 (fi) 1988-04-26
KR900004422B1 (ko) 1990-06-25
AU612086B2 (en) 1991-06-27
NO881819L (no) 1988-10-28
EP0289896A1 (en) 1988-11-09
JPS63295510A (ja) 1988-12-01
AU1520088A (en) 1988-10-27
EP0289896B1 (en) 1992-07-08
CA1304306C (en) 1992-06-30
DK226288D0 (da) 1988-04-26
ZA882948B (en) 1989-12-27
JPH0657147B2 (ja) 1994-08-03
PT87335A (pt) 1988-05-01
NO881819D0 (no) 1988-04-26
DE3872588T2 (de) 1992-12-03
DK226288A (da) 1988-10-28
ES2051790T3 (es) 1994-07-01
PT87335B (pt) 1992-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU205380B (en) Simplified process for producing killer cells activated with human lymphokine
KR101846464B1 (ko) 외래 미토콘드리아를 포함하는 자연살해세포 및 이를 포함하는 약학적 조성물
US20240197848A1 (en) Therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 in children, application of the cell sorter and the method of multiplying treg cells to produce therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1
JP7332787B2 (ja) 免疫細胞のインビトロ培養、誘導、活性化、凍結保存方法及びその細胞バンクの作成
Bol et al. The maturation state of three types of granulocyte/macrophage progenitor cells from mouse bone marrow
Horwitz et al. Spontaneous and induced cytotoxic properties of human adherent mononuclear cells: killing of non-sensitized and antibody-coated non-erythroid cells.
US20070134275A1 (en) Medicaments for the immunotherapy of malignant tumors
CN116445406A (zh) 一种脐带血来源nk细胞的体外简易培养体系和培养方法
CA2155920A1 (en) Use of interferon for the inhibition of proliferation and differentiation of primitive hematopoietic progenitor cells
WO1995010291A1 (en) Methods for collection and cryopreservation of human granulocytes
CN116490607A (zh) 肿瘤浸润淋巴细胞培养基及其应用
EP0483223B1 (en) Enhanced lak cell activation by treatment of human peripheral blood mononuclear cells with amino acid amides
EP0348290B1 (en) Method of producing activated killer monocytes and method of monitoring their tumoricidal acivity
US10577584B2 (en) Photodynamic process and product obtained therefrom
US6540994B1 (en) Macrophages, process for preparing the same and their use as active substances of pharmaceutical compositions
Watanabe et al. Autologous and allogeneic transplantation with peripheral blood CD34+ cells: a pediatric experience
Peters et al. Accessory phenotype and function of macrophages induced by cyclic adenosine monophosphate
EP0650727A1 (en) Use of hydroxychloroquine for treatment of graft-versus-host disease
JP4106488B2 (ja) 同種移植片に対する免疫寛容の誘導および／または白血病処置のための、幹細胞およびｃｄ６枯渇幹細胞の使用
US5512453A (en) Activated killer monocytes and tumoricidal activity and pharmaceutical compositions
CN108192945B (zh) 一种预测单倍体相合造血干细胞移植术后aGVHD发生风险的试剂盒
WO2014007423A1 (en) Culture composition for inducing dendritic cells from peripheral blood, culture kit comprising the same, and method for inducing dendritic cells from peripheral blood using the same
Mackinnon et al. Origin and function of adherent lymphokine activated killer cells in patients with chronic myeloid leukaemia who relapse following bone marrow transplantation
WO2014007421A1 (en) Culture composition for inducing activated t lymphocytes from peripheral blood, culture kit comprising the same, and method for inducing activated t lymphocytes from peripheral blood using the same
Verma et al. The kinetics of colony-stimulating activity elaboration from human bone marrow cells by immunoadjuvants: Interactions between light density adherent and nonadherent cells in vitro

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee