JPS63295510A - ヒトリンホカイン活性化キラー細胞の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は養子免疫療法、特にかかる療法に用いられるヒ
トリンホカイン活性化キラー細胞を生体外で生成させる
方法に関する。

養子免疫療法は、成る形態の癌に対する臨床上有望な成
果を最近もたらしている。ｒ　ＷａｌｌＳｔｒｅｅｔ　
Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　Ｊ　１９８７年４月９日号及びｒＴ
ｉｍｅＭａｇａｚｉｎｅ　Ｊ　１９８７年４月２０日号
における記事を参照されたい、この療法には、患者から
末梢血液を取り出し、その血液から赤血球（ＲＢＣ）を
除去して、リンパ球を含有する白血球（ＷＢＣ）画分を
得、この血液画分をインターロイΦン２　（ＩＬ−２）
とともに培養基中でインキュベートして活性化されかつ
腫瘍破壊性のリンパ球（ＬＡＫ細胞と呼ばれる）を生成
させ、そしてこのＬＡＫ細胞及び付加的なＩＬ−２を患
者に注入することが包含される。成る場合には、ＩＬ−
２は、リンパ球の生成を刺激せんがために、通液の取り
出し前Ｊｌｃ！ＩＡ者に注入される。

養子免疫療法に対する一つの反対は、それが非常に高価
であることである。それが高価である一つの理由は、Ｌ
ＡＫ細胞を生成させる現在の操作が労力を要しそして時
間がかかることである。この操作は、ミュール（νｕｕ
ｌ　）らのｒＪｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｊ　８８　：　２６５〜２
７５（１９ｆ３６）　：、　Ｌａｒｇｅ　５ｃａｌｅ　
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎｌｙｍｐｈｏ
ｋｉｎｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｋｉｌｌｅｒ　ｃｅｌ
ｌｓ　ｆｏｒ　ｕｓｅ　１ｎａｄｏｐｔｉｖｅ　ｉｍｍ
ｕｎｏｔｈｅｒａｐｙに記載されている。ミュールらに
よシ記載されているよう忙、１回の治療に十分なＬＡＫ
細胞を生成させるために約２×１０個のりンノ譬球が末
梢血液の１０回の連続したロイカフニレシス（１ａｕｋ
ａｐｈｅｒｅｓｉｓ　）により得られた。各ロイカフニ
レシスにおいて、約１０〜１２！の全血を４時間かけて
自動化細胞分離器で処理して４００〜５００ｖの白血球
の両分を得た。この両分を２部の塩溶液で希釈し、次に
５部ｍｌ容の円錐形遠心分離管（４０ｄ／管、管約６０
〜４０本）Ｋ注入しそして１０−のフイコールーハイペ
ク（Ｆｉｃｏｌｌ　−１ｉｙｐａｑｕｅ　）溶液を下に
入れた。内容物を遠心分離して、血小板忙冨む上澄み層
、リンパ球に冨む層、フイコールーハイペク層、顆粒球
場及びＲＢＣ１４１部分離させた。上澄み液を各管から
とり出して捨てた。フイコールーハイペタ上に浮いてい
るリンパ球に冨む画分を各管から敗り出し、これらの両
分を集め、塩溶液中に懸濁させそして遠心分離すること
によシ３回洗った。これらの工程が各ｐイカ７エレシス
についてｍ返されねばならないので、３００〜４００本
の管を１回の治療に取扱わねばならない。

ヘモネテイクス・コーポレーション（Ｅａｅｍｏｎｅｔ
ｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　（マｆ＋３−−セ”
）　”）州ｆレイ７’）リー（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ　）
　）は、ヘモネテイクスｖ−５０として知られている自
動化された自球分離器を市販しており、そこでは米国特
許第３，１４５，７１５号に記載されているがウルと同
様の入口２個を有する円錐形の遠心分離用ボウルが用い
られている。このｖ−５０は、標準的なロイカフニレシ
ス・プロトコールに従って又はサージ（Ｓｕｒｇｅ）リ
ンホサイトフエレシス（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｐｈｅｒ
ｅｓｉｓ　）プロトコールに従って操作できる。米国特
許第４、ａ　（５４，１６７及び４，４１４６５４号に
記載されているような後者の操作には、予め分離された
血漿を用いる間欠的なエルトリニージョン（ｅｌｕｔｒ
　１ａｔｉｏｎ　）が包含され、そして標準的ロイカフ
ニレシスにより達成されうるよりも一層精密な血小板、
蜜及びＲＢＣ画分が提供されうる。これを以下エルトリ
ニージョン・ロイカフニレジスト呼Ｊ：。

ＬＡＫ細胞を得るための操作について、ヘモネテイクス
社は、主として血小板及びＷＢＣよりなるパツフイ・コ
ート（Ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ、　）を分離するのにｖ−
５０を用い、次にこのバツフイ・コートから単核性細胞
（９７１９球及び単球）を単離するために同じ遠心分離
がクル中でのフイコールーハイペク密度勾配を用いる二
次分離を勧めている。この操作はミュールらに記載され
た標準的フィコール遠心分離よシも遥かに時間がかから
ずしかも労力を寮しないが、フィコール分離工程分のコ
ストが付加されるしそしてリンパ球の収量低下を生ずる
ので、該フィコール工程を排除するのが望まれる。しか
しＬＡＷ細胞を生成させるのに使用できる穆に十分ＩＣ
ＲＢＣ及び顆粒球を含まないリンパ球画分を得るために
はフイコ−ル分離を行うことが必須であるとこれ迄当業
者には考えられてきた。ＲＢＣ及び顆粒球はリンパ球の
活性化を不当に妨害するのではないかと考えられていた
。

フィコール密度勾配遠心分離１穆が、リンパ球活性化を
不当に妨害することなく排除できることを本発明者は見
出した。従って本発明は、全血からＲＢＣｆ除去して、
リンパ球を含みしかもＷＢＣに富んだ画分を得、そして
このＷＢＣに富んだ画分をＩＬ−２とともに培養基中で
インキュベートしてリンパ球を活性化することよりなる
、生体外でＬＡＫ細胞を生成させる方法の改良法である
。本発明は、フィコール勾配でリンパ球及び単球の層の
中間的な分離を行うことなしに、リンパ球を含みしかも
ＷＲＣＫ富んだ両分を用いることよシなる。

本発明の方法において、ＲＢＣは種々の方法で除去され
５る。これらは標準的なロイカフニレシス、エルトリニ
ージョン−ロイカフニレシス及び遠心分離（フィコール
の使用なし）が包含される。フィコールは、合成の水溶
性多糖類であって、約Ａ　ＯＯ，０００の重量平均分子
量を有しそして密度勾配の調製に広く用いられている。

それは、登録商標例えばフイコールーペク（Ｐａｑｕｅ
）・フイコールーハイペク及びフイコールーインベク（
ｌ５ｏｐａｑｕｅ　）の名の下に、それ自体及び他の物
質との混合物として入手しうる。ロイカフニレシスは、
末梢血液を患者又はドナーから取り出し、ＷＢＣＫ富ん
だ画分を分は取９、そして他の血液画分（血漿、血小板
及びＲＥＣ）　’ｉ供給者に戻す方法を指す、標準的な
遠心分離を用いてドナーからの血液を血漿、ＷＢＣに富
んだ画分及び′ＲＢｃ画分に分離し、これらを後の使用
のために貯鼠する。（以下で用いられる［パツフイ・コ
ート」なる用語は詳細には標準的な遠心分離により得ら
れたＷＢＣＫ富んだ画分を指すが、この用語は又ロイカ
フニレシスによシ得られる血小板に富みしかもＷＢＣに
富んだ両分を指すのにも画業上用いられる。） ＲＢＣを除去する種々の方法により種々の量の残存Ｅ’
ｔＢＣ及び種々の分画を有するｗＢＣＶｃ富んだ画分が
生成される。（「分画」なる用語は、ＷＥＣに富んだ画
分中のり７７４１球、単球及び顆粒球の総数に基づくこ
れら３種の細胞型の係数を指す。）種々の両分の組成は
供給源に応じて変化しよう。

例えば、ＩＬ−２を注入されていた患者は、非常に高い
数のリンパ球を有しよう。種々の方法により得られる’
ＷＢＣに富んだ画分に関する代表的な範囲を、全血につ
いての代表的な範囲と比較して下記の表に示す。

上述の表から、本発明で使用しうるり７７４球を含みし
かもＷＢＣＫ富んだ画分は、約１２〜約３００　ノＲＢ
Ｃ／ＷＢＣ比そして約１４〜約５０４の顆粒球含量を有
することが分る。実際問題として、パツフイ・コートは
、患者がＬＡＫ細胞を生成させうるかどうかを判定する
スクリーニングに主として用いられよう。養子免疫療法
に用いられるＬＡＫ細胞を生成させるＫは、約１〜２゜
嗟の旧ＢＣ容量係及び約ｃＬ２〜２５０のＲＢＣ／ＷＢ
Ｃの比を有するロイカフニレシス生成物が好ましい。

現在のところ、エルトリニージョン・ロイカフニレシス
生成物を用いるのが好ましい、何故ならこのものはＲＢ
Ｃ及び顆粒球の両方の含量においてフィコールで分離さ
れた生成物とよシ近似しておりそれ故恐らく当業者によ
り比較的容易に受は入れられると思われるからである。

さらに、エルトリニージョン・ロイカフニレシス生成物
は、ルーチン法基準で標準的なロイカフニレシス生成物
よシもやや高い細胞密度（例えばＩ　Ｘ　１　（３７／
ａＪ　ｔたはそれ以上）で培養されうると思われる。上
述の表から、エルトリニージョン・ロイカフニレシス生
成物は、代表的には約ｃＬ２〜約５０のＦＩＢＣ／９Ｖ
ＢＣ比、約１〜６　（７）　ＲＰＣ容量係及び１〜５の
顆粒球含量を有することが分る。より代表的な範囲は、
ＥｔＢＣ／ＷＢＣ比約０．５〜２５及びＩ’ｌＢＣ容量
憾約容量通約２〜４標準的なロイカッニレシスは、ヘモ
ネテイクス、フェンウオール（Ｆｅｎｗｏｌｌ　）及び
コープ（Ｃｏｂｅ）を含む種々の製造者から市販されて
いる装置を用い、そして製造者の指示に従って行われう
る。

エルトリニージョン・ロイカッニレシスヲ行つのく現在
入手しうる唯一の装置は、ヘモネテイクスｖ−５０であ
る。米国特許第４，４６４，１６７及び４．４１６，６
５４号の教示又はヘモネテイクスにより提供される指示
に従ってとのｖ−５０を、１’ｌＢＣ及び顆粒球含量の
低い、ＷＢＣＫ冨んだ画分を得るのに用いることができ
る。

ＷＢＣに富んだ画分の単球含量は、ロイカフニレシス生
成物をＬ−アミノ酸低級アルキルエステル又はその塩酸
塩例えばフェニルアラニン、グルタミン酸、グルタミン
又はチロシンのメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル又はｔ−ブチルエステルで処ｍ
−ｔ−ることＫより表に示された数値よシ下まで低下さ
せることができる。フェニルアラニンメチルエステルが
好ましい、これ以上の詳細は、下記の実施例に示される
。

ＩＬ−２と一緒のインキュベーションによるリン／ぐ球
の活性化は、従来の技術と同じやり方で本発明において
達成される。容器例えば従来のフラスコ及びローラー瓶
が用いられうるが、好ましい容器は、可撓性の共重合体
状フィルム材料から製造された（Ｌ２〜５！容の組織培
養バッグである。最も好ましいものは、９７モル係のエ
チレン及び１−オクテンの共重合体から製造されたバッ
グである。任意の好適な培養基が用いられうるが、好ま
しい培養基は、血清を補給されたＲＰＭＩ　１６４０　
（１’　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１
ｌｓ　ｊ、フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ　）、７
２〜７３、アラン・アール・リス（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ
５ｓ　）インコーホレーテッド、ニューヨーク、に記載
〕である。エルトリニージョン・ロイカフニレシス生成
物については細胞的ｌＸ１０’／１１１７までの当初の
細胞濃度が用いられ、そして標準的ロイカフニレシス生
成物では細胞的ｌＸ１０７個／継までが用いられうる。

経済的な理由で少くとも細胞１　ｘ　１０６／ｍｌの濃
度が用いられるべきである。好ましい範囲は、工ルトリ
エーション番ロイカフニレシス生成物については細胞５
Ｘ１０６〜１Ｑ７／Ｘ／でありセして１ｉＪ′ｓ的ロイ
カフニレシス生成物については細胞１〜５×１０６〜で
あろう。細胞は約３５〜３９℃好ましくは３７℃で約２
〜７日間好ましくは約２〜７日間工Ｌ−２とともにイン
キエペートされる。

本明細書で用いられる［インターロイキン−２Ｊ　（Ｉ
Ｌ−２）はヒトＩＩ、−２を意味する。このものには天
然及び組換えＩＬ−２ＣｒｘＬ−２）及びその生物学的
機能等価物、例えば米国特許第４．５１８，５８４号に
開示されたｒＩＬ−２ムテインが包含される。ＸＬ−２
は米国特許出顧第８２５．１５５号（１９８６年１月３
１日出願）に記載される主として水、ｒＩＬ−２および
場合によシポリオールよシなるｒＩＬ−２組成物が好ま
しい。培養基中のＭＬ−２濃度は約５Ｘ１０２〜約５Ｘ
１０４ｐＭが好ましく、最も好ましくは１０００〜２０
００　ｐＭの範囲である。

本発明の方法により製造されたＬＡＫ細胞は、製薬上許
容しうる担体例えば食塩水、５壬正常ヒト血清アルブミ
ンを含有する食塩水又はハンクスの平衡塩類溶液に懸濁
して、腫瘍患者に注入できる組成物となされうる。患者
は、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ　）らのｒ　
Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｓ　Ｊ　３１３　、１４８５〜１４９２
（１９８５）によシ記載されるようにしてｒＸＬ−２で
同時治療される。この態様においては、患者の血液を取
り出し、ロイカフニレシスにかけ、採取した細胞を直ち
に６日間培養してＬＡＫ細胞を生成させる０次にＬＡＸ
細胞を、９！１者に注入する。

代表的には、約３Ｘ１０１０〜１４Ｘ１０１０個のＬＡ
Ｋ細胞が４〜９回注入される。インターロイキン−２は
、体重１ｋｇ当り１０，０００．３０，０００又！ｔ　
１０ＣＬＤＯＯ単位のような投与量で８時間毎に投与さ
れる。

この治療は、ロイカフニレシス及び再注入からなる２週
間療法および一般に第三週から始まる繰返しよりなる。

組換え工Ｌ−２がこのＬＡＫ細旭組成物に含まれうる。

細胞毒性（ＬＡＫ）アッセイ 以下の実施例において、別に記載がない限シ、４時間の
５１０ｒ放出アツセイを用いて腫瘍細胞に対するＬＡＫ
細胞の細胞毒性を測定した（　ＬＡＫ活性）、１１当り
約２Ｘ１０”〜１０ｘ１０ｓの濃度の重瘍細胞を、トリ
ス−燐酸塩緩衝食塩水Ｑ、４′Ｒｔ中で１００加１のＮ
ａ２５１Ｃｒ０４と３７℃で１時間インキュベーション
した。この細胞を５優又は１０チのウシ胎児血清（Ｆｅ
２）を含有するＲＰＭ１１６４０で３回洗い、セしてＲ
ＭＰニー　２０％ＰＣＢ又はＢＰＭニー１０俤ＦＣ８中
細胞１０５個／ｄＫ再懸濁した。エフェクター細胞（Ｌ
ＡＫＭ胞）を種々の濃度で懸濁して、その１１紅を丸底
ミクロ滴定プレートのつ、エルに加えた。５１Ｃｒでラ
ベルした標的細胞（１１ｍｌ）をすべてのウェルに加え
た。６７℃で４時間インキュベーション後、プレートを
遠心分離しそして得られた上澄み液Ｑ、ＩＭを各ウェル
から取り出してがンマ計数計で計測した。

細胞溶解係は下記の式から計算する。

各数値は３回検査し、得られたデータを細胞溶解嗟とし
て表わす。この細胞毒性試験は、（５ｅｌｅｃｔａｄ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ　Ｊミシエル（Ｍｉａｈｓｌｌ　）及びシイ
ギ（Ｓｈｉｉｇｉ　）編、１２４〜１３７、Ｗ、Ｅ、フ
リーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ　）アンド・カフＪ４ニー、
サンフランシスコ（１９８０）、Ｋ詳細に記載されてい
る。

他の実験においては、アッセイの結果は［溶解単位Ｊ　
（ＬＵ又はＬＵ３０）として表わされる。

これはＬＡＫ　＠胞と標的細胞とを一緒にして３７℃で
４時間インキエペートシ九場合に標的細胞の３０１Ｇが
殺された場合の工７エター細Ｊ＠１００轟シの標的細胞
の数である。　ＬＵの計算は、ゾロス（Ｐｒｏｓｅ）ら
のｒ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａ１Ｍ＠ｔｈｏｄｓ　Ｊ　６８．２５５〜２４９（１９
８４）記載の方法に基づく、ＬＵの数が大きくなればな
るａｌｌ、１．ＡＫ細胞調製物の効力が大きい。

本明細書に引用されたすべての特許及び他の印刷された
刊行物は、参考として本明細書に組み入れられ、特にエ
ルトリエータ１フ分離物として予め分離されたＩｈｉ秦
を用いるエルトリニージョン・ロイカフニレシスによる
ＷＢＣＫ富んだ両分の生成に関する米国特許第４，４６
４．１６７及び４．４１４６５４号の記述がそうである
。

実施例　１ 目的： １）白血球を得るためにエルトリニージョン法を用いる
ヘモネテイクスｖ５０から得られた細胞のＬＡＫ活性を
研究するため。

２）ヘモネテイクスＶ５０エルトリニージョン法で得ら
れた細胞のＬＡＫ活性に及ぼすフェニルアラニンメチル
エステル（φＡｌａ　）処理及びフィコール処理の効果
を研究するため。

細胞：ヒトリンＩ＃球（ｖ５０エルトリニージョン法を
用いるヘモネテイクス・コーポレーションから入手）、
ラジ（Ｒａｊ　ｉ　）細胞。

材料： １）細胞培養基（ＣＣＭ）　＝　１０％ＦＢＳ％Ｌ−グ
ルタミン及びゲンタマイシンを添加した１’ｔＰＭ１１
６４０゜ ２）燐醗塩緩衝された食塩水（ＰＥＳ）　１　ｘ　（Ｃ
ａ＋＋及びＭｇ＋＋なし）。

３）フィコール・ハイペク（フィコール）４）φＡｌａ ５）　　ＷＢＣ計測のためのウノペット（Ｕｎｏｐｅｔ
ｔａ　）（登録商標） ６）細胞培養用のエチレンブテン共重合体バッグ ７）Ｔ２５組織培養フラスコ ８）１１６ＮＰ４０ ９）２Ｘ’Ｉ’Ｄ緩衝液 １０）　　５１Ｃｒ　（クロム醗ナトリウムとして）１
１）組換えインターロイキン−２，１５Ｍグルコース中
１０単位／ｉｌ　（ＩＬ−２）１２）９６ウ工ル丸底組
織培養プレート１３）　　８Ｃ８採取システム（スカト
ロン（Ｓｋａｔｒｏｎ））１４）ペックマン・ガンマ・
４０００・カウンター１５）トリパン・ブルー 操作： Ａ）細胞の調製 １）米国特許１１ｇ４，４１６，６５４及び４，４６４
，１６７号に記載のエルトリニージョン操作を用いて合
計２５０−の白血球画分をヘモネテイクスｖ５０から集
めた。

２）　　ＷＢＣ数をウノペットを用いて計測した。この
画分はＷＢＣ１，３６Ｘ１０７個／酊を含有しテオシそ
して約３容量係のＲＢＣを含有すると推定された。

３）細胞を次にＷＢＣＩＸ１０７個／紅の濃度にした（
全容量＝３４０ｍＪ）。

４）細胞４０威は直接培養Ｋかけた（下記参照）。

５）残シの３００ゴをφＡｌｌで処理した（下記参照）
。

Ｂ）φＡ１５Ｌ処理 １）　　Ｔ１５０フラスコに細胞３００Ｍを入れる。

２）細胞＆Ｃ３０紅のφＡｌａを加える。

５）十分に混合する（穏やかＫ）。

４）　４０分間室温でインキユベートする。

５）インキエペーション後、血液を１６５Ｍずつに部分
する。

ａ）部分１を培養する。

ｂ）部分２の下にフィコールを入れ（下記参照）次に培
養する。

Ｃ）培養の実施 １）　　Ｖ２Ｏから直接の細胞（フィコールなし：φＡ
ｌａなし） ａ）細胞４０１１ｊを５０Ｗ１を容の遠心分離管に入れ
る。

ｂ）　　１２０Ｏｒｐｍで１０分間細胞を遠心分離する
。

Ｃ）上澄みを捨てる。

ｄ）　　ＣＣＭＫ細胞を再懸濁して総量ａｏｉｕとする
。

ｅ）所望量の細胞をＴ２５フラスコに入れる。

ｆ）　　ＣＣＭをフラスコに加えて白血球を所望の濃度
とする。

ｇ）５μｔのＩＬ−２を各フラスコに加える（最終濃度
１０単位／履Ｂ。

ｈ）５％の００２ととも［３７℃のインキュベーター中
にフラスコを置く。

細胞１Ｍ　　　細胞５　ｍｌ　　　　細胞１０１１７培
地９　Ｒｅ、　（ＣＣＭ）　　培地５　ｍｌ　（ＣＣＭ
）　　ＩＬ−２５ｔｔＬＩＬ−２５μｔ　　　　　ＩＬ
−２５μｔ２）部分１→Ｖ５０からの細胞（φＡｌａあ
り；フィコールなし） ａ）１６５！ｊのφＡｌａ処理細胞を２５０１容の遠心
分離管に入れる。

ｂ）　　１２００　ｒｐｍで１０分間遠心分離する。

Ｃ）上澄みを捨てる。

ｄ）５０１！ｊのＣＣＪｌｌに細胞を再懸濁する。

ｅ）ウノペットを用いて細胞の計測を行い、ＷＢＣＯ数
ハ１１１１Ｊ当り１．９Ｘ１０７であった。

ｆ）所望の細胞濃度に応じてバッグ及び７ラスコ中に培
養物を入れる。

ｇ）５％のＣＯ２とともＶＣ３７℃のインキュベーター
に培養物を置く。

２種の培養物の調製： Ｔ２５７？ス：７　　細胞５Ｘ１０’／１１４バツグ　
　　　細胞９×１０６／ＩＬｔ３）部分２→ｖ５０から
の細胞（φＡｌ＆及びフィコールあり） ａ）４０ｉｕのφＡｌ＆処理細胞をＡ〜５０１１１１ｊ
容遠心分離管に入れる。

ｂ）血液の下に１０１１ｊのフィコールを入れる。

ｃ）１９００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。

ｄ）滅菌Ｉ９スツールピペットで界面の層を集めそして
細胞を滅菌した５ｏＷｊ容遠心分離管に入れる。

ｅ）　　ＰＦ３を用いて管中の容量を５０ｄにする。

ｆ）　　１２０　Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離する。

ｇ）上澄みを捨てる。

ｈ）５０ａｕの００Ｍ中にベレットを再懸濁する。

１）１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。

ｊ）５νの００Ｍ中に再懸濁する。

１０ト１７／＃ンブルーを用いて細胞の計測を行い、次
に １）所望の細胞濃度に応じてバッグ及びフラスコに培養
物を調製する。

ｍ）ｓ＊のＣＯ２とともに５７℃のインキュベーターに
培養物を置く。

註：界面の層が工程３の後では生じなかった。

そのため細胞を再懸濁し、再びフィコールを下に入れそ
して再び遠心分離し念。この後、界面における細胞を集
めた。

３種の培養物の調製： Ｔ２５７うｘ＝＋　　　細胞５　Ｘ　Ｉ　Ｑ６／ＭＴ２
５フラスコ　　細胞１０×１０６７′ＩＬｔバツグ　　
　　　細胞１．９Ｘ１０’、屓Ｄ）　　ＬＡＫアッセイ 前記操作に従って細胞を４日間培養した後に、ＬＡＫア
ッセイを行った。

註：試料に含まれた赤血球が過剰なため、ＬＡＫアッセ
イ前に３種の試料を溶解緩衝液によシ処理し九。

溶解溶液：塩化アンモニウム０．８１ 蒸留Ｈ２ｏ　　２００プ １）１０１１１１ｊの溶解溶液中に細胞ペレットを再懸
濁する。

２）室温で２０分間インキュベートする。

５）１２０　Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離する。

４）上澄みを捨てる。

５）　１１のＣＣＭに再懸濁する。

６）細胞の計測を行う。

７）　　ＬＡＫアッセイ法に記載されるＥ：Ｔ比に調整
する。

データ Ｖ２Ｏから直接　　６Ｂ　　　１．３６ｘ１０’　　　
３．ａｘ１０’／２５０ｍｇφＡｌａ後　　９７　１．
９Ｘ１０７　９．７Ｘ１０Ｓ１５０１ｔＬｌφＡ１５Ｌ
及び　　３４４　　＆８ｘ１０７　　３．４ｘ１０８１
５ｒ！Ｌｌフイコール後 φＡｌ＆Ａｌ用の細胞の調製（全細胞を細胞ｌＸ１０７
）ｊとする） Ｃ’ＣＭ９０ＲＪ ４０紅を採りそして培養にかける。

残りの細胞に３０１のφＡｌａを加えそして室温で４０
分間インキュベートする。

Ｖ２Ｏから直接 培地３９．７６０　ｒｎｌ ＊　ＬＡＫアッセイ前溶前浴解溶液り処理された試料 Ｆウメイツト９法を用いて計測された試料４日−５’Ｃ
ｒ放出データ 最大部）放出＝２［１１１自然発生的放出＝Ａ６５　　
２１．０悌２２１５　　　　　　　　　　　Ａ６９　　
７１．３４平均＝２１９６ｃｐｍ　　　　　平均＝　５
０２ｃｐｍ　　２２．８’１Ｖ５０から直接の細胞−φ
Ａｌａなし、フィコールなし２［］：］１１［］］１　
　ｉ、１　１１０２　３５．４　１２２２　４２．５９
７８　２ａｌ　　１１４３　３７．９　１１５７　５５
．２１０（Ｓ８　３′５．、！ｌ　　１１．ｌ！２　３
７．８　１３２１　４ａ４平均　３０．５　平均　！、
７．０　　平均　４ａ７１０：１　８２１　１＆９　７
５２　１４．８　１０１４　１．２７３６１五８　８６
１　２１．２　１０７２　３五７７５８　１５．１　８
６１　２１．２　１３６１　５０．７平均　１５．９　
平均　１９１　平均　３＆２５：１　６１３　６．６　
７５７１５．１　　９０７　２ｉ９６３８　　＆０　７
１９　１２．８　８７４　２２．０５９１　５．３　７
４７　１４．５　８１５　１ａ５平均　　６．６平均　
１４．１　　平均　２１．５２．５：１　５１２　　Ｇ
、６　６３５　７．９　５８４　４．９５４８　２．７
　６９９　１１．６６２９　７．５４９５−０．４　５
９２　５．３　１０１２　３０．１平均　　１．０平均
　　＆６　平均　１４．２φＡｌａあり、フィコールな
し フラスコ５×１０６　　パアグ９ＸＩＣ１６２０：１　
　８３８　　　ｊ９．９　　　　６７０　　　　９．９
７１６１２．７　　　　９６２　　　２７．２７２７　
　１＋、３　　　１１５８　　　３ａ７平均　１５．６
　　　平均　　２５．５ｉ０：１　　６２４　　７．２
　　　　８１１　　　１８．３５５０　　２．９　　　
　７２３　　　１ｉ１６３６　　７．９　　　　７６４
１５．５平均　６．０　　　平均　　１５．６ ５：ｊ　　５．！１１　　２．３　　　７１９　　１２
．８５０６　　　０、ろ　　　　　　　７１ろ　　　　
　１２．５６５４　９．０　　　８２２　　１ａ９平均
　３．９　　　平均　　１４．７ ２．５：１　４７６　１．５　　　７［］９　　１２．
２４８８−０．８　　　７１３　　１２．５．１０５　
−５．７　　　７２７　　１１３平均　−２，７平均　
　１２．７ φＡｌａあり、フィコールなし フラスコｌＸ１０６　　フラスコ５Ｘ１０６　　フラス
コｌＸ１０７希釈度　ＣＰＭ解％　　　ＣＰＭ　　解Ｉ
　　　ＣＰＭ　　解憾２０：１　１０３０　３１．２　
１２３９　４′！Ａ、５　　１４９８　　５ａ８１０１
０　３Ｑ、０　１２００　４１．２　　１２２７　　４
２．８１０６９　３五５　１２８８　　ｄ６．Ａ　　　
１１８７　　．１１０．５平均３１．６　　平均４五７
　平均　４１４１０：１　７６９１５．８　９８２　２
＆４　１１２５　３６．８７８１１６．５　９９９　２
９．４　１１８８　４Ｑ、５７４５１４．４　９３９　
２５．８　１２６１　４４．８平均１５．５　　平均２
７．８　　平均　４α７５：１　６２３　７．２　　Ｂ
７６　２２．１　１１２７　３６．９６２１　７．２　
７５５　１５．０　９５３　２１ｂ６６７６１Ｑ、３　
７５９　１５．２　１３２６　４ａ７平均　ａ２　　平
均１７．４　　平均　３７．４２．５：１　４２２−４
．７　６２７　７．４　９８３　１４４６４−２．２　
５５６　３．２　９４０　２５．９４２６−４．５　５
６３　３．７　８９４　２五２平均−五８　平均　４．
８　　平均　２５８実施例　２ プロトコール：下記フローチャートにより本実施Ｆ＝Ｔ
−２５フラスコ Ｂ＝培養バッグ 操作： Ａ）細胞の分離 １）細胞をヘモネテイクスＶ−５０でのエルトリニージ
ョン法により集めた。

２）細胞の計測を行った。＝細胞１，３ｘ１０７／ｍε
（４４２紅中）。総細胞数５．８Ｘ１ｎ９゜３）細胞を
処理のため部分した。

Ｂ）　　ＬＡＢフィコール １）２２１１１ｔの細胞をＰＥ８と混合しそしてフィコ
ール上に置いた。

２）２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。

３）次に細胞を洗滌しそして計測した。

細胞２５６（生存能力あり） 生存可能性９９憾 生存能力のない細胞１ 細胞５．ｌＸ１０８β１ ２Ｘ１０９７４０ｍ ４）　　ｌＸ１０’でＬＡＫのための培養用に細胞を調
製する。

サンプル　望ましい ニードナ　濃度　　計算　細胞１＋培地ｍＪ＋ＩＬ−２
１Ｌｔφ４　　１Ｘ１０６　１Ｘ１０”１ ５、ｌＸ１０’Ｘ１０＝０．２ｍｌ＋９．８ｍｔ＋５μ
１５）これらフィコールに重ねた細胞の残りをφＡｌａ
用に調製した。

ａ）　　ＶＩＣ１＝Ｖ２Ｃ２ （４０＋ｔＺ）（５，ｌＸ１０７）＝Ｖ２（ｌＸ１０７
）φ合計１＝Ｖ７　＝２００１１Ｚ す培地威＝Ｖ２−Ｖ１　＝　１６０ ΦφＡ１ａ　ｍｊ＝Ｖ＋／９＝２００／９＝φＡｌａ　
２２．２ｒｎｌｂ）　４０分間インキエベートし次に洗
滌する。

Ｃ）細胞の計測を行いそしてＬＡＫ用の培養物に細胞を
入れる。

生存能力のある細胞＝２２９ 生存能力なし＝６ 生存可能性９９７係 細胞／ｍ／＝４．６×１０７ ｄ）培養用に細胞を調製する。

サンプルコードナ望ましい濃度　細胞ｒｎｔ＋培地ｍ？
＋ＩＬ−２μｔ＋１　　　　　１ＸｌＸ１０６ａ２０＋
９．８ｍｇ＋５μｔ＄２　　　　　５Ｘ１０’ｉ　　　
１１９ｍｇ＋８９．１１１１＋５０μｚす３　　　　　
　１ｘ１０’　　　２１．８ｍ／＋７ａ２ｍｚ＋５０μ
／。

Ｃ）　　Ｖ−５０から直接ノＬＡＫ １）細胞の後半分をこのとき用いた。ＩＸｌ［１６，５
Ｘ１０６及びｌＸ１０７の濃度で培養するのに必要な細
胞鎗を用い、残りの細胞を希釈しそしてフェニルアラニ
ンメチルエステルで処理した。

サンプルニードナ　望ましい濃度　細胞ｍｅ十培地ｙ＋
　ＩＬ−２ｌＬｔす５　　　１ｘ１０６　　　［Ｌ７６
μ＋９．２１１１Ｊ＋５μｔ＄６　　　　５Ｘ１０６　
　　　五ｑｍｔ＋　６．１　ｍｔ＋　ｓ　ｏμｔ＋　７
　　　　１　Ｘｌ　０７　　　　スフｍｌ＋　２．３ｒ
ｕｉ＋　５０　ａｌネナ７Ａ　　　　ＩＸｌ　０７　　
１７ｍ１＋２．５ｕｌ＋５０ｔｔＬ傘１０１サンプル−
遠心分離−血漿５　ｒｐｔｌ除去：培地５　ｍｌ添加。

細胞をｌＸ１０７に希釈。

Ｄ）フィコールなしのφＡｌａ はじめにフィコールでの分離を行うことのないφＡｌａ
処理細胞 ＣＩＶｉ　＝　Ｃ２Ｖ２ （２００ｄ）　（１，２ｘｌ　０’　）＝（ｋｌ（１ｘ
１０’）＝ｘ＝２６０す培地ｒ！Ｌン＝６０虹 すφＡｌａ酊＝２９１ ４０分間インキュベート。

洗滌。

細胞の計測を行いそして培養物を調製する。

生存能力あり　２４０ 生存可能性係　９６％ 細胞／　ｍｌ＝　４．８　Ｘ　１０７ 合計＝　１．９Ｘ１０９／ＡＯＩＩＩどサンプルコード
ナ望ましい濃度　細胞紅＋培地ｍｌ＋　ＩＬ−２μｔ＋
　　８　　　　１Ｘ１０６０．２ｒｎｌ＋９．８ｍｌ＋
５ｐｔ。

ナ　　９　　　　　　５Ｘ１　０６　　　　１　Ｃ１，
Ａｍｔ＋８９．６ｍ／＋５０ｔｔｌ。

Φ１０　　　　１Ｘ１０７　　２０．３ｍ１−７２．２
ｍｌ＋５０μｔすべての培養物を３７℃及び５４７　Ｃ
Ｏ２で６日間インキュベートした。ＬＡＫ−５’Ｃｒ放
出を検べた。

下記の表において、４　ＲＥＬは放出係を意味し、それ
は上記で説明したようにして計算された細胞溶解係と同
じである。Ｅ：Ｔはエフェクター（ＬＡＫ）細胞対標的
（腫瘍）細胞の比を意味する。

細胞の計測はすべての培養物について行われた。

生存能　生存能　生存可 サンプル　力あり　力なし　能性憾　　　合　計Ａ　　
　　　　３ろ　　　　　４　　　　８Ｂ　　　　　　＆
５ｘ１０６／ＩＬｔＢ　　　　　９９　　　８　　　９
３　　　２．０ｘ１０８／１０ｙＪｃ　　　　　２３６
　　１７　　　９３　　　４．７Ｘ１０８／１０ｇ／Ｄ
　　　　　　７　　　０　　１００　　　１．４ｘ１０
６／）＋ｔＪ”Ｅ　　　　　２２　　　１　　　９６　
　　４．４Ｘ１０６／ｘｊＦ　　　　　４５　　　５　
　　９１　　　１．８ｘ１０’／２紅ａ　　　　　３８
　　　　Ａ　　　　９０　　　７．６ｘ１０６．々ｊＨ
７５６９５１，５ｘ１０８／１０ｙｉｌＪ　　　　　１
４１　　　１５　　　９０　　　２．８Ｘ１０８／１０
ＭＫ　　　　　３１　　　４　　　８９　　　６．２Ｘ
１０６／ｄ生存能　生存能　生存可 サンプル　カあり　力なし　能性係　　　合　計Φ１　
　　　３４　　　１　　　９７　　６．８Ｘ１０６／虹
２　　　　１６２　　　８　　　９５　　　五２ｘ１０
８／１０肩ｅ３　　　３７５　　２０　　　９４　　７
．５ｘ１０’／１０紅ｄ　　　　　４１　　　２　　　
９５　　　ａ１ｘ１０６／ｍ？５　　　　２７　　　２
　　　９３　　５．４ｘ１０６／ｍｚ６　　　　４３　
　　１　　　９８　　１．７ｘ１０’／２ｍＪ７　　　
１２１　　１７　　　８Ｂ　　　４．８ｘ１０７／２ｄ
７Ａ　　　　１４９　　　９　　　９４　　６．Ｏｘ１
０７７２ｍ１８　　　　５０　　　０　　　１００　　
　ｌＸ１０７７ｍ９　　　１１３　　　５　　　９６　
　２．３Ｘ１０’／１０１１ｔ１０　　　４２４　　４
７　　　９０　　　ａ５ｘ１０ｂ／１０ｍ１ＩＥは遠心
分離後密なフィブリン凝塊を有した。

ラジ腫瘍細胞が標的として調製された。生存可能性は、
五６Ｘ１　（１５ｄの濃度で１００係であった。

Ｌａｂフィコール−φＡｌａあ秒 φ１（ＩＸ１０’） Ｅ：Ｔ　　　　　　　　　ＣＰＭ　　　　　　　　係Ｆ
ＩＥＬ２０　　　　　　　　５００　　　　　　　５９
．０６２０　　　　　　　　５０１　　　　　　　５９
．２３２０　　　　　　　　４７０　　　　　　　５４
．０３１０　　　　　　　　　３７７　　　　　　　３
＆４２１０　　　　　　　　３７２　　　　　　　５７
．５８１０　　　　　　　　５２６　　　　　　２９．
８７５　　　　　　　　２３３　　　　　　１４．２６
５　　　　　　　　２８８　　　　　　　２五４９５　
　　　　　　　２５３　　　　　　　１７．６２２．５
　　　　　　　１９７　　　　　　　　ＥＬ２２２．５
　　　　　　　１９８　　　　　　　　ａ５９２．５　
　　　　　　１９６　　　　　　　　ａ０５φ２（５Ｘ
１０４） Ｅ：Ｔ　　　　　　　　ＣＰＭ　　　　　　　　係ＥＥ
Ｌ２０　　　　　　　　　６０７　　　　　　　７７．
０１２０　　　　　　　　４７８　　　　　　５５．３
７２０　　　　　　　　４８０　　　　　　５５．７０
１０　　　　　　　　４７１　　　　　　５４．１９１
０　　　　　　　　　５２７　　　　　　　６五５９１
０　　　　　　　　５１２　　　　　　６１．０７Ｅ：
Ｔ　　　　　　　　Ｃ！ＰＭ　　　　　　　４ＲＥＬ５
　　　　　　　　３８３　　　　　　３９．４５５　　
　　　　　　３１７　　　　　　２ａ３６５　　　　　
　　　　３９３　　　　　　４１．１１２．５　　　　
　　　３５Ｂ　　　　　　　３１．８８２．５　　　　
　　　２７１　　　　　　２０．６４２．５　　　　　
　　　２４２　　　　　　１５．７７÷３（ＩＸ１０７
） Ｅ：Ｔ　　　　　　　　　ＣＰＭ　　　　　　　俤ＦＩ
ＥＬ２０　　　　　　　　　６０３　　　　　　　７６
．３４２０　　　　　　　　６４７　　　　　　８五７
２２０　　　　　　　　５７１　　　　　　７［Ｌ９７
１０　　　　　　　　　５４６　　　　　　　６＆７８
’１０　　　　　　　４０８　　　　　４Ａ６２１０　
　　　　　　　４０５　　　　　　４五１２５　　　　
　　　　　３５１　　　　　　　３４．０６５　　　　
　　　　　５３３　　　　　　　３１．０１４５　　　
　　　　　３２４　　　　　　２９．５３２．５　　　
　　　　２６５　　　　　　１９．６３２．５　　　　
　　　２１７　　　　　　１１．５８２．５　　　　　
　　２７１　　　　　　２０．６１１Ｓ’ｒＤ　フィコ
ールあシーφＡｌａなしφ４（１ｘ１ｏ６） ２０　　　　　　５６５　　　　６９．９７２０　　　
　　　５２９　　　　６２．４２１０　　　　　　４８
３　　　　５＆２１１０　　　　　　４００　　　　４
２．２８１０　　　　　　４６２　　　　５２．６８５
　　　　　　２７６　　　　２１．４８５　　　　　　
２５５　　　　１７．９５５　　　　　　２９１　　　
　２五９９２．５　　　　　２８８　　　　２五４９２
．５　　　　　２６５　　　　１９．３０２．５　　　
　　２５５　　　　１４．６０エルトリニージョン−フ
ィコールもφＡ１１ｌ　４　ｆｘ　Ｌφ５（ＩＸ１０６
） ２０　　　　　　５８８　　　　　７五８３２０　　　
　　　４９５　　　　　５ａ３９２０　　　　　　４６
６　　　　　５五３６１０　　　　　　３０５　　　　
２６．５４】）：二ＴＣＰＭジ暖−ＥＥＬ １０　　　　　　　　　２９６　　　　　　２４．８３
１０　　　　　　　　　３３９　　　　　　　３２．０
５５　　　　　　　　　２Ｂ５　　　　　　２２．９９
５　　　　　　　　　２８１　　　　　　　２２．３２
５　　　　　　　　　２２８　　　　　　　１五４２２
．５　　　　　　　　２１１　　　　　　　１０．５７
２．５　　　　　　　２２９　　　　　　１五５９２．
５　　　　　　　　２５７　　　　　　　１４．９３φ
６（５Ｘ１０６） ２０　　　　　　　　７５９　　　　　　１０２．５２
２０　　　　　　　　　６２６　　　　　　　８Ｑ、２
０２０　　　　　　　　　５１２　　　　　　　６１．
０７ＩＱ　　　　　　　　　５ｍ３　　　　　　　６６
．２８１０　　　　　　　　　５３３　　　　　　　６
４．６０１０　　　　　　　　５２１　　　　　　　６
２．５８５　　　　　　　　３７５　　　　　　　３７
、７５５　　　　　　　　４７４　　　　　　　５４．
７０５　　　　　　　　４０Ｂ　　　　　　　　４３．
６２２．５　　　　　　　２２４　　　　　　１２．７
５２．５　　　　　　　　３　Ａ　１　　　　　　　３
２．３　Ｂ２．５　　　　　　　２６６　　　　　　　
１９．８０÷７（ＩＸ１０７） ２０　　　　　　　　　　３１４　　　　　　　２７．
８５２０　　　　　　　　　　２８８　　　　　　　２
３．４９２０　　　　　　　　　３１２　　　　　　２
７．５２ｊ０　　　　　　　　　　２０３　　　　　　
　９．２３１０　　　　　　　　　１８６　　　　　　
　　＆３８１０　　　　　　　　　２０６　　　　　　
　　９．７３５　　　　　　　　　１８７　　　　　　
　６．５４５　　　　　　　　　１Ｂ５　　　　　　　
６．２１５　　　　　　　　　　１７７　　　　　　　
　４．８７２．５　　　　　　　　　Ｉ５７　　　　　
　　１．５１２．５　　　　　　　　１９０　　　　　
　　７．０５２．５　　　　　　　　１６７　　　　　
　　　五１９す７Ａ（ＩＸ１０７） ２０　　　　　　　　　４Ｂ１　　　　　　５５．８７
２０　　　　　　　　　３０８　　　　　　２６．８５
２０　　　　　　　　　２９７　　　　　　２５．００
１０　　　　　　　　　２．１９　　　　　　１＆９５
１０　　　　　　　　　２Ｂ１　　　　　　２２．３２
１０　　　　　　　　　２５２　　　　　　１７．４５
５　　　　　　　　　１９７　　　　　　　　ａ２２Ｅ
：Ｔ　　　　　　　　　Ｃ”ＰＭ　　　　　　　チＲＥ
Ｌ５　　　　　　　　１４４　　　　　　−０．６７５
　　　　　　　　１６７　　　　　　　五１９２．５　
　　　　　　　１’＋０　　　　　　　２．［］Ｉ１．
５　　　　　　　１９７　　　　　　　　ＥＬ２２２．
５　　　　　　　　１６４　　　　　　　２．６８エル
トリニージョン−φＡｌａあり、フィコールなし÷８（
ＩＸ１０６） Ｅ：Ｔ　　　　　　ＣＰＭ　　　　　％ＲＥＬ２０　　
　　　　５９２　　　　７４．５０２０　　　　　　５
７４７１、［Ｉ ２０　　　　　　　、ｉ　６３　　　　５２．８５１０
　　　　　　３７７　　　　３ａ４２１０　　　　　　
４５８　　　　４ａ６６１０　　　　　　４２５　　　
　　Ｉ６．４Ｂ５　　　　　　２５７　　　　１ａ２９
５　　　　　　２２８　　　　１ｉ４２５　　　　　　
４３１　　　　４７、　、！１Ｂ２．５　　　　　　２
０７　　　　　９．９０２．５　　　　　　２１７　　
　　１１．５８２．５　　　　　　２１１　　　　１０
．５７す９（５Ｘ１０６） ２０　　　　　　　　　６８７　　　　　　９０、ＡＡ
２０　　　　　　　　　５７３　　　　　　７１．３１
２０　　　　　　　　５９８　　　　　　７５．５０１
０　　　　　　　　　６３６　　　　　　８１．８８１
０　　　　　　　　　６０９　　　　　　７７．３５１
０　　　　　　　　　６Ａ７　　　　　　８五７２５　
　　　　　　　　２５５　　　　　　１７．９５５　　
　　　　　　２８４　　　　　　２２．８２５　　　　
　　　　　５５２　　　　　　３４．２３２．５　　　
　　　　２６．！ｌ　　　　　　　１９．４６２．５　
　　　　　　　５４６　　　　　　３５．２２２．５　
　　　　　　　　′５１５　　　　　　２＆０２÷１０
（１ｘ１０７） Ｅ：Ｔ　　　　　　　　ＣＰＭ　　　　　　　％ＦＩＥ
Ｌ２０　　　　　　　　５７２　　　　　　７１．１＆
２０　　　　　　　　５８６　　　　　　７五４９２０
　　　　　　　　４９３　　　　　５７、８９１０　　
　　　　　３４９　　　　　３３．７２１０　　　　　
　　　２８Ｂ　　　　　　　２五４９１０　　　　　　
　　２５４　　　　　　１７．７９Ｅ：Ｔ　　　　　　
　　　ＣＰＭ　　　　　　　係Ｉ’ｔＥＬ５　　　　　
　　　　１８３　　　　　　　５．８７５　　　　　　
　　　２０４　　　　　　　９、４　Ｃ１０２３３１４
，２６ ２，５２０５９，５６ ２，５２１４１１，０７ ２，５１９５７，８９ 実施例　６ ５５０紅の抗凝固剤ＡＣＤ−Ｂ中に集められた５６００
ｍ＆の全血から調製された２２５＋１１Ｊのヒト白崩球
を含有する標準ロイカフニレシス生成物をＲｔｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　５ｐｅｃｉａｌｔｙ　ＣｏｒｐｏｒａＴ、ｉ
ｏｎ　（ベンフルバニア州うンスダール（Ｌａｎ５ｄａ
ｌｐ　）　）から得た。下記の方法をこの生成物に対し
て行った。

１）ウノベットでの計測（ＷＢＣ）及び分画を調べた。

分画： ９０ｑｂリンパ球 ６チ単球 ４チ顆粒球 直接＝細胞１６５ 細胞層３Ｘ１０７７ｄ 細胞７．４　ｘ　１０’／２２５ｉＬｔ２）　　ＬＡＫ
用の培養物に細胞を調製する。

ｌＸ１０’＝細胞α３０継＋培地９，７０就＋ＩＬ−２
５μｔ５Ｘ１０６＝細胞１．５２′ＩＩｌ＋培地ａ　Ａ
　Ｂｍｌ＋　ＩＬ−２５μｍ１　Ｘｌ　０７＝細胞１０
４１１１＋培地６．９６ｍｌ＋　ＩＬ−２５ｇ４日間５
１ＣＯ＋、５７℃でインキュベートする。

３）次に細胞２０威を残シの細胞から取り出しそしてＣ
ａ”＋及びＭｇ＋＋を含有しないＦＢＳ　２０１１１７
と混合した。この混合物４０ｍを４０１のフィコールの
上に重ねそしてＡ時間遠心分離した。

単核性細胞層を取り出しこれらの細胞を６回洗った。９
０分の半球接着を行った。さらに２回洗いそして細胞の
計測を行い次にＬＡＫ用の培養物に入れた。これは標準
サンプルである。

標準細胞数： 生存能力あり＝１５５ 生存能力なし＝１ 生存可能性チェ９９係 細胞／ｍＡ’　＝！Ａ、Ｉ　Ｘ　１０７／ｄ合計＝　７
．７　Ｘ　１０８／２５紅 ｌＸ１０６の細胞濃度に希釈＝細胞０．３２１Ｚ＋培地
９６８Ｍ＋５１Ｌｔ（ＩＬ−２）。

４）残りの細胞（２００紅）を次に４６０１ＬｌのＣＣ
Ｍにより希釈して細胞の数をＩ　Ｘ　１０７／ＩＩ＆と
し、そして７３ａｕのφＡｌｅで処理した。４０分間室
温テインキユヘートした。インキュベーション中に細胞
は凝塊を形成した。凝塊しなかった懸濁液を出来る限り
多く取り出し、洗滌しそしてＷＢＣウノペットにより細
胞数を計測した。

２６細胞（生存能力あり） １細胞（生存能力危し） 生存可能性９６係 細胞５．２　ｘ　１０６／ｍｅ 細胞１．０４　ｘ　１０９／　２００１！ＬＢ５Ｘ１０
６＝細胞４８ｍ１＋培地２ｍｌ　＋　ＩＬ−２２５μｍ
でバッグ中に細胞を調製した。

ＬＡＫを生成させるためｌ／Ｃ４日間６７℃、５憾ＣＯ
２でインキュベートした。

５）インキュベーション後のｍ胞数 標準物　　　２５　　１　　９６４．９ｘ１０６　　−
直接（１ｘ１ｏ６）　　２７　　　１　　　　９＜Ｓ　
　５．３Ｘ１０６　　　　−直接（５ｘ１０４）　　１
１　　　１　　　９２　２．１ｘ１０６　１．１ｘ１０
ン５ｍＡ直接（ＩＸ１０７）　　’２４　　　５　　　
　Ｂ３　４．８ｘ１０’　　４．８ｘ１０’／１０ｍＡ
！φＡｌａ（５Ｘ１０６）１９　　０　　１００３．８
ｘ１０’ラジ　　　　８５　　７　　９２１．７ｘ１０
７Ｅ：Ｔ比　２０：１．１０：１．５：１．２．５：１
希釈 Ｘ１０６ 標準物　　　　　細胞ａ、４１１１７＋培地α５９１直
接（ＩＸＩＱ６）　　　細胞０．３８Ｍ＋培地α６’ｌ
＊を直接（５Ｘ１０’）　　　細胞Ｑ、９５紅＋培地α
０５ｍ１直接（１１ｘ１０７）　　　細胞α４２１１１
十培地０．５８扉ｌφＡｌａ　　　　　　　細胞Ｑ、５
３ｍＩ！十培地Ｑ、４７１１１ラジ　　　　　　細胞０
．１２１１１７＋培地１９．８８ｍ／結果： 合計及び自然発生Ｃ’ＰＭ ２　ブランク　　　　　−ａ６　　　　　０．０３　ブ
ランク　　　　−１０，３０，００平均　　−ａ３　　
　α０ 最大放出　　４　合計　　　８２五〇　　　　　０．０
５合計　　７００．９　　　（ＬＯ ６合計　　８ｉ９　　　ａｏ ０平均　　８０６．９　１００．０ 自然発生放出　７　１’１ＥＦＲ１０４，５１＆０８　
　ＲＥＦＲ９７，５１２，１ ９ＲＥＦＢ　　　　１０９．５　　　１五５０平均　　
１〇五８０．０ 杼準フィコール　ｌＸ１０６ ２０：１　　　１０　　ＵＮＫＳ　　　　　　２７６．
５　　　　　　２４．６１１　　ＵＮＫＳ　　　　　　
２８７．２　　　　　　２６．１１２　　ＵＮＫＳ　　
　　　　３０９．１　　　　　　２９．２０平均　　２
９１．０　　　２６．６ １Ｄ：１　　　　１３　　　　　　　　　　２２６．２
　　　　　　１７．、！１１．１　　　　　　　　　　
　２１２．４　　　　　　１５．４ｉ５　　　　　　　
　　　　２５５．８　　　　　　７１．６０平均　　２
３１．４　　　１＆２ ５：１　　　　　１６　　　　　　　　　　１７４．４
　　　　　　１０．０１７　　　　　　　　　　１８Ｑ
、４　　　　　　１１９１８　　　　　　　　　　１６
２．４　　　　　　　　ａ３０平均　　１７２．４　　
　９．８ ２．５：１　　　１９　　　　　　　　　　１５４．２
　　　　　　　４．３２０　　　　　　　　　　１２４
．８　　　　　　　　五〇２１　　　　　　　　　　　
９９．６　　　　　　−０．６０平均　　１１９．５　
　　２．２ 直接−フィコールなしｌＸ１０６ ２０：１　　２２　　　　　　　４９０．６　　　　５
５．０２３　　　　　　　４３６．５　　　　４７．３
２４　　　　　　４２五７　　　　４５．５０平均　　
４５０．３　　４９．！１ １０：１　　　２５　　　　　　　　　　４Ｂ４．５　
　　　　５４．１２６　　　　　　　　　　５２＆７　
　　　　　６（Ｌ１２７　　　　　　　　　　４９５．
８　　　　　　５５．８０平均　５０２．４　　５＆７ ５：１　　　　２８　　　　　　　　　３９１．６　　
　　　４α９２９　　　　　　　　　　３９５．３　　
　　　４１．５３０　　　　　　　　　　４５２：２　
　　　　４６．７０平均　４０６．４　　４ｉ０ ２．５：１　　　３１　　　　　　　　　２５４５　　
　　　１ａ９３２　　　　　　　　　２９ａ４　　　　
　２７．７３３　　　　　　　　　２２α７　　　　１
＆６０平均　２５１．９　　２１．１ 直接−フィコールなし５Ｘ１０’ ２０：１　　３４　　　　　　　４０９．２　　　　４
五４３５　　　　　　３７α９３ａ０ ３６　　　　　　　５６１．２　　　　３６．６０平均
　５８ＣＬ５　　３９．３ １０：１　　３７　　　　　　３５２．４　　　　３５
．４３８　　　　　　４０９．５　　　　４五４３９　
　　　　　５６４．４　　　　３７．１０平均　５７５
．５　　３ａ６ ５：１　　　　　４０　　　　　　　　　　３゛１五３
　　　　　　２９．８４１　　　　　　　　　　２９五
３　　　　　　　２７．Ｏ４０２９２，５２４，０ ０平均　２９五１　　２６．９ ２．５：１　　　４３　　　　　　　　　　１９４．５
　　　　　　１２．９４４　　　　　　　　　２２７．
２　　　　　　１７．６４５　　　　　　　　　　　１
９４．９　　　　　　１五〇〇平均　２０５．５　　１
４．５ 直接−フィコールなしｌＸ１０７ ２Ｄ：１　　４６　　　　　　　２４５．６　　　　２
α２４７　　　　　　１９五２　　　　１２．７４８　
　　　　　　１９５．７　　　　１３．１０平均　２１
１．５　　１５．５ １０：１　　４９　　　　　　　１９１．３　　　　１
２．４５０　　　　　　　１８＆６　　　　１２．１５
１　　　　　　　２３２．２　　　　１ａ３０平均　２
０４．１　　１４．３ ５：１　　　５２　　　　　　　１７４．１　　　　１
０．０５ろ　　　　　　　　　　　１６６．８　　　　
　　　　９．０５４　　　　　　　１６１．８　　　　
　＆２０平均　１６７．６　　９．１ ２．５：１　　　　５５　　　　　　　　　　１３＆０
　　　　　　　４．６５６　　　　　　　　　　１４９
．８　　　　　　　　＆５５７　　　　　　　　　　１
１４．９　　　　　　　　１．６０平均　１５五６４．
２ φＡ１ａ５Ｘ１０’ ２０：１　　　５８　　　　　　　　　２７ａ１　　　
　　　２４．８５９　　　　　　　　　　２２１．１　
　　　　　１６．７６０　　　　　　　　　　２２６．
６　　　　　　１７．５０平均　２４１．９　　１９．
６ １０：１　　　　＜５１　　　　　　　　　　２０＆５
　　　　　　１４．６６２　　　　　　　　　　　１８
ａ９　　　　　　１２．１６５　　　　　　　　　　　
１９５．９　　　　　　１五１０平均　１９７．１　　
１五３ ５：１　　　　　６４　　　　　　　　　　１８６．５
　　　　　　１１．８６５　　　　　　　　　　１９９
．８　　　　　　１五７６６　　　　　　　　　１７五
３９．９０平均　１８６，５　　１１．８ ２．５：１　　　６７　　　　　　　　　１９９．２　
　　　　１五６６８　　　　　　　　１７５．１　　　
　　１Ｑ、１６９　　　　　　　　　２１２．７　　　
　　　１５．５０平均　１９５．７　　１五１ 実施例　４ ５２０Ｍの抗凝固剤ＡＣＤ−Ｂ中に集められた３６００
ｍＪの全血から調製された２３０ｍ／のヒト白血球を含
有する標章ロイカフニレシス生成物をＢｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　５ｐｅｃｉａｌｔｙ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎか
ら得た。

下記の方法はこの生成物について行われた。

１）細胞１０ＩＩＩｌを取り出した。

Ａ） １）この血液の５ｒＩＬｌを採りそして５　ｒｎｉのＰ
ＢＳと混合した。

２）１０ｍＪのフィコールを下に入れた。

３）　　２０００　ｒｐｍで５０分間遠心分離した。

４）洗滌しそして計測した。

５）これは１Ｑｍｌ容フラスコ中における細胞１．５Ｘ
１０６／−標準物であった。

標準物 生存能力あシ＝４９ 生存能力なし＝０ 生存可能性係＝１００係 細胞／１ｎｌ＝　９．８　Ｘ　１０６／ｒｔｔ１合計＝
　１．９６　ｘ　１０８／２０ｍ希釈：細胞１，５Ｍ＋
培地ａ５ｍ／＋　ＩＬ−２１１ｔｌＢ） １）別の５１を直接テストに用いた。

２）ＷＢＣ（ウノペットによる）及び分画を検へた。

３）　　ＷＢＣ４，５Ｘ１０’／ＩＬｔ２．２５ｘ１０
８１５成 分画　７２俤リンパ球 ２２優頌粒球 ６嗟単球 ４）次ｌｌＣｍ胞を１０１容フラスコ中で１．５×１０
６／−及び５×１０６／Ｍで培養物に調製した。

１．５×１０６／Ｍｌ＝細胞α３３紅＋培地９．６７ｍ
Ａ’＋　ＩＬ−２１ｔｚ１５　ｘ　Ｉ　Ｑ６／Ｍ＝細胞
１．１１ｍ／十培地＆８９ｍＡ！＋　ＩＬ−２１ｐｔ細
胞を４日間インキュベートした。クロム放出アッセイを
行った。

細胞の計測： 標準物１．５ｘ１［］６　４ｏ　　　　３　　　９３　
　８ｘ１０６直接　１．５Ｘ１０６　４０　　　２　　
　９４　　８Ｘ１０６直接　５Ｘ１０６　　２１　　　
１　　　９６　　４．８Ｘ１０６ラジ　　　　　４０　
　６　　８７　８Ｘ１０６５）　　ＬＡＫアッセイ Ｅ：Ｔ比　４０：１．２０：１．１０：１．５：１．２
．５　：　１．１．２５：１細胞を４ｘ１０６４Ｃ希釈
した。

ラゾをｌＸ１０５に希釈した。

希釈 標準物　　　　　細胞ａ、５紅十培地０．５扉ε直接１
．５Ｘ１０６　　　　細胞α５Ｍ＋培地０．５扉ｌ直接
５Ｘ１０６　　　　細胞０．８３ｍ／十培地０．１７酎
ラジ　　　　細胞（１２５ｍ＋培地１９．７５＊／結果
： 合計及び自然発生ＣＰＭ ブランク　　　１　ブランク　　−１１，ＯＱ、０２　
ブランク　　　−ＩＱ、６　　　　　　０．０３　ブラ
ンク　　　−１１１１Ｌ６［Ｌ００平均　−ＩＱ、７　
　０．０ 最大放出　　４　合計　　　５７６．９　　　　０．０
５５合計５６４．６　　　ｎ。

６合計　５８４．６　　０．０ ０平均　５７５．４　　１００．０ 自然発生放出　７　　ＲＥＦＥＩ　　　　　１３９．７
　　　　　２４．３８　　ＲＥＦＢ　　　　１４０．６
　　　　２４．４９　　ＦＩＥＦＲ１５２，３２６，５ ０平均　１４４．２　　０．０ 標準物　１．５Ｘ１０６ ４０：１　　　１０　　ＵＮＫＳ　　　　５４０．１　
　　　９１．８１１　　ＵＮＫａ　　　　５４７．０　
　　　９五４１２　　ＵＮＫＳ　　　　５１ａ３　　　
　８６．８０平均　５３５．２　　９１］、７ ２０：１　　　１３　　　　　　　　　　４５９．５　
　　　　　７五１１４　　　　　　　　　５〇五２　　
　　　　８３．３１５　　　　　　　　　　４５ａ０　
　　　　　７２．８０平均　４７五６　　７６．４ １０：１　　　　１６　　　　　　　　　　７１０４．
５　　　　　　６０．４１７　　　　　　　　　　　４
１（１８６１，８１８４３９，１６ａ４ ０平均　４１ａ１　　６五５ ５：１　　　　　１９　　　　　　　　　　３２０．５
　　　　　　４Ｑ、９２０　　　　　　　　　　２７９
．１　　　　　　３１．５２１　　　　　　　　　　　
２７５．０　　　　　　３０．３０平均　２９１．５　
　５４．２ ２．５：１　　　　２２　　　　　　　　　　２２２．
１　　　　　　１ａ１２３　　　　　　　　　２５五０
　　　　　　２５．２２４　　　　　　　　　　　２３
２．１　　　　　　２Ｉ１４０平均　２３５．７　　２
１．２ １．２５：１　　２５　　　　　　　　　　１７５．７
　　　　　　　７．３２６　　　　　　　　　　２０５
．６　　　　　　１４．２２７　　　　　　　　　　２
０７．９　　　　　　１４．８０平均　１９６．４　　
１２．１ 直接−フィコールなし１．５Ｘ１０６ ８０：１　　２８　　　　　　　４１５．５　　　　６
２．９２９５９五ＯＳ７．７ ３０　　　　　　　４６１．８　　　　７五７０平均　
４２五４　　６４．８ ４０：１　　　３１　　　　　　　　　　４１スフ　　
　　　　６五４３２　　　　　　　４０４．２　　　　
６０．３３３　　　　　　　４０５．６　　　　６［Ｌ
６０平均　４０９．２　　６１．５ ２０：１　　５４　　　　　　　３８１．１　　　　５
ａ０５５　　　　　　　４０７．０　　　　６（Ｌ９３
６　　　　　　　４４７．９　　　　７０．４０平均　
４１２．０　　　＜５２．１ １０：１　　３７　　　　　　　　Ａ３α５　　　６＆
ル３８　　　　　　　４０７．４　　　　６１゜０３ｑ
　　　　　　　　４４２．６　　　　６９．２０平均　
４２＆８　　６５．５ ５：１　　　４０　　　　　　　３３７．５　　　　４
４．８４１　　　　　　　５５７．４　　　　４９．５
４２　　　　　　　３５ａＯＡ９．６ ０平均　３５１．０　　４ａ０ ２．５：１　　　４３　　　　　　　　　２１（Ｌ８　
　　　　２２．４４４　　　　　　　　　２７（１９２
９，４４５２５２，１２７，３ ０平均　２５７．９　　２６．４ １．２５：１　　４６　　　　　　　　　　１Ｂ６．９
　　　　　　　９．９４７　　　　　　　　　　１９４
．１　　　　　　１１．６４８　　　　　　　　　　１
８２．７　　　　　　　　ａ９０平均　１８７．９　　
１Ｑ、１ 直接−フィコールなし５Ｘ１０６ ４０：１　　４９　　　　　　　３９１．０　　　　５
７．２５０　　　　　　　３９２．１　　　　５７．５
５１　　　　　　　３９９、６　　　　５９．２０平均
　３９４．２５＆０ ２０：１　　５２　　　　　　　３８６．３　　　　　
Ｓ＆２５５　　　　　　　３８ｆ、１　　　　５４．９
５４　　　　　　　３７７．０　　　　５４．００平均
　３８１．５　　５５．０ １０：１　　５５　　　　　　　３１６．０　　　　．
１１８５６　　　　　　　３４　Ａ０　　　　４６．８
５７　　　　　　　３２５．５　　　　　ＡＺ、００平
均　３３９．２　　４５．２ ５：１　　　　５８　　　　　　　　　　２９４５　　
　　　　３５．３５９　　　　　　　　　　２３１５６
　　　　　　２１、、ｌｌ６０　　　　　　　　　２３
９．０　　　　　　２２．００平均　２５７．４　　２
６．２ ２．５：１　　　６１　　　　　　　　　１９（Ｌ６　
　　　１ＣＬ８６２　　　　　　　　　１７２．８　　
　　　　６．６６５　　　　　　　　　１９α５　　　
　　１ＣＬ７０平均　１８４．６　　９．４ １．２５：ｉ　　　６４　　　　　　　　　１５１．７
　　　　　　　１．７６５　　　　　　　　　　１７２
．５　　　　　　　６．６６６　　　　　　　　２〇五
８　　　　１＆８０平均　１７４０　　７．４ 実施例　５ 材料： パツフイ・コート−血液５２Ｍ 細胞数　細胞４．５Ｘ１０’／”ｊ（全ＷＢＣ）好中球
１．８Ｘ１０７／ｉＬｔ（４２ｍ）（推定）リンパ球１
〜２Ｘ１０’／１１７（２０〜５０％）（推定）　ＲＢ
Ｃ５Ｘ　１０９〜 （推定）単球ＣＬ　５〜Ｉ　Ｘ　１０　’　、４ｕフィ
コール・ハイペク（フィコール） ＣＣＭ　−５係ＦＣ８−ＲＰＭＩ 操作： １）フィコールなし ａ）１１５１のパツフイ・コートに２１５継のＣＣＭを
加える。細胞数２Ｘ１０６／Ｍ（全茹Ｃ）。

ｂ）　１０μを浬のＩＬ−２を加える。

Ｃ）フラスコに１１２１の培養混合物を入れる。

ｄ）バッグに１１２紅の培養混合物を入れる。

ｅ）２０日間３７℃でインキュベートする。

ｆ）　細胞の計測及び５’Ｃｒ放出（ＬＡＫ）アッセイ
の喪めに５．６．１２．１７及び２０日にサンプルを採
取する。

２）　フィコール ａ）５ＱＩＩｊ容遠心分離管に４２−のパツフイ・コー
トを入れる。

１））８００Ｆで１０分間遠心分離する。

Ｃ）上澄みを捨て、フィコール層上に浮く単核性ＷＢＣ
層（りンノ豐球及び単球）を回収し、３回洗う。３００
Ｘ１０’個の総単核性細胞が単離される。

ｄ）　　ＣＣＭを加えて単核性細胞濃度を２Ｘ１０６膚
とする。

ｅ）　　７ラスコに７５３１１を入れる。

ｆ）バッグに７５ｓｕを入れる。

ｇ）２０日間３７℃でインキュベートする。

ｈ）細胞の計測及び５１Ｃｒ放出（ＬＡＫ）アッセイの
ため３．６．１２，１７及び２０日にサンプルを採取す
る。

細胞計測一覧表（φＸ１０ｄ／ａＡ′）０　２Ｘ１０６
２ｘ１０６　　２ｘ１０６２Ｘ１０６３　１．５ｘ１０
６　０．９ｘ１０６２．１ｘ１０６　　　［Ｌ７ｘ１０
６６　２．５Ｘ１０６　　ｏ、ａｘｌｏｔｓ　　２Ｘ１
０６　　１１８Ｘ１０６１２　１．６刈０６　１．４Ｘ
１０６　２．７ｘＩＤ６　　２ｘ１０６１７　１．６Ｘ
１０６　１．２ｘ１０６　１．９ｘＩＱ６　　１．１ｘ
１０６２０　１．１ｘ１０６　　Ｑ、６ｘ１０６　２．
４ｘ１０６　　１．２ｘ１０６ＬＡＫ活性一覧表 ５　ＬＵ５゜ ３　　１０　　　　　　　ル０　　　　５　　　　　２
０１２　　　２．５　　　　　１　　　　２　　　　　
　＜１２０７２２，５１ 以上本発明の詳細な説明したが、本発明はさらに次の実
施態様によってこれを要約して示すことができる。

１）′全血からＩ’（ＢＣ’及び血漿を除去して、リン
／９球を含みしかもＷＢＣＫ富んだ画分を得、そしてこ
のＷＢＣに富んだ両分をＩＬ−２とともに培養基中でイ
ンキュベートすることよ抄なる生体外でＬＡＫ細胞を生
成させる方法において、ＢＢＣ及び崩漿を除去し、そし
てフィコール勾配でリンノ臂球を中間分離することなし
にこのＷＢＣＫ、富んだ画分を使用することを特徴とす
る方法。

２）　　ＲＢＣがロイカフニレシスによシ除去されそし
てＷＢＣに冨んだ画分中のＲＢＣの容量係が約１〜２０
の範囲内にある前記１）記載の方法。

３）　　ＷＢＣに冨んだ画分中のＲＢＣ／ＷＢＣの比が
約ａ２〜２５０の範囲内にある前記２）記載の方法。

４）　　ＲＰＣカエルトリエーション・ロイカフニレシ
スにより除去されそしてＷＢＣＶｃ富んだ画分中のＲＢ
Ｃの容量幅が約１〜乙の範囲内にある前記１）記載の方
法。

５）　　ＷＢ（７に富んだ画分中のＭＣ’βＰＣの比が
約０．２〜５０の範囲内にある前記４）記載の方法。

６）　　ＷＢＣの分画が約８０〜８５チのリンパ球、約
１０〜２０チの単球及び約１〜５チの顆粒球である前記
５）記載の方法。

７）　　ＷＢＣに富んだ両分中のＢ′ＢＣの容量幅が約
２〜４の範囲内にあり、ＷＢＣに冨んだ画分中の１”ｔ
Ｂｃ／ＷＢＣの比が約Ｑ、５〜２５の範囲内にある前記
６）記載の方法。

８）　　ＷＢＣ’に冨んだ画分のインキュベーションに
先立チ単球をフェニルアラニンメチルエステルで処理す
ることにより欠失させる前記１）記載の方法。

９）　　ＷＢＣに富んだ画分をインキュベーションに先
立ち塩溶液で洗って凝塊形成を阻止する前記２）記載の
方法。

１０）リンパ球を含みかつＷＢＣに冨んだ画分をＩＬ−
２とともに培養基中でインキュベートすることによりＬ
ＡＫ細胞を生成させる方法において、ＲＥＣ／ＷＢＣの
比的［１２〜３００．並びにＲＢＣ容量係約１〜５０を
有するものである、リン１４球を含みしかもＷＢＣＫ富
んだ画分を用いることを特徴とする方法。

１１）　　ＷＢＣＫ冨んだ画分においテＲＢＣ’／ＷＢ
ＣＯ比が約Ｉ１２〜２５０の範囲内にありセしてＲＢＣ
容量係が約１〜２０の範囲内にある前記１ｏ）記載の方
法。

１２）　　ＷＢＣ’に富んだ画分においてＲＢＣ’βＢ
ＣＯ比が約０．２〜５０の範囲内にありそしてＰＢｃ容
量係が約１〜６の範囲内にある前記１１）記載の方法。

１３）ＷＢＣＫ富んだ画分の分画が、約１〜５憾の顆粒
球、０〜２０係の単球及び約８０係より多いリンツク球
である前記１２）記載の方法。

−１４）　　ＷＢＣＫ冨んだ画分にオイテＲＢＣ／ＷＢ
Ｃｆ）比が約０．５〜２５の範囲内にありそしてＲＢＣ
容量係が約２〜４である前記１５）記載の方法。

１５）患者から末梢血液を取り出し、その血液からり７
７９球を含みしかもＷＢＣに富んだ画分を分離し、この
リン・臂球を含みしかもＷＢＣに冨んだ画分をインター
ロイキン２とともにインキュベートしてリンホカイン活
性化キラー細胞を生成させ、そしてこの活性化された細
胞を患者に再注入することよプなる養子免疫療法により
癌患者を治療する方法において、フィコール勾配を用い
ることなくリン・ぐ球を含みしかもＷＢＣに富んだ画分
を分離し、それによりＷＢＣに富んだ画分中のＲＢＣの
容量幅が約１〜２０の範囲内にあることを特徴とする方
法。

１６）リンパ球を含みしかもＷＢＣに富んだ画分をエル
トリニージョン・ロイカフニレシスにより分離し、それ
によりＷＢＣ画分中のＲＢＣの容量幅が約１〜６の範囲
内にある前記１５）記章の方法。

特許出願人　　イー・アイ・デュｌン・ド・ネモアース
・アンド・コンパニー 同　　　　ヘモネティクス・コーポレイション外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）全血からＲＢＣ及び血漿を除去して、リンパ球を含
   みしかもＷＢＣに富んだ画分を得、そしてこのＷＢＣに
   富んだ画分をＩＬ−２とともに培養基中でインキュベー
   トすることよりなる生体外でＬＡＫ細胞を生成させる方
   法において、ＲＢＣ及び血漿を除去し、そしてフィコー
   ル勾配でリンパ球を中間分離することなしにこのＷＢＣ
   に富んだ画分を使用することを特徴とする方法。 ２）リンパ球を含みかつＷＢＣに富んだ画分をＩＬ−２
   とともに培養基中でインキュベートすることによりＬＡ
   Ｋ細胞を生成させる方法においてＲＢＣ／ＷＢＣの比約
   ０．２〜３００、並びにＲＢＣ容量％約１〜５０を有す
   るものである、リンパ球を含みしかもＷＢＣに富んだ画
   分を用いることを特徴とする方法。