RU2662080C1 - Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных - Google Patents
Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662080C1 RU2662080C1 RU2017132651A RU2017132651A RU2662080C1 RU 2662080 C1 RU2662080 C1 RU 2662080C1 RU 2017132651 A RU2017132651 A RU 2017132651A RU 2017132651 A RU2017132651 A RU 2017132651A RU 2662080 C1 RU2662080 C1 RU 2662080C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- spermatozoa
- genetically
- hyaluronic acid
- sperm
- farm animals
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
- A61B17/42—Gynaecological or obstetrical instruments or methods
- A61B17/425—Gynaecological or obstetrical instruments or methods for reproduction or fertilisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Surgery (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарии и представляет способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных, заключающийся в связывании генетически полноценных и зрелых сперматозоидов с высоким оплодотворяющим потенциалом с иммобилизованной 1%-ной высокомолекулярной гиалуроновой кислотой животного происхождения при 37°C в течение 30 мин, с последующим удалением из эякулята не связанных с гиалуроновой кислотой дефектных, ослабленных и генетически неполноценных сперматозоидов. Изобретение обеспечивает возможность повышения эффективности оплодотворяющей способности спермы сельскохозяйственных животных, путем отбраковки генетически неполноценных и незрелых сперматозоидов, не связавшихся рецептор-опосредованным образом с гиалуроновой кислотой. 1 пр.
Description
Изобретение относится к области ветеринарии и животноводства и может быть использовано при искусственном осеменении для отбора зрелых генетически полноценных сперматозоидов и удалении из эякулята неполноценных форм.
Существует множество способов отбора полноценных сперматозоидов, основанных, в частности, на их подвижности: метод swim-up (всплытия), основанный на способности сперматозоидов всплывать в более верхние слои питательной среды, метод центрифугирования в градиенте плотности, основанный на способности живых сперматозоидов проходить сквозь градиент силиконовых частиц, отбор и отсеивание апоптозных клеток (сортировка на магнитной ячейке и стекловате), сортировка клеток по поверхностному заряду (электрофорез и ψ-потенциал), морфологический отбор с помощью ультрамикроскопии [1].
При экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) в методе ПИКСИ (Physiologic ICSI) селективным фактором для «физиологического отбора» полноценных сперматозоидов человека выступает гиалуроновая кислота. Многочисленные исследования показали, что сперматозоиды, имеющие в клеточной мембране рецепторы, обладающие высоким сродством к гиалуроновой кислоте, обладают целостной ДНК, низким уровнем остаточных гистонов и сниженным уровнем анеуплоидии, что положительно сказывается на качестве полученных эмбрионов и частоте наступления беременности [2-3].
Однако метод ПИКСИ применяется для отбора единичных полноценных сперматозоидов человека, является дорогостоящим, а также не подходит для применения в искусственном оплодотворении у сельскохозяйственных животных.
Технический результат заключается в повышении эффективности оплодотворяющей способности спермы сельскохозяйственных животных, путем отбраковки генетически неполноценных и незрелых сперматозоидов, не связавшихся рецептор-опосредованным образом с гиалуроновой кислотой.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных путем связывания генетически полноценных и зрелых сперматозоидов с высоким оплодотворяющим потенциалом с иммобилизованной 1%-ной высокомолекулярной гиалуроновой кислотой животного происхождения при 37°C в течение 30 мин, с последующим удалением из эякулята не связанных с гиалуроновой кислотой дефектных, ослабленных и генетически неполноценных сперматозоидов.
Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных (хряков) осуществляется следующим образом. Для поддержания физиологического статуса сперматозоидов исследование проводят при температуре 37°C. Первоначально готовят 1%-ную высокомолекулярную гиалуроновую кислоту. Для ее приготовления необходимо взвесить 100 мг гиалуроновой кислоты с молекулярным весом не менее 500 кДа и добавить навеску к 10 мл подогретой до 40°C дистиллированной воды, постоянно перемешивая. После полного растворения гиалуроновой кислоты и образования текучего геля добавляют 2-3 мл геля в опытные емкости, имеющие объем 50 мл, покрывая их дно слоем толщиной 3-4 мм. Оставляют сформированные емкости на 3 час при комнатной температуре для подсушки слоя высокомолекулярной гиалуроновой кислоты.
На следующим этапе эякулят хряков в пакетах объемом 100 мл переливают в 2 пробирки по 50 мл, затем отбирают небольшую аликвоту для контрольной оценки концентрации и подвижности сперматозоидов. Центрифугируют пробирку с эякулятом в течение 10 мин при 1000 об/мин, затем большую часть супернатанта (около 80 мл) сливают. В остаточном объеме, включающим осадок сперматозоидов, общим объемом 20 мл подсчитывают концентрацию сперматозоидов с помощью камеры Горяева. Концентрированный эякулят помещают в опытную емкость с гиалуроновой кислотой и инкубируют в термостате при 37°C в течение 30 мин, периодически помешивая. Затем сливают супернатант с не прикрепившимися к иммобилизованной гиалуроновой кислоте незрелыми и имеющими генетические дефекты сперматозоидами. Добавляют в опытную емкость устройства для отбора генетически полноценных сперматозоидов 20 мл элюирующего раствора (среда для разбавления сперматозоидов), подогретого до 37°C, помещают емкость в шейкер и встряхивают в течение 10 мин для отделения сперматозоидов от иммобилизованной гиалуроновой кислоты.
Подсчитывают в отобранной фракции эякулята, включающего генетически полноценные сперматозоиды с высоким оплодотворяющим потенциалом, концентрацию сперматозоидов и оценивают подвижность. В случае если концентрация сперматозоидов составит 60 и более млн/мл, а общая подвижность сперматозоидов повысилась, переливают эякулят, содержащий генетически полноценные сперматозоиды с высоким оплодотворяющим потенциалом, в стерильную тубу для спермы объемом 100 мл, добавляют среду для разбавления в объеме 50 мл и запаивают тубу.
Оценку генетической полноценности сперматозоидов в отобранной аликвоте проводят с помощью комплекса методик, позволяющих оценить структурно-функциональные изменения ядра и хроматина, одноцепочечные разрывы ДНК, уровень процессов перекисного окисления липидов [4].
При оценке генетической полноценности сперматозоидов используют методики морфологической оценки структурного состояния ядра и хроматина с помощью флуоресцентного ядерного красителя Hoechst 33258, определяют фрагментацию ДНК методом Гало, анализируя интенсивность перекисного окисления липидов с помощью ТБК-теста [5-7].
Генетически полноценные сперматозоиды не имеют патологических аномалий и дефектов, характеризуются отсутствием или слабой степенью агглютинации, слабой склонностью к апоптозу (не более 10-15%), отсутствием разрывов в ДНК, ярким и выраженным свечением Гало, низким уровнем содержания ТБК-реактивных продуктов (0,24±0,05 мкМоль/л).
Генетически неполноценные сперматозоиды могут иметь патологические аномалии и дефекты, склонны к индуцированному или спонтанному апоптозу, имеют высокую частоту встречаемости одноцепочечных разрывов в ДНК и менее яркое и выраженное свечение Гало, а также высокий уровень ТБК-реактивных продуктов, чем генетически полноценные сперматозоиды.
Селекция сперматозоидов по признаку рецептор-опосредованного связывания с иммобилизованной гиалуроновой кислотой позволяет получать фракцию сперматозоидов, имеющих минимальное количество генетических и морфологических нарушений, высокоподвижных с высоким оплодотворяющим потенциалом, и использовать ее для искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. Сперматозоиды, способные связываться с гиалуроновой кислотой, характеризуются отсутствием первичных морфологических признаков апоптоза, одноцепочечных разрывов и фрагментации ДНК, низкой интенсивностью процессов перекисного окисления липидов. При выявлении низкого процента апоптотически гибнущих сперматозоидов до 10-15%, достаточно яркого и выраженного свечения Гало, возрастания содержания ТБК-реактивных продуктов не более чем на 30-40% по отношению к контролю, оценивают сперматозоиды как генетически полноценные.
Таким образом, разработка способа массового отбора сперматозоидов сельскохозяйственных животных, основанного на рецептор-опосредованном связывании с иммобилизованной гиалуроновой кислотой является обоснованной и актуальной, поскольку данная биотехнология отбора позволит селектировать генетически полноценные сперматозоиды и тем самым повысить эффективность искусственного оплодотворения у животных и использовать для осеменения только зрелые сперматозоиды, обладающие высоким оплодотворяющим потенциалом.
Способ заключается в имитации природного явления аффинного взаимодействия зрелых и генетически полноценных сперматозоидов, имеющих в клеточной мембране, экспонированные наружу рецепторы с гиалуроновой кислотой, являющейся компонентом клеточной мембраны яйцеклетки. Зрелые и генетически полноценные сперматозоиды имеют на своей мембране рецепторы, связывающиеся с мономерными остатками гиалуроновой кислоты [8-9]. Если мембрана сперматозоида незрелая или в ней имеются структурно-функциональные нарушения, то связывание с гиалуронатом не происходит или сильно затруднено.
По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить эффективность оплодотворяющей способности спермы сельскохозяйственных животных путем отбраковки генетически неполноценных и незрелых сперматозоидов, не связавшихся рецептор-опосредованным образом с гиалуроновой кислотой.
Источники информации
1. Said Т.М., Land J.A. Effects of advanced selection methods on sperm quality and ART outcome: a systematic review // Hum Reprod Update., 2011, 17, pp. 719-733.
2. Huszar G., Ozenci C.C., Cayli S. et al. Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity, viability, and unreacted acrosomal status // Fertil Steril., 2003, 79, pp. 1616-1624.
3. Parmegiani L., Cognigni G.E., Bernardi S. et al. "Physiologic ICSI": hyaluronic acid (HA) favors selection of spermatozoa without DNA fragmentation and with normal nucleus, resulting in improvement of embryo quality // Fertil Steril., 2010, 93, pp. 598-604.
4. RU 2568845, МПК G01N 33/48, опубл. 20.11.2015.
5. Mikhailenko V.M., Philchenkov A.A. Analysis of 1H NMR-detectable mobile lipid domains for assessment of apoptosis induced by inhibitors of DNA synthesis and replication // Cell Biology International, 2005, 29, 33-39.
6. Fernandez J.L. The Sperm Chromatin Dispersion Test: A Simple Method for the Determination of Sperm DNA Fragmentation // Journal of Andrology. Volume 24, Issue 1, January-February, 2003, pages 59-66.
7. Janero D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury // Free Radical Biology and Medicine. Volume 9, Issue 6, 1990, PP. 515-540.
8. Redgrove K.A., Anderson A.L., McLaughlin E.A. et al. Investigation of the mechanisms by which the molecular chaperone HSPA2 regulates the expression of sperm surface receptors involved in human sperm-oocyte recognition // Mol Hum Reprod. 2013, 19, PP. 120-35.
9. Huszar G., Stone K., Dix D. et al. Putative creatine kinase M-isoform in human sperm is identified as the 70-kilodalton heat shock protein HspA2 // Biol Reprod., 2000, 63, pp. 925-932.
Claims (1)
- Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных, заключающийся в связывании генетически полноценных и зрелых сперматозоидов с высоким оплодотворяющим потенциалом с иммобилизованной 1%-ной высокомолекулярной гиалуроновой кислотой животного происхождения при 37°C в течение 30 мин, с последующим удалением из эякулята не связанных с гиалуроновой кислотой дефектных, ослабленных и генетически неполноценных сперматозоидов.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017132651A RU2662080C1 (ru) | 2017-09-18 | 2017-09-18 | Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017132651A RU2662080C1 (ru) | 2017-09-18 | 2017-09-18 | Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2662080C1 true RU2662080C1 (ru) | 2018-07-23 |
Family
ID=62981495
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017132651A RU2662080C1 (ru) | 2017-09-18 | 2017-09-18 | Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2662080C1 (ru) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4804537A (en) * | 1985-10-18 | 1989-02-14 | Pharmacia Ab | Sperm selection process using a salt of hyaluronic acid |
US5801058A (en) * | 1994-06-20 | 1998-09-01 | Blanco-Esteve; Carmen | Analytic method to determine the fertilizing capacity of a human semen sample |
RU2535359C1 (ru) * | 2013-12-04 | 2014-12-10 | Алексей Алексеевич Бирюков | Способ селекции сперматозоидов для экстракорпорального оплодотворения |
-
2017
- 2017-09-18 RU RU2017132651A patent/RU2662080C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4804537A (en) * | 1985-10-18 | 1989-02-14 | Pharmacia Ab | Sperm selection process using a salt of hyaluronic acid |
US5801058A (en) * | 1994-06-20 | 1998-09-01 | Blanco-Esteve; Carmen | Analytic method to determine the fertilizing capacity of a human semen sample |
RU2535359C1 (ru) * | 2013-12-04 | 2014-12-10 | Алексей Алексеевич Бирюков | Способ селекции сперматозоидов для экстракорпорального оплодотворения |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Verheyen et al. | Processing and selection of surgically-retrieved sperm for ICSI: a review | |
Cummins et al. | A test of the human sperm acrosome reaction following ionophore challenge: relationship to fertility and other seminal parameters | |
Tavalaee et al. | Relationship between potential sperm factors involved in oocyte activation and sperm DNA fragmentation with intra-cytoplasmic sperm injection clinical outcomes | |
Petersen et al. | Efficacy of hyaluronic acid binding assay in selecting motile spermatozoa with normal morphology at high magnification | |
Frydrychová et al. | Effects of long-term liquid commercial semen extender and storage time on the membrane quality of boar semen | |
Prakash et al. | Sexing of spermatozoa in farm animals: a mini review. | |
Olaciregui et al. | Freeze‐dried stallion spermatozoa: evaluation of two chelating agents and comparative analysis of three sperm DNA damage assays | |
Behera et al. | Effect of cholesterol supplementation on cryosurvival of goat spermatozoa | |
Rajoriya et al. | Exogenous cholesterol prevents cryocapacitation‐like changes, membrane fluidity, and enhances in vitro fertility in bubaline spermatozoa | |
US5770363A (en) | Methods for diagnosing human male infertility | |
Rosyada et al. | Sperm protein markers for Holstein bull fertility at National Artificial Insemination Centers in Indonesia | |
Vozaf et al. | Cryopreservation of ram semen: Manual versus programmable freezing and different lengths of equilibration | |
Baudi et al. | Influence of cooling rate on the ability of frozen–thawed sperm to bind to heterologous zona pellucida, as assessed by competitive in vitro binding assays in the ocelot (Leopardus pardalis) and tigrina (Leopardus tigrinus) | |
Morrell et al. | Stallion sperm viability, as measured by the Nucleocounter SP-100, is affected by extender and enhanced by Single Layer Centrifugation | |
RU2662080C1 (ru) | Способ отбора генетически полноценных сперматозоидов сельскохозяйственных животных | |
Vigolo et al. | Selection of frozen–thawed stallion semen by microfluidic technology | |
Jo et al. | Effect of antibodies binding to Y chromosome-bearing sperm conjugated with magnetic nanoparticles on bull sperm characteristics | |
Fan et al. | Fresh and cryopreserved ovarian tissue from deceased young donors yields viable follicles | |
Wang et al. | New method of FACS analyzing and sorting of intact whole ovarian fragments (COPAS) after long time (24 h) cooling to 5 C before cryopreservation | |
Bergqvist et al. | Single Layer Centrifugation of Stallion Spermatozoa through Androcoll™‐E does not Adversely Affect their Capacitation‐Like Status, as Measured by CTC Staining | |
Nicolae et al. | Effect of thawing time and temperature variation on the quality of frozen-thawed ram semen | |
Lebeda et al. | Gonadal histology and concentration of 11-ketotesterone of meiotic gynogens confirm female heterogametic sex determination in sterlet (Acipenser ruthenus) | |
Lee et al. | Effect of methyl-beta-cyclodextrin on the viability and acrosome damage of sex-sorted sperm in frozen-thawed bovine semen | |
Golshan Iranpour et al. | Effects of temperature and storage time on the motility, viability, DNA integrity and apoptosis of processed human spermatozoa | |
Zoca et al. | Bull field fertility differences can be estimated with in vitro sperm capacitation and flow cytometry |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190919 |