CN108496957A - 脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法 - Google Patents

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刘学彬
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Abstract

脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法，属于脐带间充质干细胞保存技术领域。取足月健康新生儿脐带，经过检查鉴定可用，然后进行分离、培养、饥饿培养，制备干细胞培养上清，最后加入白花檵木提取物保护液于0‑8℃条件下低温冷藏，本发明的保护方法确保脐带间充质干细胞培养上清在低温(0‑8℃)条件下保存15天，干细胞上清中的总蛋白质含量基本不变，且EGF、VEGF和TNF‑α含量均没有明显改变，延长干细胞上清液在低温条件下的存放时间，降低保存和运输成本。

Description

脐带间充质干细胞培养上清的低温冷藏保存方法
技术领域
本发明属于生物技术领域涉及一种脐带间充质干细胞培养上清冷藏保存方法，属于脐带间充质干细胞保存技术领域。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)最早发现于1968年是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有易于采集和分离、免疫原性低、分化及旁分泌能力强、造血支持等特点而日益受到人们的关注。
间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复
脐带间充质干细胞是从人脐带组织中的沃顿胶分离培养获得的一种来源的间充质干细胞，流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR，具有和骨髓、胎盘羊膜以及脂肪组织来源的间充质干细胞一样的表面抗原。
脐带间充质干细胞(MSCs)具有多向分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。研究报道从人脐带中分离出MSCs，无论细胞含量、增殖能力还是分化能力均优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。干细胞的培养体系主要采用含动物血清(如胎牛血清)或无血清的培养基(无血清便于临床研究)，对脐带沃顿胶组织进行贴壁扩增培养间充质干细胞，同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、免疫表型等特性(详见图1和2)，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种脐带间充质干细胞培养上清低温(0-8℃)的保存方法，延长其保存时间。
本发明采取的方案是：一种脐带间充质干细胞培养上清低温(0-8℃)保存方法步骤如下：
(1)取足月健康胎儿脐带，用荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV,抗-HDV,抗-HEV,抗-HIV-1/2,HCV-RNA,HIV-1-RNA,CMV-DNA,检测结果均为阴性可用
(2)将手术室取出的脐带放入装有生理盐水的无菌培养瓶中，4℃保存或运输至无菌实验室；入细胞培养室后，去除细胞培养瓶瓶口处的封口塑料，后放入处于运行状态的洁净台中。
(3)从4℃的冰箱中取出DMEM培养基，FBS,使其慢慢恢复至室温。
(4)脐带华通氏胶的剥离并洗涤
优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；
(5)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(4)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-5mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；
(6)接种
将步骤(5)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(7)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(6)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5％-10％胎牛血清的基础培养基(DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；
培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(8)换液
第一次换液：步骤(7)脐带华通氏胶培养到第5天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有5％-10％胎牛血清的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；
第二次换液：脐带华通氏胶培养到10天后，重复第一次换液的操作；
(9)收获原代细胞
细胞观察：脐带华通氏胶培养到,14-16天后，将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；
(10)原代细胞收获
配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液。
去除旧的培养液：摇晃培养瓶并用移液器吹打，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；
消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；
终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入含有胎牛血清的DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；
(10)原代细胞传代(P0传P1)
将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有胎牛血清的DMEM培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有胎牛血清的DMEM培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。
优选种瓶：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中。
(11)干细胞培养上清
根据步骤(9)-(10)，细胞传代至第四代P4(步骤(10)，养至细胞融合度达到80-90％)。
除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水液，加入DMEM培养基，饥饿培养48小时；
(12)保存
吸出收集培养瓶中饥饿培养48小时后的干细胞培养上清，进行离心，弃沉淀，收集干细胞培养上清，用5KD透析袋进行浓缩，浓缩，获取分子量在5000以上的干细胞分泌因子；在上述浓缩后的干细胞培养上清中加入质量百分比浓度0.5-5％(优选1％)的白花檵木提取物的DMEM培养基作为干细胞培养上清的保护剂，放入0-8℃的冰箱保存。
优选加入保护剂后，细胞的浓度为1x104-1x106个/ml。
本发明的保护方法确保脐带间充质干细胞培养上清在低温(0-8℃)条件下保存15天，干细胞上清中的总蛋白质含量基本不变，且EGF、VEGF和TNF-α含量均没有明显改变，延长干细胞上清液在低温条件下的存放时间，降低保存和运输成本。
附图说明
图1、不同阶段和时期间充质干细胞镜下形态特点(40倍)：脐带间充质干细胞呈纺锤形生长。
图2、流式细胞仪鉴定脐带间充质干细胞免疫表型表征
流式细胞术检测结果表明，表面抗原CD105,CD73和CD44阳性率大于96％,而CD34,CD45,CD31,CD146和HLA-DR不足1％，保证了脐带间充质干细胞的纯度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
白花檵木提取物的制备：将白花檵木鲜材料破碎，采用水煮、水提醇沉或乙醇提取，溶剂为水或50-90％的乙醇；回流前浸渍20-50min，回流提取时间为50-80min，回流次数为1-2次，醇沉浓度为50-80％的乙醇；最后减压干燥得白花檵木提取物。
实施例1
一种脐带间充质干细胞培养上清低温(0-8℃)保存方法步骤如下：
(1)取足月健康胎儿脐带，用荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV,抗-HDV,抗-HEV,抗-HIV-1/2,HCV-RNA,HIV-1-RNA,CMV-DNA,检测结果均为阴性可用
(2)将手术室取出的脐带放入装有生理盐水的无菌培养瓶中，4度保存或运输至无菌实验室。入细胞培养室后，去除细胞培养瓶瓶口处的封口塑料，后放入处于运行状态的洁净台中。
(3)从4℃的冰箱中取出DMEM培养基，FBS,使其慢慢恢复至室温。
(4)脐带华通氏胶的剥离
准备培养皿：在百级洁净工作台中摆放至少6-8个10ml的无菌培养皿(可根据实际情况适当加减)，往第三个培养皿中加入20-40ml的75％酒精，其余皿中加入20-40ml的生理盐水备用。
去除血渍：用无菌止血钳从细胞培养瓶中取出脐带并放入第一个培养皿中，使其浸泡在生理盐水中，反复冲洗去除脐带表面的血渍、粘液以及血管内血液，然后将脐带转移至第二个培养皿中重复洗涤，以彻底除去表面血渍。
浸泡酒精：将洗涤好的脐带放入装有75％的酒精的培养皿中，浸泡不超过2min消毒灭菌。
再次洗涤：将浸泡过75％酒精的脐带转移至第四个培养皿中，洗去脐带表面残余酒精。
剪切脐带：将洗涤后的脐带转移至第五个培养皿中，用无菌组织剪将脐带剪成2-3cm小段，再用镊子夹住在装有生理盐水的培养皿中洗涤，以清除脐带小段血管中的淤血和凝块。
剥离华通氏胶：用无菌有齿镊将小段脐带转移至空的无菌培养皿中，在脐带的一端脐静脉和脐动脉间的位置撕开一小口，沿着撕口将脐带平铺展开，使华通氏胶层完全裸露在表面，羊膜层处于底面，撕开脐静脉和脐动脉表面的胶体，找出一条脐静脉和两条脐动脉将其剔除，再用有齿镊将华通氏胶剥离，放入第六个培养皿中，待胶体剥离完后再用生理盐水进行洗涤两遍。
(5)组织块制备
剪切胶体：将洗涤后的华通氏胶剪切成1-5mm的组织块儿。
洗涤组织匀浆：用生理盐水将剪切后的组织块儿转移到盛有40ml生理盐水的离心管中，盖紧离心管，1000转离心5分钟。
(6)接种
根据离心的胶体沉淀体积与接种瓶数控制在1:1.5之间。将离心后的组织匀浆去除上清后，平均加到T150培养瓶中，再用一根5ml移液管将他们平铺到整个培养瓶底面。
(7)华通氏胶的培养
平置培养瓶，然后放置于CO2培养箱中，往培养瓶中底部加入20ml含有5％-10％fbs的DMEM基础培养基，然后缓慢让它浸润整个组织块。
培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％.
(8)换液
第一次换液：脐带华通氏胶培养到第5天进行全量换液。将培养瓶缓慢地平放于超净工作台内，打开培养瓶盖子缓慢倾斜瓶子将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，再用10ml移液管往培养瓶中缓慢加入20ml含有5％-10％fbs的DMEM基础培养基培养基，平置培养瓶使组织块尽量分布于整个底面，放置到从CO2培养箱中继续培养
第二次换液：脐带华通氏胶培养到10天后，重复第一次换液的操作。
(9)收获原代细胞
从4℃的冰箱中取出DMEM培养基、FBS、胰酶，使其慢慢恢复至室温，留待后用。
细胞观察：脐带华通氏胶培养到14-16天，将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获。
(10)原代细胞收获
去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，并用移液器吹打，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入离心管中。
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入少量生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次。
消化：往洗涤后的培养瓶中加入胰酶消化液，每个3ml，使每个培养瓶的下消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min左右，然后摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，待大部分贴壁的组织块脱落，镜下观察90％的细胞脱落变圆后停止消化。
终止消化：往预终止消化的培养瓶中每瓶加入5ml新鲜培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，使终止液和消化的细胞充分接触稀释，再用10ml移液管将培养瓶内的细胞悬液和组织块吸起来，加入到50ml离心管中。
离心：将过滤后收集到的细胞悬液配平后放入离心机中，1000转离心5分钟。
(11)原代细胞传代(P0传P1)
将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入适量的培养基，将细胞沉淀吹打均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数。
制备种瓶用的细胞悬液离心管：根据最终传代的T150培养瓶的数量、及生物安全柜一次能放T150培养瓶的数量，取一定数量的空的50ml离心管，再将重悬后的细胞悬液定容到一定体积，均分到空的离心管中，然后用培养基将分装的后细胞悬液定容到一定体积，使每个离心管中的细胞浓度相同。
种瓶：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入培养基20ml
摇匀并标记：将加好的培养瓶平放于工作台上，在瓶子底部标记好该代次细胞编码、传代瓶数、传代日期，使细胞均匀的平铺到整个培养瓶的表面。
放入CO2培养箱：将摇匀后的培养瓶以5个为一摞放入到培养箱中，37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度培养至细胞融合度达到80-90％。
(12)干细胞培养上清
重复【9】-【11】步骤，细胞传代至第四代P4，养至细胞融合度达到80-90％。
除去培养瓶中的培养基，并用20ml生理盐水，清洗2-3次。
吸尽培养瓶中生理盐水缓冲液，加入10-15ml的DMEM培养基，饥饿培养48小时。
(13)保存
用移液管吸出收集培养瓶中饥饿培养48小时后的干细胞培养上清，加入到50ml离心管中，300g离心5min，弃沉淀，收集干细胞培养上清，用5KD透析袋进行浓缩，浓缩10倍，获取分子量在5000以上的干细胞分泌因子
在浓缩后的干细胞培养上清中加入10％体积的1％浓度白花檵木提取物的DMEM培养基作为干细胞培养上清的保护剂，以添加保护剂的干细胞培养上清做对照，放入4℃的冰箱保存。
用CCK-8分别测定4℃保存前与保存15天后的加入檵木保护液和未加檵木保护液的各组干细胞培养上清的蛋白质浓度。
用ELISA方法分别测定两组干细胞培养上清中的表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)以及肿瘤坏死因子(TNF-α)，详见表2。
表1是干细胞培养上清的总蛋白质含量
天数 干细胞上清 上清加保护剂
0天 530μg/ml 528μg/ml
15天 289μg/ml 478μg/ml
表2干细胞上清因子含量的变化
0天 无保护液添加组(Pg/ml) 檵木保护液添加组(Pg/ml)
EGF 31 29
VEGF 215 190
TNF-a 13 15
15天 无保护液添加组(Pg/ml) 檵木保护液添加组(Pg/ml)
EGF 10 21
VEGF 93 165
TNF-a 39 28

Claims (7)

1.一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取足月健康胎儿脐带，用荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV,抗-HDV,抗-HEV,抗-HIV-1/2,HCV-RNA,HIV-1-RNA,CMV-DNA,检测结果均为阴性可用
(2)将手术室取出的脐带放入装有生理盐水的无菌培养瓶中，4℃保存或运输至无菌实验室；入细胞培养室后，去除细胞培养瓶瓶口处的封口塑料，后放入处于运行状态的洁净台中；
(3)从4℃的冰箱中取出DMEM培养基，FBS,使其慢慢恢复至室温；
(4)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；
(5)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(4)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-5mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；
(6)接种
将步骤(5)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(7)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(6)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5％-10％胎牛血清的基础培养基(DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；
培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(8)换液
第一次换液：步骤(7)脐带华通氏胶培养到第5天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等量的含有5％-10％胎牛血清的培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；
第二次换液：脐带华通氏胶培养到10天后，重复第一次换液的操作；
(9)收获原代细胞
细胞观察：脐带华通氏胶培养到,14-16天后，将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；
(10)原代细胞收获
配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液；
去除旧的培养液：摇晃培养瓶并用移液器吹打，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；
消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；
终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入含有胎牛血清的DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；
(10)原代细胞传代(P0传P1)
将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有胎牛血清的DMEM培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有胎牛血清的DMEM培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％；
(11)干细胞培养上清
根据步骤(9)-(10)，细胞传代至第四代P4；
除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水液，加入DMEM培养基，饥饿培养48小时；
(12)保存
吸出收集培养瓶中饥饿培养48小时后的干细胞培养上清，进行离心，弃沉淀，收集干细胞培养上清，用5KD透析袋进行浓缩，浓缩，获取分子量在5000以上的干细胞分泌因子；在上述浓缩后的干细胞培养上清中加入质量百分比浓度0.5-5％的白花檵木提取物的DMEM培养基作为干细胞培养上清的保护剂，放入0-8℃的冰箱保存。
2.按照权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，脐带华通氏胶的剥离并洗涤：在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤。
3.按照权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，步骤(10)原代细胞传代，接种时：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中。
4.按照权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，白花檵木提取物的浓度为1％。
5.按照权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，步骤(12)加入保护剂后，细胞的浓度为1x104-1x106个/ml。
6.按照权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞培养上清低温保存方法，其特征在于，白花檵木提取物的制备：将白花檵木鲜材料破碎，采用水煮、水提醇沉或乙醇提取，溶剂为水或50-90％的乙醇；回流前浸渍20-50min，回流提取时间为50-80min，回流次数为1-2次，醇沉浓度为50-80％的乙醇；最后减压干燥得白花檵木提取物。
7.白花檵木提取物用于脐带间充质干细胞培养上清低温0-8℃保存中。
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