JPS63501056A - 運動性精子の選択方法および手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 選択方法および手段 本発明は、流体試料例えば射精物から運動性精子を選択するための改善された試 験管内方法に関する。本発明は、前記選択方法をも含む。

不本意に子供ができないということは関係者にとって大きな問題であり、それ故 、その状態の原因をつきとめるべく幾多の研究がなされている。男性の側に関す る限り、射精物中の精子濃度についての精子試料の品質、および精子細胞の形態 と運動性に主な関心が注がれている。

受精力状態評価のために普通に用いられるルーチンにおいてこれら基準の中でも 射精濃度が他のものよりも信頼性の高い基準であるように思われる。通常新鮮な 射精物は優れた運動性を有しそして前方向に高速移動する細胞から迷走的運動ま たは全面的な非運動性により特徴付けられる精子細胞に至るまでの全範囲を含む 広範囲の運動性を有する様々な精子細胞を示すであろう。従って、所定量の流体 中に存在する精子細胞の数にのみ基づく受精力評価は信頼性のないものであって 、精子運動性を定性分析した方が男性受精力評価のためのより良い基礎が与えら れる。精子試料中の精子運動速度および運動性精子の相対割合は多くの方法、例 えばＫｒｅｍｅｒ法により研究されている（　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｆｅｒｔｉｌ、 １０／１９６５／Ｌ２０９−２１５゜例えばり、　Ｂｌａｓｃｏ、　Ｆｅｒｔｉ ｌｉｔｙ　ａｎｄ　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ　４１　（１９８４）　ｐ。

１７７＝　１９２も参照されたい）。これらのおよびその他の論文は精子の子宮 頚管粘液（ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｍｕｃｕｓ）侵入能の研究の試みを記載している 。これらの実験においては、子宮頚管粘液を一端をシールした毛細管に吸引し、 次いで他端を精液（所望により希釈）または精液から単離された精子細胞の懸濁 液と接触させる。適当な時間の後、管を顕微鏡で調べ、そして粘液媒質に侵入し た精子数を測定する。しかしながら子宮頚管粘液の質は女性ごとに、また同じ女 性であっても月経周期の時期により異なるのでこのタイプのテストを標準化する ことは難しい。更に子宮頚管粘液試料は入手が困難であり、また試験管内方法に 対し試料を不適にする成分を含有する。子宮頚管粘液試料は低い貯蔵特性を有し 、滅菌し難く、また伝染性作用体（ａｇｅｎｔ）を伝染させる点で害を伴う。

そこで精子に対する天然の侵入媒質（すなわち子宮頚管粘液）の前記欠点を回避 するために、各種物質の水溶液よりなる代替物が用いられるに至っている。以下 の記載および請求の範囲において、かかる代替物を前述の精子用天然侵入媒質に 対するものとして「精子用水性人工侵入媒質」（あるいは単に「侵入媒質」また は「媒質Ｊということにする。これまでに様々なタイプのかかる人工媒質が記載 されている。この目的に用いられる生理学的塩溶液は低分子物質を含有し、また 時には高分子物質例えばアルブミンなどをも含有する。かかる溶液は（例えば生 理学的に許容し得る緩衝剤を添加することにより）精子にとって適切でありかつ 生理学的に許容し得るｐｌ値が与えられ、またそれらは精子にとって生理学的に 許容し得る物質、例えば塩類、栄養素、活性化物質、キャパシテーション（受精 能獲得）に影響を及ぼす物質、微量元素などを含有してもよい。これらの例とし ては、血漿または血清中に存在する物質が挙げられる（かかる媒質に対しては血 清が適切な添加剤である）。添加剤により溶液の浸透圧を調節して精子に適した 値を得ることも可能である。それら溶液は媒質中での微生物増殖を防止する添加 剤、例えば抗生物質を含んでいてもよい。精子が中で生存できそしてそれらの運 動性および受精能を維持できる適当な溶液を記載した包括的な文献が存在するが 、これらの溶液は侵入媒質として有用である。

それらは例えば名前も当業者によく知られた周知の生理学的媒質よりなる。すな わち例えば所望により更なる添加剤例えば緩衝物質、アルブミンまたは血清など で改変されたＲｉｎｇｅｒ、　Ｋｒｅｂｓ−ＲｉｎｇｅｒｌＴｈｙｒｏｄｅ、　 ＢＨ，ＨａｍｓＨＡＴ、　ＢａｋｅｒＳＥａｇｌｅ、　Ｅａｒｌなどである。（ いくつかの例は次の参考刊行物に与えられている。すなわちＥｒ１ｃｓｓｏｎｅ ｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　２４６（１９７３）　ｐ、４２１−４２４．　Ｌｏ ｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ　２７（１９７６）　ｐ、６ ７７−６８４．　Ｋｏｐｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｕｒｏｌｏｇｙ　 ５１（１９７９）　ｐ、５８７−５９０．　Ｗｏｌｆ　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ａ ｎｄｒｏｌｏｇｙ　３（１９８２）ｐ、４４５−４５１．　Ｂｅｅｒｎｉｋ　ｅ ｔ　ａｌ、。

Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ　３ｇ（１９ｇ２）　ｐ、４ ９３−４９５およびＰｒａ、ｓａｄ　Ｉｎｔ　Ｊ、　Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ　７（ １９８４）　ｐ、５−２２）所定の精子を受精に用いる場合、それらは欠陥のな いものでなければならない。それらは受精能があり、良好な運動性を有しそして 例えばヒアルロニダーゼの完全な酵素産性を示す必要があり、またかかる精子が 中に存在精子細胞が中に移動していくことのできる侵入媒質層によって十分な運 動性を有する精子の選択を行う方法にはいろいろある。最も普通の処理方法は侵 入媒質層を精子含有流体試料の上に重ねた後、運動性精子を重層中へ泳動させる ことによりなる。もう一つの処理方法は例えば侵入媒質層を精子含有流体試料の 下に置くようにすることよりなるが、精子細胞はその場合下方に向かって下層中 に泳動しなければならない。媒質の密度と流体試料の密度はその手順に適切にあ うように選択される。一般に侵入媒質層は全くの均質層であるが、わずかに組成 の異なる複数の層を通して精子が移動できるようにすることよりなる別の手順を 用いることも可能であり、あるいは精子を媒質中に存在するーまたはそれ以上の 物質について濃度勾配を有する層を通過させてもよい。

人工侵入媒質中への移動による精子選択方法は診断に利用できる。例えば層中に 移動する精子の数およびそれらの移動速度を調べることができる。この方法は更 に受精に用いるべき良好な運動性を有する精子の選択に利用することもできる。

この場合に侵入媒質層中に移動した精子細胞は分離され、そして必要に応じ、こ のようにして抜出された精子懸濁液は例えば遠心分離などにより濃縮された後、 少量の同じ媒質または他の媒質に再懸濁される。

例えばＷｏｌｆおよび５ｏｋｏｌｏｓｋｉ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｄｒｏ ｌｏｇｙ３（１９ｇ２）Ｉ）、４４５−４５１）およびＰｒａｓａｄ（Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ７（１９８４）　］）、５−２２）に記載の 方法では試験管底部の特定量の精液をその下の媒質上に注意深く重層されたアル ブミン含有媒質と接触さ仕る。その試験管を次にやや斜位に傾けて媒質層の接触 表面を高めた後３７℃で約１時間侵入を進行さする。上清を取り、その中の精子 を遠心分離により濃縮した後、再懸濁−遠心分離手順を繰り返すことにより洗浄 する。最終的精子ペレットを適−当な媒質に再懸濁しそして精子の量を測定する 。

しかしながら、試験管内受精に最も普通に用いられる手順は次のものである。す なわちアルブミン含有媒質で希釈した精液を試験管内に遠心沈降させ、上清を除 去し、そして試験管底部の固体物質ベレットを再懸濁する。洗浄を効率的に行う ためにこの方法を所望により数回繰り返す。この方法はもとの試料の欠陥のある 非運動性の精子やその他の不溶成分から活力のある運動性精子を分離するもので はないことに留意すべきである。

従来技術が十分満足できるものではないことから、精子用侵入媒質を用いて運動 性精子を欠陥精子および他の成分から選択するための改良された、簡素で再現性 あるしかも緩和な方法が大いに望まれている。精子運動性を定量分析するために も定性分析するためにも、そしてまた例えば試験管内および生体内受精用の精子 材料を調製するなど他の目的のためにも改良された方法が望まれている。

今般、前述の如き侵入媒質を用いた運動性精子選択方法はその侵入媒質に精子細 胞に対して生理学的に許容でき、水溶性であって、またそれ故に媒質中の溶存状 態で存在するヒアルロン酸塩を添加含有させることにより著しく改善できること を見出した。驚くべきことに前記精子細胞用水性人工侵入媒質をヒアルロン酸の 水溶性で生理学的に許容し得る塩を付加的に含めるように補填することが極めて 好ましい便法であることを見出した。この改良された侵入媒質はまず第一に人間 の精子選択スクリーニングに対して意図されるが、その他のタイプの精子、好ま しくは哺乳動物の精子、例えば家畜の精子に対する選択操作にも用いることがで きる。

すなわち本発明は、水性精子含有試料を精子細胞用水性人工侵入媒質層と接触さ せることにより運動性精子細胞を前記精子含有試料から前記層中に移動させるこ とよりなり、そして前記侵入媒質中にヒアルロン酸の水溶性で生理学的に許容し 得る塩を配合することを特徴とする、水性精子含有試料からの運動性精子細胞の 試験管内分離方法に関する。

本発明はまた、侵入媒質中に移動した精子細胞を例えば受精、例えば試験管内受 精などのために回収することを特徴とする前述の方法をも包含する。

本発明はまた、前述の如くして得られた精子細胞を用いることを特徴とする受精 、例えば試験管内受精をも包含する。

更に本発明は、前記方法を実施するための手段、すなわちヒアルロン酸の水溶性 で生理学的に許容し得る塩を中に配合したことを特徴とする精子細胞用水性人工 侵入媒質をも包含する。

更にまた、本発明方法により、異なる速度で移動する精子細胞を相互に分離する ことができるが、これは所与の時間内にこれらの異なる精子細胞は侵入媒質層中 を異なる距離移動する、ことによるものである。所望により前記層の異なるレベ ノルから精子試料を採取してもよく、あるいは精子細胞を更に別の液層中に移動 させてそこで回　収してもよい。言うまでもなく、本発明はこの態様をも包含す る。

その塩（ヒアルロネート）をも包含するヒアルロン酸は、極めて特殊な性質を有 し、また例えばとさかから、あるいはあるタイプの微生物を培養することにより 得られる多糖類である。この多糖類の生理学的、化学的および物理化学的性質の 故に、多重酸性ヒアルロン酸の水溶性で生理学的に許容を得る塩（すなわち水溶 性で生理学的に許容し得るヒアルロン酸塩）を精子用侵入媒質中に配合すると該 媒質は意図された目的に対し、顕著に有用なものとなる。特定のヒアルロン酸の ２・水溶性で生理学的に許容し得る塩の選択に関しては、こ゛れはまず第一にナ トリウム塩（ナトリウムヒアルロネート）であろうが、他の水溶性で生理学的に 許容し得る塩を用いてもよい。

更にまた塩は２種以上の陽イオンがヒアルロン酸カルボキシルに対イオンとして 存在する混合塩であってもよい。

かかる陽イオンは例えば血漿中および品質の血漿代替溶液中に存在し、そして精 子用侵入媒質に通常用いられる２以上の陽イオンであってよい。これらのイオン は例えば中でも体液中例えば血漿、子宮液および精液中のこれらのイオンの生理 学的割合と実質的に同じオーダの大きさの割合で存在するように選択してもよい 。すなわち、このことはカリウムイオンよりもナトリウムイオンを多く存在させ ることを意味している。更に考えられることとして、生理学的に許容し得る有機 アミンを塩形成剤として用いてもよいが、ヒアルロン酸はそのナトリウム塩とし であるいは実質的にそのナトリウム塩として、そして侵入媒質それ自体のイオン と平衡状態で媒質中に存在させるのが好ましい。媒質に生理学的濃度のナトリウ ムおよびカリウムイオンを含ませるのが適切である。

起源、調製方法そして場合によっては分画方法に応じて極めて広い範囲の平均分 子量（偏）を有する水溶性で生理学的に許容し得る塩を得ることができる。平均 分子量（ん）ハ例えば１００，０００以上、例えば５０．０（１０以上、例えば １０．０００以上であってもよいが、例えば２０，０００，０００以下、例えば １０，０００，０００以下、例えば５，０００，００．０以下とする。

状況によって゛は５０，０００を超える、例えば１００，０００を超え、例えば １０，０００，０００または５，０００，０００以下の平均分子量（〜）を有す る高分子物質が選択される。約４，０００，０００までの分子量のヒアルロネー トのほか、例えば数十万の分子量あるいはそれよりも低い分子量の解重合ヒアル ロン酸トも商業的に入手できる。

ヒアルロネートを添加することにより、侵入媒質に適切であって、また実験条件 に応じてそして精子侵入法によって達成すべき目的に応じて任意に変えることの できる粘性を媒質に付与することもできる。媒質の粘性が高過ぎると精子細胞の 移動速度が低下し過ぎるのでこれは避けるべきである。それ故侵入媒質には３０ ０ｃＰ（センチポイズ、ゼロ剪断粘度、３７℃）以下の粘度を与えるのが好まし い。多くの場合、粘度を１００ｃＰ　以下、例えば５０ｃＰ以下あるいは例えば ３０ｃＰ以下とするのが好ましい。媒質の粘度は１ｃＰ　以上例えばほとんどの 場合２ｃＰ　以上、例えば５ｃＰ　以上、例えば１０ｃＰ　以上である。もちろ ん前記物質に対し選択された平均分子量が大きい程、・所望の・粘性を得るのに 必要な添加剤の量は少な・くてすむ二とｉは理解されよう。

実験糸＃３二応１じて、また精子侵入法により達成すべき目的に応Ｃて変えなが ら、辷アルロネートの平均分子量および濃度を各個のケースに最適なものとなる ように選択することができる。侵入媒質中のヒアルロネート濃度は０．０５Ｍ９ ７１１ρ以上とするのが好ましい。多くの場合その濃度は０．１ｇｙ／ｘ（１以 上、例えば０，２πｌ？　／　ｘ（とするのが好ましい。その濃度は１１ａ９　 ／　ＦｌＮ！以下とするのが好ましい。多くの場合、濃度を５　ｘｇ　／　ｍ（ ｌ以下、例えば２　ｒｔｇ　／　ｘρ以下とするのが好ましい。はとんどの場合 に濃度はそれ以下とし、粘度は前述の如＜３００ｃＰ以下、例えば１００ｃＰ以 下とするのが好ましい。達成すべき目的が例えば診断方法である場合には、例え ば約４，０００，０００などという極めて高分子量のヒアルロネートを用いると きには約０．０５〜２　Ｍ９／　ｍＱの濃度で最良の結果が得られること、例え ば約２００，０００などという比較的低分子量のヒアルロネートを用いるときに は約０．０５〜４ｍり／　ｍ（ｌの濃度で最良の結果が得られること、そしてこ れらの場合における好ましい範囲は０．１〜２、例えば０．５〜１　、５ｍｇ　 ／　ｖｒ（ｌであることを見出した。実験による研究によれば、本発明による侵 入媒質を調製する場合に、少なくとも約１００，０００〜７，０００，０００の 範囲内では分子量は臨界的パラメータではないことが示された。

運動性精子細胞の分離方法について、またこの目的に用いられる水性人工侵入媒 質について最初に述べたことは本発明の方法および媒質についてもあてはまる。

すなわち例えば本発明の改良された媒質には、精子にとって適切でありまたそれ らにとって生理学的に許容し得る範囲のｐＨ値が与えられ（例えば生理学的に許 、容し得る緩衝剤、例えばホスフェートまたは重炭酸塩緩衝剤、例えば燐酸ナト リウム緩衝剤などを添加することにより生理学的に正常なｐＨ値とする）；この 改良された媒質は本明細書の導入部で説明したとおり生理学的に許容し得る物質 〔例えば次の群のうちの１以上の群より選択される１以上の物質：塩類、例えば ナトリウム、カリウムおよびカルシウムの塩化物、酢酸塩、乳酸塩（選択される 陽イオン濃度は生理学的濃度とするのが好ましい）；栄養素例えばグルコース、 ガラクトース；タンパク質例えばアルブミン；血清、好ましくは５６℃で３０分 間熱失活させたちの；所望により（例えば５％の）Ｃ０２を含有する空気と平衡 させる；等々〕を含有してもよく；また媒質の浸透圧は精子にとって適切な値と なるよう調節してもよい。

本発明の媒質はヒアルロン酸の水溶性で生理学的に許容し得る塩を前述の精子用 水性人工侵入媒質に配合することにより製造することができる（ヒアルロネート の平均分子量とその濃度および媒質は前述の如く選択することができる）。水性 溶液を調製する際の成分添加順序は言うまでもなく、本発明思想から逸脱するこ となく様々に変えることができる。望ましい濃度のヒアルロネートを含む侵入媒 質は無菌的に調製してもよく、あるいは所望により滅菌してもよい。媒質は使捨 て可能なユニットパッケージの形で、あるいは精子選択操作を複数回行うのに十 分な比較的多量の媒質を含む比較的大きなパックの形で提供することもできる。

本発明による改良された媒質は本発明方法を極めて信頼性のあるものとし、信頼 性がありそして再現性のある精子スクリーニング結果を与える。この媒質は精子 にとって好ましいものであり、媒質に移動した精子細胞については例えば２時間 を超える、例えば４時間を超えるような長い生存時間を得ることができる。この 媒質に移動した精子を受精に用いると高い受精度が得られる。更にこの媒質は卵 に対して実質的に無害である。

本発明を更に以下の実施例によって説明するがそれらは本発明の範囲を限定する ものではない。

−実施例　１ （ａ）０．７５容の５６℃で３０分間熱失活した人血清を０．５ｒ１９／　ｍ（ ｌのナトリウムヒアルロネート（Ｍｗは約４，０００，０００）を補填した１０ 容のＨａｍのＦＩＯ媒質〔例えばＳｉｇｍａ　Ｃｈｅ−ｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａ ｎｙ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）より商業的に入手でき、またＲ、　 Ｇ、　ｌ（ａｍ、　Ｅｘｐｔｌ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｒｅｓ、　３９（１９６３）　ｐ、５１５の論文に記載されている〕に添加しモ してｐｌｌを７．４に調節する。この侵入媒質を５％Ｃ０２を含有する空気下に 例えば３７℃で半時間保ってから使用する。

（ｂ）実施例１（ａ）と同様の媒質であるが、０　、３７７９／　７１１（！の ナトリウムヒアルロネートを含む。（ＭＷは約４，０００，０００）（Ｃ）実施 例１　（ａ）と同様の媒質であるが、０　、８ｘｇ　／　２（ｌのナトリウムヒ アルロネートを含む。（馬は約４，０００，０００）（ｄ）実施例１（ａ）と同 様の媒質であるが、血清は添加せずその代わりに５　ｚｇ　／　ｍ（ｌの人血清 アルブミンを用い。

る。

（ｅ）２ａｙのナトリウムヒアルロネート（Ｍｗは約３，６００，０００）およ び８．５即のＮａＣＱを含有しそして燐酸ナトリウム濃度が０．００２Ｍである １　ｘ（ｌの溶液（ｐＨ７，４）を１　蛇のＥａｒｌｅの平衡塩溶液（例えば前 記同様Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍ−ｐａｎｙ社より入手）および０ ．１祿の人血清（５６℃で３０分間熱失活させたもの）と混合する。このように して得られた侵入媒質を５％Ｃ０２含有空気の下に３７℃で３０分間保ち、そし てｐＨ値を約７．４に調節する。

０、　、０５〜８　ｍｇ　／　ｍＱのヒアルロネート（分子量１３０，０００〜 ７．０００，０００）濃度範囲をカバーする一連の侵入媒質を前記実施例と同様 にして調製した。一部の実験においてＥａｒｌｅの媒質（例えば前記同様Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ社より入手）または他の何らかの細胞 培養培地を用いた。

実施した侵入試験の結果は、高分子量例えば約１．０００，０００以上のヒアル ロネートを用いた場合には、約０．０５〜２ｍｇ　／　ｘｇの濃度で最良の結果 が得られることを示した。低分子量のヒアルロネート（例えばＮｔｗは１６０， ０００）を用いる場合には濃度を約４１１ｇ／πＱに増加させることができる。

診断試験に好ましい範囲は０，１〜２次ｆ！／靜、特に０．５〜１．５Ｒｇ／π ρである。

実施例　２ 精子侵入実験の実施には例えば毛細管（例えば長さ４〜７　ｃｍであり１０７ｍ の内容積を有するもの）を用いることができる。この毛細管に本発明の改良され た侵入媒質゛（例えば実施例Ｉと同様にして調製された媒質）を充填する。毛細 管の上側開口部をシールし、そして管の下側部分を射精物試料を容れた小容器内 に導入する。毛細管内の精子侵入を例えば３７℃で１時間進行させる（所望によ りこれを５％ＣＯ２含有空気の下で行ってもよい）。

精子侵入は顕微鏡で観察することができ、精子の移動距離を測定し、その測定値 から移動速度を算出する（Ｉ／ｓｅｃ単位が適当である）。このようにして例え ば他をはるかに引き離した精子の移動速度を算出でき、従っていわゆるトップ値 を得ることができるほか、媒質中に入り込んだ他のすべての精子細胞の大部分の 移動速度（これがいわゆる基礎値である）を算出することもできる。更にトップ 値に近い速度で移動した精子細胞の量を評価することができる。例えばトップ値 は９．６ｐ／ｓｅｃで、基礎値は例えば４〜６μ／ｓｅｃであり得る。並行試験 は再現性の良好な値を与えるであろう。この侵入試験は例えば診断目的に利用す ることができる。

実施例　３ 短いパスツールピペットの先端を溶融によりシールする。０．２５πρの射精物 試料をシールされたピペット管の底部に管を垂直位に保ちながら挿入する。０． ２５７１１ｆ！の本発明による改良された侵入媒質（例えば実施例１によるもの ）を精子含有底部相上に重層する。その底部相から侵入媒質上層中への精子細胞 の侵入を３７℃で進行させる（所望によりこれは５％ＣＯ２含有空気の下に行っ てもよい）。

精子細胞が上方に移動して侵入層の上部に入ったところで（例えば６０分後）、 全侵入層の例えば２に相当するその上部を吸引により注意して取り出す。このよ うに抜出した試料は運動性精子細胞を含有する。この試料中に存在する精子は自 体公知の方法で受精目的（例えば試験管内受精）に用いることができる。

国際調査１￥［ｌ失

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．水性精子含有試料を精子細胞用人工侵入媒質層と接触させることにより連動 性精子細胞を前記精子含有試料から前記層中に移動させることによりなり、そし て前記侵入媒質中にヒアルロン酸の水溶性で生理学的に許容し得る塩を配合する ことを特徴とする、水性精子含有試料からの運動性精子細胞の試験管内分離方法 。
2. ２．前記侵入媒質層に移動した精子細胞を回収することを特徴とする請求の範囲 第１項記載の方法。
3. ３．前記侵入媒質層に移動した精子細胞を受精のために回収することを特徴とす る請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．前記侵入媒質層に移動した精子細胞を試験管内受精のために回収することを 特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．この目的のために請求の範囲第３項に従って得られた精子細胞を用いること を特徴とする受精。
6. ６．この目的のために請求の範囲第４項に従って得られた精子細胞を用いること を特徴とする試験管内受精。
7. ７．ヒアルロン酸の水溶性で生理学的に許容し得る塩を中に配合したことを特徴 とする精子細胞用水性人工侵入媒質。
8. ８．ヒアルロン酸の可溶性で生理学的に許容し得る塩の、精子細胞用水性人工侵 入媒質中の成分としての使用。