CN110079498A - 一种人胎盘间充质干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人胎盘间充质干细胞及其制备方法和应用,制备方法包括采集、分离、培养、冻存、检测、复苏等步骤。其中分离过程得到人胎盘绒毛膜组织块后只需爬片贴壁培养即可得到高纯度、高活性的间充质干细胞，不仅简化了工艺流程，节省了酶消化的成本，加快了原代细胞的贴壁和生长速率，缩短了细胞培养周期，而且避免引入较多外源干扰因素，使得工艺稳定性较易控制。本发明最终获得的人胎盘间充质干细胞的增殖能力相比其他类型的间充质干细胞更加稳定，传到P20代后依然能够稳定增殖，其细胞形态、分子表面抗原及成脂成骨分化潜能均符合国际细胞治疗协会对MSC鉴定的最低标准的规定。

Description

一种人胎盘间充质干细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人胎盘间充质干细胞及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是干细胞的一种，因能分化为间充质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成多种组织细胞，如可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞。间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。间充质干细胞广泛分布在骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中。其在多数组织中含量甚微，且不易获取而难以广泛应用。它首先在骨髓中被发现，随后分别在脂肪、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及脐带、脐带血、胎盘组织中被分离出来。由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。

作为要应用于临床细胞治疗的细胞产品，应当具有组织取材方便，来源广泛，不受伦理限制，分离过程简单等特点。而骨髓来源的MSC取材难，细胞增殖和分化能力受供体年龄限制，异体移植存在免疫排斥强等缺点，所以寻求一种来源丰富，干细胞含量高，取材方便，无创性并且不受伦理学限制的MSCs来源已然成为如今的研究热点。最近有研究发现，人胎盘来源间充质干细胞(placenta derived MSCs，PMSCs)具有自我更新和多向分化潜能，有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，不会发生免疫排斥反应，无致瘤性，这为各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。

胎盘是胎儿发育期的一个附属组织，在胎儿生产后被当作医疗垃圾废弃掉，不仅对环境造成污染而且对医学资源也造成重大浪费。Mihu(2008)等的研究均证实，被当做医疗垃圾丢弃的人类胎盘中存在大量的MSCs，研究表明PMSCs主要存在于羊膜、绒毛膜等来源于胎儿的组织，并且与绒毛的分布密切相关，多分布于绒毛内皮下以及绒毛附近间质内。胎盘由绒毛板、绒毛层、蜕膜构成，绒毛板外层由羊膜覆盖、内层由滋养层细胞覆盖，而脐带末梢血管则穿行其中，因此绒毛板在组织结构上保持相对独立性，是一种较易分离的胎盘组织。研究表明胎盘绒毛板中含有大量的间充质干细胞，所以从胎盘绒毛板分离提取间充质干细胞将会为间充质干细胞的实验研究和临床应用开辟一条崭新的道路。

从实体组织提取间充质干细胞的方法主要采用酶消化法。酶消化法是一种快速从实体组织提取间充质干细胞的方法，但这种方法获得的细胞包含多种细胞成分，往往采取多种方法加以纯化，如密度梯度离心法、流式细胞仪分选、磁珠分选、血细胞裂解液去除血细胞等纯化方法。不仅酶的种类和酶溶液的配方影响酶消化法的作用效果，而且酶的使用还会引入多种外源干扰因素。因此，酶消化法不仅增加了生产成本，而且使工艺变得复杂，从而影响工艺的稳定性。

现有的胎盘间充质干细胞制备工艺存在诸多不足，如工艺复杂、生产成本高、细胞生长速度过慢，较多的外源干扰因素等。如中国专利CN101270349A公开了胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，该方法采用Ⅳ型胶原酶消化母体侧蜕膜胎盘组织，接着扩增获得分离得到的细胞，然后用正负磁珠进行分选纯化得到胎盘间充质干细胞。中国专利CN102586184A公开了建立胎盘间充质干细库的方法，该方法采用组织消化酶液(含dispase、胰酶、脱氧核糖核酸酶I、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶)消化胎盘小叶组织，通过克隆挑取扩增获得胎盘间充质干细胞，上述方法在工艺简化和生产成本降低方面还有待进一步提高。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种人胎盘间充质干细胞及其制备方法和应用。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种人胎盘间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)将采集到的胎盘放入含4万IU/L硫酸庆大霉素的胎盘保护液中，于2～8℃恒温条件下保存，并在36小时内送至采集地所属的干细胞库；

(2)采集母血，并进行传染病检测，检测通过后取出胎盘，弃去覆盖在外侧的羊膜，并用无菌手术剪取靠近脐带附着处的5cm²左右大小的胎盘绒毛膜；

(3)将剪取的胎盘绒毛膜放入盛有75％酒精的烧杯中浸泡10～15s；

(4)取出后用D-Hanks溶液清洗，并剔除附着在胎盘绒毛膜上的血管和绒毛组织；

(5)再次用D-Hanks溶液清洗步骤(4)所得的胎盘绒毛膜至没有血色；

(6)将清洗后的绒毛膜剪成1～3mm²的组织块；

(7)将步骤(6)中的组织块使用爬片法以每瓶≧200块的密度均匀接种，然后于37℃、5％CO₂条件下培养3～5小时，然后取出培养瓶，每瓶加入含10％胎牛血清的完全培养基15ml后继续放入培养箱中培养；

(8)培养5～7天后取出培养瓶，在显微镜下观察培养瓶壁，有少量大小不一、细胞数量密集的细胞团或者培养基已经变成黄色时，进行一次全量换液，继续培养3～5天，在显微镜下观察到多个大小不一、细胞数量密集的细胞团时，则获得人胎盘间充质干细胞原代细胞；

(9)将人胎盘间充质干细胞原代细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，离心处理，收集细胞，计数后按1×10⁴～2×10⁴个细胞/cm²的密度接种，然后添加完全培养基置于37℃、5％CO₂潮湿培养箱中传代培养；

(10)冻存：当传代培养的细胞达到80％以上融合时进行细胞冻存，将传代培养后的人胎盘充质干细胞加入冻存液后按2×10⁶～4×10⁶个细胞/mL密度冻存，冻存细胞经程序降温至-80℃过夜后转入液氮罐中长期保存；

(11)对步骤(10)获得的人胎盘间充质干细胞检测以下项目：细胞活性、细胞数量、支原体检测、无菌检测、细胞表面标志物，以确定制备出来的胎盘间充质干细胞是否符合间充质干细胞的一般特性及冻存要求；

(12)冻存细胞的复苏：取出冻存管于37℃融化，加入D-Hanks溶液混匀后离心，去除含有的冻存液和胎牛血清，加含10％胎牛血清的完全培养基重悬细胞，并于体积分数为5％CO₂、温度为37℃静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功；

(13)建立包含上述步骤所有信息的人胎盘间充质干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(10)的冻存细胞进行关联。

进一步地，所述步骤(2)中对胎盘的处理需在采集后36h内进行。

进一步地，所述步骤(9)中离心处理的条件为：转速2000～3000rpm，时间10min。

进一步地，所述步骤(9)传代培养过程中细胞接种密度为1×10⁴个细胞/cm²。

进一步地，所述步骤(9)和所述步骤(10)中的计数方法为将所得细胞悬液进行细胞计数，取50μl细胞悬液与50μl 0.4％台盼蓝混匀后，用移液器打入血球计数板中，静置1min后，显微镜下观察计数。

进一步地，所述步骤(10)中冻存液为胎牛血清：DMSO(二甲基亚砜)按照体积比＝7:3的比例混合而成。

进一步地，所述步骤(10)中冻存时细胞密度为2×10⁶个细胞/mL。

进一步地，所述步骤(12)中离心处理的条件为：转速1200～1800rpm，时间5～7min。

进一步地，所述完全培养基成分为：DMEM-F12(Gibco)、Egf(0.025ug/ml)、10％的胎牛血清。

第二个方面，本发明还提供一种人胎盘间充质干细胞，是采用上述方法制备。

第三个方面，本发明还提供上述人胎盘间充质干细胞在治疗疾病的细胞制剂、化妆品、保健品、药品上的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

(1)本发明的制备方法步骤简单，分离得到人胎盘绒毛膜组织块后只需爬片贴壁培养即可得到高纯度、高活性的间充质干细胞，不仅简化了工艺流程，节省了酶消化的成本，加快了原代细胞的贴壁和生长速率，缩短了细胞培养周期，而且避免引入较多外源干扰因素，使得工艺稳定性较易控制。

(2)本发明以人胎盘绒毛膜为材料提取间充质干细胞，从采集、分离到培养过程中层层把关，在保护液中添加硫酸庆大霉素，分离过程中对胎盘组织进行酒精浸泡，有效的减少霉菌、细菌的污染几率，同时选用硫酸庆大霉素也避免了细胞移植过程中可能引起的过敏反应。

(3)本发明在对人胎盘绒毛膜取材时剪取脐带周围富含间充质干细胞的绒毛膜，并彻底去除绒毛膜下层的毛细血管，可获得活性较好、种类单一的间充质干细胞。

(4)本发明获得的人胎盘间充质干细胞的增殖能力相比其他类型的间充质干细胞更加稳定，传到P20代后依然能够稳定增殖，其细胞形态、分子表面抗原及成脂成骨分化潜能均符合国际细胞治疗协会对MSC鉴定的最低标准的规定。

附图说明

图1为人胎盘绒毛膜组织贴壁培养7天后在组织块周围爬出的P0代细胞照片。图2为人胎盘绒毛膜组织传代后的P1代细胞照片。

图3为人胎盘绒毛膜组织传代后的P5代细胞照片。

图4为人胎盘绒毛膜组织传代后的P10代细胞照片。

图5为人胎盘绒毛膜组织传代后的P15代细胞照片。

图6为人胎盘绒毛膜组织传代后的P20代细胞照片。

图7为人胎盘绒毛膜组织P2代的细胞流式检测结果。

图8为人胎盘绒毛膜组织P5代的细胞流式检测结果。

图9为人胎盘绒毛膜组织P10代的细胞流式检测结果。

图10为人胎盘绒毛膜组织P15代的细胞流式检测结果。

图11为人胎盘绒毛膜组织P20代的细胞流式检测结果。

图12为人胎盘间充质干细胞成脂分化潜能检测结果。

图13为人胎盘间充质干细胞成骨分化潜能检测结果。

图14为人胎盘间充质干细胞标准曲线图。

图15为人胎盘间充质干细胞两种浓度下的生长曲线图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明具体实施例提供一种人胎盘间充质干细胞的制备方法，包括采集、分离、培养、冻存、检测、复苏等步骤。详见以下实施例。

实施例1

人胎盘的采集、运输和接收

经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿胎盘。胎盘采集之前产妇需做艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒等传染性感染性疾病检测，全部合格以确保安全性后方可采集。

将采集的胎盘，用生理盐水对胎盘组织进行清洗以除去胎盘组织周围的血液和胎粪防止污染，然后放入含有4万IU/升硫酸庆大霉素的胎盘保护液的无菌袋内，将无菌袋进行密封并放入采集盒，将采集盒及采集到的5ml母血一起放入恒温采集箱，胎盘保护液的成分为培养液；

4～8℃冷链运输，在36小时内用恒温采集箱将胎盘、母血样本及相关采集资料送至干细胞库，运输过程中要避免过度颠簸、温度变化和X光照射；

干细胞库对样本进行接收，登记相关信息后签字确认，并在数据库中录入胎盘样本采集和接收的相关信息。

实施例2

人胎盘间充质干细胞的分离

首先用体积浓度为75％酒精擦拭采集容器进行消毒后拿入超净工作台，无菌环境下打开胎盘采集容器，用体积浓度为75％酒精浸泡过的纱布擦拭容无菌采集袋周围的血液，打开无菌采集袋，用止血钳将胎盘从采集袋中转移到400mm²的圆盘中，胎儿面朝上。

用D-Hanks溶液将胎盘上的血丝冲洗干净，用灭菌过的镊子轻轻剥离羊膜暴露出羊膜下层的绒毛膜层，用18cm灭菌手术剪沿着脐带断面剪取脐带周围5cm²左右大小的绒毛膜层，剪取过程中应尽量沿着绒毛膜剪，去除连接在绒毛膜下的绒毛和毛细血管，将获得的组织放入150ml的无菌烧杯中，用75％的酒精浸泡10～15s，之后用D-Hanks溶液冲洗2～3次组织，并将组织置于肾形盘中；此步骤中的D-Hanks溶液成分为：氯化钠8g/L、氯化钾0.4g/L、磷酸氢二钠0.15g/L、磷酸二氢钾0.06g/L、碳酸氢钠0.35g/L。

用剪刀和止血钳剥去绒毛膜下层的绒毛组织和毛细血管，清理结束后将绒毛膜组织置于150ml的无菌烧杯中，用D-Hanks溶液反复冲洗2～3次。将清洗完成后的绒毛膜组织放入另外一个150ml无菌烧杯中，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成1～3mm²大小的组织块。

取3个75cm²培养瓶，将剪碎的胎盘绒毛膜组织平铺到培养瓶中，目测组织块不少于200块，置于体积分数为5％的CO₂、饱和湿度、37℃的细胞培养箱中培养，4h后向每个培养瓶中加入15mL完全培养基继续培养，5～7天换液一次，可根据细胞生长情况适当缩短或延长换液时间；分离完毕后，填写分离操作记录，并在数据库中录入分离的相关信息；完全培养基成分为：DMEM-F12(Gibco)、Egf(0.025ug/ml)、10％的胎牛血清；组织贴壁培养结果见图1。

由图1可知，贴壁培养7天后有少量细胞爬出组织块，培养14天后有大量细胞爬出组织块。

实施例3

人胎盘间充质干细胞的传代培养

显微镜下观察分离出的人胎盘间充质干细胞培融合度达到80％左右时，用0.25％胰蛋白酶(Gibco)进行消化处理，消化时，吸取胰蛋白酶加入到培养瓶内，平摊均匀，静置1～2分钟，在显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶，确保细胞完全消化下来后加入0.5ml胎牛血清终止消化，在培养瓶中加入适量D-Hanks溶液，将细胞悬液置于50ml无菌离心管内，吹打混匀，取适量细胞悬液检测细胞活率，并进行细胞计数，将剩余细胞悬液在2000r/min的条件下离心10min，然后收集细胞。

按照1×10⁴个细胞/cm²密度接种于T75培养瓶中，并加入10mL完全培养基进行传代培养。

一般2～3天细胞融合度可达80％，此时可进行再次传代，细胞融合度达80％时可进行再次传代，通过以上步骤可完成间充质干细胞的传代培养，根据需要重复上述操作进行P2、P3、P4……传代，如图2～6分别为传至第1代、第5代、第10代、第15代、第20代的人胎盘间充质干细胞，随着传代次数的增加细胞形态会有所改变，特别是从第10代开始，细胞生长速度开始减慢，细胞开始变得细长，成衰老的发展趋势。

填写细胞换液和传代记录，并在相对应的数据库中录入相关信息。

实施例4

人胎盘间充质干细胞的冻存

取出需要冻存的细胞，在倒置显微镜下观察细胞状态：梭形、紧密、漩涡生长，在T75培养瓶中的细胞融合度达到80％以上时，可进行间充质干细胞的冻存(按照本实施例的方法，在P1-P2代即可进行胎盘间充质干细胞的冻存)。

依照胎牛血清:DMSO体积比＝7:3的比例配置细胞冻存液4.5ml，混匀后放在4℃冰箱中静置30分钟以上。

将细胞置于超净台中，旋开瓶盖，吸取培养瓶中原有培养基9ml进行支原体检测，其余的培养基吸弃；向每瓶加D-Hanks液重复清洗，吸弃废液，然后每瓶加1.5ml浓度为0.25％的胰蛋白酶，平摊均匀，静置1～2分钟，在显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶，确保细胞完全消化下来，加入0.5ml胎牛血清终止消化，并加入适量D-Hanks溶液制成细胞悬液，取样3ml细胞悬液做细胞表面标志物检测，并检测细胞活率，进行细胞计数，之后2000r/min离心10min，离心结束后，取上清液进行细菌和支原体检测，然后收集细胞。

将收集到的细胞按密度2×10⁶～4×10⁶个细胞/mL重悬于9ml的胎牛血清中，平均加入到9个冻存管中，每管1ml，再分别添加0.5ml的冻存液，封盖后上下混匀，然后经梯度降温到-80℃后过夜，过夜后放置于液氮罐中长期保存。

细胞冻存完毕后，填写细胞冻存报告，并在相对应的数据库中录入冻存和储存的相关信息。

实施例5

人胎盘间充质干细胞的复苏

核实要复苏的细胞样本的信息和冻存位置，填写记录。

取一个保温的容器装入适量37℃温水，从液氮罐中取出1支需要复苏的细胞冻存管，迅速置于37℃温水中并不断晃动细胞冻存管，使冻存管中的液体迅速融化。

待液体完全融化后，加入D-Hanks液混匀后于1200～1800rpm离心5min，去除含有的冻存保护剂和胎牛血清，加入10ml完全培养基重悬细胞，并将悬液转移至T75培养瓶中，于5％CO₂、37℃细胞培养箱静置培养。

第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，继续观察细胞生长情况，根据细胞状态和融合度进行传代。

实施例6

人胎盘间充质干细胞的生物学特性鉴定

一、人胎盘间充质干细胞表面标记物检测

取实施例4中收集的待冻存的P1或P2代人胎盘间充质干细胞悬液3ml进行干细胞表面标记物检测，分别用流式抗体CD45、HLA-DR、CD73、CD105及对应的同型对照20μl进行标记，加入100μl细胞悬液，室温背光孵育30min。

加入1mlPBS液，用快速混匀器混匀，1500转离心5min。

离心结束后，弃去上清液，加入200μlPBS液，用混匀器混匀后上机检测。

通过FACSCalibur流式细胞仪检测，收取20000个细胞计数，用CellQuest软件获取和分析，其流式检测结果(P2代、P5代、P10代、P15代、P20代)见图7到图11，由图可以看出其P2～P20代细胞流式检测结果CD45及HLA-DR检测值均≦2％，CD73及CD105检测值均≧95％，均符合目前认可度较高的ISCT(国际细胞治疗协会)间充质干细胞委员会制定的一系列标准。

填写胎盘间充质干细胞表型检测报告，并将检测结果录入对应的数据库中。

二、人胎盘间充质干细胞传染感染性因素检查

(1)取实施例1中的母血样本进行乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、梅毒、巨细胞病毒等传染性感染疾病。

(2)取实施例4中的细胞培养液进行细菌、真菌和支原体检测，排除细胞污染。

人胎盘间充质干细胞多向诱导分化潜能的鉴定

(1)成脂诱导分化检测：取P3代人胎盘间充质干细胞按2*10⁴/cm²的密度接种于六孔板中，每孔加入2ml含10％胎牛血清的细胞培养液，待细胞融合度为80％时，弃去细胞培养液，用D-Hanks液洗涤2次，更换为成脂诱导培养液(含10％胎牛血清；10mg/L胰岛素；1μmol/L地塞米松；0.5mmol/L抗1-甲基-3-异丁基黄嘌呤；100μmol/L的吲哚美辛)，每4天更换一次诱导培养液，连续诱导21天左右，取出6孔板，弃去诱导液，用D-Hanks液洗涤2次，加入2ml 4％的组织细胞固定液固定15min，弃去固定液，用纯化水洗涤2次并用60％异丙醇浸洗，加入2ml油红O染色10min(饱和油红O原液：蒸馏水＝3:2，室温放置10min)，弃去染料，用纯化水洗涤3次，倒置显微镜下观察分析并拍照，显微镜下，可见红色脂滴广泛分布，表明该方法获得的人胎盘间充质干细胞具有成脂分化潜能，见图12。

(2)成骨诱导分化检测：取P3代人胎盘间充质干细胞按2*10⁴/cm²的密度接种于六孔板中，每孔加入2ml含10％胎牛血清的细胞培养液，待细胞融合度为80％时，弃去细胞培养液，用D-Hanks液洗涤2次，更换为成骨诱导培养液(含10％胎牛血清；100nmol/L地塞米松；10mmol/Lβ-甘油磷酸钠；0.2mmol/L抗坏血环酸)，每4天更换一次诱导培养液，连续诱导21天左右，取出6孔板，弃去诱导液，用D-Hanks液洗涤2次，加入2ml 4％的组织细胞固定液固定15min，弃去固定液，用纯化水洗涤2次，将水完全吸干后加入2ml茜素红S染色液染色25min，弃去染料，用纯化水洗涤3次，倒置显微镜下观察分析并拍照，显微镜下观察，茜素红S染色可见细胞浆中有大量的钙沉积，表明该方法获得的人胎盘间充质干细胞具有成骨分化潜能，见图13。

三、人胎盘间充质干细胞生长曲线检测

(1)标准曲线的绘制

胎盘间充质干细胞生长标准曲线的绘制，取P4代的胎盘间充质干细胞，设定五个细胞浓度分别为5*10³/μl、1*10⁴/μl、2*10⁴/μl、4*10⁴/μl、8*10⁴/μl，每个浓度做6个平行试验，接种于96孔板，在37℃，5％CO₂环境下培养，显微镜下观察，待细胞均贴壁后，每孔加入10μl CCK8，再放入培养箱培养20min后，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，将不接种细胞的培养液作为空白对照。各细胞浓度的平均吸光度减去空白对照组的吸光度，即为实际的吸光度。以细胞数量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，用SPSS17.0软件求得细胞生长的标准曲线为Y＝2.66*10^-6·X+0.002，线性相关系数为0.9972，见图14。

(2)生长曲线的绘制

取两个96孔板，在周围一圈加入空白培养液，在两个96孔板内剩余的孔(60)中分别接种100μl细胞浓度为5*10³/μl、1*10⁴/μl的P4代胎盘间充质干细胞细胞。接种24h后开始测定吸光度，测定方法与上述方法相同；每次做5个平行试验，之后每隔12h测定一次吸光度，共测定12次。以培养天数(t/d)为横坐标，以吸光度(450nm)为纵坐标绘制胎盘间充质干细胞的生长曲线，见图15。

由图15可以看出，在1～2d，两种浓度的胎盘间充质干细胞均处于潜伏期，增殖较为缓慢；在2～4d，1*10⁴/μl浓度的细胞进入对数生长期，生长迅速，在4～5.5d开始进入平台期，细胞生长速度减慢，在5.5～6.5d，细胞完全进入平台期，细胞生长缓慢；在2～5.5d，5*10³/μl浓度的细胞进入对数生长期，生长迅速，在5.5～6.5d时，细胞进入平台期，细胞生长缓慢。

综上，本发明主要通过人胎盘绒毛膜组织块爬片法，发明了一种工艺简单，生产成本低廉的胎盘间充质干细胞的制备方法。并通过生物学鉴定确认其符合间充质干细胞的特点，同时通过成脂与成骨诱导分化实验再次验证了其具有多向分化的潜能。间充质干细胞，作为现在生物领域研究的热点细胞之一，在自身免疫疾病、移植物抗宿主病、心脑血管疾病等治疗方面具有突出的疗效，其临床应用的有效性及安全性已经得到了大家的共识，国内外已有多项间充质干细胞相关应用制剂应用于临床的研究，且更多的临床试验正在进行或申请。本发明作为一种十分有潜力的间充质干细胞的提取制备方法，十分适合大规模标准化生产，所生产的干细胞不仅可以为现代医学研究提供高品质的临床级间充质干细胞产品，也可以应用在在美容护肤、新药研发等方面。并且，随着现代医学研究的不断发展，间充质干细胞应用领域的不断拓展，人们对于间充质干细胞的需求量也将不断上涨。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种人胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将采集到的胎盘放入含4万IU/L硫酸庆大霉素的胎盘保护液中，于2～8℃恒温条件下保存，并在36小时内送至采集地所属的干细胞库；

(2)采集母血，并进行传染病检测，检测通过后取出胎盘，弃去覆盖在外侧的羊膜，并用无菌手术剪取靠近脐带附着处的5cm²左右大小的胎盘绒毛膜；

(3)将剪取的胎盘绒毛膜放入盛有75％酒精的烧杯中浸泡10～15s；

(4)取出后用D-Hanks溶液清洗，并剔除附着在胎盘绒毛膜上的血管和绒毛组织；

(5)再次用D-Hanks溶液清洗步骤(4)所得的胎盘绒毛膜至没有血色；

(6)将清洗后的绒毛膜剪成1～3mm²的组织块；

(7)将步骤(6)中的组织块使用爬片法以每瓶≧200块的密度均匀接种，然后于37℃、5％CO₂条件下培养3～5小时，然后取出培养瓶，每瓶加入含10％胎牛血清的完全培养基15ml后继续放入培养箱中培养；

(8)培养5～7天后取出培养瓶，在显微镜下观察培养瓶壁，有少量大小不一、细胞数量密集的细胞团或者培养基已经变成黄色时，进行一次全量换液，继续培养3～5天，在显微镜下观察到多个大小不一、细胞数量密集的细胞团时，则获得人胎盘间充质干细胞原代细胞；

(9)将人胎盘间充质干细胞原代细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，离心处理，收集细胞，计数后按1×10⁴～2×10⁴个细胞/cm²的密度接种，然后添加完全培养基置于37℃、5％CO₂潮湿培养箱中传代培养；

(10)冻存：当传代培养的细胞达到80％以上融合时进行细胞冻存，将传代培养后的人胎盘充质干细胞加入冻存液后按2×10⁶～4×10⁶个细胞/mL密度冻存，冻存细胞经程序降温至-80℃过夜后转入液氮罐中长期保存；

(11)对步骤(10)获得的人胎盘间充质干细胞检测以下项目：细胞活性、细胞数量、支原体检测、无菌检测、细胞表面标志物，以确定制备出来的胎盘间充质干细胞是否符合间充质干细胞的一般特性及冻存要求；

(12)冻存细胞的复苏：取出冻存管于37℃融化，加入D-Hanks溶液混匀后离心，去除含有的冻存液和胎牛血清，加含10％胎牛血清的完全培养基重悬细胞，并于体积分数为5％CO₂、温度为37℃静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功；

(13)建立包含上述步骤所有信息的人胎盘间充质干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(10)的冻存细胞进行关联。

2.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(9)中离心处理的条件为：转速2000～3000rpm，时间10min。

3.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(9)传代培养过程中细胞接种密度为1×10⁴个细胞/cm²。

4.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(9)和所述步骤(10)中的计数方法为将所得细胞悬液进行细胞计数，取50μl细胞悬液与50μl0.4％台盼蓝混匀后，用移液器打入血球计数板中，静置1min后，显微镜下观察计数。

5.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(10)中冻存液为胎牛血清：DMSO(二甲基亚砜)按照体积比＝7:3的比例混合而成。

6.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(10)中冻存时细胞密度为2×10⁶个细胞/mL。

7.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤(12)中离心处理的条件为：转速1200～1800rpm，时间5～7min。

8.根据权利要求1所述的一种人胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述完全培养基成分为：DMEM-F12(Gibco)、Egf(0.025ug/ml)、10％的胎牛血清。

9.一种人胎盘间充质干细胞，其特征在于，是采用权利要求1～8任意一项权利要求所述的制备方法制备。

10.权利要求9所述的人胎盘间充质干细胞在治疗疾病的细胞制剂、化妆品、保健品、药品上的应用。