KR970000783B1 - 생육 세포의 라벨링(Labelling) - Google Patents

생육 세포의 라벨링(Labelling) Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

생육 세포의 라벨링(Labelling)
본 발명은 세포의 헝태나 기능에는 해로운 영향을 미치지 않고 생육세포만을 라벨링되게 하는 신규 공정에 관한 것이다.
면역학과 세포 생물학에서 많은 세포의 특징적인 성격을 알기위한 분석기술로써 형광 검출법이 사용된다. 형광측정법의 잇점은, 하나의 염료분자가 흥분되어서 초당 천배의 빛을 방사하면서 많은 광량자로써 지면상태로 돌아온다는 것이다. 따라서 만일 하나의 항체분자가 둘 또는 세개의 염료분자로 라벨되면, 하나의 항원-항체 결합 부위로부터 수천 광량자의 빛을 얻을 수 있다. 이것은 매우 큰 신호 중진기술이다.
백혈구를 감별하는데 디옥시카르보시아닌 염료가 사용되어 왔다. 군트 발렐의 막스 플란크 게스 위센츠 ; 특허 승인번호 84-1023017/17의 선택적인 염색과 부피측정 및 형광에 의한 혈구의 동시 정량결정 참조.
그러나, 이러한 연구에서 사용된 염료들은 짧은 사슬의 카르보시아닌 염료(10개 이하) 이어서 막전위의 변화에 반응한다. 게다가 짧은 사슬의 카르보시아닌 염료는 세포의 미트코트리아에 들어가서 독성을 띠며, 세포를 세척하면 세포의 막전위의 변화와는 관계없이 세포의 바깥으로 쉽게 새어나온다. 본 발명의 긴사슬 염료는 세포막에 제한되며 막전위에 의해 극 최소로만 영향을 받는다. 이것은 세포밖으로 새어나오지 않는다.
백혈구 감별을 위해 사용되는 다른 형태의 염료들은 시아닌 형태의 염료가 아니며 지질속으로 분할하지 않는다. 백혈구의 종류를 분화하기 위해서 피릴리움이나 티아피릴리움 화합물이 사용되어 왔다. (다비드에스. 프랭크, 알. 티. 벨리, 특허승인번호 84-166275/27, 피릴리움이나 티아피릴리움 화합물로의 염색에 의한 생물 샘플의 세포 구별).
그러나 이 색소는 세포의 핵성분 및 세포질 성분과 결합하며 ; 특히 세포막과는 결합하지 않는다. 다른 양이온 염료들(엘. 카스, 특허승인번호 81-78187/43, 메타로의 염색에 의한 상이한 백혈구류의 결정 : 염색질 양이온 염료, 엘. 카스, 미합중국 특허 제4,400,370, 1983년 8월 23일, 백혈구의 감별 결정을 위한 메타크로마틱 염료 수착법, 엘. 카스, 특허승인번호 83-771982/39, 특정한 염기 염료로의 비고정화된 세포 염색에 의한 사람의 백혈구 분석)도 백혈구 감별을 위해 사용되어 왔으나, 이들 염료들은 막지질 속으로 분할하지 않고 세포내에 있는 여러 소기관을 염색한다. 백혈구 감별을 위해 사용된 또 하나의 메타크로마틱 염료는 아크리딘 오렌지이다.
(피. 제이. 나탈의 미합중국 특허 제4,336,029, 1982년, 6월 22일, 전혈액에 있는 망상 적혈구와 혈소판의 정량 결정을 위한 방법과 시약, 알. 제이. 게쉬만의 미합중국 특허 제4,325,706, 1982년 4월 20일, 전혈액에 있는 혈소판과 망상적혈구의 오토메이션 검출). 아크리딘 오렌지는 세포의 RNA와 DNA를 염색하며 막지질속으로 분할하지 않는다.
또다른 것에서는 악성 종양 세포로부터 정상세포를 분리하기 위해서 메로시아닌 540을 사용한다. 이 염료는 15개까지의 탄소로된 긴 탄화수소 꼬리를 가지나, 이 분자는 탄화수소 꼬리의 끝에 친수성 그룹을 가지고 있으며 세포가 빛에 노출되었을때 세포독성을 띤다. 발린스키, 제이. 이., 레쉬, 이. 와 에스톤, 티. 지., 미합중국 특허 제4,424,201, 1984년 1월 3일의 악성종양 백혈구 세포의 검출을 위한 메로시아닌 염료의 사용 참조, 메로시아닌은 정상세포막과 악성 종양세포막에 달리 결합된다.
지방족 사슬의 길이가 짧은 시아닌 염료들이 많은 생물검정에 사용된다. 그러나 이 짧은 지방족 사슬분자들은 막전위에 반응하며 세포막을 가로질러 세포의 미토콘트리아속으로 침투한다. 에이취, 엠. 사피로의 미합중국 특허 제4,343,782, 1982년 8월 10일 참조.
짧은 사슬의 시아닌 염료들도 세포에 유독하며 세포의 바깥으로 재빨리 새어나오기 때문에 생체내에서 세포를 탐지하는데 사용될 수 없다.
트리카보시아닌 염료들(폭스, 아이, 제이. 등의, 마이요 임상 공정 32 : 478-484, 1957)과 에반스-블루염료(스케드, 에이취 등의 유럽의 플뤼거구조 생리학지 370(2) : 139-144, 1977)은 희석법에 의한 심장혈액 박출량을 측정하기 위해서 생체내에서 사용되어 왔다.
도우(도우. 피., 생리학 논평, 36 : 77-102, 1956)는 폐의 폐정맥 부분상에 어떤 공지된 양의 지시약을 맥관내로 주입하는 방법과 주입점과 샘플링 사이의 부피를 결정하기 위해서 시간의 경과에 따른 동맥내 지시약의 농도의 측정을 서술한다. 이 염료는 세포를 염색하는데는 사용되지 않는다.
긴 사슬의 플루어레신과 로다민 지방족 유도체들이 세로융합을 감지하는데 사용되어 왔다(완다, 피. 이. 와 스미드, 제이 디.의 조직화학과 세포화학지, 30 : 1297-1300, 1982). 그러나 이 염료들은 단지 하나의 지방족 탄소사슬만을 포함하며 오랜기간 동안 막에서 안정하지 않다. 게다가, 이형다핵세포 형성을 검출하는 방법은 두개의 염료물질들 사이의 공명 에너지 전달이었다. 부가적으로, 염색은 염수에서 행해졌으며 용해도에 대해서는 밝혀지지 않았다.
생체물리학자들은 세포막의 유동성을 연구하기 위해서 주로 긴사슬 형태의 이 지방족 시아닌 염료를 적용해오고 있다(디. 악세로드, 생물물리학지, 26, 557-574, 1979).
이러한 형태의 연구에서 염료는 에탄을 저장물로부터 단기 배양의 세포에 적용된다. 염색하는 상태에서의 생육성은 다단히 크다는 것이 여러 연구가들에 의해 발표되었다. 그러나 생물물리학 측정에 있어서는 각각 여러차례 측정된 단지 몇세포만을 보아야 한다. 또한, 배양중의 뉴튼(neuron)의 고유성질을 결정하기 위해서 원형질 막속으로 융합되는 긴사살의 카보시아닌 염료들이 사용되어 오고 있다(호니그, 엠. 지. 와 훔, 알. 아이., 세포생물학지 103 : 171-187(1986)). 상기의 눈문들에서의 세포의 형태나 기능에 해로운 영향을 미침이 없이 생육세포를 염색하는 방법이 한결같이 결여되어 있다.
본 발명은 세포질의 형태나 기능을 심하게 변화시키지 않으면서 생육 세포에게 일관되며 복제 가능한 라벨링을 할 수 있는 신규 공정이다. 본 발명에 따라 높은 지질 용해도와 염료분자가 세포막으로부터 이동하는 것을 최소화하거나 방지하기에 충분히 높은 세포막 분할계수를 갖는 시아닌 염료로 세포에 라벨을 붙인다.
일관되며 복제 가능한 라벨링은, 세포 생육에는 심한 영향을 미치지 않으며 염료가 용해될 수 있는 삼투성 조절제를 포함하는 배지에 현탁되어 있는 세포에 염료를 첨가해서 얻는다. 이러한 삼투성 조절제에는 당, 당-알코올, 아미노산과 일정한 수소 이온 완충액(구드의 완충액)이 포함된다.
세포질의 형태나 기능에는 해로운 영향을 미치지 않으면서 생육세포를 라벨링하는 본 발명의 공정에서는, 시아닌 염료가 사용된다. 본원에서 언급된 시아닌 염료들은 다음과 같은 구조를 갖는 화합물이다.
Figure kpo00001
이식에서, Y는 산소, 유황, 메틸렌 또는 알킬-치환된 메틸렌이며, m은 0-3이고 ; n은 12-22이다.
본원에서 사용한 알킬-치환된 메틸렌이란 메틸, 에틸 또는 프로필 치환체와 화합된 모노- 또는 디-치환된 메틸렌을 말한다.
상기 구조식의 화합물들은 대개 다음과 같이 알려진 속기 일반식으로 표시된다.
DiYCu (2m+1)
(심즈, 피. 제이. 동, 생화학, 13 : 3315, 1974) 따라서, Y가 유황이고 3개의 탄소가 고리들을 연결하고 있으며 탄소 14개의 지방족 사슬이 두개인 화합물은 Disc14(3)이라고 표시한다. 비슷하게, DiIC14(5)는 Y가 이소프로필이고, 5개의 탄소원자가 고리들을 연결하고 있으며, 탄소 14개의 지방족 사슬이 두개인 화합물을 가르키는 것이다.
시아닌 염료로써 본원에 언급된 화합물에는 하나 또는 그 이상의 치환체를 갖는 상기 구조의 화합물이 포함되며 이 치환된 화합물들은 최소한 라벨링에 필요한 시간 동안 세포 라벨링 배지에서 용해될 수 있으며 라벨이 붙은 세포막과 결합해 있기에 충분히 높은 세포막 분할 계수를 갖는다는 것을 조건으로 한다. 이와 같은 화합물들은 라벨링에 필요한 농도에서 세포 생육에는 심각한 영향을 미쳐서는 안된다. 세포 라벨링 배지에서의 용해도는 라벨링 배지에서 시아닌 염료를 분산시키고 표준 분광 형광계로 시간에 따른 세포질 형광도를 측정하여 결정한다.
형광도의 감소는 염료가 침전되어서 용기의 벽에 부착되는 것은 가리킨다. 염료가 세포막과 결합한 채로 남아있다고 하더라도 공지된 유동 혈구계산 공정을 사용하여 라벨링한 후에 공여 동물속으로 재주입된 적혈구의 형광도를 감지한다. 재주입후의 라벨이 붙은 세포의 일관된 형광도는 세포막에서 염료의 안정성을 입증하는 것이다. 시아닌 염료로써 본원에 언급되는 화합물에는 핵자기 공명상에 의해 감지될 수 있는 원자를 결합하고 있는 상기 구조식의 화합물도 포함된다. 이와 같은 화합물들은 예를들어, 플루오르 원자를 지방족 사슬의 메틸그룹의 하나에 결합시켜서 제조할 수 있다. 상기 구조식에125I와 같은 감마 방사체가 붙어있는 화합물도 시아닌 염료로써 본원에 언급된다.
본 발명에서 사용되는 시아닌 염료들은 오리건주유겐의 분자탐사 협회와 같은 여러 경로를 통해서 구입할 수 있으며 공지된 합성법을 사용하여 입수할 수 있는 출발물질로부터 제조할 수도 있다.
(하머, 에프. 엠. 시아닌 염료와 관련 화합물, 상호 과학출판사(1964)).
본 발명 공정을 이용하여 어떠한 생육세포에 시아닌 염료로 라벨을 붙일 수 있다. 본원에서 사용된 세포라는 의미에는 세균과 같은 원시핵세포, 백혈구와 같이 핵이 있는 성숙핵 세포, 여러가지 종양세포와 중국쥐의 난소세포, 효모 및 적혈구와 혈고판같이 핵이 없는 세포와 같은 배양된 포유동물 세포가 포함된다. 핵이 있는 세포는 그 형태의 세포에 대해서 기대되는 성장이나 기능을 할 수 있으면 생존할 수 있으며 ; 핵이 없는 세포는 그것의 기대되는 기능, 즉 생존할 수 있는 적혈구가 산소와 이산화탄소를 수송할 수 있는 기능을 수행할 수 있으면 생존할 수 있고 ; 생존할 수 있는 혈소판은 응집과 방출분석에서 본래 기대되는 것을 행한다.
세포의 라벨링은 세포에게 치명적이지 않고 복제 가능한 세포 라벨링을 위해 준비된 배지에서 행해진다.
배지에 필요한 특성을 부여하기 위해서, 시아닌 염료가 최소한 라벨링에 요구되는 시간 동안 안정된 용액을 형성하는 삼투성 조절제가 사용된다. 허용할 수 있는 삼투성 조절제에는 당과 같은 약제나 이 약제들의 혼합물이 포함되는데, 예컨데. 글루코스, 프락토스, 소르보스, 자이로스와 같은 단당류와 슈크로스와 같은 이당류와 만니톨, 글리세롤, 이노시톨, 크실리트와 아도니틀과 같은 당-알코올과 글리신, 아르기닌같은 아미노산과 N-트리스(히드록시메틸)-메틸-3-이미노 프로판설폰산과 같은 일정한 구드의 완충액이 포함되며 아래 표 Ⅱ에 나타나 있다. 구드, 엔. 이. 등의 생화학 15, 467-477(1966), 구드, 엔. 이. 와 에스. 아이자와의 방법효소학 24, B부분, 53(1968), 폐구선, 더블유. 제이. 등의 생화학분석, 104 : 301-310(1980).
그러나 어떤 세포주들은 하나 또는 그 이상의 삼투성 조절제, 특히 당-알코올에 민감하기도 하다. 따라서, 라벨링을 하기전에, 사용하고저 하는 삼투성 조절제에서 세포들이 생존할 수 있는지를 확인하기 위해서 표준시험을 행한다. 부가적으로, 수소이온 농도를 조절하기 위해서 약간의 완충제를 라벨링 배지에 첨가하기도 한다.
여러가지 삼투성 조절제에 노출되었을때의 세포 생육에 미치는 영향은, 세포를 여러 삼투성 조절제에 30분 동안 노출시킨후에 Yac 세포의 이배화 시간을 측정해서 결정한다. Yac 세포란 미국 균주보존헙회로부터 입수할 수 있는 쥐의 임파종 조직 배양세포주를 말하며 이 세포주는 케스링, 알. 이. 유럽면역학지, 5 : 112-117(1975)에 서술되어 있다. 표 I에 나타난 자료가 예중하고 있는 바와 같이, 인산염으로 완충된 염수와 슈크로스, 글루코스 및 구드의 완충액 즉 TAPS, CAPS, EPPS, HEPPSO와 DIPSO에 노출된 것을 비교했을때 노출과 관련된 세포질 독성이 없음을 나타내는 세포의 이배화시간 상에서의 영향은 무시해도 좋다는 결론이 나왔다.
Figure kpo00002
A-성장하지 않았거나 부분적으로 세포독성이 있음.
B-심한 세포독성이 있음.
시아닌 염료용해도를 알기 위해서 시험된 여러가지 삼투성 조절제가 표 Ⅱ에 나타나 있다. 모든 농도는 원심분리로 침전물을 제거하고 분광형광계 분석을 위해서 시아닌 염료를 포함하고 있는 소량의 삼투성 조절제 부분표본을 에탄올에 용해한 후에 측정한다. 사용된 염료는 DiSC(5)와 DiOC(3)이며 삼투성 조절제는 동삼투압성 농도이다. 에탄올 용액 표준으로부터 얻는 형광도의 감소는 시아닌 염료 용해도의 감소와 직접적으로 관련한다.
Figure kpo00003
* 에탄올에 침전, 데이타 얻을 수 없음.
** 암금을 형성하지 않는 많은 결정체로 인한 인공물.
*** 에탄올에 침전(데이타가 정확하지 않음)
ND 결정되지 않음.
표 Ⅱ에서 나타난 바와 같이, 시아닌 염료는 표준 염들이 존재하는 상태보다는 릭소스를 제외한 당, 당-알코올, 아미노산과 TAPS, HEPPSO, DIPSO, CAPS, EPPS인 구드의 완충액이 존재하는 상태에서 더 잘 용해된다. 부가적으로, 글루코스, 프락토스, 리보스, 소르보스, 슈크로스와 자이로스와 같은 당과, 글리세롤, 이노시톨, 크실리트와 아도니톨과 같은 당-알코올과, 글리신과 아르기닌같은 아미노산에서의 DiSC(15)의 안정성을 결정했다. 시아닌 염료는 시험된 용액내에서 복제 가능한 라벨링을 하기에 충분한 시간인 최소한 20분 동안 안정했으며 많은 약제에 있어서, 용액내의 시아닌 염료양이 60분까지도 심각하게 감소되지는 않았다.
게다가, 표준염들과 삼투성 조절제를 포함하고 있는, 염료가 용해될 수 있는 배지에서 시아닌 염료의 용해도를 조사했다. 동 삼투압성 글루코스 용액내의 DiSC(5)의 용해도는 증류수로 희석해도 심각한 영향을 받지 않는다. 그러나 동 삼투압성 글루코스 용액내의 DiSS(5)의 용해도는 단지 약 20%의 동삼투압성 염화나트륨 용액으로 희석했을때 심각하게 감소했다. 따라서, 시아닌 염료로 복제 가능한 세포 라벨링은 아주 적은 양의 표준염들 즉, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 요오드화나트륨, 염화콜린 혹은 요오드화콜린을 포함하고 있는 배지에서 행해질 수 있으며, 적절하기로는 삼투성을 조절하는데 사용되는 표준염들이 들어있지 않는 배지에서 행한다.
본 발명 공정으로 시아닌 염료 라벨이 붙은 세포들을 분석하여 세포 생육성에 미치는 라벨링의 영향을 결정했다. 마릴랜드주 록빌의 미국 균주보존협회로부터 입수할 수 있으며 프레스코트, 디. 엠. 의 뉴욕 과학학회의 연보, 397 : 101-109(1982)에 서술되어 있는 V79 세포를 10 또는 4×10 M 농도의 DiOC(3)을 포함하고 있는 용액으로 라벨을 붙이고 염색된 세포의 성장운동학을 염색되지 않은 세포 및 염색된 것과 염색되지 않은 세포가 동일하게 혼합된 세포와 비교했다. 세포의 이배화시간은 시간은 시아닌 염료 라벨링에 영향을 받지 않았다. 따라서, 라벨링이 세포의 성장에는 영향을 미치지 않는다.
또한, 트리판청 축출(Typan Blue Exclusion)과 프로피듐 요오드 축출(Propidium iodide Exclusion) 같은 여러가지 다른 세포 생육성 표준 시험들로써 서술된 공정에 다른 시아닌 염료 라벨링이 세포 생육성에는 영향을 미치지 못함을 확인했다.
세포생육성에 미치는 시아닌 염료 라벨링의 영향은 적혈구 파멸성을 측정하여 정하기도 한다. 라벨이 붙은 적혈구와 라벨이 붙지 않은 적혈구를 염농도의 변화로 삼투력을 변화시키는 염화나트륨 배지에 현탁했다. 세포의 체적분포는 캐널라이저가 부착되어 있는 코울터 계수기
Figure kpo00004
로 측정했다. 각 염농도에 대한 체적 중간치를 결정하여 도표를 그렸으며, 체적은 약 0.5그람/100ml까지는 염화나트륨농도가 감소함에 따라 증가했으며, 이점에서는 체적이 급격히 감소했다. 이점에서 적혈구가 용해된다. 또한, 세포가 시아닌 염료로 라벨이 붙는 것과 상관없이 체적의 변화는 동일하다.
마찬가지로, 유사한 샘플에서 염화나트륨 농도에 다른 용혈반응을 감지했다. 적혈구를 약 2-3분 동안 염화나트륨속에 놓아둔 후에 용액을 원심분리하여 용해되지 않은 세포를 침전시킨다. 그다음에 상등액을 분광형광계 분석하여서 헤모글로빈 농도를 결정한다. 용해된 총 대조표준에 대한 각 샘플의 헤모글로빈 농도를 비교하여 용해백분율을 결정한다. 100ml에 대해 염화나트륨이 0.5g이 될때 까지는 유리 헤모글리빈 농도가 상대적으로 낮았으나 그후에 헤모글로빈은 즉시 방출된다. 적혈구 파멸성과 비교해 본 결과, 체적의 변화는 헤모글로빈 방출과 직접적으로 연관되었다.
게다가, 헤모글로빈 방출은 라벨이 붙운 세포와 라벨이 붙지 않은 세포에서 동일했다.
본 발명의 방법에 따라 생체내에서의 시아닌 염료로 라벨이 붙은 세포의 안정성을 조사하기 위해서, 토끼의 적혈구를 취하여 DiSC14(5)로 라벨을 붙인후에 재주입했다. 그후에 주기적으로 혈액샘플을 얻어서 라벨이 붙은 세포 백분율과 라벨이 붙은 세포의 형광도를 분석했다. 순환하는 적혈구의 수는 시간에 따라 직선적으로 감소했으며 라벨이 붙은 세포에서 측정된 수명 52일은 토끼 적혈구의 평균 수명으로 알려진 40 내지 60일과 밀접하게 관련되어 있다. 따라서 시아닌 염료 라벨링은 적혈구의 정화 속도에는 영향을 미치지 않았다.
시험된 5마리의 토끼중 한마리를 제외한 전부에서 염색된 세포의 형광도는 라벨링해서 재주입한 후 60일 동안 변하지 않았다. 50마리에서, 토끼의 순환기인 60일 이후에 단지 시아닌 염료의 20%만이 라벨이 붙은 세포로부터 이동했다. 라벨이 붙은 세포로부터 라벨이 붙지 않은 세포로 염료가 이동하지 않았음을 나타내는 조직배양으로부터 얻은 자료와 이 자료를 연합해볼때 세포는 염료로 안정하게 라벨이 됨을 나타내고 있다.
본 발명에 따라 시아닌 염료로 라벨이 붙은 생육세포는 세포집단의 복잡한 부차집단을 구별하는 능력을 필요로 하는 여러가지 적용에 사용된다. 예로써, 적혈구 수혈후 출혈로 인한 헤마토크리트(hemotocrit)의 감소인지 수주된 세포에 대한 면역반응인지를 결정하기 위해서는, 수주하기전에 세포의 부분표본을 본 발명에 따라 라벨을 붙이고 수주한 후 즉시 순환하는 라벨이 붙은 적혈구 단편을 결정한다. 그 이후에, 하락하는 헤마토크리트를 보면서, 라벨이 붙은 세포의 단편을 수주후 즉시의 단편과 비교하고 라벨이 붙은 세포와 라벨이 붙지 않은 세포에 대한 상대적인 감소율을 평가한다. 라벨이 붙은 세포와 라벨이 붙지않은 세포에서의 감소가 동일하다는 것은 혈액손실은 출혈에 의한 것임을 나타내며, 반면에 라벨이 붙은 세포의 감소가 더 크다는 것은 수주된 세포에 대한 면역반응을 나타내는 것이다. 유사한 방법으로, 혈소판 수주후에 출혈에 의한 혈소판 수의 감소와 수주된 혈소판에 대한 면역반응은 구별될 수 있다.
본 발명의 방법 또한 배양된 포유동물 세포의 성장 속도를 결정하는데 사용된다. 라벨이 붙은 배양된 세포가 분할할때 마다 시아닌 염료를 따라 세포들 사이에 고르게 뿌린다.
그후에, 유동혈구 계산법으로 라벨링한 직후의 세포의 형광도와 어느 정도 성장한 후의 세포의 형광도, 즉 세포분할수를 비교하여 성장속도를 결정할 수 있다.
다음 실시예들은 본 발명을 예증하고 있으며, 발명의 범위를 상기한 것과 아래의 특허청구범위로 제한하고저 하는 것은 아니다.
실시예 1
조직배양세포를 염색하는 방법
Ⅰ. 세포의 제조
최상의 결과를 얻기 위해서는 대수중식기(log phase)의 조직배양 세포를 사용한다. 배양용기로부터 현탁배양액을 들어내어 폴리프로필렌 원심분리튜브 속에 넣는다.
단일층 배양을 할때는, 상등액을 제거해야 하며 밀착하는 세포를 칼슘과 마그네슘이 없는 인산염 완충염 수 용액으로 세척하여 플라스크로부터 혈청단백질을 제거한다. 트립신-EDTA용액(뉴욕주 그랜드 아이스랜드의 깁소 실험실, # 610-5300)을 플라스크 바닥이 덮힐 만큼 첨가하고, 세포 단일층이 움직이며 응집되지 않을때까지 실온에서 배양한다. 그 결과의 세포 현탁액을 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 옮기고 10%의 태아소혈청(FBS) (하젤튼)이 첨가된 동체적의 배지를 첨가하여 트립신의 효소작용을 저지하다.
세포를 실온에서 10분 동안 400xg로 원심분리한다. 상승액을 따라내고 동체적의 동삼투압성 만니톨을 가하여 세포응집체(Cell Pellet)을 재현탁한다. 이 만니톨은 세포현탁액으로부터 혈장단백질을 제거하고 염색할 세포를 준비하기 위한 것이다. 세포를 실온에서 10분 동안 400xg로 한번 더 원심분리한다. 상등액을 따라내고 그 결과 생성된 세포 응집체를 2×106세포/ml 농도의 만니톨 용액에설 재현탁한다. 그러나 일부 세포주들은 당알코올(만니톨)에 민감하며 ; 이러한 경우에는 동삼투압성 글루코스용액(MW 180.16, 54.05g/l)을 사용한다.
Ⅱ. 염료원액의 제조
2×10-3의 원액을 순에탄올에서 다음과 같이 제조한다.
DiO-C14(3) MW 800(1.600mg/ml)
DiS-C14(5) MW 814(1.628mg/ml)
DiO-C18(3) MW 936(1.872mg/ml)
DiI-C14(5) MW 850(1.700mg/ml)
모든 염료들은 오게건주 유겐의 분자조사로부터 얻는다.
염료원료들은 초음파, 처리를 하여 염료가 완전히 용해될 수 있게 하며 튜브에 부착하는 것을 최소화시킨다. 원액을 제조하여 염료의 용해도를 관찰하기 위해서는 폴리스티렌 튜브를 사용한다. 그러나 세포를 염색하는데는 폴리프로필렌 튜브를 사용하는데, 수성상태의 시아닌 염료는 폴리스티렌보다는 폴리프로필렌에 덜 부착되기 때 문이다.
Ⅲ. 세포의 염색
동 삼투압성 만니톨에서 세포를 2×106세포/ml 농도로 조정한다. 세포를 염색하기 위해서 2×10-3M 염료원액을 세포 현탁액 1ml에 대해 염료 5μl의 염색용액이 될때까지 가한다. 염색용 샘플을 피페트로 재거나 와동시켜 샘플을 완전히 섞는다. 세포를 10분 동안 염료와 함께 배양하고, 형광 현미경하에서 실험하는 동안 작은 부분 표본을 제거하여 강도와 일정한 염색이 일어날 수 있게 한다. DiO 염료계열은 480nm 자극광에 대해 선택적인 현미경 필터를 사용하는 반면에, DiS와 DiI 염료계열은 형광 관찰을 위해서 575nm 근처의 자극를 필요로 한다.
배양한 후에, 동체적의 인산염 완충염수(PBS)를 색소-세포 현탁액에 가한다. 세포를 20℃에서 10분 동안 400xg로 원심분리한다. 상등액을 따라내고 응집체를 PBS에서 다시 현탁한다. 원심분리공정을 반복하고 그결과 생성된 상등액의 염료존재 여부를 관찰한다. 만일 상등액에 염료가 명백히 이으면, 분광 형광분석기의 측정으로 상징액에서 유리염료가 완전히 없어질때까지 반복해서 세척한다. 최종적으로 세척한 후에, 상징액을 제거하고 응집체를 적절한 배지에서 원하는 농도까지 재현탁한다. 모든 공정은 무균상태에서 행한다.
실시예 2
적혈구의 염색
I. 시약의 제조
A. 구연산염 항응고제
1.66g 구연산나트륨
0.206g 구연산
0.140g NaH2PO4
1.61g 글루코스
위의 성분들을 중류수 63ml에 용해하고 용액의 5.6으로 조정한다.
최종용액을 살균하기 위해서 0.22 미크론 필터에 통과시킨다.
B. 동삼투압성 글루코스 용액
글루코스(54.05g)를 증류수 1l에 용해한다. 피스커 삼투압계로 삼투성을 검사하여 필요하다면 320mOsm으로 조정한다.
Ⅱ. 염료원료의 제조
염료 1.628mg/ml를 순에탄올에 용해하여 2×10-3M DiIC14(5)의 원액을 제조한다. 염료를 완전히 용해하기 위해서 초음파 처리를 한다.
Ⅲ. 염색 공정
모든 혈액은 구연산 나트륨을 포함하고 있는 바큐테이너를 사용하거나, 주사기 총체적의 1/10 만큼의 구연산염 항응고제를 포함하고 있는 주사기를 사용하여 수거한다. 유동혈구계산이나 기능성 시험을 위해서 작은 부분표본을 준비해둔다. 혈액을 실온에서 10분 동안 100xg으로 원심분리하여 적혈구 응집체를 얻는다.
혈장을 포함하고 있는 혈소판을 제거하여 보존해두고, 모아진 적혈구 응집체 부피의 5배 만큼의 동삼투압성 글루코스를 가하여 적혈구를 세척한다. 세포를 실온에서 10분 동안 100xg로 다시 원심분리하여 상등액을 따라 낸다. 이 세제는 혈장 단백질을 제거하여 더 강하고 일정한 염색을 할 수 있게 하는 것으로, 한번 더 반복한다. 최종적을 원심분리한 후에, 상징액을 따라내고 적혈구를 동 삼투압성 글루코스에서 4×108세포/ml 농도까지 재 현탁한다.
염료를 첨가하기 전에, 샘플을 피페트로 재거나 와동시켜 침전이 일어나지 않게 해준다. DiSC14(5) 원료15μl(ETOH에 2mM)를 각각 적혈구 현탁액 1ml에 가한다. 이 샘플을 즉시 혼합하여 염료가 용액에서 빠르고 일정하게 분포되도록 한다. 거의 5분후에 현미경 관찰을 위해서 작은 부분표본을 옮긴다. 밀초 연필을 사용하여 고리를 현미경 받침유리위에 끌어내고 염색용액내의 작은 세포샘플을 밀초고리 내부에 놓는다.
덮개 유리를 받침유리 위에 놓고 샘플을 관찰한다. 밀초고리를 사용하는 것은 받침 유리와 덮개 유리로 인한 디스코사이트-에키노사이트 변형을 줄이기 위한 것이다.
이렇게 하여 염색공정동안 적혈구 구조는 유지된 채로 강하고 균일한 염색이 일어나는 것을 확인할 수 있다. 세포는 5분 후에 균일하게 염색되며, 10분 이상 노출시킬 필요는 없다.
세포가 균일하게 염색되었음이 결정된 후에, 동체적의 인산염 완충염수를 염색현탁액에 가한다. 세포를 실온에서 10분 동안 400xg으로 원심분리하고 상등액을 제거한다. 대체로 원심분리한 후의 상등액에 유리염료의 흔적이 눈에 띄게 존재하므로 분광형광 분석기로 측정하여 상징액에 유리염료가 완전히 없어질때까지 칼슘과 마그네슘을 포함한 인산염 완충염수로 계속해서 세척해준다.
이점에서 세포를 실험에 사용하기 위해서 적절한 용액에 현탁하거나 공여동물에게 재주입하기 위해서 혈소판이 없는 혈장에 현탁해둔다. 재주입하는 일반적 방법은, 수거된 전혈액을 첫번째 원심분리하여 회수하고 4000xg에서 원심분리하여 혈소판을 제거한 혈장의 체적내에 염색된 적혈구를 재현탁하는 것이다. 모든 공정은 무균법으로 행한다.
실시예 3
혈소판의 염색
Ⅰ. 세포의 제조
모든 혈액은 구연산나트륨을 포함하고 있는 바큐테이너 또는 주사기 총체적의 1/10의 구연산염 항응고제를 포함하고 있는 주사기를 사용하여 수거한다. 세포를 실온에서 10분 동안 100xg으로 원심분리하여 혈소판이 풍분한 혈장을 얻는다. 혈소판을 포함하고 있는 모든 공정에서는 활성화를 방지하기 위해서 플라스틱 피펠과 폴리프로필렌 원심분리기 튜브를 사용한다.
혈소판이 풍부한 혈장을 뽑아내어 다른 원심 분리기 튜브에 옳긴다. 피 다음 20℃에서 10분 동안 1000xg으로 원심분리하여 혈장으로부터 혈소판을 응집시킨다. 혈장을 수거하여 다른 기능성 시험이나 재주입을 위한 현탁배지로 사용하기 위해서 보존해둔다. 이 혈장은 재현탁배지로 사용하기 전에 10분 동안 4000xg에서 원심분리하여 잔류 혈소판을 제거해야 하며 이 혈장을 혈소관이 없는 혈장(PPP)라고 한다.
1000xg에서 원심분리하여 얻어진 혈소판 응집체를 소체적의 구연산염 항응고제에서 부드럽게 재현탁하여 농축된 일정한 현탁액을 얻는다. 이것이 얻어진 후에 원래의 혈장과 동일한 양만큼의 동 삼투압성 글루코스를 희석제로써 혈장에 첨가한다. 그후에 혈소판을 5분 동안 300xg로 원심분리하고 상등액을 뽑아낸다.
이 글루코스 세제는 잔류 혈장을 제거하여 균일하며 더 강한 염색이 일어날 수 있게 해준다. 혈소판 응집체를 글루코스 용액에서 재현탁하면 염색을 위한 준비가 된 것이다.
혈소관농도를 4×108/ml로 조정하고 DiOC14(3) 원료 15μl(순 ETOH에서 2mM)을 혈소관 현탁액의 ml당 첨가한다. 현탁액을 즉시 그러나 부드럽고 계속적으로 혼합해 주어서 염료가 잘 분포되게 해준다. 형광현미경으로 혈소판을 관찰하여 균일한 염색이 일어나는지를 살피고 만일되었다면 현탁액에 있는 유리염료로부터 혈소판을 분리해야 한다.
Ⅱ. 라벨이 붙은 혈소관을 분리하기 위한 세파덱스 G∼100칼럼의 사용
혈소판이 풍부한 혈장으로부터 혈소판을 분리하게 위해 통상적으로 세파로스 2B가 사용되어 왔다. 세파덱스 G-100 또한 혈소판분리에 잘 작용한다는 것을 발견했다 이 기술은 염색기술에 사용되며 다음의 방법으로 작용한다. 혈소판-염료 현탁액을 칼럼위에 놓는다. 분자량이 작은 염료분자들은 소입자속에 잡히게 되지만 분자량이 큰 혈소판들은 바로 칼럼을 통과한다.
이러한 방법에서, 세파덱스 G-100이 현탁액내의 유리 염료로부터 형광 라벨이 붙은 혈소판을 분리하는데 사용될 수 있다.
A. 칼럼의 제조
세파덱스 G-100(뉴저지주 피스카타웨이의 제약 실험실)을 제조업자의 지시에 따라 수화시키고 혈고판용 분리배지로써 사용하고저 제조한 아세톤(100%)에서 세척한다. 세척공정은 실온에서 10분 동안 300xg로 세파덱스를 원심분리한 후, 상징액을 제거하고 한크 발란스드 염용액(Hank, Balanced Salt Solution)에서 재 현탁하여 행한다. 아세톤 냄새가 더이상 나지 않을때까지 세파덱스를 한크 발란스드 염용액으로 반복해서 세척한다.
그 결과의 용액을 끓고 있는 수조에 진공에 의해 삽입하여 가스를 없앤다.
그 다음이 세파덱스 슬러리를 칼럼에 붓는다. 플런저(Plunger)가 없는 10cc 주사기를 칼럼 지지물로 사용한다. 실리콘 튜브를 주사기의 중심에 부착하고 작은 조정가능한 튜브 죔쇠로 칼럼을 통과하는 유체의 흐름을 조절하는데 사용한다. 주사기의 밑면에 47미크론의 나일론 망사를 지지물로 사용하여 세파덱스 구슬을 간수한다. 유리원료를 녹인 유리필터 지지물이 있는 통상적인 유리 칼럼을 혈소판을 활성화시키므로 피해야한다. 칼럼을 한크로 채우고 소량의 세파덱스 슬러리를 칼럼에 가한다. 천천히 그렇지만 일정하게 흐를 수 있을 만큼 죔쇠를 열어둔다. 이 공정은 세파덱스를 고르고 균일하게 채워서 홈이 파이거나 거품이 형성되어 공기층이 생기지 않게한다. HBSS와 세파덱스 슬러리를 첨가하는 공정은 원하는 크기로 채워진 칼럼을 얻을때까지 반복한다. 칼럼은 사용하기 전에 HBSS(2공간 부피)로 완전히 잠기게 한다.
B. 혈소판의 제조
혈소판 염료와 현탁액을 세파덱스 상에 조심스럽게 바른다. 칼럼의 바닥에 있는 죔쇠를 열어서 칼럼에 있는 유체층이 세파덱스 유체의 꼭대기에 도달할때까지 떨어뜨린다. 현탁액이 세파덱스에 침투하도록 다시 흐르게 한다. 수준이 세파덱스의 꼭대기에 이르면 흐름을 다시 중단한다. 충분한 HBSS를 칼럼의 꼭대기에 조심스럽게 가하여 완충액을 만들어서 세파덱스를 교란시키지 않고 쉽게 부가적인 HBSS를 가할 수 있다. 칼럼의 흐름을 다시 계속한다. 이 방법은, 혈소판 현탁액이 겔에서 탄탄한 밴드를 형성하게 하며 칼럼의 길이를 통하여 상당히 균일한 속도로 이동하게 한다. 이렇게 하여 더 농축된 혈소판 용출제를 얻는다. 칼럼을 통해서 계속 흐르게 하고 0.5 내지 1.0ml의 단편을 수거한다.
단편을 포함한 혈소판은 이들의 불투명으로 감지될 것이며 함께 풀(pool)을 형성하기도 한다. 풀을 형성한 단편을 10분동안 300xg으로 원심분리한다. 상징맥을 뽑아내고 응집체를 실험용이나 분리용의 적절한 배지 또는 기능성 결정이나 재주입을 위한 혈소판이 없는 혈장에서 재현탁한다.
본 발명의 우선되는 설명들은 위에서 언급하고 있으나 본 발명은 본원에서 나타난 것에 제한되지 않으며 다음의 특허청구범위이내의 모든 변형에까지 그 원리가 미친다.

Claims (28)

  1. 세포를, 세포의 생육에는 심각하게 영향을 미치지 않으면서 복제 가능한 세포의 라벨링을 제공하는 삼투압물 농도 조절제를 함유하는 배지중에서 시아닌 염료와 접촉시킴을 특징으로 하여, 생육세포를 시아닌 염료로 라벨링하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 삼투압몰농도 조절제가 당, 당-알코올, 아미노산, 또는 구드의 완충제 또는 이들의 배합물인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 배지가 동 삼투압성인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 세포가 적혈구 세포인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 세포가 백혈구 세포인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 세포가 혈소판인 방법.
  7. 제3항에 있어서, 삼투압몰농도 조절제가 당인 방법
  8. 제7항에 있어서, 당이 글루코스인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 삼투압몰농도 조절제가 당-알코올인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 당-알코올이 만니톨인 방법.
  11. 제3항에 있어서, 삼투압몰농도 조절제가 아미노산인 방법
  12. 제11항에 있어서, 아미노산이 글리신인 방법.
  13. 제3항에 있어서, 삼투압몰농도 조절제가 구드의 완충제인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 구드 완충제가 HEPPSO인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 구드 완충제가 EPPS인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 구드 완충제가 TAPS인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 구드 완충제가 CAPS인 방법
  18. 제13항에 있어서, 구드 완충제가 DIPSO인 방법.
  19. 제3항에 있어서, 시아닌 염료가 DiSC14(5)인 방법.
  20. 제3항에 있어서, 시아닌 염료가 DiOC14(3)인 방법
  21. 세포의 생육에는 심각하게 영향을 미치지 않는 삼투압몰농도 조절제중에 용해된 시아닌 염료를 함유하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 삼투압몰농도 조절제가 당, 당-알코올, 아미노산, 구드의 완충제 또는 이들의 배합물인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 당이 글루코스인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 당-알코올이 만니톨인 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 아미노산이 글리신인 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 구드의 완충제가 HEPPSO, EPPS, TAPS, CAPS 또는 DiPSO인 조성물.
  27. 제22항에 있어서, 시아닌 염료가 DiSC14(5) 또는 DiOC14(3)인 조성물.
  28. 제3항에 있어서, 세포가 조직배양 세포인 방법.
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