JP2872243B2

JP2872243B2 - ｉｎｖｉｖｏ細胞追跡

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Publication number: JP2872243B2
Application number: JP62277257A
Authority: JP
Inventors: ポール・カール・ホーラン; シュー・エレン・スレザック
Original assignee: FUANOSU TEKUNOROJIIZU Inc
Current assignee: FUANOSU TEKUNOROJIIZU Inc
Priority date: 1986-10-31
Filing date: 1987-10-30
Publication date: 1999-03-17
Anticipated expiration: 2014-03-17
Also published as: US4762701A; PT86030B; EP0266195A1; JPS63126833A; DK167957B1; PT86030A; AU8040187A; DK570487D0; DE3751434D1; ZA878116B; DK570487A; PH24539A; IL84294A; ES2076929T3; DK167850B1; KR880005458A; IL84294A0; ATE125710T1; CA1294545C; DE3751434T2

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、in vivoにて細胞を追跡するための組成物
およびin vivoにて細胞寿命を測定するための組成物に
関する。発明の背景 in vivo細胞追跡および寿命測定は、細胞中にて安定
である。すなわち、該細胞から失なわれず、かつ、細胞
機能に顕著な影響を及ぼさないマーカーにて標識された
細胞を必要とする。現在入手できるマーカーは、必要な
特性を提供できない。例えば、蛍光抗体は、それらが容
易に該細胞から解離するので適当ではない。他の可能性
のあるマーカーは、それらが細胞機能を妨害するので用
いることができない。シアニン染料は、種々の生物学的適用に用いられてい
る。ジオキサカルボンシアニン染料が、白血球識別計数
を行なうに際し用いられている「ギュンター・バレッ
ト、マックス・プランク・ゲス、ヴィッシェンシュ（Gu
nter Valet,Max Planck Ges Wissensch）；特許照会番
号第84−102307/17号、選択的染色および容積測定およ
び蛍光による血液の同時定量分析（Simultaneous Quant
itative Determination of Blood Cells by Selective
Staining and Measuring Volume and Fluorescenc
e）」。しかしながら、これらの研究に用いられた染料
は、短鎖カルボシアニン染料（10炭素以下）であり、か
つ、膜電位の変化に応答する。さらに、該短鎖カルボシ
アニン染料は、細胞マトコンドリアに侵入し、細胞毒で
あり、かつ、該細胞を洗浄した場合、これら染料は、該
細胞の膜電位が変化しようとしまいと該細胞から容易に
流出する。他の短鎖脂肪族シアニン染料が多くの他の生
物検定に用いられている。しかし、該短鎖分子は、膜電
位に応答し、かつ、該細胞膜を横断してミトコンドリア
中に浸透する「エッチ・エム・シャピロ（H.M.Shapir
o）、米国特許第4343782号」。該短鎖シアニン染料も細
胞に対して毒性であり、in vivoにて細胞を追跡するた
めに用いることはできない。トリカルボシアニン染料「フォックス，アイ・ジェイ
ら、プロシーディングス・オブ・マヨ・クリニク（Fox,
I.J.et al.,Proc.Mayo Clinic），32,478〜484（195
7）」およびエバンズ−ブルー染料「シァッド・エッチ
ら、プフレガーズ・アルカイブ−ヨーロピアン・ジャー
ナル・オブ・フィジオロジー（Pfluegers Arch.Eur.J.P
hysiol.），370（２）,139〜144（1977）」がin vivoに
て希釈法により心臓出力を測定するために用いられてい
る。ダウ「ダウ，ピー、フィジオロジカル・レビューズ
（Dow.P,.physiol.Rev.），36,77〜102（1956）」は、
既知量のある種の血管内指示薬を肺の動脈側に注入し、
該指示薬の静脈濃度を経時的に測定して注入時およびサ
ンプリング時の間の容積を測定するような方法を記載し
ている。これらの染料は、細胞を染色するために用いら
れない。発明の要約本発明は、in vivo細胞追跡およびin vivo細胞寿命測
定の新規方法に関する。本発明の新規な細胞追跡方法に
よれば、まず細胞をシアニン染料にて標識し、ついで検
体中に注入し、該シアニン染料を用いて該細胞の位置を
決定する。もう１つの態様において、標識細胞の消失速
度を測定することにより細胞寿命を測定する。発明の詳説 in vivo細胞追跡およびin vivo細胞寿命測定について
の本発明方法において、細胞はシアニン染料にて標識す
る。つぎの構造を有する化合物：［式中、Ｙは酸素、硫黄、メチレンまたはアルキル置換
メチレン;mは０〜3;およびｎは12〜22を意味する］を本明細書においてシアニン染料と称する。本明細書にて用いられているように、アルキル置換メ
チレンは、メチル、エチルまたはプロピル置換基のいず
れかの組合せを有するモノ−またはジ−置換メチレンを
意味する。前記構造の化合物は、つぎの一般的に知られた簡略
式： DiYCn（2m＋１）により表わされる「シムズ，ピー・ジェイら，バイオケ
ミストリー（Sims,P.J.et al.,Biochem.），13,3315（1
974）」。すなわち、例えばＹが硫黄であり、該環を架
橋する３個の炭素および14個の炭素の脂肪族鎖を２つ有
する化合物をDiSC₁₄（３）と称する。同様に、DiIC
₁₄（５）は、Ｙがイソプロピルであり、該環を架橋する
５個の炭素および14個の炭素の脂肪族鎖を２つ有する化
合物を示す。１またはそれ以上の置換を有する前記構造の化合物
は、そのような置換化合物が、少なくとも標識に必要な
間細胞標識培地に溶解し、かつ、十分に高い細胞膜分配
係数を有し、依然として標識細胞膜に結合している場合
に、本明細書にてシアニン染料と称する化合物に包含さ
れる。そのような化合物は、また、標識に必要な濃度に
て細胞生育力に顕著な影響を及ぼしてはならない。細胞
標識培地中の溶解度は、該標識培地中にシアニン染料を
分散し、かつ、標準分光蛍光法により蛍光強度を期間中
測定することにより以下に示すように決定する。蛍光強
度の減少は、染料の沈澱および容器壁への付着を示して
いる。該染料が依然として細胞膜に結合しているかどう
かは、例えば、公知のフローサイトメトリー法を用い
て、標識後供血動物中に再注入した赤血球の蛍光強度を
モニターして決定する。本質的に、注入後の標識細胞の
一定蛍光強度は、細胞膜中の該染料の安定性を決定す
る。核磁気共鳴画像により検出できる原子を取込んだ前記
構造の化合物もシアニン染料のような本発明書にて言及
している化合物に包含される。そのような化合物は、例
えば、該脂肪族鎖のメチル基の１つにフッ素原子を取込
むことにより製造する。¹²⁵Iのようなガンマ放出体を付
加した前記構造の化合物も本明細書にてシアニン染料と
称す。本発明にて用いられるシアニン染料は、モレキュラー
・プローブズ・インコーポレーティッド、ユージーン、
オレゴン（Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oregon）の
ような種々の源から購入でき、かつ、公知の合成法を用
いて入手可能な出発物質から製造できる「ハマー，エフ
・エム、ザ・シアニン・ダイズ・アンド・リレーディッ
ド・カンパウンズ、インターサイエンス・パプリッシャ
ーズ（Hamer,F.M.,The Cyanine Dyes and Related Comp
ounds,Interscience Publishers）（1964）」。本発明方法を用いれば、いずれの生育可能細胞もシア
ニン染料にて標識できる。本明細書にて用いられている
ように、「細胞」なる語は、バクテリアのような原核細
胞、白血球のような有核真核生物細胞、種々の腫瘍細
胞、他の哺乳動物の細胞、（例えば、組織培養チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞）、酵母、赤血球および血小板
のような無核細胞を包含する。有核細胞は、それが、そ
の種の細胞に対して予期されるように本質的に増殖また
は機能しうる場合に生育可能であり、無核細胞は、それ
が、例えば、生育可能な赤血球が酸素および二酸化炭素
を運搬できるようなその予期される機能を発揮しうる場
合に生育可能であり、生育可能な血小板は、例えば、凝
集および解離検定において予期されるように本質的に機
能する。細胞標識は、細胞に対して致命的でなく、かつ、再現
可能な細胞標識を供給する培地中にて行なわれる。必要
な特性を該培地に付与するため、シアニン染料が、少な
くとも標識に要する間安定な溶液を形成する浸透圧調節
剤を用いる。許容可能な浸透圧調節剤は、糖、例えば、
グルコース、フルクトース、ソルボース、キシロース、
リボースのような単糖類およびシュークロースのような
二糖類、マンニトール、グリセロール、イノシトール、
キシリトールおよびアドニトールのような糖−アルコー
ル、グリシンおよびアルギニンのようなアミノ酸、Ｎ−
トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパ
ンスルホン酸のようなある種のグッド緩衝剤を包含する
「グッド，エヌ・イーら、バイオケミストリー（Good,
N.E.,et al.,Biochem.），15,467〜477（1966）、グッ
ド，エヌ・イーおよびエス・イザワ、メソッズ・オブ・
エンザイモロジー（Good,N.E.and S.Izawa,Methods Enz
ymol.），24，パートB,53（1968）、フェグソン，ダブ
リュー・ジェイら、アナリティカル・バイオケミストリ
ー（Feguson,W.J.,et al.,Anal.Biochem.），104,301〜
310（1980）」。しかしながら、いくつかの細胞系は、
１またはそれ以上の浸透圧調節剤、特に、糖−アルコー
ルに対して感受性である。したがって、標識前に標準試
験を行って、該細胞が予定した浸透圧調節剤中にて生育
可能であるということを確かめる。さらに、少量の緩衝
剤を該標識培地に加えて水素イオン濃度を調節する。種々の浸透圧調節剤に対する暴露の細胞生育力に対す
る影響は、該細胞を種々の浸透圧調節剤に30分間暴露し
た後のYac細胞の倍加時間を測定することにより決定し
た。Yac細胞は、アメリカンタイプ・カルチャー・コレ
クションから入手できるマウスリンパ腫組織培養細胞系
であり、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムンロジ
ー（European Journal of Immunology），５,112〜117
（1975）に記載されている。第１表に示したデータが示
すように、リン酸塩緩衝生理食塩水と比較した場合、シ
ュークロース、グルコースおよびグッド緩衝剤、TAPS
CAPS、EPPS、HEPPSOおよびDIPSOに対する暴露は、細胞
倍加時間に対して無視できる影響しか生じず、暴露に関
係した細胞毒性が存在しないことを示している。第１表浸透圧調整剤倍加時間（時間）リン酸緩衝生理食塩水 31.0 シュークロース 41.0 グルコース 34.5 TAPS 32.7 CAPS 45.8 EPPS 32.2 HEPPSO 23.4 DIPSO 36.7 ３−アミノ−１−プロパンスルホン酸 99.6 ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルンホン酸ナトリウ
ム（MOPS）Ａ２−アミノ−２−メチル−1,3−プロパンジオールＢ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールＢＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンス
ルホン酸（TES）Ｂ N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタ
ンスルホン酸（BES）Ａ第１表（続き）浸透圧調整剤倍加時間（時間）３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−
プロパンスルホン酸（CAPSO）ＡトリエタノールアミンＢトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIZMA）Ｂビス−トリスプロパンＢ２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスルホン酸（MES）Ｂ３−［ジメチル（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−
２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（AMPSO）Ａ N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（BICIN
E） 57.7 ３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］
−１−プロパンスルホネート（CHAPS）Ｂ３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］
−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（TAPSO） 63.6 第１表（続き）浸透圧調整剤倍加時間（時間）３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパスルホ
ン酸（MOPSO） 178.4 ２−［２−アミノ−２−オキソエチル）アミノ］エタン
スルホン酸（ACES） 1038.4 ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノ−トリス−（ヒド
ロキシメチル）メタン（BIS−TRIS） A ２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（CH
ES） 51.5 Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（TR
ICINE） A グルコサミン 288.4 イミダゾール B グルシルグリシン 66.9 Ａ−非増殖または部分的細胞毒Ｂ−毒性細胞毒第２表は、シアニン染料溶解性について調べた種々の
浸透圧調節剤を示している。濃度の測定は、全て、遠心
分離により沈澱を除去し、かつ、分光蛍光分析のために
シアニン染料を含有する浸透圧調節剤の少量をエタノー
ル中に溶解した後に行った。用いた染料はDiSO₁₄（５）
およびDiOC₁₄（３）であり、かつ、該浸透圧調節剤は等
浸透圧濃度であった。エタノール溶液標準からの蛍光濃
度の減少は、シアニン染料溶解度の減少と直接相関して
いる。第２表から明らかなように、シアニン染料は、リキソ
ースを除く糖、糖−アルコール、アミノ酸およびグッド
緩衝剤、TAPS、HEPPSO、DIPSO、CAPSおよびEPPSの存在
下より古典的塩の存在下にてずっと溶解しにくい。さら
に、グルコース、フルクトース、リボース、ソルボー
ス、シュークロースおよびキシロースのような糖、グリ
セロール、イノシトール、キシリトールおよびアドニト
ールのような糖−アルコールならびにグリシンおよびア
ルギニンのようなアミノ酸中のDiSC₁₄（５）溶液の安定
性を測定した。該シアニン染料は、再現可能な標識のた
めに十分な時間である少なくとも20分間試験溶液中で安
定であり、かつ、多くの該薬剤において、溶液中のシア
ニン染料の量は、60分では著しい減少を示さなかった。さらに、シアニン染料が溶解可能である古典的塩およ
び浸透圧調節剤を含有する培地中のシアニン染料の溶解
度を調べた。等浸透圧性グルコース溶液中のDiSC
₁₄（５）の溶解度は、蒸留水での希釈によって顕著な影
響を受けなかった。しかし、等浸透圧性グルコース溶液
中のDiSC₁₄（５）の溶解度は、約20％等浸透圧性塩化ナ
トリウム溶液のみにて希釈することにより顕著に減少し
た。すなわち、シアニン染料を用いた再現可能な細胞標
識は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、硫酸ナトリウム、
ヨウ化ナトリウム、塩化コリンまたはヨウ化コリンのよ
うな古典的塩の極く少量を含有する培地中にて行なうこ
とができ、好ましくは、古典的塩を用いずに浸透圧を調
節した培地中にて行なう。本発明方法を用いて標識した細胞シアニン染料を分析
して細胞生育力に対する標識の影響を測定した。アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビ
ル、メリーランド（the American Type Culture Collec
tion,Rockville,Maryland）から入手でき、かつ、プレ
スコット，ディー・エム、アナルズ・オブ・ニューヨー
ク・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Prescott,D,
M.,Ann.New York Acad.Sci.），397,101〜109（1982）
に記載されているV79細胞を、10^-5または４×10^-5Mの濃
度にてDiOC₁₄（３）を含有する溶液を用いて標識し、該
染色細胞の増殖動力学を、非染色細胞ならびに染色およ
び非染色細胞の等量混合物と比較した。細胞倍加時間
は、シアニン染料標識により影響されなかった。すなわ
ち、標識は、細胞増殖に影響しなかった。また、トリパ
ンブルー排除およびヨウ化プロピジウム排除のようない
くつかの他の細胞生育力の標準試験は、前記方法による
シアニン染料標識の細胞生育力に対する影響の欠如を確
認した。また、細胞生育力に対するシアニン染料標識の影響
は、赤血球脆性を測定することにより分析した。標識お
よび非標識赤血球を、塩濃度を変えることにより種々の
浸透圧強度の塩化ナトリウム培地中に懸濁した。該細胞
の容積分布は、チャネライザーアタッチメントを有する
コールター・カウンターを用いて測定した。平均容積
を測定し、それぞれの塩濃度に対してプロットした。容
積は、該容積が急激な低下を示す約0.5g/100mlまで塩化
ナトリウム濃度が減少するにつれて増加した。この時点
において、該赤血球は溶血する。さらに、該容積変化
は、該細胞がシアニン染料にて標識されると否とにかか
わらず同じであった。同様に、同じ試料にて、塩化ナト
リウム濃度の関数として溶血をモニターした。赤血球を
約２〜３分間塩化ナトリウム中に置いた後、該溶液を遠
心分離していずれもの未溶解細胞をペレットにした。つ
いで上清溶液を分光蛍光分析に付してヘモグロビン濃度
を測定した。全溶血対照に対するそれぞれの試料のヘモ
グロビン濃度を比較することにより溶血百分率を測定し
た。100ml当たり塩化ナトリウム約0.5gに達するまで遊
離ヘモグロビン濃度は相対的に低く、ついで、ヘモグロ
ビンが直ちに放出された。赤血球脆性結果と比較する
と、容積変化は、ヘモグロビン放出と直接相関してい
た。さらに、ヘモグロビン放出は、標識および非標識細
胞において同じであった。本発明方法により標識した細胞シアニン染料のin viv
o安定性を試験するため、ウサギ赤血球を採取し、DiSC
₁₄（５）にて標識し、再注入した。その後定期的に血液
試料を採取し、標識細胞百分率および該標識細胞の蛍光
強度を分析した。循環赤血球の数は、時間の関数として
１次的に減少し、測定した標識細胞の52日の寿命は、ウ
サギ赤血球について報告されている40〜60日の平均寿命
と密接に相関していた。すなわち、シアニン染料標識
は、赤血球のクリアランス率に影響を及ぼさなかった。試験した５匹のウサギのうち１匹を除き全てにおい
て、染色細胞の蛍光強度は、標識および再注入後60日の
間実質的に未変化であった。５番目の動物においては、
該シアニン染料の20％以下が、ウサギの循環において60
日後には該標識細胞から移動した。これらのデータは、
標識細胞から非標識細胞への染料の移動がないことを示
す組織培養からのデータと合わせて、該細胞が該染料に
て安定に標識されるということを示している。本発明のヒトを含む哺乳動物検体のin vivo細胞追跡
およびin vivo細胞寿命分析においては、シアニン染料
にて標識した生存可能細胞が用いられる。本明細書にて
用いているように、in vivo細胞追跡は、検体の身体に
おける細胞の位置測定および細胞がある地点を通過する
速度、例えば、細胞が血管を流通する速度の測定を包含
する。輸血赤血球の寿命は、シアニン染料標識赤血球の一部
の輸血を包含することにより測定する。輸血直後、標準
方法を用いて、全身循環中の標準赤血球の画分の測定を
行なう。その後分析した標識細胞百分率を用いて該輸血
細胞の寿命を計算する。さらに、輸血後、標準細胞の画
分の変化とヘマトクリットの変化を比較することによ
り、出血と免疫反応を識別する。含気性および標準細胞
百分率の減少速度が等しい場合、出血に起因する血液減
少を示し、一方、標準細胞総数の減少速度が比較的高い
場合は、輸血細胞に対する免疫反応を示す。ヘモグロビ
ンによる自動蛍光および自己消光を回避するためには、
好ましくは、赤色波長域内に励起し、かつ、ヘモグロビ
ンの励起波長によりさらに赤色側に放射するシアニン染
料にて赤血球を標識する。そのような染料の例は、DiC
₄₅（５）およびDiSC₁₄（３）を包含する。赤血球に用いた方法と同様の方法を用いて、in vivo
血小板寿命および出血と血小板減少症に起因した免疫反
応間の識別を行なう。しかし、血小板は、用いられる波
長の光の吸収または放出する分子を欠くので、血小板測
定を行なう際、より広範囲のシアニン染料を用いる。そ
のような血小板寿命測定は、赤血球についての前記の方
法を用いて輸血後出血と免疫反応を識別するためおよび
アテローム性動脈硬化症または罹患した患者の血小板寿
命が、該疾病に罹患していない患者の血小板寿命と異る
他の疾病の診断に用いられる。さらに、記載した方法を
用いて、白血球を包含する他の細胞のin vivo寿命の測
定を行なう。該in vivo細胞追跡分析において、細胞、外部から検
出できるシアニン染料にて標識する。そのような外部か
ら検出できる染色は、¹²⁵I−標識DiOC₁₄（３）のような
シアニン染料を包含する。細胞追跡は、また、例えば、
核磁気共鳴画像を用いて標識細胞の位置を決定できる核
磁気共鳴プローブを有するシアニン染料を用いて行なう
ことができる。さらに、シアニン染料の蛍光を用いて、
身体の外部から認識できる身体部分の細胞を追跡する。
最も一般的には、蛍光を用いて、斑、網膜および眼の血
管の細胞を追跡する。以下の実施例に記載したように、
第１期悪性腫瘍および転位悪性細胞、感染部位の検出、
静脈収縮の撮影ならびに移植拒絶の測定を包含するin v
ivo細胞追跡に用いられる。実施例つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。実施例１組織培養細胞の染色方法 I.細胞の調製最良の結果を得るために対数期組織培養細胞を用い
る。懸濁培養物を培養容器から取り出し、ポリプロピレ
ン遠沈管に入れる。単層培養を用いる場合、上清を除去し、カルシウムお
よびマグネシウム不含リン酸塩緩衝生理食塩水溶液にて
付着細胞を洗浄して、該フラスコから血清タンパクを除
去しなければならない。トリプシン−EDTA溶液（ギブコ
・ラボラトリーズ、グランド・アイランド、ニューヨー
ク（Gibco Laboratories,Grand Island,New York）＃61
0〜5300）を加えて該フラスコの底をおおい、該細胞単
層が移動し、かつ、分離するまで室温にてインキュベー
トする。得られた細胞懸濁液をポリプロピレン遠沈管に
移し、10％胎児ウシ血清（FBS）（ハツェルトンHazelto
n））を含有する等容量の培地を加えてトリプシンの酵
素作用を抑制する。細胞を室温にて10分間400×ｇにて
遠心分離する。上清を吸収し、等容量の等浸透圧性マン
ニトールを該細胞ペレットの再懸濁のために取り替え
る。このマンニトール洗浄は、血漿タンパクを該細胞懸
濁液から除去し、かつ、染色用細胞を調製するためであ
る。再度、細胞を室温にて10分間400×ｇにて遠心分離
する。上清を吸収し、得られた細胞ペレットを染色のた
め２×10⁶細胞/mlの濃度にてマンニトール溶液中で再懸
濁する。しかし、いくつかの細胞系は、糖−アルコール
（マンニトール）の使用に対して感受性であり、そのよ
うな場合、等浸透圧性グルコース溶液（MW180.16,54.05
g/）を用いることができる。 II.貯蔵染料溶液の調製２×10^-3M貯蔵溶液は、以下のように無水エタノール
中にて調製する。 DiO−C₁₃（３） MW800（1.600mg/ml） DiS−C₁₄（５） MW814（1.628mg/ml） DiO−C₁₈（３） MW936（1.872mg/ml） DiI−C₁₅（５） MW850（1.700mg/ml）全ての染料は、モレキュラー・プローブス・ユージー
ン、オレゴン（Molecular Probes,Eugene,Oregon）から
得られる。染料貯蔵物を音波処理して該染料の完全溶解を確実に
し、かつ管に対する付着を最小限にする。貯蔵溶液の調
製のためにポリエチレン管を用いるので該試料の溶解性
を観察できる。しかし、水性雰囲気下におけるシアニン
染料は、ポリスチレンと比較した場合ポリプロピレンに
対する付着がずっと少ないためポリプロピレン管を用い
て細胞を染色する。 III.細胞染色細胞を等浸透圧性マンニトール中２×10⁶細胞/mlの濃
度に調整する。細胞を染色するために、２×10^-3M貯蔵
染料溶液を細胞懸濁液1ml当たり染料５μにて該染色
溶液に加える。染色する試料をピペットで分注するか、
または撹拌して該試料を十分に混合する。細胞と該染料
を10分間インキュベートし、その後蛍光顕微鏡下での試
験用に少量を取って強く、かつ、均一な染色が生じてい
ることを確実にする。DiO染料系列は、488nm励起光に対
して選択的な顕微鏡フィルターを用い、一方、DiSおよ
びDiI染料系列は、蛍光観察のために575nm付近にて励起
を必要とする。インキュベーション期間後、等容量のPBSを該染色細
胞懸濁液に加える。該細胞を20℃にて10分間400×ｇに
て遠心分離する。該上清を吸引し、ペレットをPBS中で
再懸濁する。該遠心分離操作を繰り返し、染料の存在に
ついて得られた上清を観察する。染料が上清中に見られ
る場合、分光蛍光計により測定した時に該上清が遊離染
料を有しなくなるまで洗浄を繰り返す。最終洗浄後、上
清を除去し、ペレットを適当な培地中にて所望の濃度に
再懸濁する。全ての操作は、滅菌条件下にて行なう。実施例２赤血球染色 I.試薬調製 A.クエン酸塩抗凝血剤クエン酸ナトリウム 1.66 g クエン酸 0.206g NaH₂PO₄ 0.140g グルコース 1.61g 前記成分を蒸留水63mlに溶解し、該溶液をpH5.6に調
整する。最終溶液を滅菌のため0.22ミクロンフィルター
に通す。 B.等浸透圧性グルコース溶液グルコース54.05gを蒸留水１中に溶解する。フィス
ケ（Fiske）浸透圧計を用いて浸透圧を検査し、要すれ
ば、320mOsmに調整する。 II.貯蔵染料の調製２×10^-3MDiIC₁₄（５）の貯蔵溶液は、染料1.628mg/m
lを無水エタノール中に溶解することにより調製する。
該染料を完全に溶解するためには音波処理を必要とす
る。 III.染色方法クエン酸ナトリウムを含有するバキュテーナーまたは
シリンジの全容量の1/10に等しい量の調製クエン酸塩抗
凝血剤を含有するシリンジを用いて全血を無菌的に収集
する。フローサイトメトリーまたは機能性試験のために
少量を保存しておく。該血液を室温にて10分間100×ｇ
にて遠心分離して赤血球をペレットにする。血小板含有
血漿を除去し、保存し、充填赤血球ペレットの容積の５
培に等しい量の等浸透圧性グルコースを加えることによ
り該赤血球を洗浄する。該細胞を再度室温にて10分間10
0×ｇにて遠心分離し、上清を吸引する。血漿タンパク
を除去し、かつ、より強く、かつ、均一な染色を可能と
するこの洗浄を再度繰り返す。最終遠心分離および上清
の吸引後、該赤血球を等浸透圧性グルコース中４×10⁸
細胞/mlの濃度に再懸濁する。染料添加前に、該試料をピペットで分注するか、また
は撹拌して沈降が生じないことを確実にする。15μの
貯蔵DiS₁₅（５）（エタノール中2mM）を、それぞれ1ml
の赤血球懸濁液に加える。該試料を直ちに混合して溶液
中の迅速かつ均一な該染料の分散を確実にする。約５分
後、少量を顕微鏡観察のために取る。ワックスペンを用
いて顕微鏡スライドグラス上に環を描き、染色溶液中の
細胞の小試料を該ワックス環内に置く。該スライド上に
カバーグラスを置き、該試料を観察する。該ワックス環
の使用は、スライドグラスおよびカバーグラスによるデ
ィスコサイト−エキノサイト形質転換を減少させる。プ
ラスチック製のスライドおよびカバーの使用もこの形質
転換を抑制する。この方法にて、強く、かつ、均一な染
色が生じることを確実にしながら該染色方法の間該赤血
球構造を維持することが保証されうる。細胞は、５分後
に均一に染色され、10分以上の暴露時間は必要としな
い。該細胞が均一に染色されていることを分析した後、等
容積のリン酸塩緩衝生理食塩水を該染色懸濁液に加え
る。細胞を室温にて10分間400×ｇにて遠心分離し、上
清を除去する。通常、遠心分離後該上清中に目に見える
遊離染料の痕跡が存在するので、該上清が分光蛍光計に
より測定した時遊離染料を有しなくなるまでカルシウム
およびマグネシウム含有リン酸緩衝生理食塩水を用いた
洗浄方法を繰り返さなければならない。この時点で細胞を、実験用の適当な溶液または受容動
物中に再注入するための血小板欠乏血漿中のいずれかに
懸濁する。再注入のための一般的方法は、収集した全血
の最初の遠心分離から回収し、かつ、4000×ｇにて遠心
分離して血小板を除去した血漿の体積中に該染色赤血球
を再懸濁するものである。全ての操作は、滅菌方法を用
いて行なわれる。実施例３血小板の染色 I.細胞の調製クエン酸ナトリウムを含有するバキュテーナーまたは
シリンジの全容量の1/10に等しい量の調製クエン酸ナト
リウム抗凝血剤をが有するシリンジを用いて全血を収集
する。該細胞を室温にて10分間100×ｇにて遠心分離し
て血小板の豊富な血漿を得る。活性化を抑制するため血
小板を含有する全操作についてプラスチック製ピペット
およびポリプロピレン遠沈管を用いる。血小板の豊富な血漿を吸引し、他の遠沈管に移す。つ
いで、該血小板を20℃にて10分間1000×ｇにて遠心分離
することにより血漿を用いてペレットにする。ついで、
血漿を収集し、機能性試験または再注入用懸濁培地とし
ての使用のいずれかのために保存する。この血漿を10分
間4000×ｇにて遠心分離し、再懸濁培地として用いる前
にいずれの残留血小板の除去を確実にし、血小板欠乏血
漿（PPP）と称する。 1000×ｇの遠心分離から得られた血小板ペレットを少
量のクエン酸塩抗凝血剤中に穏やかに懸濁して濃厚均一
懸濁液を得る。これを実施した後、等浸透圧性グルコー
スを希釈剤として最初から存在する血漿に等容量にて加
える。ついで、該血小板を５分間300×ｇにて遠心分離
し、上清を吸引する。このグルコース洗浄は、残留血漿
タンパクを除去し、均一、かつ、より強い染色を可能に
する。該血小板ペレットをグルコース溶液中に再懸濁
し、染色の準備をする。血小板濃度を４×10⁸細胞/mlに調整し、血小板懸濁液
1ml当たり15μ貯蔵DiOC₁₄（３）（無水エタノール中2
mM）を加える。該懸濁液を直ちに、しかし、穏やか、か
つ十分に混合して該染料の均一分散を確実にする。蛍光
顕微鏡を用いて血小板を観察して均一染色が生じている
ことを確実にし、そうである場合、懸濁液中の遊離染料
からの分離の準備ができる。 II.標識血小板の分離のためのセファデックスＧ−100カ
ラムの使用セファロース2Bは、血小板の豊富な血漿からの血小板
の単離に従来から用いられている。本発明者らは、セフ
ァデックスＧ−100が、また、血小板の単離に十分使用
できることを見出した。この手法は、以下の方法にて染
色技術および作業に適用される。該血小板−染料懸濁液
を該カラム上に付す。小分子量染料分子は該粒子内にト
ラップされるが、大きな血小板は、該カラムを素通りす
る。この方法にて、セファデックスＧ−100を用いて蛍
光的に標識した血小板を懸濁液中の遊離染料から分離で
きる。 A.カラムの調製セファデックスＧ−100（ファルマシア・ラボラトリ
ーズ、ピスカタウエイ、ニュージャーン（Pharmacia La
boratories,Piscataway,New Jersey））を製造者の指示
に従って水和し、アセトン（100％）中で洗浄し、血小
板用分離培地として用いる準備をする。該洗浄操作は、
該セファデックスを室温にて10分間300×ｇにて遠心分
離し、該上清を除去し、ハンクス液中に再懸濁すること
により行う。アセトン臭がもはや検出できなるなるまで
該セファデックスを繰り返しハンクス液にて洗浄する。
得られた溶液を沸騰水浴中に入れるか減圧下にて脱気す
る。ついで、セファデックススラリーを用い、カラムを注
ぐ。プランジャーを除去した10ccシリンジをカラム支持
体として用いる。シリコーンチューブを該シリンジの受
口に取付け、小型の調節可能なチューブクランプを用い
てカラムを通過する流体流量を調節する。47μナイロン
メッシュを支持体として該シリンジの底にて用い、セフ
ァデックスビーズを保持する。フリット化グラスフィル
ター支持体を有する従来のガラスカラムは、これらが血
小板を活性化するのに役立つため避けるべきである。該
カラムをハンクス液で満たし、少量のセファデックスス
ラリーを該カラムに加える。該クランプを、緩慢である
が一定の流量を可能にするのに十分開放する。この方法
は、セファデックスを平滑かつ均一に充填し、溝または
泡からの空隙を防止する。所望の大きさの充填カラムを
得るまでHBSSおよびセファデックススラリーの添加操作
を繰り返す。該カラムは、使用する前にHBSS（２気孔
率）にて完全にフラッシュすべきである。 B.血小板の分離血小板染料および懸濁液を該セファデックス上に注意
深く加層する。該カラムの底部のクランプを開け、カラ
ム中の液面が、該セファデックス流体の上端に達するま
で低下させる。流動を再開して該懸濁液を該セファデッ
クスに浸透させる。液面がセファデックスの上端に達し
た時流動を再び減じる。セファデックスを乱すことなく
追加のHBSSを容易に加えることができるように十分なHB
SSを注意深く該カラムの上端に加えて緩衝部を形成す
る。再度、該カラムの流動を再開する。この方法を用い
て該血小板懸濁液を該ゲル中にて隙間のないバンドに
し、カラムの長さの間十分均一な速度にて移動させる。
この方法にてかなり濃厚な血小板溶離液が得られる。該
カラムを継続的に流し、0.5〜1.0mlの画分を収集する。
該血小板含有画分は、その不透明性により認識でき、合
して貯蔵しない。ついで、該貯蔵画分を300×ｇにて10
分間遠心分離する。該上清を吸引し、該ペレットを実験
もしくは分析のため適当な媒質中に再懸濁し、または、
血小板欠乏血漿上清を機能性分析もしくは再注入のため
に用いる。実施例４輸血後の出血および免疫反応の識別輸血する血液の各成分からの赤血球の少数を注入前に
蛍光形態の標識分子にて標識する。手術および輸血後直
ちに少量の静脈血を採取し、標準フローサイトメトリー
または分光蛍光法により標識細胞百分率（蛍光百分率）
の測定を行なう。最初の静脈穿刺後一定間隔にて、さら
に血液の一部を採取して同様に分析する。内出血が生じ
た場合、例えヘマトクリットが低下しても非染色細胞に
対する染色細胞の割合は変化しない、該患者が輸血後反
応を生じた場合、その後該染色細胞（輸血した細胞）が
選択的に破壊され、非染色細胞に対する染色細胞の割合
が低下する。この分析は、出血および輸血後の免疫反応
の識別を可能にする。実施例５特発性血小板減少症の診断法該方法は、血小板寿命および血小板産生速度を測定す
る以外実施例４と同様である。すなわち、患者自身の血
小板を注入前に標識する（実施例３参照）。該血小板の
注入後直ちに、少量の静脈血を採取し、標準フローサイ
トメトリーまたは分光蛍光法により1ml当りの標識血小
板数（蛍光百分率）の測定を行なう。最初の静脈穿刺後
一定間隔にて、さらに少量の血液を採取し、陽性蛍光百
分率について分析する。時間の関数として染色血小板お
よび非染色血小板の百分率をプロットして、該標識血小
板の分解速度および該非染色血小板の産生速度の基準を
臨床医に供する。血小板の産生または分解速度は、血小
板減少症経過の動的基準である。このようにして、臨床
医は、特発性血小板減少症様症候群が血小板産生レベル
にあるかまたは血小板寿命レベルにあるかを決定する。輸血した血小板もこれらの染料にて標識される。さら
に、前記の自己血小板についてと同様の方法にて、供血
者血小板の寿命測定を行なう。実施例６アテローム性動脈硬化症の診断法この方法を用いたアテローム性動脈硬化症の診断法
は、アテローム性動脈硬化症の血小板の寿命が正常血小
板の寿命より短いという仮説に基づいている。少数の患
者の血小板を蛍光、NMRまたは放射性標識形態の細胞標
識染料にて標識する（実施例３の方法に従う）。蛍光形態の分子にて標識した血小板（方法については
実施例３参照）を再注入し、連続静脈穿刺および時間の
関数としての標識血小板の残存数の分析（実施例５参
照）により該血小板の寿命を測定する。寿命の減少を示
す血小板寿命測定板は、アテローム性動脈硬化症に特徴
的である。別の診断法は、放射性同位体形態の分子（ガンマ放出
体）およびin vivo標識患者血小板（実施例３の方法を
用いて）を用いるものである。標識血小板を再注入し、
標準同位体計数法を用いて該血小板の寿命を測定する
か、または標準ガンマ線カメラを用いて患者を撮影し、
該標準血小板が血管に付着しているか否かを分析するか
のいずれかである。実施例７第１期腫瘍または転移の検出ガンマ放出体またはNMR感受性形態の分子と組み合せ
て２種の異る細胞方法を用いる。両方の方法において、
腫瘍細胞追跡細胞を用いる。一方の方法は、活性または
不活性リンパ球を用い、もう一方の方法は、単核細胞、
好中球または血小板追跡を用いる。リンパ球またはNK細胞は、インターロイキン−２また
は等価な分子を用いて公知の方法によりin vitroにて活
性化する。ついで、実施例１の方法を用いて、これらの
細胞を放射性またはNMR形態の分子にて標識し、患者に
再注入する。ついで、該患者を適当な撮影装置下に置
き、リンパ球回帰をモニターして未知起源の腫瘍の位置
を決める。同様の方法は、リンパ球の代わりに試験する患者から
の単核細胞を用いる。この方法においては、単核細胞を
腫瘍型特異的であるヒトまたはマウスモノクローナル抗
体にて標識して腫瘍細胞認識を維持する「ホリス，ジー
ら、セルラー・イムノロジー（Foris,G.,et al.,Cell.I
mmuno.），78,276−284（1983）」。ついで、これらの
細胞を放射線同位体またはNMR−像影形態の標識分子に
て標識し、患者に再注入する。時間連続画像は、標的単
核細胞の回帰位置を示す。第１期腫瘍または転移の位置を決定するもう１つの方
法においては、前記実施例３と同様にして単核細胞、好
中球または血小板を標識し、腫瘍または転移を発見する
ために用いる。これらの細胞は、腫瘍部位にて初期に出
現するので、該標識細胞の画像は、該腫瘍の位置測定を
可能にする。実施例８感染部位の検出この適用においては、好中球を追跡する。試験する患
者からの好中球を採取し、放射性同位体またはNMR像影
形態の標識分子にて標識する（標識については実施例１
および２の方法を用いる）。ついで、これらの細胞を再
注入し、ガンマ線カメラまたは核磁気像影法を用いて該
好中球回帰画像から感染部位を同定する。好中球プール
の動的変化の同定および治療関与から生じる変化のモニ
ターについて連続画像を用いる。実施例９斑変性をモニターすることによる糖尿病性網膜症のモニ
ター少数の赤血球（タイプＯまたは自己細胞）を、ヒト可
視域外の波長の光（700nm以上）にて励起する形態の標
識分子にて標識する（方法については実施例２参照）。
ついで、該細胞を該患者に静脈内注射する。標準蛍光網
膜カメラを用いて、網膜の血管の連続写真を撮る。蛍光
トレーサーを有する細胞を適当な波長にて励起し、放出
された蛍光を写真フイルム上に捕らえる。該染料は赤血
球にトラップされ、かつ、該赤血球は、脈管構造の外に
移動しないので、該蛍光画像は、網膜血管のみの画像で
ある。もう１つの態様においては、血管内の同一細胞を該血
管内の２つの異なる地点にて励起する標準デュアルビー
ムレーザー励起装置を用いて、該血流速度を測定する。
しかし、励起地点間の距離は固定する。それぞれの励起
地点にて蛍光を測定し、２励起地点間に要する時間の長
さが、該血管中の細胞の流速の基準になる。血管完全性および血流速度を用いて斑変性を測定す
る。そのようなモニターを用いて糖尿病患者の視力障害
の程度および治療効果を評価する。実施例10 前発作直後の患者の切迫発作の検出入念に調べる患者からの血小板を、ヒト可視域外の波
長の光（700nm以上）にて励起する形態の標識分子にて
標識する（方法については実施例３参照）。ついで、該
細胞を該患者に静脈内注射する。標準集束光源（励起波
長にて）を網膜床中の単一血管に向ける。適当な標準集
束光学および光電子増倍管を用いて蛍光を測定する。該
光電子増倍管の出力をデジタル化し、コンピュータに記
録する。蛍光強度は、静脈中に見い出される単一、二
重、三重等の血小板の数の基準である。血小板の凝集増
加は、第２発作の危険が高いことを示している。実施例11 静脈収縮の撮影放射線同位体形態の分子（ガンマ放出体）を用いて、
in vitroにて患者自身の血小板（実施例３の方法を用い
て）または赤血球（実施例２の方法を用いて）を標識す
る。標識細胞を注入し、標準ガンマ線カメラを用いて該
患者を撮影して血管の管腔が収縮しているか否かを分析
する。赤血球標識は、自己のものまたはいずれもの供血
者からのタイプＯ細胞を用いて行なうことができる。実施例12 関節炎の診断法および病期決定放射性同位体またはNMR像影形態の分子を用いて試験
する患者のリンパ球、単核細胞、または好中球を標識す
る（実施例１または２の方法）。ついで、これらの標識
細胞を該患者に再注入し、標準撮影装置を用いてうつ血
を完済する。関接炎においては、単核細胞追跡がより有
効であると予想され、骨関節炎においては、リンパ球追
跡がより有効であると予想される。これは、熱性関節の
数の測定および患者の症状に対する治療効果の評価を可
能にする。実施例13 移植拒絶の迅速測定リンパ球、好中球または血小板は、それぞれ、移植ま
たは組織拒絶において重要な役割を果す。患者の細胞を
採取し、放射性同位体またはNMR像影形態の分子にて標
識する（実施例１〜３の方法を用いて）。標識細胞を再
注入し、該患者を連続撮影する。切迫した拒絶時または
その前に、該移植中にその方法により検出される注入細
胞型の局在化が増大する。実施例14 多発性硬化症の診断法この適用は、脊髄領域またはミエリンが高率の他の領
域における細胞の局在化が測定する以外、実施例13と同
様の方法を用いる。実施例15 赤血球寿命、赤血球およ血液容積の測定赤血球寿命は、出血と移植後反応を識別する前記の方
法（実施例４）と同様にして測定する。唯一の差違は、
患者自身の赤血球を標識し、かつ、再注入することであ
る。注入後、1ml当りの標識赤血球の数を時間の関数と
して測定し（フローサイトメトリーまたは分光蛍光法を
用いて）、これらの細胞の寿命を測定する。赤血球量および血液容積は、蛍光形態の染料を用いて
既知数の赤血球（自己またはタイプＯ）を染色すること
により測定する。既知数の染色赤血球（10⁹）を０時間
目に該固体に注入し、５分後に血液の一部を採取する。
フローサイトメトリーまたは分光蛍光法により標識細胞
の画分を分析する。この希釈率および1mm³当りの全細胞
数の知見から、赤血球量および血液容積を測定する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献米国特許4424201（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 49/00 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】１．細胞生育力に対して有意な影響を及ばさない、次
式：［式中、Ｙは酸素、硫黄、メチレンまたはアルキル置換
メチレン;mは０〜3;およびｎは12〜22を意味する］で示されるシアニン染料で標識した細胞を有してなる、
in vivoにて細胞を追跡するための組成物。２．該シアニン染料標識細胞が、第１期または転位腫瘍
細胞を検出する腫瘍細胞追跡細胞である前記第（１）項
の組成物。３．該シアニン染料標識細胞がリンパ球または天然キラ
ー細胞である前記第（２）項の組成物。４．該リンパ球または天然キラー細胞を検体に処理する
前に活性化する前記第（３）項の組成物。５．該腫瘍細胞追跡シアニン染料標識細胞が単核細胞で
ある前記第（２）項の組成物。６．該腫瘍細胞追跡細胞が、腫瘍細胞認識を保持してい
る単核細胞に結合した腫瘍特異的モノクローナル抗体を
有する単核細胞である前記第（２）項の組成物。７．該腫瘍細胞追跡シアニン染料標識細胞が血小板であ
る前記第（２）項の組成物。８．該腫瘍細胞追跡シアニン染料標識細胞が好中球であ
る前記（２）項の組成物。９．該シアニン染料が、式：で示される化合物（DiSC₁₄（５））または式：で示される化合物（DiOC₁₄（３））である前記第（１）
項の組成物。１０．該シアニン染料がガンマ放出体に結合している前
記第（９）項の組成物。１１．該シアニン染料が核磁気共鳴プローブに結合して
いる前記第（９）項の組成物。１２．該シアニン染料標識細胞が、検体に感染した有機
体と相互作用して該感染部位を決定する前記第（１）項
の組成物。１３．該有機体が細菌または真菌である前記第（12）項
の組成物。１４．該シアニン染料標識細胞が好中球である前記第
（13）項の組成物。１５．該シアニン染料標識細胞が赤血球である前記第
（１）項の組成物。１６．検体の網膜をシアニン染料標識赤血球の存在につ
いて調べ網膜症または血管変性を検出するための前記第
（15）項の組成物。１７．該シアニン染料標識赤血球が血管中を流動する速
度を測定するための前記第（15）項の組成物。１８．該シアニン染料の励起波長がヒト可視波長域外で
ある前記第（15）項の組成物。１９．該シアニン染料標識細胞が血小板である前記第
（１）項の組成物。２０．シアニン染料標識血小板の集団が網膜血管中に検
出される前記第（19）項の組成物。２１．該シアニン染料標識細胞が単核細胞、好中球、リ
ンパ球または血小板である前記第（１）項の組成物。２２．該シアニン染料がガンマ放出体に結合している前
記第（21）項の組成物。２３．該シアニン染料が核磁気共鳴プローブを有する前
記第（１）項の組成物。２４．細胞生育力に対して有意な影響を及ぼさない、次
式：［式中、Ｙは酸素、硫黄、メチレンまたはアルキル置換
メチレン;mは０〜3;およびｎは12〜22を意味する］で示されるシアニン染料で標識した細胞を有してなる、
in vivoにて細胞の寿命を測定するための組成物。２５．該シアニン染料標識細胞が赤血球である前記第
（24）項の組成物。２６．該シアニン染料標識赤血球の消失速度とヘマトク
リット変化を比較して出血および赤血球に対する免疫反
応のいずれかを識別するための前記第（25）項の組成
物。２７．一定数の完全標識細胞を注入し、かつ、平衡後の
希釈率を測定することにより全血液容積を測定するため
の前記第（25）項の組成物。２８．該検体細胞を標識することにより該シアニン染料
標識赤血球を調製する前記第（25）項の組成物。２９．ランダムドナータイプＯ赤血球を標識することに
より該シアニン染料標識赤血球を調製する前記第（25）
項の組成物。３０．該シアニン染料標識細胞が血小板である前記第
（24）項の組成物。３１．該シアニン染料標識血小板の消失速度と全血小板
数を比較して出血または血小板産生の減少および血小板
に対する免疫反応のいずれかを識別するための前記第
（30）項の組成物。３２．該シアニン染料が、式：で示される化合物（DiSC₁₄（５））または式：で示される化合物（DiOC₁₄（３））である前記第（24）
項の組成物。３３．シアニン染料標識血小板の寿命をアテローム性動
脈硬化症の基準として測定するための前記第（30）項の
組成物。３４．該シアニン染料標識好中球を用いて感染場所を検
出するための前記第（22）項の組成物。３５．シアニン染料標識血小板を眼内測定して微小塞栓
を検出するための前記第（32）項の組成物。３６．シアニン染料標識細胞を画像法と共に用いて動脈
収縮を測定するための前記第（22）項の組成物。３７．該シアニン染料標識細胞を関節炎の病期決定に用
いるための前記第（24）項の組成物。３８．該シアニン染料標識細胞を関節炎の病期決定に用
いるための前記第（22）項の組成物。３９．該シアニン染料標識細胞を用いて移植または組織
拒絶をモニターするための前記第（22）項の組成物。