KR100298682B1

KR100298682B1 - 시아닌염료-표시된세포의생체내세포추적용또는생체내세포의수명측정용용도

Info

Publication number: KR100298682B1
Application number: KR1019870012050A
Authority: KR
Inventors: 폴칼호랜; 슈엘렌슬레작
Original assignee: 에드워드 티. 렌쯔; 스미스클라인 비참 코포레이션
Priority date: 1986-10-31
Filing date: 1987-10-30
Publication date: 2001-11-22
Also published as: DK570487D0; DK167850B1; PT86030B; DK167957B1; PT86030A; DK570487A; ZA878116B; PH24539A; IL84294A0; ES2076929T3; DE3751434T2; KR880005458A; DE3751434D1; ATE125710T1; EP0266195A1; JPS63126833A; IE70749B1; US4762701A; IL84294A; JP2872243B2

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

생체내에서 세포의 추적 또는 세포의 수명 측정을 위한 시아닌 염료-표시된 세포

[기술분야]

본 발명은 생체내에서 세포를 추적하는 방법과 생체내의 세포 수명을 측정하는 방법에 관한 것이다.

[배경기술]

생체내의 세포추적 및 수명 측정을 위하여 세포들이 그 세포내에서 안정성이 있는, 즉 그 세포에서 소실되지 않으며, 세포기능에 현저하게 영향을 미치지 않는 표시물에 의해 표시되어야 한다. 현재 이용할 수 있는 표시물들은 필요한 특성을 부여하는데는 부족한 점이 있다. 예컨데, 형광 항체는 세포로부터 쉽게 분리되기 때문에 적절하지 않다. 다른 강력한 표시물은 세포 기능을 방해하기 때문에 사용할 수 없다.

시아닌 염료가 여러 가지 생물학적 응용에 사용된바 있다. 디옥사카르보시아닌 염료가 백혈구의 세포분화 측정에 사용된 바 있다. 군터 빌레트, 맥스 플랑크 게스 위쎈취; 특허허여번호 84-102307/17, 선택적 염색 및 용적과 형광성의 측정에 의한 백혈구의 동시 정량적 측정. 그러나 이들 연구에서 이용된 염료는 10개 이하의 탄소로된 짧은 사슬의 카보시아닌 염료이며 막전위 변화에 일치한다. 더욱이, 짧은 사슬 카보시아닌 염료는 세포 미토콘드리아내로 침투되며, 세포에게 독성이 있고, 세포를 세척했을 때 이들 염료는 세포의 막전위 변화에 관계없이 세포에서 쉽게 빠져나간다. 기타 짧은 지방족 사슬 시아닌 염료가 여러 다른 생물학적 분석에서 사용된다. 그러나, 짧은 사슬 분자들은 막전위와 일치되고 그 세포막을 횡단하여 미토콘드리아에 침투된다(에이취. 엠. 샤피로, 미국특허 제4,343,782, 1982. 8. 10일자). 짧은 사슬 염료도 세포들에게 독성이 있어서 생체내에서 세포를 추적하는데 사용될 수 없다.

트리카보시아닌 염료(폭스, 아이. 제이. 등, Proc. Mayo Clinic, 32:478-484, 1957) 및 에반스-청 염료(샤드, 에이취. 등, Pfluegers Arch. Eur. J. Physiol., 370(2):139-144, 1977)는 희석 방법을 통하여 생체내 심장에서의 혈액 분출양을 측정하기 위하여 사용되었다. 다우(다우, 피., Physiol. Rev., 36:77-102, 1956)는 폐의 정맥쪽에 공지된 양의 특정 혈관주사용 지시약을 주사하는 방법과 주사하는 위치 및 시료채취 위치 사이의 용적을 측정하기 위하여 지시약의 동맥내 농도를 시간 경과에 따라 측정하는 방법을 설명하고 있다. 이들 염료는 세포를 염색하는데 사용되지 않는다.

[발명의 요약]

본 발명은 생체내에서 세포를 추적하고 세포 수명을 측정하는 새로운 방법이다. 본 발명의 신규 세포추적 방법에 따라 먼저 세포를 시아닌 염료로 표시한 다음 피검물에 주사하여 시아닌 염료가 세포의 위치를 알아내는데 이용된다. 또 다른 특징으로는 세포 수명을 표시된 세포의 소멸율을 측정하여 결정한다.

이상의 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다. 본 발명 방법에서 생체내에서 세포를 추적하고 생체내에서 세포 수명을 측정하기 위하여는 세포를 시아닌 염료로 표시한다. 다음 구조식을 갖는 화합물을 본원에서 시아닌 염료라고 부른다.

이 구조식에서, Y는 산소, 유황, 메틸렌 또는 알킬-치환된 메틸이며; m은 0-3이고; n은 12-22이다.

여기에서 사용한 바와 같은 알킬-치환된 메틸렌은 메틸, 에틸, 또는 프로필 치환체들중 몇가지 혼합하여 가진 일- 또는 이-치환된 메틸렌을 말한다.

상기 구조식의 화합물들은 다음과 같이 일반적으로 알려진 간단한 일반식으로 표시된다.

DiYCn (2m+1)

(심즈, 피.제이. 등, Biochem., 13:3315 (1974). 그러므로, 예컨데, Y가 유황이고 3개의 탄소가 고리들을 연결하고 있으며 탄소 14개의 지방족 사슬이 두개인 화합물은 DiSC₁₄(3)라고 부른다. 이와 유사하게, DiIC₁₄(5)는 Y가 이소프로필이고, 고리들과 14개의 탄소로된 지방족 사슬 두 개의 교량역을 해주는 5개의 탄소를 갖는 화합물을 가리킨다.

본원에서 시아닌 염료라고 부르는 화합물에 속하는 것은 한 개나 둘 이상의 치환체를 갖는 상기 구조식의 화합물인데 이때 그 치환된 화합물은 적어도 세포 표시를 하는데 필요한 만큼의 기간동안 세포 표시 매질에서 가용성이고 표시된 세포막과 결합하여 남아있도록 충분히 높은 막분할 계수를 갖는 것을 조건으로 한다. 이런 화합물들은 표시에 필요한 농도로 존재할 경우 세포의 생육에 현저한 영향을 주지 말아야 한다. 세포 표시 매질의 용해도는 표시 매질에 시아닌 염료를 분산시켜서 전 시간에 걸쳐 형광 강도를 측정하는 표준 분광형광 기술로 아래와 같이 측정한다. 형광 강도의 감소는 혈관벽에 염료가 침전되어 부착된다는 것을 가리키는 것이다. 그 염료가 세포막과 결합되어 남아있는지 여부를 측정한다. 예컨데, 세포 표시 후 공여동물에 주사한 적혈구의 형광 강도를 감시하기 위한 공지된 유출 혈구 계산 공정을 이용하여 측정한다. 본질적으로 주사 후 표시된 세포의 일정한 형광 강도가 세포막에서의 염료 안정성을 확정짓는다.

또한, 본원에서 시아닌 염료라고 부르는 화합물의 범위내에 속하는 것으로는 자기 공명상으로 탐지될 수 있는 원자들과 결합된 상기 구조식의 화합물들이다. 그 화합물들은 공지 기술들을 이용하여 제조한다. 예컨데, 불소원자를 지방족 사슬의 메틸 그룹중의 하나에 결합시켜서 제조한다.¹²⁵I와 같은 감마 방사체가 붙어있는 상기 구조식의 화합물도 여기에서 시아닌 염료라고 부른다.

본 발명에서 사용된 시아닌 염료는 오레곤, 유겐에 위치한 분자 소식자 인코포레이션과 같은 여러 출처에서 구매할 수 있고, 공지된 합성 방법을 사용하여 유용한 출발물질로 제조할 수 있다. 해머, 에프. 엠. 시아닌 염료와 관련 화합물, 인터 사이언스 출판사 (1964)

본 발명 공정을 사용하여 살아있는 세포를 시아닌 염료로 표시시킬 수 있다. 여기에서 사용된 세포란 용어는 백혈구, 각종 종양세포들, 기타 포유동물 세포들 (예를 들면, 조직배양된 중국 햄스터 난소세포), 효모등과 같은 핵보유 진핵 세포 (nucleated eukaryotic cells) 및 적혈구와 혈소판같은 비-핵보유 세포 (non-nucleated cells)를 포함한다. 핵보유 세포는 그 형태의 세포들에게서 본질적으로 기대되는대로 성장하거나 기능을 발휘할 수 있으면 살아있는 것이고; 비-핵보유 세포는 예컨데, 적혈구가 산소 및 이산화탄소를 운반할 수 있고 살아 있는 혈소판이 본질적으로 기대되는 바와 같이 응집과 방출 분석등을 수행하는 것과 같이 이들 세포에서 기대되는 기능을 수행할 수 있으면 살아있는 것이다.

세포 표시는 세포에 치명적이지 않으며 재생성 세포 표시를 할 수 있는 매질에서 실시된다. 필요한 특성을 매질에 주기 위해서는 적어도 세포 표시에 필요한 기간동안 시아닌 염료가 안정한 용액을 형성하는 삼투압 조절제를 사용한다. 허용되는 삼투압 조절제로는 당류, 예컨데, 포도당, 과당, 소르보스, 크실로스 및 리보스등과 같은 단당류와 설탕 및 당-알콜과 같은 이당류, 만니톨, 글리세롤, 이노시톨, 크실리톨 및 아도니톨과 같은 아미노산, 글리세린과 아르기닌 및 굳(Good) 완충액 이를테면 N-트리스 (하이드록시메틸)-메틸-3-아미노프로판 술폰산과 같은 약품이 포함된다. 굳, 엔. 이.등, Biochem. 15, 467-477 (1966), 굳, 엔. 이. 및 에스. 이자와, Methods Enzymol., 24, Part B. 53 (1968), 휘구손, 더블유. 제이. 등, Anal. Biochem. 104:301-310 (1980). 그러나 몇 가지 세포주는 한 개나 둘 이상의 삼투압 조절제, 특히, 당-알콜류에 민감할 수도 있다. 그래서, 세포 표시 이전에, 그 세포들이 시도하려는 삼투압 조절제에서 생존할 수 있는지를 확실히 하기 위해서 표준 시험을 실시한다. 그 외에, 수소이온 농도를 조절하기 위해서는 표시 매질에 소량의 완충제를 추가할 수도 있다.

각종 삼투압 조절제에 노출시 세포의 생존 가능성에 미치는 영향을 그 세포들을 여러 삼투압 조절제에 30분 동안 노출시킨 후 Yac 세포의 배가 시간 측정을 통하여 조사하였다. Yac 세포는 매릴랜드주 로크빌에 위치한 미국 균주보존협회에서 얻을 수 있는 생쥐의 임파 조직 배양 세포주이며, 유럽면역학회지 5:112-117 (1975)에 기술되어 있다. 표 1의 데이터는 인산 완충식염수와 비교했을 때 설탕, 포도당 및 굳 완충액: TAPS, CAPS, EPPS, HEPPSO 및 DIPSO에 대한 노출이 세포 배가시간에 아무런 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 것이며, 이는 노출에 관련된 세포 독성이 없음을 의미하는 것이다.

A-성장하지 않았거나 부분적으로 세포독성이 있음.

B-심한 세포독성이 있음.

A-성장하지 않았거나 부분적으로 세포독성이 있음.

B-심한 세포독성이 있음.

표 2는 시아닌 염료 독성에 관하여 시험한 여러 가지 삼투압 조절제를 나타낸 것이다. 원심분리시켜 침전물을 제거한 후, 전체 농도를 측정하고 분광형광 분석을 위해서 시아닌 염료가 들어 있는 소량의 삼투압 조절제 표본을 에탄올에 녹인다. 사용한 염료는 DiSC₁₄(5) 및 DiOC₁₄(3)이었고, 삼투압 조절제는 등-삼투압성 농도였다. 표준 에탄올 용액에서 얻은 형광 강도의 감소는 시아닌 염료 용해도의 감소와 직접 관련이 있다.

* 에탄올에서의 침전물, 어떤 자료도 얻을 수 없음.

** 펠릿화하지 않았던 대형 결정에 의한 가공품.

*** 에탄올에서의 침전(자료 의문시됨).

ND 측정하지 않음.

표 2와 같이, 시아닌 염료는 릭소소, 당-알콜, 아미노산 및 굳 완충액, TAPS, HEPPSO, DIPSO, CAPS 및 EPPS를 제외한 당류의 존재하에서 보다 전형적인 염의 존재하에서 훨씬 용해성이 적다. 이외에도, 포도당, 과당, 리보스, 소르보스, 설탕 및 크시로스와 같은 당류와 글리세롤, 이노시톨, 크실리톨 및 아도니톨과 같은 당-알콜 및 글리신과 아르기닌과 같은 아미노산류에서 DiSC₁₄(5) 용액의 용해도를 측정하였다. 시아닌 염류는 재생 가능한 세포 표시를 위해서 충분한 시간인 적어도 20분동안 시험용액에서 안정성이 있었으며, 많은 약품들 중에서 용액중의 시아닌 염료량이 60분동안 현저하게 감소하지 않았다.

더욱이, 염료가 용해할 수 있는 전형적인 염과 삼투압 조절제를 함유하는 매질에서 시아닌 염료의 용해도를 측정하였다. 등-삼투성 포도당 용액에서 DiSC₁₄(5)의 용해도는 증류수 희석에 의하여 현저한 영향이 없었다. 그러나, 등-삼투성 포도당 용액에서의 DiSC₁₄(5) 용해도는 약 20% 등-삼투성 염화나트륨 용액만으로의 희석에 의해 현저하게 감소되었다. 그래서, 시아닌 염료로 재생 가능한 세포의 표시는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 초산나트륨, 초산칼륨, 황산나트륨, 요오드화나트륨, 염화콜린 또는 요오드화 콜린과 같은 표준염소량에 불과한 매질에서 실시할 수 있고, 바람직하게는 어떤 전형적인 염류도 삼투압 조절을 위하여, 사용하지 않는 매질에서 실시하는 것이 좋다.

본 발명 공정을 사용하여 표시한 세포 시아닌 염료를 세포의 생존성에 관한 표시의 효과를 측정하기 위하여 분석을 실시하였다. 메릴랜드주 로크빌에 위치한 미국 균주보존협회에서 이용할 수 있고, 디. 엠. 아나레티칼뉴욕 아카데미 소사이어티., 397:101-109 (1982)에서 설명되어있는 V79 세포는 10^-5나 4 × 10^-5M의 농도로 DiOC₁₄(3)를 함유하는 용액으로 표시하였고, 염색된 세포의 성장 반응을 염색되지 않은 세포 및 염색된 것과 염색되지 않은 세포의 동일 혼합물과 비교하였다. 세포 배가 시간은 시아닌 염료 표시에 의해 아무런 영향을 받지 않았다. 그러므로, 세포 표시는 세포의 성장에는 아무런 영향을 미치지 않는다. 또한 "트리판 청 배제 및 프롬피듐 요오드배제" 방법과 같은 여러 이외의 세포 생존성의 표준시험들도 앞서 설명한 공정에 따라 표시된 시아닌 염료가 세포 생존성에 영향을 미치지 않음을 확신시켜주었다.

세포 생존성에 관한 시아닌 염료 표시 효과도 적혈구 파멸성을 측정하여 결정하였다. 표시되었거나 표시되지 않은 적혈구를 염의 농도를 변경시키면서 여러 가지 삼투강도의 염화나트륨 매질에 현탁시켰다. 세포의 용적분포는 채널라이저 부품이 장착된 쿨터 카운터(coulter counter)를 사용하여 측정하였다. 평균 용적을 결정하고 각 염 농도에 대하여 도표를 만들고 용적이 직하하는 방울모양을 나타내는 약 0.5 g/100 ml까지 염화나트륨 농도를 감소시켜서 용적을 증가시켰다. 이 단계에서 적혈구가 분해된다. 또한 용적 변화는 세포가 시아닌 염료로 표시되는 것과 관계없이 동일하였다. 이와 유사한 경향으로 염화나트륨 농도의 함수로서 동일 방향의 시료에서 용혈 반응이 관찰되었다. 적혈구를 약 2-3분간 염화나트륨속에 위치시킨 후, 용액을 원심분리하여 약간 분해되지 않은 세포들을 펠릿으로 만들었다. 그 다음 상등액을 분광광도계로 분석하여 헤모글로빈 농도를 결정했다. 분해율은 전체적으로 분해된 대조구에 대한 각 시료의 헤모글로빈 농도를 비교하여 결정하였다. 유리 헤모글로빈 농도는 약 0.5 g의 염화나트륨/100ml에 도달할때까지는 비교적 낮았으며 그 후 헤모글로빈을 즉시 방출했다. 적혈구의 파멸성 결과와 비교하여, 용적 변화는 헤모글로빈의 방출과 직접적으로 관련이 있었다. 더구나, 헤모글로빈의 방출은 표시된 세포와 표시되지 않은 세포에서 동일했다.

본 발명 방법에 따라 표시된 세포 시아닌 염료의 생체내 안정성을 시험하기 위하여, 토끼의 적혈구를 수거하여 DiSC₁₄(5)로 표시하고 재주입시켰다. 그후 주기적으로 혈액시료를 얻어서 표시된 세포 비율과 표시된 세포의 형광 강도를 분석했다. 시간의 함수와 같이 선형으로 감소된 순환하는 적혈구의 수와 평균 52일로 측정된 표시된 세포의 수명은 평균 40 내지 60일로 보고된 토끼의 적혈구의 수명과 밀접한 관계가 있다. 그러므로, 시아닌 염료표시는 적혈구의 제거율에 영향을 미치지 않았다.

시험한 5 마리 토끼중 한 마리를 제외하고는 모두에서 남아있는 염색된 세포의 형광 강도가 본질적으로 세포를 표시하여 재주사한 후 60일간 변하지 않았다. 5마리의 동물에서, 겨우 20%의 시아닌 염료가 그 토끼들의 순환 세포내에서 60일 후 표시된 세포로부터 이동했다. 표시된 세포에서 표시되지 않은 세포들로 아무런 염료의 이동이 없음을 보여주는 조직 배양에서 얻은 데이터와 혼합된 이들 데이터는 그 세포들이 염료들로 안정하게 표시되었음을 입증하는 것이다.

시아닌 염료로 표시된 생존 가능한 세포를 본 발명에서는 생체내에서 세포의 추적과 사람을 포함한 포유동물 피검물에서의 생체내의 수명분석에 사용한다. 여기에서 사용된 바와 같은 생체내의 세포 추적은 피검물 본체내의 세포의 위치를 결정하는 것과 세포들이 혈관을 통하여 흐르는 속도를 측정하는 것이 포함된다.

수혈된 적혈구의 수명은 그 수혈내에 시아닌 염료-표시된 적혈구의 부분표본을 포함시켜서 결정된다. 수혈후 즉시 표준 기술을 사용하여 계통순환내의 표시된 적혈구의 유분을 결정한다. 표시된 세포들의 퍼센트를 연속결정하여 수혈된 세포들의 수명을 계산하였다. 더구나, 수혈후 출혈은 표시된 세포의 유분의 변화를 헤마토그리트관의 변화와 비교하므로 면역 반응과 구별된다. 공기의 감소와 표시된 세포 퍼센트의 감소의 비율이 동등한 것은 출혈에 의하여 생긴 혈액의 손실을 의미한다. 이에 반하여 비교적 높은 비율의 표시된 세포 총수의 감소는 수혈세포에 대한 면역 반응을 가리킨다. 헤모글로빈에 의한 자동 형광성과 자체-소멸을 피하기 위하여 적혈구를 적색파장내에서 자극되고 헤모글로빈의 자극 파장보다 그 적색파장에 더욱 빛을 발하는 시아닌 염류로 표시한다. 그런 염료의 예는 DiSC₁₄(5)와 DiSC₁₄(3)을 포함한다.

적혈구를 가지고 사용한 그것들과 유사한 기술을 사용하여, 생체내에서의 혈소판의 수명과 혈소판 감소증으로 인한 출혈 반응이나 면역 반응간의 차이점을 얻는다. 그러나 혈소판이 사용된 파장에서 빛을 흡수하거나 반사하는 분자가 결핍되었기 때문에 보다 다양한 여러 시아닌 염료가 혈소판 측정에 사용된다. 그런 혈소판 수명 측정치는 적혈구에 관한 상기 설명한 방법을 사용하여 수혈후-출혈을 면역 반응과 구별하는데 사용되며, 질병으로 인하여 영향을 받지 않는 환자들의 혈소판 수명이 완치된 환자의 혈소판 수명과 다른 아테롬성 동맥경화증이나 다른 질병들을 진단하는데 사용된다. 이외에도, 위에서 설명한 방법은 백혈구를 포함하여, 생체내에서 다른 세포들의 수명을 결정하는데 사용된다.

생체내의 세포 추적 분석에는, 세포들을 외부적으로 탐지할 수 있는 시아닌 염료로 표시한다. 그런 외부적으로 탐지가능한 염료들로는¹²⁵I-표시된 DiOC₁₄(3)과 같은 시아닌 염료들이 포함된다. 세포추적 또한 핵자기 공명소식자를 갖는 시아닌 염료를 사용하여 실시할 수 있으므로 표시된 세포를 찾기 위해서 핵자기 공명 심상을 사용하는 것이 가능하다. 이외에도, 시아닌 염료의 형광성은 체외곽에서 가시할 수 있는 몸의 영역에서 세포들을 추적하는데에 사용된다. 가장 일반적인 것으로는 눈의 흑점, 망막, 및 혈관에서 세포들을 추적하는데 형광이 사용된다. 다음 실시예들에서 설명된 것들은 초기 악성 종양과 전이 악성 종양 세포의 탐지, 감염부위의 탐지, 관상동맥의 협착 및 이식조직 거부의 결정을 포함한 생체내 세포 추적에 관한 용도들이다.

다음의 실시예들은 본 발명을 구체적 예를 들어 설명한 것이며, 상기에서 정의하고 하기에서 청구한 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

[실시예 1]

조직배양 세포의 염색 방법

I. 세포의 준비

최상의 결과를 얻기 위하여 대수 성장기의 조직배양 세포를 사용한다. 현탁 배양액을 배양 용기로부터 폴리프로필렌 원심분리관으로 옮긴다. 단층 배양을 사용할 경우, 상등액을 제거하여야 하며, 플라스크로부터 혈청단백질을 제거하기 위하여 부착된 세포를 칼슘과 마그네슘이 제거된 인산완층 식염수로 세척한다. 트립신-EDTA 용액 (기브코 레보러토리스, #610-5300, 뉴욕, 그랜드 아일랜드)을 첨가하여 플라스크 바닥을 덮고 세포단층이 제거되어 분산될때까지 실온에서 배양시킨다. 그 결과 생긴 세포 현탁액을 폴리프로필렌 원심분리관에 옮기고, 10% 태아 송아지 혈청 (FBS)(하젤톤)이 들어있는 동일 용적의 배지를 첨가하여, 트립신의 효소작용을 억제한다. 세포들을 실온에서 10분간 400×g으로 원심분리한다. 상등액을 흡출기로 빨아내고 동일 용적의 등-삼투성 만니톨을 세포 펠릿을 재현탁시키기 위하여 대신 넣는다. 이 만니톨 세척은 세포 현탁액에서 혈장 단백질을 제거하여 염색할 세포를 마련하는 것이다. 세포들을 실온에서 10분간 400×g로 다시한번 원심분리한다. 상등액을 흡출해내고, 그 결과 생긴 세포 펠릿을 염색하기 위해서 2×10⁶세포수/ml의 농도로 만니톨 용액에 재현탁시킨다. 그러나 몇가지 세포주들은 당-알콜(만니톨)의 사용에 민감하다. 이 경우에 등-삼투성 포도당 용액(분자량 180.16, 53.05 g/l)을 사용할 수도 있다.

Ⅱ. 염료 원액의 제조

순수 에탄올에 다음 물질들을 넣어서 2×10^-3M 원액을 제조하였다.

DiO-C₁₄(3) 분자량 800 (1,600 mg/ml)

DiS-C1₄(5) 분자량 814 (1,628 mg/ml)

DiO-C₁₈(3) 분자량 936 (1,872 mg/ml)

DiI-C₁₄(5) 분자량 850 (1,700 mg/ml)

모든 염료는 오레곤주, 유겐에 위치한 몰레큘과 프로브 회사로부터 수득한다.

염료를 완전히 용해시키고 시험관에 부착되는 것을 최소화하기 위하여 염료 원액을 고주파 분해시킨다. 폴리스티렌 시험관을 원액 제조에 사용하므로써 염료의 용해도를 관찰할 수가 있다. 그러나 수용액 상태의 시아닌 염료를 폴리스티렌보다 폴리프로필렌에 훨씬 적게 부착되므로 폴리프로필렌 시험관을 세포를 염색하는데 사용한다.

Ⅲ. 세포 염색

세포들을 등-삼투성 만니톨에 2×10⁶세포/ml의 농도로 조절한다. 세포를 염색하기 위해서 2×10^-3M 염료 원액을 1 ml의 세포 현탁액당 5 ml의 염료 농도로 염색 용액에 첨가한다. 염색할 시료를 피펫으로 옮기거나 와동시켜서 시료를 완전히 혼합한다. 세포를 10분동안 염료와 배양시킨 후 형광현미경을 통한 관찰을 위해 소량의 부분표본을 채취하여, 진하고 균일한 염색이 되었음을 확인한다. DiO 염료계열은 488 nm 자극광에 대해 선택적인 현미경 필터를 사용하는 반면, DiS와 DiI 염료 계열은 형광성 관찰을 위해 575 nm 가까운 자극광이 요구된다.

배양 후, 동일 용적의 PBS를 염색세포 현탁액에 첨가한다. 세포들을 20℃에서 10분간 400×g으로 원심분리한다. 상등액을 흡출해내고 펠릿을 PBS에 재현탁시켰다. 원심분리 과정을 반복하여 생긴 현탁액에 염료가 존재하는 가를 관찰했다. 염료가 상등액에 존재하면 분광형광계로 측정하여 유리염료가 완전히 없어질때까지 세척을 반복한다. 최종 세척 후, 상등액을 제거하고 펠릿을 적절한 배지에서 필요한 농도로 재현탁시킨다. 모든 공정을 무균 상황하에서 실시한다.

[실시예 2]

적혈구 염색

I. 시약조제

A. 구연산염 항응고제

1.66g 구연산나트륨

0.206g 구연산

0.140g NaH₂PO₄

1.61g 포도당

상기에 나열된 성분들은 63 ml의 증류수에 용해시키고, 용액을 pH 5.6까지 조절했다. 최종 용액의 살균을 위해 0.22 미크론 필터에 통과시켰다.

B. 등삼투성 포도당 용액

포도당(54.05g)을 1 1 증류수에 용해한다. 휘스크 삼투압측정기를 사용하여 삼투압을 측정하고 필요한 경우 320 mOsm 까지 조절한다.

Ⅱ. 염료원액 제조

순수 에탄올에 1.628 mg/ml의 염료를 용해하여 2 ×10^-3M DiIC₁₄(5)의 원액을 제조한다. 완전하게 염료를 용해하기 위해서는 고주파 분해가 필요할 수도 있다.

Ⅲ. 염색 공정

구연산 나트륨이 들어있는 바큐테이너 또는 주사기 총용적의 10분의 1에 해당하는 양의 상기 제조된 구연산염 항응고체가 들어있는 주사기를 사용하여 무균적으로 전체 혈액을 수거한다. 유출 혈구계산이나 기능성 시험을 위해서 소량의 부분 표본을 저장한다. 적혈구를 펠릿화하기 위해서 실온에서 10분간 100×g으로 혈액을 원심분리한다. 혈소판이 포함된 혈장을 분리 보관하고 충진된 적혈구 펠릿 용적의 5배에 해당하는 양으로 등-삼투성 포도당을 첨가하여 적혈구를 세척한다. 세포는 다시 실온에서 10분동안 100×g으로 원심분리하고 그 상등액은 흡출제거 한다. 혈장 단백질을 제거하고 보다 진하고 균일한 염색이 되도록 세척을 한번 더 반복한다. 최종 원심분리 및 상등액의 흡출 후, 적혈구를 등-삼투성 포도당에 재현탁시켜 4 ×10⁸세포/ml의 농도로 한다.

염료를 첨가하기 전에, 시료를 피펫으로 옮기거나 와동시켜서 침전이 생기지 않았는지를 확인한다. 15 ㎕ 원액 DiSC₁₄(5) (2 mM의 에탄올 용액)을 적혈구 현탁액 1 ml에 첨가한다. 용액속에 염료가 신속하고 균일하게 분포되도록 시료를 즉시 혼합한다. 약 5분 후 소량의 부분 표본을 채취하여 현미경 관찰을 실시한다. 왁스 연필을 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 원을 그리고, 염색 용액내 소량의 세포 시료를 그 왁스원안에 위치시킨다. 덮게를 그 슬라이드 상에 덮고 시료를 관찰한다. 왁스 원의 사용은 유리 슬라이드와 덮게로 인한 원판 세포-성게 세포 변형을 감소시킨다. 플라스틱 슬라이드와 덮게를 사용하여도 이 형질 변형을 막게된다. 이 방법으로 적혈구 구조가 전염색 과정에 걸쳐 유지되며, 진하고 균일한 염색이 된 것을 확인할 수 있다. 5분 후 세포들이 균일하게 염색되어야 하며 10분 이상의 긴 시간의 노출이 요구되어서는 안된다. 세포들이 균일하게 염색된 것을 관찰한 후, 동일 용량의 인산 완충 식염수를 염색 현탁액에 첨가한다. 세포를 실온에서 10분간 400×g로 원심분리하고 상등액을 제거한다. 원심분리후 상등액에 존재하는 가시적인 유리 염료의 흔적이 보통 있게 된다. 그러므로 칼슘과 마그네슘이 포함된 인산 완충 식염수를 사용하는 세척 공정을 상등액에서 분광 형광계로 측정하여 유리 염료가 없어질때까지 반복해야 한다.

이 시점에서 실험용의 적절한 용액이나 수체 동물에 재주사한 혈소판 결핍혈장에 세포들을 현탁시킬 수도 있다. 재주입을 위한 일반적 방법은 수집한 전체 혈액을 최초 원심분리를 통하여 회수하고 혈소판을 제거하기 위해서 400×g로 원심분리된 혈장 용적에 염색된 적혈구를 재현탁하는 것이다. 모든 공정은 무균 기술을 이용하여 실시한다.

[실시예 3]

혈소판 염색

I. 세포의 준비

구연산 나트륨이 들어있는 바큐테이너 또는 시린지의 총용량의 10분의 1에 해당하는 양으로 준비된 구연산 나트륨 항응고제가 들어있는 시린지에 전체 혈액을 모은다. 혈소판이 풍부한 혈장을 얻기 위해서 실온에서 10분간 100×g로 세포를 원심분리한다. 활성화를 막기 위해서 혈소판이 들어있는 모든 공정에서 플라스틱 피펫과 폴리프로필렌 원심 분리관을 사용한다.

혈소판의 풍부한 혈장을 흡출해내고 또 다른 원심분리관에 옮긴다. 그 다음 20℃에서 10분간 100×g으로 원심 분리하여 혈장을 벗어나 혈소판을 펠릿으로 만들었다. 그때 혈장을 수거하고 기능성 시험을 하거나 재주사를 위한 현탁 매질로써 사용하기 위하여 보관한다. 이 혈장은 어떤 잔류 혈소판이 재현탁 매질로서 사용하기 전에 제거 되었음을 확실히 하기 위하여 10분간 4000×g로 원심분리시켜야하며 이 혈장은 혈소판 결핍 혈장(ppp)이라고 부른다. 1000×g로 원심분리하여 얻은 혈소판 펠릿은 농축된 균일 현탁액을 얻기 위하여는 소량의 구연산염 항응고제에 유연하게 현탁시켜야 한다. 이렇게 한 후, 그 다음 등-삼투성 포도당을 희석제로서, 원래 존재하는 혈장에 해당하는 양으로 첨가할 수도 있다. 그때 혈소판을 5분동안 300×g로 원심분리하고 상등액을 흡출시킨다. 이 포도당 세척은 잔류한 혈장 단백질을 제거하여 균일하고 보다 진한 염색이 되도록 한다. 혈소판 펠릿을 포도당 용액에 재현탁시켜서 염색할 준비를 한다.

혈소판 농도를 4×10⁸세포/ml로 조절하고 15 ㎕의 원료 DiOC₁₄(3)(2mM의 순수에탄올 용액)을 혈소판 현탁액 1 m에 첨가한다. 현탁액을 즉시 부드럽고 전체적으로 혼합하여 골고루 염료가 분포되도록 한다. 형광 현미경을 사용하여 혈소판을 관찰하고 균일한 염색이 되었나를 확인한 후 현탁액에서 유리 염료를 분리할 준비를 한다.

Ⅱ. 표시된 혈소판의 분리를 위한 세파덱스 G-100 칼럼의 사용

세파로즈 2B가 전통적으로 혈소판이 풍부한 혈장에서 혈소판을 분리하는데 사용되어 왔다. 세파덱스 G-100도 혈소판의 분리에 잘 적용되는 것으로 알려졌다. 이 기술을 염색 기술에 적용시켜 다음 방법으로 작업한다. 혈소판-염료 현탁액을 컬럼속에 넣는다. 작은 분자량의 염료 분자들은 입자들 속에 걸리게 되는 반면 큰 혈소판들은 직접 컬럼을 거쳐 통과된다. 이 방법에서, 세파덱스 G-100이 현탁액내의 유리 염료에서 형광에서 표시된 혈소판을 분리하는데 사용될 수 있다.

A. 컬럼의 준비

세파덱스 G-100 (뉴저지주, 피스카타웨이 파마시아 레보라토리스)을 수화시키고, 혈소판용 분리 매질로써 사용하기 위하여 아세톤(100%)으로 세척한다. 실온에서 10분간 300×g으로 세파덱스를 원심분리시키고, 상등액을 제거하고, 한크스(Hanks) 균형염 용액에 재현탁시키는 것으로 세척 공정을 실시한다. 세파덱스는 아세톤 냄새가 더 이상 탐지되지 않을 때까지 한크스균형 염용액으로 반복하여 세척해야 한다. 그 결과 얻어진 용액을 끓는 수욕조에 넣거나 진공으로 탈기체화한다.

그 후 세파덱스 슬러리를 컬럼에 붓기 위하여 사용한다. 피스톤이 없는 10 cc의 시린지를 컬럼 지지물로 사용한다. 실리콘관을 시린지의 바퀴통에 부착시키고 미세한 조절이 가능한 시험관 집께를 사용하여 컬럼을 통하여 흐르는 유체를 조절하도록 한다. 47 미크론의 나일론체를 시린지 바닥의 지지체로 사용하여 세파덱스 구슬을 지탱하도록 한다. 유리 도자기로된 유리필터 지지체가 달린 통상의 유리칼럼은 피해야 하는데 이는 이것들이 혈소판을 활성화시키는 역할을 할 수도 있기 때문이다. 그 컬럼을 한크스 용액으로 채우고 소량의 세파덱스 슬러리를 그 컬럼에 첨가한다. 집께를 충분히 열어서 서서히 일관된 유속으로 흐르게 한다. 이러한 공정은 세파덱스를 고르고 균일하게 컬럼에 충진하게하여 채널이나 공극이 형성되는 것을 방지한다. HBSS와 세파덱스 슬러리를 첨가하는 공정은 필요한 크기의 충전된 컬럼이 얻어질때까지 반복된다. 이 컬럼은 사용전에 HBSS (그 공간 용적)으로 완전하게 넘치도록 해야한다.

B. 혈소판의 분리

혈소판 염료와 현탁액으로 조심스럽게 세파덱스위에 층을 형성한다. 칼럼 바닥에 있는 집께는 열어야 하며, 칼럼내의 유체 수준은 세파덱스 유체의 정상에 도달할때까지 떨어지도록 해야한다. 현탁액이 세파덱스를 침투하도록 하기 위해서 유출을 계속한다. 그 수준이 세파덱스의 정상에 있을 때 다시 유출을 줄인다. 세파덱스를 손상하지 않고 쉽게 추가 HBSS를 첨가할 수 있도록 완충액을 만들기 위하여 컬럼의 정상에 주의 깊게 충분한 HBSS를 첨가한다. 다시 컬럼의 유출을 계속한다. 이 방법을 이용하여 혈소판 현탁액이 겔 내에서 단단한 띠를 형성하여 컬럼 전체 길이에 걸쳐 균일한 속도로 이동하도록 한다. 이 방법에서, 보다 농축된 혈소판 용출액을 얻는다. 컬럼을 통하여 유출을 계속하여 0.5 내지 10 ml의 분획을 모은다. 분획이 들어있는 혈소판은 불투명하여 눈으로 볼 수 있으며 함께 모일 수도 있다. 이후 모여진 분획을 10분간 300×g로 원심분리하였다. 상등액은 흡출시켜 제거하고 실험이나 분석을 하기 위해 적절한 매질에 그 펠릿을 재현탁시키거나, 기능성 결정이나 재주입을 위해 혈소판 결핍 혈장 상등액을 사용한다.

[실시예 4]

수혈후 출혈을 면역반응과 구별

수혈할 각 혈액 유니트에서 얻은 소수의 적혈구를 주입전에 표시 분자의 형광 형으로 표시한다. 수술 및 혈액 수혈 직후, 소량의 정맥혈 표본을 옮겨서 표준 유출 혈구 계산계나 분광형광계로 표시 세포의 비율(형광 비율)을 결정했다. 초기 정맥 타진후 주기적인 간격으로 추가 혈액 표본을 옮겨 유사하게 분석한다. 내부 출혈이 발생하면 적혈구 용적이 감소하더라도 염색된 세포대 염색되지 않은 세포의 비율은 변하지 않는다. 환자가 수혈 후 반응을 경험하면, 그 때 염색된 세포들(수혈된 세포들인)이 우선적으로 파괴되고 염색된 세포와 염색되지 않은 세포의 비율은 감소한다. 이와 같은 측정으로 출혈 및 수혈 후 면역 반응간의 식별을 가능하게 한다.

[실시예 5]

자연발병의 혈소판 감소증 진단

혈소판 수명과 혈소판 생성율을 결정하는 것 외에는 실시예 4와 동일한 방법이다. 그러므로 환자들 자신의 혈소판을 주입전에 표시한다(실시예 3참조). 혈소판 주입 직후 소량의 정맥혈 표본을 채취하여 표준 유출 혈구계산 공정이나 분광 형광계 공정으로 ml당 표시된 (형광 퍼센트) 혈소판의 수를 결정한다. 초기 정맥 타진후 주기적인 간격으로 추가로 혈액 표본을 채취하여 양성 형광 비율에 관하여 분석하였다. 시간의 함수로서, 염색된 혈소판과 염색되지 않은 혈소판의 백분율을 도형으로 표시한 것은 표시된 혈소판의 파괴율과 염색되지 않은 혈소판의 생성율의 정도를 임상의학자들에게 제공해준다. 혈소판의 생성 및 파괴율이 혈소판 감소증 과정의 동적인 척도이다. 이 방법으로, 임상의학자들은 증후군과 같은 자연 발병적인 혈소판 감소증이 혈소판 생성과 연관되어 있는지 또는 혈소판 수명과 연관되어 있는지를 결정한다.

수혈된 혈소판 역시 이들 염료들로 표시한다. 더구나, 공여체의 혈소판의 수명 측정은 자체의 혈소판에 관하여 설명된 것과 같은 형태로 한다.

[실시예 6]

아테롬성 동맥경화증의 진단

이 방법을 사용하는 아테롬성 동맥 경화증의 진단은 아테롬성 동맥 경화증 환자의 혈소판 수명이 정상적인 혈소판의 수명보다 짧다는 가설에 근거를 둔 것이다. 소수 환자들의 혈소판을 (실시예 3의 병력기록서에 따라) 형광물질, NMR, 또는 방사-표시 형태의 표시 염료로 표시한다.

형광성분자로 표시한 (방법에 관하여는 실시예 3 참조) 혈소판을 재주사하고 혈소판의 수명을 일련의 정맥 천자로 결정하여 시간의 함수로서 나머지 수의 표시 혈소판들을 결정한다 (실시예 5 참조). 감소된 수명을 가리키는 혈소판 수명 측정이 아테롬성 동맥경화증의 진단이다.

또 다른 진단 방법은 방사-이성형의 분자(감마 방사체)와 시험관내에서 표시된 환자들의 혈소판들을 사용하는 것이다 (실시예 3의 방법을 사용하여). 표시된 혈소판을 재주입시켜서 혈소판의 수명을 표준 이성체 계산방법을 사용하여 측정하거나 표시된 혈소판이 혈관벽에 붙어있는가를 결정하기 위하여 표준 감마 카메라를 사용하여 환자의 위상을 그린다.

[실시예 7]

초기 종양이나 전이의 탐지

감마 방사체나 NMR 민감한 형의 분자를 혼합하여 두가지 상이한 세포성 방법을 이용한다.

두 방법에서 종양세포-찾는 세포를 사용한다. 한가지 방법은 활성적이거나 비활성적인 임파구를 사용하고 다른 하나의 방법은 단핵세포(단구), 호중구 또는 혈소판 추적을 사용한다.

임파구나 자연-치사(NK) 세포들을 공지된 공정으로 인터로이킨-2나 이와 균등한 분자를 사용하여 시험관내에서 활성화시킨다. 그 다음 이들 세포를 실시예 1의 방법을 이용하여 방사능이나 NMR 형의 분자로 표시하고 환자에게 재주사한다. 그 다음 환자를 적절한 영상 장치 아래에 놓고 알려지지 않은 종양을 찾기 위하여 귀환하는 임파구를 감시했다.

한가지 유사한 방법은 임파구 대신에 시험할 환자로부터 나온 단구를 사용한다. 이 방법에서는 단구를 사람이나 생쥐의 단일 클론 항체로 표시하는데 이 항체는 종양 세포 유형에 대해 특이성을 나타내어 종양 세포를 인식한다. [참조문헌: 포리스, 지.등, Cell Immuno. 78:276-284 (1983)]. 이들 세포를 방사-이성형이나 NMR-영상형의 표시 분자로 표시하여 환자에게 재주사한다. 시간 연속 영상은 표적이 된 단구의 귀환 위치를 나타낸다.

초기 종양이나 전이를 찾아내는 또다른 방법으로는 단구, 호중구 또는 혈소판을 실시예 3에서 설명한 바와 같이 표시하고 종양이나 전이를 찾는데 사용한다. 이들 세포는 초기에 종양 부위에 나타나므로 표시세포의 영상은 종양의 위치 측정을 가능케 한다.

[실시예 8]

감염부위의 탐지

이 적용에서는 호중구를 추적한다. 시험할 환자로부터의 호중구를 채취하여 방사-이성형이나 NMR-영상형의 표구분자로 표시한다. (실시예 1과 2의 방법을 표시하기 위해서 사용한다). 그 후 이들 세포들을 재주입하고 감마 카메라나 핵자기 영상 기술을 사용하는 귀환 호중구의 영상으로 감염 부위를 확인한다. 호중구 모임에서의 동적인 변화를 확인하고, 치료적 간섭에서 생기는 변화를 감시하기 위해서 연속적 영상을 사용한다.

[실시예 9]

흑점변질을 감시하여 당뇨병성 망막증의 감시

소수의 적혈구 (O형, 또는 자체의 세포)를 인간의 가시범위(700nm 이상) 밖의 빛의 파장으로 자극시킨 표시 분자의 형태로 표시하였다 (방법은 실시예 2 참조). 그 후 세포를 환자의 정맥내로 주사하였다. 표준 형광 망막카메라를 사용하여 일련의 망막 혈관 사진을 찍었다. 형광 흔적을 옮기는 세포를 적절한 파장으로 자극시켜서 방사된 형광을 사진 필름에 잡았다. 염료가 적혈구에 모이게 되고 적혈구는 혈관계의 외곽으로 움직이지 않게 되므로 형광 영상은 망막 혈관에 관한 것 뿐이다.

또 다른 특징으로는, 그 혈관내의 두 개의 다른 지점에서 혈관내에 있는 동일한 세포를 자극시키는 표준 이중 레이저 광 자극 장치를 사용하여 혈액 유속을 측정한다. 그러나 자극 지점간의 거리는 고정되어 있다. 각 자극 지점에서 형광을 측정하고 두 자극 지점사이에 필요한 시간의 길이는 맥관내의 세포의 유속의 측도가 된다.

혈관 통합성과 혈액 유속이 흑점 변질을 측정하는데 사용된다. 그런 감시기는 시력 손상의 정도와 당뇨병 환자의 치료결과를 평가하는데 이용된다.

[실시예 10]

발작전후 환자에게서의 발작의 임박성 탐지

조사할 환자로부터의 혈소판을 인간의 가시범위 (700 nm 이상)밖의 광선 파장으로 자극시킨 표시 분자의 형태로 표시한다 (방법은 실시예 3 참조). 그 다음 표시된 세포를 환자의 정맥내로 주사한다. 표준 초점을 맞춘 광원 (자극 파장으로)을 망막 베드내의 단일 혈관쪽으로 향하게 한다. 적절한 표준 초점렌즈와 광전 배증관을 사용하여 형광을 측정했다. 그 광전 배증관의 출구를 손으로 조작하여 컴퓨터에 기록한다. 형광 강도는 정면에서 찾아낸 단일, 이중, 삼중등의 혈소판 수치의 크기이다. 증간된 혈소판의 집합은 제 2의 발작의 위험이 높다는 것을 가리킨다.

[실시예 11]

영상 동맥 협착

시험관내에서 (실시예 3의 방법을 사용하여) 환자 자신의 혈소판을 표시하거나 적혈구 (실시예 2의 방법을 이용하여)를 표시하는데 방사-이성형의 분자 (감마 방사체)를 사용한다. 표시된 세포를 주입하고 혈관의 구경이 협착되었는지를 결정하기 위하여 표준 감마 카메라를 사용하여 환자의 영상을 찍는다. 적혈구 표시는 제자리에 있는 세포나 어떤 공여체에서 나온 O형 세로포 할 수 있다.

[실시예 12]

관절염의 진단 및 기결정

시험할 환자로부터의 임파구, 단구 또는 호중구를 표시하기 위하여 (실시예 1 이나 2의 방법으로) 방사-이성형이나 핵자기공명 영상형의 분자를 사용한다. 그 다음 이들 표시된 세포들을 환자에게 재주입하고 표준 영상장치를 사용하여 모이는 것을 관찰했다. 관절염에서, 단구 추적이 더욱 유용한 것으로 기대되며 퇴화성 관절질병에서는 임파구 추적이 더욱 유용한 것으로 기대된다. 이것으로 뜨거운 관절의 수를 결정할 수 있고 환자의 상태에 따른 치료효과를 평가할 수 있다.

[실시예 13]

이식 거부의 신속한 결정

임파구, 호중구 또는 혈소판은 각각 이식 조직이나 기관 거부에서 중요한 부분을 차지한다. 환자의 세포를 채취하여 방사-이성형이나 핵자기 공명 영상형의 분자로 (실시예 1-3의 방법을 사용하여) 표시를 한다. 표시된 세포를 재주사하고 환자에 관한 연속적인 영상을 만들었다. 거부가 임박한 시간에나 또는 그 전에, 이 방법으로 탐지된 이식 조직내에서 주사된 세포형태의 위치측정이 증가된다.

[실시예 14]

다발성 경화증의 진단

이 방법은 척수의 영역에 있는 세포나 수소가 높은 다른 영역내의 세포의 위치를 측정하는 것외에 실시예 13과 같은 방법이다.

[실시예 15]

적혈구 수명, 적혈구 및 혈액 용적의 측정

적혈구의 수명은 출혈과 수혈후 반응을 구별하는 상기에서 기술된 동일한 방법으로 측정한다 (실시예 4). 환자 자신의 적혈구를 표시시킨 후 재주입하는 것이 유일한 차이점이다. 적혈구의 수명을 결정하기 위하여, 주사후 1ml 당 표시된 적혈구의 수를 분광 형광방법이나 유출혈구 계산 방법을 사용하여 시간의 함수로서 결정한다.

적혈구 질량과 혈액 용적은 알려진 수의 자체의 또는 O형의 적혈구를 형광형 염료로 염색하여 결정한다. 알려진 수의 염색된 적혈구 (10⁹)를 혈액 표본을 제거하고 0 및 5분 후에 각각 환자에게 주사한다. 표시된 세포의 비율을 유출 혈구 계산계나 분광 형광계로 결정한다. 이 희석 인자와 mm³당 총 세포수로부터 적혈구 질량과 혈액 용적을 결정한다.

본 발명의 바람직한 구현예는 상기 예로서 구체적으로 설명하였지만 본 발명은 여기에 소개된 것에 국한되지 않으며 하기의 청구범위내에 속하는 모든 변형에 대한 권리는 유보된다.

Claims

생체내에서 핵보유 진핵세포 또는 비핵보유세포를 추적하는데 사용하기 위한 용도로서의 하기 일반식의 시아닌 염료-표시된 세포:

상기식에서, Y는 산소, 황, 메틸렌 또는 알킬-치환된 메틸렌이고, m은 0내지 3이며, n은 12 내지 22 이다.
제1항에 있어서, 임파구, 자연-치사세포, 단구, 호중구 또는 혈소판이 시아닌 염료에 의해 표시되어 일차 또는 전이 종양세포를 추적할 수 있는 시아닌 염료-표시된 세포.
제2항에 있어서, 자연-치사 세포가 시아닌 염료에 의해 표시된 시아닌 염료-표시된 세포.
제3항에 있어서, 자연-치사 세포가 사전에 활성화되는 시아닌 염료-표시된 세포.
제2항에 있어서, 단구가 시아닌 염료에 의해 표시된 시아닌 염료-표시된 세포.
제2항에 있어서, 종양 특이적 단일 클론 항체가 결합된 단핵세포가 시아닌 염료에 의해 표시된 시아닌 염료-표시된 세포.
제2항에 있어서, 혈소판이 시아닌 염료에 의해 표시된 시아닌 염료-표시된 세포.
제2항에 있어서, 호중구가 시아닌 염료에 의해 표시된 시아닌 염료-표시된 세포.
제1항에 있어서, 시아닌 염료가¹²⁵I로 연결된 시아닌 염료-표시된 세포.
제1항에 있어서, 시아닌 염료가 핵자기 공명 소식자(Probe)로 연결된 시아닌 염로-표시된 세포.
제1항에 있어서, 적혈구 세포가 시아닌 염료에 의해 표시된 시아닌 염료-표시된 세포.
제11항에 있어서, 시아닌 염료-표시된 적혈구 세포의 존재를 검사하여 망막증 또는 혈관 변성을 추적하는 시아닌 염료-표시된 세포.
제11항에 있어서, 시아닌 염료-표시된 적혈구 세포가 혈관을 유동하는 속도를 측정하여 추적하는 시아닌 염료-표시된 세포.
제11항에 있어서, 시아닌 염료의 여기 파장이 인간의 가시스펙트럼밖에 있는 시아닌 염료-표시된 세포.
제1항에 있어서, 혈소판이 시아닌 염료에 의해 표시된 시아닌 염료-표시된 세포.
제15항에 있어서, 시아닌 염료-표시된 혈소판의 응집체를 망막의 혈관에서 추적하는 시아닌 염료-표시된 세포.
생체내에서 핵보유 진핵세포 또는 비핵보유 세포의 수명을 측정하는데 사용하기 위한 용도로서의 하기 일반식의 시아닌 염료-표시된 세포:

상기식에서, Y는 산소, 황, 메틸렌 또는 알킬-치환된 메틸렌이고, m은 0 내지 3이며, n은 12 내지 22 이다.
제17항에 있어서, 적혈구 세포가 시아닌 염료에 의해 표시된 시아닌 염료-표시된 세포.
제18항에 있어서, 시아닌 염료-표시된 적혈구 세포의 소멸속도를 헤마토크리트 값 변화와 비교하여 출혈과 적혈구 세포의 면역반응을 구별하는 시아닌 염료-표시된 세포.
제18항에 있어서, 고정된 수의 완전하게 표시된 세포를 주사하고 평형을 유지시킨 후 희석인수를 측정하여 전체 혈액 용적을 측정하는 시아닌 염료-표시된 세포.
제18항에 있어서, 대상체의 적혈구 세포를 표시하여 제조된 것이 시아닌 염료-표시된 세포.
제18항에 있어서, 임의 수혈자의 O형 적혈구 세포를 표시하여 제조된 것인 시아닌 염료-표시된 세포.
제17항에 있어서, 혈소판이 시아닌 염료에 의해 표시된 시아닌 염료-표시된 세포.
제23항에 있어서, 시아닌 염료-표시된 혈소판의 소멸 속도를 총혈소판 수와 비교하여 출혈 또는 감소된 혈소판 생성과 혈소판의 면역반응을 구별하는 시아닌 염료-표시된 세포.
제23항에 있어서, 시아닌 염료-표시된 혈소판의 수명을 아테롬성 동맥경화증의 척도로서 측정하는 시아닌 염료-표시된 세포.
제9항에 있어서, 시아닌 염료-표시된 호중구를 사용하여 감염의 위치를 추적하는 시아닌 염료-표시된 세포.
제9항에 있어서, 화상 방법으로 사용하여 동맥협착을 측정하는 시아닌 염료-표시된 세포.
제9항에 있어서, 관절염 증세의 척도에 사용하는 시아닌 염료-표시된 세포.
제9항에 있어서, 이식 또는 기관 거부를 모니터하는데 사용하는 시아닌 염료-표시된 세포.