JP2012528298A - マラリア原虫(Plasmodium)属の寄生原虫に感染した赤血球の硬直性を上昇させる能力について化合物をスクリーニングする方法、赤血球を濾過する方法、およびこれらの適用 - Google Patents
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Abstract
Description
a)前記寄生虫に感染したRBCを培養し、場合によって、別々に未感染RBCを培養するステップであって、iRBCの硬直性を上昇させるその能力について調べる化合物の存在下および不在下の両方において各培養を実施するステップと、
b)前記化合物の存在下において培養された1つまたは複数のiRBC、および前記化合物の不在下において培養された1つまたは複数のiRBCの変形能を測定するステップと、
c)場合によって、前記化合物の存在下において培養された1つまたは複数の未感染RBC、および前記化合物の不在下において培養された1つまたは複数の未感染RBCの変形能を測定するステップと
を含むかまたはこれらからなり、
化合物の存在下において培養されたiRBCの変形能が、同化合物の不在下において培養されたiRBCの変形能と比較して、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%低下(特に、硬直性が、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%上昇)することにより、前記化合物がiRBCの硬直性を上昇させることが可能であることが示される方法に関する。
a)前記寄生虫に感染したRBCを培養し、別々に未感染RBCを培養するステップであって、iRBCの硬直性を上昇させる、特に選択的に上昇させるその能力について調べる化合物の存在下および不在下の両方において各培養を実施するステップと、
b)前記化合物の存在下において培養された1つまたは複数のiRBC、
前記化合物の不在下において培養された1つまたは複数のiRBC、
前記化合物の存在下において培養された1つまたは複数の未感染RBC、および
前記化合物の不在下において培養された1つまたは複数の未感染RBC
の変形能を測定するステップと
を含むかまたはこれらからなり、
化合物の存在下において培養されたiRBCの変形能が、同化合物の不在下において培養されたiRBCの変形能と比較して、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%低下することにより、前記化合物がiRBCの硬直性を上昇させることが可能であることが示される。
1)例えば、plasmion (登録商標)処理により、または当技術分野で知られる他の任意の技法により、iRBCの培養物中における分裂体期iRBCを濃縮するステップと、
2)RBC、特に、新鮮なRBC (すなわち、8日齢以下のRBC、好ましくは、8日齢未満のRBC)に、ステップ1)の分裂体を濃縮したiRBC培養物を感染させるステップ(この第2のステップにより、輪状体期にあるiRBCを得ることが可能となる)と、
3)ステップ2)で得られたiRBCを培養し、場合によって、別々に未感染RBCを培養するステップであって、iRBCの硬直性を上昇させるその能力について調べる化合物の存在下および不在下の両方において各培養を実施するステップと、
4)前記化合物の存在下において培養された1つまたは複数のiRBC、および前記化合物の不在下において培養された1つまたは複数のiRBCの変形能を測定するステップと、
5)場合によって、前記化合物の存在下において培養された1つまたは複数の未感染RBC、および前記化合物の不在下において培養された1つまたは複数の未感染RBCの変形能を測定するステップと
を含むかまたはこれらからなり、
化合物の存在下において培養されたiRBCの変形能が、同化合物の不在下において培養されたiRBCの変形能と比較して、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%低下することにより、前記化合物がiRBCの硬直性を上昇させることが可能であることが示される。
a) RBCを含む試料に、濾過ユニット内を流過させるステップと、
b)濾過ユニット内を流過する前における前記試料のアリコート(上流アリコート)、また、濾過ユニット内を流過した後における前記試料のアリコート(下流アリコート)を回収するステップと、
c)場合によって、濾過ユニット内へと貯留されたRBC (貯留アリコート)を回収するステップと、
d)場合によって、上流アリコートおよび下流アリコート、また場合によって、貯留アリコートを解析し、特に、上流アリコート中および下流アリコート中、また場合によって、貯留アリコート中におけるRBCまたはRBC部分集団の濃度または密度を決定するステップと
を含むかまたはこれらからなる方法にも関する。
(下流アリコート中におけるRBCまたはRBC部分集団の密度-上流アリコート中におけるRBCまたはRBC部分集団の密度)/上流アリコート中におけるRBCまたはRBC部分集団の密度
を用いて、濾過ユニット内におけるRBCまたはRBC部分集団の貯留率(すなわち、貯留されるRBCまたはRBC部分集団の百分率)を計算するステップをさらに含む。
・上流アリコート中および下流アリコート中、また場合によって、貯留アリコート中における寄生虫血状態の百分率を決定するステップと、
・場合によって、(i)以下の式: (下流アリコート中における寄生虫血状態の百分率-上流アリコート中における寄生虫血状態の百分率)/上流アリコート中における寄生虫血状態の百分率を用いる、濾過ユニット内におけるRBC貯留率、または(ii)貯留率(下流アリコート中における寄生虫血状態の百分率/上流アリコート中における寄生虫血状態の百分率)を決定するステップと
を含むかまたはこれらからなる。
本発明の赤血球を濾過する方法を、RBCを含む2つの試料アリコートに適用するステップであって、1つのアリコートだけが、RBCの硬直性を調節し、好ましくはこれを上昇させるその能力について調べる化合物にあらかじめ曝露されている(曝露されていないアリコートは、内部対照を構成する)ステップと、
両方の試料アリコートについて決定されたRBC貯留率またはRBC貯留比を比較し、絶対値における両方のRBC貯留率または両方のRBC貯留比の間の少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%の変化により、前記化合物がRBCの硬直性/変形能を調節しうることが示され、また、化合物に曝露されていない試料アリコートについて得られたRBC貯留率またはRBC貯留比と比較して、化合物に曝露された試料アリコートについて得られたRBC貯留率(絶対値における)またはRBC貯留比が、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%上昇することにより、前記化合物がRBCの硬直性を上昇させうる/RBCの変形能を低下させうることが示されるステップと
を含むかまたはこれからなる。
(実施例A)
ヒト脾臓の緩徐な開放マイクロ循環における、熱帯熱マラリア原虫の輪状体に感染した赤血球の貯留
患者、材料、および方法
ヒトボランティア被験者におけるコントラスト増強超音波検査:以下の組入れ基準:アテロームの危険因子がなく(すなわち、動脈圧が正常であり、現在または過去において喫煙の習慣がなく、血清コレステロールレベルが正常であること)、腹部手術の既往歴がなく、現在または過去において著明な健康問題がなく(健康診断で正常であり、血清クレアチニンレベル、血清ASTレベル、および血清ビリルビンレベルが正常であり、HIV、HBV、およびHCVに対する抗体が不在であり)、従来の超音波検査およびドップラー検査により評価された脾臓の大血管構造が正常であり、また、血球カウント、血清ハプトグロビン、およびヘモグロビン電気泳動が正常であることを含め、赤血球疾患の臨床的または生物学的徴候が見られないことに従い、18〜50歳の健康な男性ボランティア被験者16例を登録した。試験は、ネッカー病院の治験審査委員会により承認され、すべての被験者から書面によるインフォームドコンセントを得た。一定の注入速度1ml/分で超音波検査用造影剤(イタリア、ミラノ、Bracco社製、Sonovue (登録商標))を静脈内注射した。Phillips HDI 5000 (米国、ワシントン州、ボセル、Philips US社製)を用いて、コントラスト増強超音波検査を実施した。注入開始の2分後から、微小気泡による破壊を最小化するため、低メカニカルインデックスのパルスインバージョン造影を用いるリニアトランスデューサー(L10-5型)により、脾臓を画像化した17。各回の画像収集は3回ずつ繰り返し、生データをPCへと伝送し、さらなる定量化を行った。圧縮マップを考慮に入れ、線形ユニットにおける定量化を可能とするソフトウェアであるHDI Lab (米国、ワシントン州、ボセル、Philips US社製)を用いて、各シネループを定量化した。被膜下領域内に位置する対象領域(ROI)からのシグナル強度を計算した。ROIの位置は、呼吸運動および皮下におけるアーチファクトを補正するように移動させた。時間-強度曲線を、Deltagraph (米国、ユタ州、ソルトレークシティ、Red Rock software社製)にエクスポートした。2成分指数関数モデルを用いて、データを近似した。データとモデルとの相関係数を用いて、近似の質を評価した。
ヒト脾臓における循環コンパートメント
16例のボランティア被験者におけるコントラスト増強超音波検査を用いて、ヒト脾臓の循環パターンを探索した。造影剤注入から2分後に(すなわち、微小気泡の安定的な濃度が達成されたら)、低メカニカルインデックスのパルスインバージョン造影を用いて脾臓を調べた。この低音響エネルギーを用いるにも関わらず、超音波ビームに対する脾臓の連続的な曝露の間中、ある量の微小気泡が破壊された。時間-強度曲線は、シグナル強度の低下を反映した(図1;材料および方法の節)。16例のボランティア被験者における指数関数的減衰に対する最良の近似を示したモデルでは、2つの指数関数成分が組み合わされた(全例において相関係数R2>0.96)。2成分指数関数は、N(t)=V1(C0exp(-β1t))+V2(B+(C0-B)exp(-β2t)) [式中、第1項および第2項は、それぞれ、緩徐流過コンパートメント、および急速流過コンパートメントに対応する。C0は、初期(t=0)の微小気泡濃度を指し、両方のコンパートメントにおいて同一であると考えられた。V1およびV2は、相対容量分率(V1+V2=1)を指し、β1およびβ2は、それぞれ、各コンパートメント内における微小気泡の平均速度を指す]として表わすことができる。実験曲線の解析により、以下の値がもたらされる:各1コンパートメントの指数関数曲線のY切片(Y10およびY20)がC0V1およびC0V2に対応するのに対し、1/β1および1/β2は、指数関数の特性時間に対応する。緩徐コンパートメントでは、緩徐コンパートメントの平均(SD、範囲)相対容量分率は70.6% (9.6、51.5〜84.4)であり、平均(SD、範囲)相対流量分率は10.12% (4.40、3.99〜16.47)であった(図1)。まとめると、これらの観察は、血液流入量の約10%が、緩徐コンパートメント内を流過する(図1および6)、ヒト脾臓による二重のマイクロ循環機構の存在を強く裏付ける(図1)。
分裂体期(侵入後40±8時間)または輪状体期(侵入後7±7時間)にある高度に同期性の寄生虫培養物により、分離灌流されたヒト脾臓を灌流した。灌流物に対して逐次ギムザ染色した薄膜により、循環する分裂体iRBCおよび(予測外ではあるが)輪状体iRBCによる寄生虫血状態は、急速に低下することが示された。分裂体iRBCおよび輪状体iRBCによる寄生虫血状態が、それぞれ、それらの初期値の4.5% (範囲: 0〜12.9)および26.3% (範囲: 22.9〜35.4%)へと低下したのは、10および20分間以内であった(図2a)。分裂体iRBCの完全なクリアランスが急速であったのに対し、輪状体iRBCの寄生虫血状態はより緩徐な速度で低下し、プラトーに達した(図2a)。分裂体iRBCと対照的に、輪状体iRBCは、それらの表面上において突起も、ヨード化可能な寄生虫タンパク質も示さず(図8)、また、C32ヒト黒色腫細胞上においても(データは示さない)、脾臓の組織学的検査においても(図4)、細胞接着は認められなかった。
輪状体iRBCのクリアランスが部分的であるなら、それは脾内におけるそれらのより緩徐な循環、または脾内におけるそれらの安定的な貯留を反映しうるであろう。この問題を明らかにするため、輪状体iRBC調製物を分割し、1つの部分には脾内を即座に灌流させ、第2の部分はクレブス-アルブミン培地(対照の「脾臓未通過」細胞)中37℃で保持した。灌流開始の40分後(すなわち、40回の脾臓通過後)、未貯留細胞を灌流物から回収した。これらの「脾臓通過」集団、および「脾臓未通過」集団を、各々異なるPKHにより標識し、プールし、脾内に再導入した。次に、フローサイトメトリーを用いて、灌流システムに由来する逐次的な試料を解析した(図3)。「脾臓未通過」輪状体iRBCの平均(SD)半減期(5.7±3.1分間; 2つの個別実験)は、過去の6回の実験(次節「iRBCクリアランスのモデル化」の結果を参照されたい)において観察された半減期と同様であった。これに対して、「脾臓通過」輪状体iRBCは排除されなかった(図3b、c)。これは、輪状体iRBCが、実のところ、1つは脾内に貯留され、1つは流過する、2つの異なる部分集団からなることを示す。脾内貯留に関する輪状体iRBCのこの異種性は、本発明者らの培養条件における時間経過では安定的であり、灌流された脾内に導入された初期の寄生虫血状態からはかなりの程度独立していた(図2a)。D10寄生虫株についても同様の結果が得られたので、それはまた、寄生虫株からも独立であった。
残留寄生虫血状態(プラトー相)を伴わないかまたは伴う、1コンパートメントモデルまたは2コンパートメントモデルを用いて、灌流物中におけるiRBCによる寄生虫血状態の動態をモデル化した(図3a1〜3)。残留寄生虫血状態を伴わない1コンパートメントモデルは、分裂体iRBCの動態を説明するのに最良のパフォーマンスを示した。灌流物中における輪状体iRBCの動態は、「流過する」部分集団(流入量の約26%)の自由循環を伴う、「貯留可能な」部分集団(流入量の約74%)の1次クリアランス相により最もよく説明された(図3およびTable I (表1))。
実験の終了時には、脾臓組織を処理して組織学的解析を行い、RPおよび濾胞周囲帯(PFZ)における輪状体iRBCおよび分裂体iRBCの分布を定量化した(図4)。輪状体iRBCによる組織寄生虫血状態は、ギムザ染色された切片(2.8%対1.1%、p=0.00009、図4a1〜2)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色された切片(3.0%対1.1%、p=0.007、図4b 1〜2)の両方において、PFZ内よりRP内において有意に高度であった。比率(「組織における寄生虫血状態」)/(実験終了時点の循環における寄生虫血状態)として定義される、輪状体iRBCによる平均(Cl95%)貯留指数は、PFZ内(1.4; 0.8〜2.0、p=0.002,図4a3)よりRP内(3.7; 1.9〜5.4)の方が有意に高値であった。脾臓(両方の領域を含めた)内における輪状体iRBC全体の平均貯留指数は2.5であった。興味深いことに、PFZ内における輪状体iRBCの貯留指数は1に近かったが、これは、アーテスネートに曝露されたiRBCについて既に観察された通り7、PFZが、輪状体iRBCにとって、貯留/処理領域であるより流過領域であることを示唆する。分裂体iRBCの平均貯留指数は、いずれの領域においても高値(>8)であり、RP内におけるより強力な貯留への傾向を伴った。静脈洞に固有の螺旋形の基底膜を強力に染色したPAS23を用いることにより、RPの部分コンパートメント内、とりわけ、脾索、脾洞内腔、および脾洞壁の脾臓実質側における輪状体iRBCの分布についての解析が可能となった(図4c1)。大半(86.0±6.9%)の輪状体iRBCが脾索において観察されたのに対し、14.0±6.9%は、脾洞内腔において観察された。RPの他の部分コンパートメント内より著明に多くの輪状体iRBCが、静脈洞のPAS染色された基底膜(すなわち、狭小な内皮細胞間隙のすぐ上流)と直接接触した(図4c2)。透過電子顕微鏡法により、脾洞基底膜および内皮細胞間隙に対する、無突起輪状体iRBCの極めて緊密な近接性が確認された(図2b3および図4d1〜2)。
LORCAを用いて、輪状体iRBC集団または分裂体iRBC集団の伸び指数(EI)を測定した。単一iRBCレベルにおける変形能を推定するため、本発明者らは、異なる寄生虫血状態にある、同期化した集団のEIを測定し(分裂体の場合が3%〜80%、輪状体の場合が4%〜76%、図5A)、100%の寄生虫血状態に外挿した。予測される通り、分裂体iRBCは、すべてのせん断応力にわたり、伸び指数が極めて低値であった(30パスカル、80%の寄生虫血状態において<0.1)。30パスカルのとき(脾類洞内において遭遇するせん断応力と同様である24)、輪状体iRBCの変形能は、中程度ではあったが、共培養および共灌流された未感染RBCより著明に低度であった(図4A)。100%のiRBC集団へと外挿したところ、輪状体iRBCの平均(Cl95%) EIは、対照未感染RBCの0.58に対して0.47 (0.43〜0.51)であった(p<0.0001;図4A3)。
本明細書で用いられる安全な手法は、ヒト脾臓の生理学およびマラリアの病態生理学に対する新規で相互に関連し合う洞察をもたらし、これにより、輪状体期にある集団は異種であり、変形能がより低度の部分集団は脾内で貯留されるという新たなフレームワークが提起される。コントラスト増強超音波検査は、血液流入量の10%が緩徐コンパートメントを流過する、2コンパートメントのマイクロ循環機構を示した。輪状体iRBCの実質的部分は、単離灌流されたヒト脾臓により急速に排除された。貯留可能な輪状体iRBC集団の5.9分間のクリアランス半減期は、各回の脾臓通過時における流入量の約10%の除去と符合し、緩徐な循環コンパートメント内におけるそれらの貯留と符合する。輪状体iRBCが、脾洞壁の脾臓実質側と共に、RP内だけにおいて蓄積されたことは、この解釈と符合する。輪状体iRBCの変形能は、中程度ではあったが、著明に低下した。これらの輪状体は、小型であり、突起を欠き、in vitroで細胞接着せず、任意の観察可能な、寄生虫により誘導される表面変化を示さず、PfEMP1を介する貯留機構は除外された。全体像は、狭小な内皮間隙(すなわち、RBCの変形能に対して厳密な負荷を与える緩徐コンパートメントのマイクロ循環構造11、25)の上流における、変形能が低下した輪状体RBCの貯留を示し、これはおそらく、宿主細胞の新たな生物物理的特性に基づく、微生物独自のクリアランス機構を反映する。
いて0.47)。
熱帯熱マラリア原虫の輪状体に感染した赤血球(輪状体iRBC)の硬直性を増大させる化合物をスクリーニングする方法の例
寄生虫の培養:熱帯熱マラリア原虫のパロアルト株(FUP株)44を用いる。既に説明されている通りに45、熱帯熱マラリア原虫の輪状体iRBCを培養する。略述すると、4時間以内にそれらの完全な再侵入が得られるように、5% (w/v)ソルビトールによる(37℃で5分間にわたる)連続処理(少なくとも2回の連続処理)を介して輪状体期寄生虫を選択することにより、寄生虫を同期化させる。次いで、輪状体に感染したRBCを、75cm2のフラスコ内において、1% O2、3% CO2、および96% N2の雰囲気により30秒間にわたり処理した、O+型RBCを含有する完全培地(RPMI 1640培地、重炭酸塩、25mMグルタミン、0.2%グルコース、100μMヒポキサンチン、10μg/mlゲンタマイシン、および10% AB+型不活化ヒト血清プール)中37℃でインキュベートする。
変形能の評価は、複数のステップにおいて実施される(図9を参照されたい):
1.平均EIの低下についてのスクリーニング閾値を10%とする、LORCAの使用。
2.LORCA法により輪状体iRBCの硬直性を上昇させることが可能であると同定された化合物に対する、輪状体iRBCの変形能を個々の細胞スケールで評価することを可能とする(LORCAの場合、解析は、集団的な細胞スケールで実施される)より精密な技法、例えば、マイクロピペット、光ピンセット、またはマイクロ流体デバイスによる解析。これらの技法により、EIの分散、また、したがって、スクリーニングされた化合物への曝露後に脾内貯留されうる輪状体iRBCの百分率をより正確に評価することが可能となる。
3.場合によって、単離灌流されたヒト脾臓モデルを用いて、少数の候補化合物を調べる。
脾臓の濾過機能の代替法としてのRBCおよび熱帯熱マラリア原虫に感染したRBC (Pf-iRBC)の濾過
材料および方法
寄生虫が寄生したRBC:臨床試料および培養物:説明される通りに61、熱帯熱マラリア原虫(D10株、3D7株、またはFUP/パロアルト株)をin vitroで培養した。RBCを洗浄し、4〜8℃で1〜10日間にわたり保存した。患者の血中に存在するPf-iRBCを、回収後24時間未満にわたり4〜8℃で保管した。
Pf-iRBCの導入前15分間にわたり、懸濁培地(RPMI+4%アルブミン+5% Plasmion (登録商標))によりカラム表面および膜をブロッキングした。4%アルブミンおよび5% Plasmion (登録商標)を補充したRPMI中2%〜2.5%のヘマトクリットで懸濁させた後、培養Pf-iRBCまたは「臨床」Pf-iRBCに、幅0.8〜8μmのチャネルを穿孔した、厚さ24μmのポリカーボネート膜(Sterlitech社製;図10および11を参照されたい)内を流過させた。濾過は、一定の圧力(80〜85cmの水圧)下において、34〜37℃で実施した。予備実験は、チャネル直径が≧3μmの場合は流過が妨げられないのに対し、その直径値が≦1μmである小孔内では流過が観察されないことを示した。幅2μmのチャネルにより後続の実験を行った。チャネル幅が≧3μmである場合は、Pf-iRBCの貯留が観察されなかった。幅2μmのチャネル膜からの流出量は、0.1〜1ml/分であった。
1% albumax II (登録商標) (Gibco社製)を補充したPBSまたはRPMI中2%〜2.5%のヘマトクリットで懸濁させた後、培養Pf-iRBCまたは「臨床」Pf-iRBCに、直径を増大させる(2〜12μm、5〜15μm、15〜25μm、および40μmを超える;図12および13を参照されたい)スズビーズ(フランス、アンヌマス、Industrie des poudres spheriques (IPS)社製)による厚さ0.5〜2mmの層内を流過させた。濾過は、一定の圧力(80〜85cmの水圧)下において、20〜25℃で実施した。Pf-iRBCの導入前15分間にわたり、懸濁培地(PBS+1% Albumax II (登録商標))によりカラム表面および膜をブロッキングした。予備実験は、5〜15μm、15〜25μm、および40μmを超える直径のビーズからなるスズビーズ層、またはビーズ層を維持するのに用いられるチップ内のフィルターだけでは、Pf-iRBCが貯留されないことを示した。さらなる実験は、層の厚さが>5mmである場合は、5〜15μmおよび15〜25μmの等重量による混合物(以後、「5〜25μm層」と称する)により、iRBCの貯留が誘導されることを示した。次いで、直径5〜25μmのビーズによる厚さ7mmの層を用いることにより、濾過プロトコールを改変した。
濾過前に少なくとも300μlの「上流」試料を取り置き、遠心分離し(1500gで5分間)、得られたRBCペレットを用いて定量化した;
ビーズ層内を流過したRBCを含有する8mlの「下流」試料を、1500gで5分間にわたり遠心分離し、このようにして得られた10〜14μlのRBCペレットを用いて定量化した。
濾過過程の終了時には、1.5mlのエッペンドルフ管内にビーズ層を回収した。1〜3分間ずつの3ステップからなる重力を介するデカンテーションにより、ビーズの含有が3%未満である1〜5μlのRBCペレットの回収が可能となった。
ギムザ染色:メタノールで固定した薄いスメアを、10%ギムザにより10分間にわたり染色し、RBC 2000個に対する、寄生虫が寄生したRBCの比率を計算した。結果は、発育期特異的な寄生虫血状態として表わされた。
異なる2つの濾過方法が用いられた(図10〜18を参照されたい):
チャネル穿孔膜による重力駆動型濾過、および
ビーズ層による濾過。
(i)栄養体/分裂体(成熟形態)を宿すRBCの完全な/ほぼ完全な貯留(Table II (表2)および図21を参照されたい);
(ii)輪状体を宿すRBCの部分的な貯留(Table II (表2)および図21を参照されたい);
(iii)成熟生殖母細胞を宿すRBCの貯留の不在または部分的な貯留(Table II (表2)を参照されたい);
(iv)患者の末梢血に由来する輪状体を宿すRBCの貯留と比較して、in vitroの培養物に由来する輪状体を宿すRBCの貯留が大量であること(患者の血中に存在する輪状体を宿すRBCは、(i)いまだ「IES負荷」にかけられていない(平均すると、RBCは、2〜3時間ごとに1回IESを超える54)か、または(ii)この付加にかけられたにもかかわらず、循環を維持するのに十分な程度に変形可能/フィルター流過可能であった) (Table II (表2)および図21を参照されたい);ならびに
(v)ビーズ層(その形状が、チャネル穿孔膜より良好に、赤脾髄の循環床を模倣する(図14および15を参照されたい)により、脾臓濾過、とりわけ、溶血の不在(Table II (表2)を参照されたい)およびRBC形態のより良好な保存をより良好に模倣する貯留特徴が示されたこと
を観察した。
a.濾過ユニットの小孔が、狭小(0.2〜2μm)で、短い(好ましくは<5μm)こと;
b.測定値が、試料中に含有される検査中の赤血球(例えば、異なる発育期にあるPf感染赤血球)の濃度のばらつきに基づくこと;
c.少量(1〜100マイクロリットルの濃厚赤血球)の試料を用いること;
d.濾過ユニット内の流過が、重力に駆動されるか、またはフラッシュ、もしくは吸引、もしくは遠心分離により実施されるか、または、好ましくは、低ヘマトクリット(<5%)の試料にフィルター内を流過させる任意の方法により実施されること;
e.スクリーニングが、3つの主要なステップ過程:
培養された輪状体を宿すRBCまたは成熟生殖母細胞を宿すRBCを、マイクロプレート内のライブラリーに由来する、既知であるかまたは新規の化学的実体に曝露する過程;
薬物に曝露されたRBC容量の一部を濾過ユニット内へと吸引し、下流試料を別のマイクロプレート内に入れる過程;
上流プレートおよび下流プレート内における寄生虫濃度の定量化を、自動化法により同時に実施する。結果は、下流濃度/上流濃度の比率として表わす。次いで、非曝露の内部対照と比較して、この比率の著明な低下を包含する化合物を、ヒット化合物と考える過程;
に従い実施されること;
f.濾過ユニットの性質は改変しうるが、その構造が、1μl〜1mlの貯留RBCの回収に適すること
を示すものとする。
成熟雄生殖母細胞および成熟雌生殖母細胞を宿すRBCが吸血中に存在した場合に限り、ハマダラカ属種は、マラリア原虫属種の宿主および媒介動物として活動しうる。伝染が低度である地域では、他の方法およびツールと併せて、治癒をもたらす抗マラリア療法(アルテミシニンベースの組合せ療法; ACT)が、血液感染性の低下を結果としてもたらすことが示されている。ACTは、生殖母細胞をもたらす寄生虫の数を低減し、循環しない未成熟の生殖母細胞を直接的に死滅させる。しかし、ACTは、循環する成熟生殖母細胞に対しては有効でない1。高度な流行地域では、多くのヒト対象が成熟生殖母細胞を保有するが、症状を示さない:これらの対象は、治療されたわけではないので、伝染に対するACTの効果は限定される。プリマキンが、成熟生殖母細胞に対して有効な、利用可能な唯一の抗マラリア薬である。選択された地域では、プリマキンの大量投与が有効であるが、その投与スケジュール、また、G6PD欠損対象におけるその毒性により、アフリカの高度な流行地域における大規模使用には適さない1。したがって、成熟生殖母細胞に対して有効であり、大量投与に適する新たな薬物を開発することが極めて重要である。
(参考文献)
Claims (46)
- マラリア原虫 (Plasmodium)属の寄生原虫に感染した赤血球(RBC)の硬直性を上昇させる能力について化合物をスクリーニングする方法であって、
a)前記寄生虫に感染したRBCを培養し、場合によって、別々に未感染RBCを培養するステップであって、感染したRBC(iRBC)の硬直性を上昇、特に選択的に上昇させるその能力について調べる化合物の存在下および不在下の両方において各培養を実施するステップと、
b)前記化合物の存在下において培養された1つまたは複数のiRBC、および前記化合物の不在下において培養された1つまたは複数のiRBCの変形能を測定するステップと、
c)場合によって、前記化合物の存在下において培養された1つまたは複数の未感染RBC、および前記化合物の不在下において培養された1つまたは複数の未感染RBCの変形能を測定するステップと
を含むかまたはこれらからなり、
化合物の存在下において培養されたiRBCの変形能が、同化合物の不在下において培養されたiRBCの変形能と比較して、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%低下することにより、前記化合物がiRBCの硬直性を上昇させることが可能であることが示される方法。 - 前記iRBCが、輪状体を宿すRBCおよび/または生殖母細胞を宿すRBC、特に、成熟生殖母細胞を宿すRBCである、請求項1に記載の方法。
- ステップa)で用いられるiRBCが、
RBC、好ましくは、8日齢未満のRBCにiRBC、特に、分裂体期のiRBCが濃縮されたiRBCの培養物を感染させ、前記濃縮を、例えば、ゼラチン溶液、例えば、plasmion (登録商標)処理により実施するステップ
により得られる、請求項1または2に記載の方法。 - ステップa)および/または請求項3に記載のステップの前に、
例えば、1回または複数回のソルビトール処理による、iRBCの寄生虫、または分裂体を濃縮したiRBC培養物の寄生虫の同期化ステップ
を行う、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - 化合物の存在下において培養された未感染RBCの変形能が、化合物の不在下において培養された未感染RBCの変形能とほぼ同じであるか、またはこれとの差違が5%未満の場合をスクリーニングし、
場合によって、化合物の存在下において培養された分裂体iRBCの変形能が、化合物の不在下において培養された未感染の分裂体iRBCの変形能とほぼ同じであるか、またはこれとの差違が5%未満の場合をスクリーニングする、
請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 実施されるスクリーニングが、ロースループットスクリーニングまたはハイスループットスクリーニングである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- RBCおよびiRBCの変形能が、集団的な細胞スケールおよび/または個別の細胞スケールにおいて測定される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- RBCおよびiRBCの変形能が、レオスコープ、エクタサイトメーター、マイクロ流体デバイス、マイクロピペット、および/または光ピンセットにより測定される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- エクタサイトメーターが市販の自動式装置であり、Laser-assisted Optical Rotational Cell Analyzer (LORCA;オランダ、ホールン、Mechatronics社製)、またはRHEODYN-SSD(ドイツ、レートゲン、Myrenne社製)が好ましく、LORCAがより好ましい、請求項8に記載の方法。
- RBCおよびiRBCの変形能が、1.7パスカル(Pa)および30Paを含めた0.3〜30Paのせん断応力の範囲にわたり測定される、請求項8または9に記載の方法。
- iRBCの寄生虫血レベルが、細胞集団の少なくとも20%または30%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは細胞集団の少なくとも70%である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 変形能の測定が、伸び指数(EI)を参照することにより実施される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 30Paで100%の寄生虫血状態に外挿する場合、化合物の存在下において培養したiRBCについて、0.43未満のEI、より好ましくは0.42未満のEIにより、前記化合物がiRBCの硬直性を上昇させうることが示される、請求項12に記載の方法。
- 前記未感染RBCおよび感染RBCがヒトRBCである、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記寄生虫が、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、二日熱マラリア原虫(Plasmodium knowlesi)、プラスモジウム・イヌイー(Plasmodium inui)、サルマラリア原虫(Plasmodium cynomolgi)、プラスモジウム・セミオバーレ(Plasmodium semiovale)、プラスモジウム・ブラジリアーヌム(Plasmodium brasilianum)、プラスモジウム・シュウェツィー(Plasmodium schwetzi)、およびプラスモジウム・シミウム(Plasmodium simium)からなる群、好ましくは、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、および四日熱マラリア原虫からなる群、より好ましくは、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫からなる群において選択される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記寄生虫が、熱帯熱マラリア原虫、特に、熱帯熱マラリア原虫のパロアルトI原虫株である、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- スクリーニングされた化合物を、単離灌流されたヒト脾臓モデル、および/または単離灌流されたブタ脾臓モデルにより検証するステップをさらに含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
- スクリーニングされた化合物が、その表層細胞骨格を含めたiRBC膜と相互作用し、かつ/またはiRBC内に侵入する、特に、iRBCの脂質二重層を越えるか、もしくは修飾された二重層そのものと相互作用することが可能である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- マラリア原虫属の寄生原虫に感染した赤血球(iRBC)と選択的に相互作用するか、または輪状体期にあるiRBCおよび/または生殖母細胞を宿すRBC、特に、成熟生殖母細胞を宿すRBCと選択的に相互作用し、それらの硬直性を上昇させるのに適する化合物を選択するための、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法の適用。
- 変形能が異常であり、特に変形能が低下した赤血球(RBC)の濾過ユニット内での貯留を可能とする、RBCを濾過する方法であって、
a) RBCを含む試料に、濾過ユニット内を流過させるステップと、
b)濾過ユニット内を流過する前における前記試料のアリコート(上流アリコート)、また、濾過ユニット内を流過した後における前記試料のアリコート(下流アリコート)を回収するステップと、
c)場合によって、濾過ユニット内へと貯留されたRBC (貯留アリコート)を回収するステップと、
d)場合によって、上流アリコートおよび下流アリコート、また場合によって、貯留アリコートを解析し、特に、上流アリコート中および下流アリコート中、また場合によって、貯留アリコート中におけるRBCまたはRBC部分集団の密度を決定するステップと
を含むかまたはこれらからなる方法。 - ステップd)が、(i)例えば、以下の式: (下流アリコート中におけるRBCまたはRBC部分集団の密度-上流アリコート中におけるRBCまたはRBC部分集団の密度)/上流アリコート中におけるRBCまたはRBC部分集団の密度を用いる、濾過ユニット内におけるRBC貯留率、または(ii)以下の式:下流アリコート中におけるRBCまたはRBC部分集団の密度/上流アリコート中におけるRBCまたはRBC部分集団の密度を用いる、濾過ユニット内におけるRBC貯留率を計算するステップをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- ステップd)が、例えば、遠心分離した上流アリコートおよび下流アリコート、また場合によって、遠心分離した貯留アリコートからの上清中におけるヒト乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)濃度を定量化することにより、上流アリコート中および下流アリコート中、また場合によって、貯留アリコート中における溶血を決定するステップを含む、請求項20または21に記載の方法。
- 試料が、変形能が低下したRBC、特に:
寄生虫、好ましくは、マラリア原虫属の寄生原虫に感染したRBC、特に輪状体を宿すiRBCまたは生殖母細胞を宿すiRBC、例えば、成熟生殖母細胞を宿すiRBC
加熱されたRBC、および
先天性または後天性の免疫機能不全のほか、先天性または後天性のRBC障害を有しうる患者に由来するRBC、また好ましくは、遺伝性または後天性の球状赤血球症、楕円赤血球症、敗血症、異常ヘモグロビン症(アルファサラセミアまたはベータサラセミア、鎌状赤血球症、および鎌状赤血球形質)、自己免疫性溶血性貧血、他の溶血性貧血、酵素欠損(グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、他の赤血球酵素)を有しうる患者に由来するRBC
のうちから選択されるRBCを含む、請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。 - 前記寄生虫が、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、プラスモジウム・イヌイー、サルマラリア原虫、プラスモジウム・セミオバーレ、プラスモジウム・ブラジリアーヌム、プラスモジウム・シュウェツィー、およびプラスモジウム・シミウムからなる群、好ましくは、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、および四日熱マラリア原虫からなる群、より好ましくは、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫からなる群、例えば、パロアルトI株の熱帯熱マラリア原虫において選択される、請求項23に記載の方法。
- ステップd)で解析されるRBC、またはステップd)で解析される少なくとも1つのRBC部分集団が、異常なRBCまたはマラリア原虫に感染したRBC (iRBC)であり、特に、輪状体を宿すiRBCまたは生殖母細胞を宿すiRBC、例えば、成熟生殖母細胞を宿すiRBCである、請求項20から24のいずれか一項に記載の方法。
- ステップd)が、
上流アリコート中および下流アリコート中、また場合によって、貯留アリコート中における寄生虫血状態の百分率を決定するステップと、
場合によって、(i)以下の式: (下流アリコート中における寄生虫血状態の百分率−上流アリコート中における寄生虫血状態の百分率)/上流アリコート中における寄生虫血状態の百分率を用いる、濾過ユニット内におけるRBC貯留率、または(ii)以下の式:下流アリコート中における寄生虫血状態の百分率/上流アリコート中における寄生虫血状態の百分率を用いる、濾過ユニット内におけるRBC貯留率を計算するステップと
を含むかまたはこれらからなる、請求項25に記載の方法。 - RBCがヒトRBCである、請求項20から26のいずれか一項に記載の方法。
- 試料のRBCが、化合物、特に、RBCの硬直性を調節し、好ましくはこれを上昇させることが可能でありうる化合物、例えば、iRBCの硬直性を特異的に調節し、好ましくはこれを上昇させうる化合物にあらかじめ曝露されている、請求項20から27のいずれか一項に記載の方法。
- RBCが、あらかじめ患者から得られた血液試料から、また好ましくは末梢血試料から回収されている、請求項20から28のいずれか一項に記載の方法。
- 例えば、化合物の存在下においてRBCをin vitroで培養することにより、RBCが、in vitroで前記化合物にあらかじめ曝露されている、請求項28または29に記載の方法。
- 濾過ユニットのチャネルの直径が、1〜10μm、また好ましくは1.85〜9.4μmまたは1〜3μmの範囲にあり、例えば、直径が2μmである、請求項20から30のいずれか一項に記載の方法。
- 濾過ユニットのチャネルの厚さが、24μm未満、また好ましくは5μm未満である、請求項20から31のいずれか一項に記載の方法。
- 濾過ユニット内の流過が、重力、フラッシュ、吸引、または遠心分離により駆動される、請求項20から32のいずれか一項に記載の方法。
- 試料のヘマトクリットが低値、例えば5%未満、より好ましくは2%〜2.5%の範囲内にあり、前記試料が、好ましくは4%アルブミンおよび5% Plasmion (登録商標)を補充するか、もしくは1% albumax II (登録商標)を補充したPBSもしくはRPMIを含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる懸濁培地中に懸濁されることが好ましい、請求項20から33のいずれか一項に記載の方法。
- 濾過ユニットが、チャネル穿孔膜、例えば、ポリカーボネート製チャネル穿孔膜を含むかまたはこれらからなる、請求項20から34のいずれか一項に記載の方法。
- ステップa)が重力により駆動し、一定圧力下、例えば、80〜85cmの水による一定圧力下において、また好ましくは約34〜37℃の温度で実施される、請求項35に記載の方法。
- 濾過ユニットが、1つまたは複数のビーズ層、また好ましくはスズビーズ層を含むかまたはこれらからなり、濾過ユニット内に存在するビーズの直径が、2〜25μmまたは5〜25μmの範囲内にあり、濾過ユニット内におけるビーズ間腔により形成されるチャネルが、0.74〜9.4μmまたは1.85〜9.4μmの間で変化することが好ましい、請求項20から35のいずれか一項に記載の方法。
- 濾過ユニット内に存在する各ビーズ層が、少なくとも0.5〜10μmの厚さであり、濾過ユニット内におけるビーズの厚さの合計が、少なくとも5mm、好ましくは7mmである、請求項20から35または37のいずれか一項に記載の方法。
- 濾過ユニット内の流過が、シリンジにより加圧された流過であるか、または遠心分離により誘導された流過である、請求項37または38に記載の方法。
- ステップa)が、一定圧力下、例えば、80〜85cmの水による一定圧力下において、また好ましくは約20〜25℃の温度で実施される、請求項37から39のいずれか一項に記載の方法。
- ステップd)、特に密度または寄生虫血状態の決定が、液相蛍光ベース定量化法により、またはギムザ染色後に実施される、請求項20から40のいずれか一項に記載の方法。
- 赤血球(RBC)、とりわけマラリア原虫属の寄生原虫に感染したRBCの変形能を調節する能力、特にこれらの硬直性を誘導するかまたは上昇させる能力について化合物をスクリーニングする方法における、例えば請求項1から18のいずれか一項に記載の方法における、請求項20から41のいずれか一項に記載の方法の適用。
- 化合物のスクリーニングが、
請求項20から41のいずれか一項に記載のRBCを濾過する方法を、RBCを含む2つの試料アリコートに適用するステップであって、1つのアリコートだけが、RBCの硬直性を調節し、好ましくはこれを上昇させるその能力について調べる化合物にあらかじめ曝露されているステップと、
両方の試料アリコートについて決定されたRBC貯留率またはRBC貯留比を比較し、両方のRBC貯留率または両方のRBC貯留比の間の少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%の変化により、前記化合物がRBCの硬直性を調節しうることが示され、また、化合物に曝露されていない試料アリコートについて得られたRBC貯留率(絶対値における)またはRBC貯留比と比較して、化合物に曝露された試料アリコートについて得られたRBC貯留率(絶対値における)またはRBC貯留比が、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも15%上昇することにより、前記化合物がRBCの硬直性を上昇させうることが示されるステップと
を含むかまたはこれからなる、請求項42に記載の適用。 - RBCまたはiRBCの変形能の測定が、請求項20から41のいずれか一項に記載のRBCを濾過する方法を用いて、好ましくは、RBCまたはiRBCの貯留率または貯留比を参照することにより実施される、請求項1から18のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 特に実験研究ならびに/またはマラリア原虫に感染したRBC、例えば輪状体を宿すRBCおよび/もしくは生殖母細胞を宿すRBCの存在の診断もしくは検出のために、またはRBCの変形能に影響を及ぼす後天性もしくは先天性の障害、例えば後天性もしくは遺伝性の球状赤血球症の診断もしくは予後診断のために、変形能が異常であり、とりわけ変形能が低下したRBCを単離および/または検出するための、請求項20から41のいずれか一項に記載のRBCを濾過する方法の適用。
- 患者における、特に先天性または後天性の免疫機能不全のほか、先天性または後天性のRBC障害を有する患者における脾臓機能をin vitroで解析するための、請求項20から41のいずれか一項に記載のRBCを濾過する方法の適用。
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