CN102112874A - 用于筛选具有增加受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球细胞刚性的能力的化合物的方法，用于过滤红血球细胞的方法，及它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及筛选能增加受疟原虫属原生动物具体为热带疟原虫(Plasmodium falciparum)的寄生虫感染的红血球细胞(RBC)刚性的化合物的方法。本发明还涉及过滤RBC的方法，其能在过滤单元中使具有异常具体为降低的变形能力的RBC保留，以此代替脾过滤功能。所述方法具体为分离和/或检测疟原虫感染RBC或与由来自患者的血液样本的获得或遗传性球形红细胞性贫血有关的红细胞，或体外分析患者的脾功能。本发明还涉及所述方法的应用，用于筛选可以选择性与iRBC相互作用或者选择性与环状-iRBC相互作用，并且适合于增加其刚性的化合物，或者涉及所述方法用于过滤RBC，分离和/或检测具有异常并且特别是降低的变形能力的RBC的应用。这种新过滤方法还易于自动化，并且允许进行粘结RBC的清除或浓缩，在遗传或后天的RBC异常(包括疟疾)中具有广泛的实验和医疗应用。

Description

用于筛选具有增加受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球细胞刚性的能力的化合物的方法,用于过滤红血球细胞的方法,及它们的应用

技术领域

本发明涉及用于筛选具有增加受疟原虫(Plasmodium)属原生动物寄生虫特别是热带疟原虫(Plasmodium falciparum)感染的红血球细胞(RBC)刚性的能力的化合物的方法。

本发明还涉及用于过滤RBC的方法，其能在过滤单元中使具有异常和特别是降低的变形能力的RBC保留。所述方法可以，具体地，分离和/或检测疟原虫感染RBC或与下述疾病相关的异常RBC：后天或遗传性球形红细胞症、败血症、血红蛋白病(α或β地中海贫血、镰状细胞疾病和镰状细胞性状)、自免疫溶血性贫血、其它溶血性贫血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、其它红血球酶)，和与来自患者的血液样本的脾肿大有关的其它红血球细胞疾病，或体外分析患者的脾功能。

本发明进一步涉及所述方法的应用，用于筛选选择性地与受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球细胞相互作用并适合增加它们刚性的化合物。

背景技术

疟原虫属的原生动物寄生虫引起人和很多动物种类中的疾病(疟疾)。在人类中，疟疾主要由热带疟原虫、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)和间日疟原虫(Plasmodium vivax)引起。热带疟原虫是最主要的病因并且是所有疟疾病例中约80％病例的发病原因，并且还是人类疟疾死亡中约90％的病因。寄生虫疟原虫还感染动物，包括鸟、爬虫和哺乳动物，特别是猴、猩猩和啮齿动物。由几种疟原虫的猿猴种类，即诺氏疟原虫、猪尾猴疟原虫(Plasmodium inui)、食蟹猴疟原虫(Plasmodium cynomomlgi)、似卵形疟原虫(Plasmodium simiovale)、巴西疟原虫(Plasmodium brazilianum)、许氏疟原虫(Plasmodium schwetzi)和吼猴疟原虫(Plasmodium simium)引起的人类感染也已经有记载。

热带疟原虫首先感染肝脏，但是然后转移进入血液，在其中扩增并在红血球细胞(也称作RBC、红血球或红细胞)中持续保持无性复制循环。在侵入红血球细胞后，热带疟原虫经过连续的表型变化和几轮有丝分裂。在约48小时后，受感染的红血球细胞破裂并释放游离寄生虫(裂殖体)，其或者侵入另一个红血球细胞，或者快速(在半小时内)通过各种机制离开血流。

疟疾的发病机理与多种寄生虫和宿主因子有关¹。脾过滤和免疫功能对于实验模型中疟原虫感染的过程有重要影响^2，3。在疟疾流行的国家中，脾切除术容易引起发烧、更频繁和更高的寄生虫感染量(包括寄生虫的循环成熟形式)，并且可能再次激活潜伏的疟原虫感染^4，5。除了相对较少的已发表数据(在⁵中进行了综述)，临床医生将疟疾包括在证明在脾切除非免疫患者中日益引起重视的感染性疾病名单中⁶。因为动物和人类疟原虫感染之间的关键特征可能不同，并且因为人类脾脏的深入探索受到伦理和技术的限制⁷，所以仅对热带疟原虫感染红血球细胞(iRBC)和人脾脏微循环结构之间的精确相互作用进行了间接或通过验尸而进行探索¹⁰。因此，在人疟疾期间推定的脾脏保护或发病作用下的机制主要仍然是推测性的。

人脾脏可以感受RBC变形能力中的适度变化，所述机制导致衰老或异常RBC的选择性生理保留/破坏^11，48。在几种病理状态中，RBC保留与脾肿大相关。同样的机制下，脾切除术减轻了患有各种红血球细胞疾病的患者中的贫血，所述疾病包括遗传性球形红细胞症，和遗传的RBC疾病⁴⁹。遗传性球形红细胞症由RBC膜(包括其皮质细胞骨架)的结构组织改变而表征，并且脾脏隔离是RBC(球形红细胞)寿命减少的主要机制。遗传性球形红细胞症疾病的严重性与膜表面积的降低程度直接相关，并且因此导致变形能力的降低⁵⁰。

通过其红髓(RP)的特殊微循环结构进行RBC变形能力的脾脏特异性感应。最广为人知的变形能力-感应结构是红髓窦壁中的内皮间间隙(IES)。这是动态的0.2-2μm宽(如同从人脾脏样本的光学和超结构显微镜图片所估计的)，0.5-3μm长的间隙，位于2个串状内皮细胞之间，通过所述间隙，离开脾红髓索的RBC必须经过挤压，到达窦腔和静脉循环^11，21，51。IES可能是体内最严紧的RBC变形能力-感应结构。为了穿过静脉窦中狭窄的IES，RBC经过相当程度的变形：如果细胞不能充分变形，会保留在静脉窦壁的上游¹¹。期望这种RBC-处理功能作用于RBC上寄生的疟原虫上¹²。

RBC是热带疟原虫的主要宿主细胞(无性和有性红细胞阶段)⁵²。裂殖子侵入RBC，在其中发育48小时，然后产生新一代裂殖子。RBC内部寄生虫的发育导致宿主细胞膜的改变，表现为新结构、功能和抗原性质，其中有些性质与罕见的严重热带疟原虫感染有关^13，14。根据广泛接受的范例，热带疟原虫的RBC寄生无性形式(iRBC)在侵入后循环16-20小时(环状阶段)，然后在红细胞循环内的最后28-32小时过程中隔离在脉管系统中(营养共生和裂殖体阶段)³⁶。因此，环状-iRBC是循环中发现的主要热带疟原虫形式，与细胞粘附的成熟-iRBC的组织隔离相反。成熟-iRBC的变形能力显著下降，将导致在“经典”血管床中那些逃逸隔离的脾脏中保留¹⁵。此外，获得自疟疾患者血液，然后在活体外加热僵化、标记并为相同患者重新注射的RBC(热带疟原虫感染RBC)，由脾脏快速清除³⁹。

在本上下文中，定量的脾循环框架是对于疟疾发病原因一致理解的基本先决条件。先前对朝向动物中开放式循环的过滤床的脾血流的比例经实验确定从90％16至10％¹¹，确保指导对人的体内探索。

我们在本文(和在⁵⁴中)利用两种概念上相关的方法：健康志愿者的体内成像，和用培育的iRBC刺激活体外的人脾脏灌注系统，报道人脾脏生理和疟疾发病原因的互补方面。我们在本文中首先提供人脾脏内双室血液循环的体内证明，慢室占流量的10％。体外培养中超过50％的热带疟原虫环状感染RBC(环状)由离体-灌注的人脾脏保留，并沿着窦壁的近端积累(即，内皮间间隙的上游⁵⁴)。我们表明，在每次脾脏传代时，环状-iRBC中先前忽略的子群体中的10％保留在人脾RP的缓慢、开放式循环结构中，最有可能的是通过机械过程实现。这些结果揭示了环状阶段寄生虫的不均匀性，并为由脾脏进行的RBC过滤提供新视角，为疟疾患者中寄生虫扩增和RBC损失的控制带来曙光。

不同于携带未成熟配子体的RBC-其为固着的-携带成熟配子体的RBC(后文称作成熟配子体)在外周血液中循环⁵³。因为成熟配子体循环，所以可为嗜血的疟蚊所利用。当成熟配子体包含于疟蚊的血液大餐中时，会启动寄生虫有性阶段的完全发育，这是由热带疟原虫传播到其他人类所必需的步骤。

因此，人外周血液中RBC寄生环或成熟配子体的存在是脾脏中具有这些热带疟原虫发育阶段的RBC部分同时保留或不同时保留的指示。

RBC变形能力(和脾中RBC的保留)依赖(至少)3个因素：膜粘弹性、细胞质粘性，和细胞的几何尺度，其标志是表面积与体积的比例^28，50。可以根据有/没有同渗容摩变化(激光衍射计，Lorca)时的切应力下RBC群体的伸长指数估计RBC变形能力⁵⁰。经过过滤膜的时间也可以在群体水平反映RBC变形能力。因此这些工具的应用限于研究占全部的比例小于10％的子群体(最常见的是临床或培育样品中的Pf-iRBC)。在先技术中公开的微量吸管和微流体设备可以测量RBC在有限表面上变形或者流过狭窄如1μm(但是通常＞5μm长)的通道的能力⁵⁵。因为它们的读数是在单细胞水平，所以这些工具不适用于大型(＞10³细胞)RBC群体的快速分析。因为通过现有工具不能适当地模拟RBC和Pf-iRBC体内通过IES时的罕见变形，所以没有经过验证的、能预测脾保留的RBC变形能力的标志-包括严紧的“内皮间间隙通过刺激”。

本发明通过提供用于过滤RBC的方法克服了上述困难，所述方法使过滤单元中具有异常特别是降低的变形能力的RBC保留。本方法能用于从来自患者的血液样本检测疟原虫感染RBC或变形能力改变的RBC(例如球形红细胞)的存在，或者用于患者脾生理状况的体外分析。

此外，可以从珠层取得僵化的RBC，在细胞、子细胞和分子水平进一步比较分析，所述分析用不同子群体进行。还易于自动化，并允许进行僵化RBC的清除和浓缩，在遗传或后天的RBC疾病中具有广泛的潜在实验和医疗应用。

附图说明图1：人脾软细胞组织中血液循环的超声分析。(a)接收Sonovue微气泡恒定灌注的人志愿者的脾中超声信号强度的增强。(b1)对子囊区域[(a)中的白线]信号强度在超声诱导下的降低⁴³研究了≥8秒。用双指数曲线(TC)获得了对于得到的实验信号-时间曲线(EC)的最佳拟合，如同这个典型实例所示(在全部16个志愿者中，关联系数R2＞0.96)。(b2)信号强度对时间的双指数数学模型N(t)＝V₁(C₀0exp(-β₁t))+V₂(B+(C₀-B)exp(-β₁t))的图示，其中第一和第二项分别对应于慢室和快室。(c)源自这些观察的人脾软组织细胞中血液循环的示意图。

图2：通过离体-灌注的人脾清除iRBC。(a)在用离体-灌注人脾的6个独立实验之一的120分钟灌注过程中，热带疟原虫FUP裂殖体-iRBC(△)和环状-iRBC(·)的寄生虫感染量(全部6个实验如图7a1-6所示)。(b)末端实验脾样本的透射电镜，表示红髓窦内腔(SL，b1)中有结节的裂殖体-iRBC[S，b1-2，(横杠＝1)(b2，箭头)，和索(Co，b1)中的无结节环状iRBC(R，b1-3)。保留的环状-iRBC的另一个实例如图4所示(d1-2)。

图3：在“循环”和“循环-再循环”实验过程中环状-iRBC清除的模拟。发现两个环状-iRBC子群体。(a)灌注液中环状-iRBC寄生虫感染量的模拟，通过理论实例由图形阐述：没有残留寄生虫感染量的单室(a1)、没有残留寄生虫感染量的双室(a2，直线对应于双指数曲线，虚线对应于单指数曲线)，和有残留寄生虫感染量的单室(平台期，a3)。根据赤池信息准则(AIC)、参数评价的变异性(VC)(AIC和VC值越小，模型越差)和测量浓度和预测浓度之间权重差相对于时间的随机分布，评价拟合程度和估计的参数。个体数值如表1所示。对于双室模型和有残留寄生虫感染量的1-室模型，AIC低于没有残留寄生虫感染量的单室模型。然而，对于双室模型，第二个半衰期参数的变异系数不显著(＞100％)。所以，有残留寄生虫感染量的单室模型是最好的模型。(b)“循环-再循环”实验。将为脾刺激制备的部分iRBC和RBC群体(“脾原初”群体)在灌注培养基中保持在37℃，而其它部分灌注脾脏。(b1)灌注开始四十分钟后，从循环灌注液获得iRBC和RBC(“脾传代”群体，b1)。使用PKH-26或PKH-76差异标记两个群体，然后合并并在初始灌注步骤后110-120分钟重新引入灌注液。使用流式细胞仪建立的每个iRBC子群体的清除动力学，表明清除了脾“原初”环状-iRBC，同时先前进行约40次脾传代的iRBC则没有清除。“脾原初”群体动力学的最差的模型还是有残留寄生虫感染量的单室。来自两个独立实验的平均(个体数值)AIC和半衰期与前面6个“循环”实验(b2)观察的结果相似。对于“脾传代”群落的最差模型是没有清除的残留寄生虫感染量(参见表1)。

图4：人脾中热带疟原虫iRBC沉积的分析。(a1-2)对于环状-iRBC(R，PFZ中，RP中)、裂殖体-iRBC(S，PFZ中，RP中)或红细胞外寄生虫剩余(EER，PFZ中，RP中)毛囊周区域(PFZ)或红髓(RP)中的平均(SEM)iRBC数目/100个RBC(来自6个离体灌注人脾实验的平均值，吉氏染色部分，WP＝白髓，横杠＝50_m)。每个寄生虫发育阶段的典型方面如插入部分所示(中间柱)。(a3)PFZ或RP中环状-iRBC(R)或裂殖体-iRBC(S)的保留指数[RI＝(a2中的“iRBC数目/100RBC”/(相应实验末期的循环寄生虫感染量)]。保留至少为1(黑色断线)对应于没有保留。(b1-2)与a1-2中相同的方法，但是使用PAS-染色(a＝主动脉)。(c1)紫色PAS-染色部分(横杠＝5μm)，表示红髓静脉窦的基底膜。脾髓中RBC沉降的工作分类：在窦内腔(SL)中，在与窦壁基底膜直接接触的索中(索近腔，CoA)，或者在不接触基底膜的索中(严格意义上的索，Co)。(c2)使用c1中定义的RP中RBC沉积的工作分类，对于环状iRBC的保留指数。(d1-d2)人离体-灌注脾样本的透射电镜，分别表示内皮间间隙(黑箭头)上游和下游的环状iRBC(白星形)和未感染RBC(黑星形)。这种布局反映了红髓中RBC从索(Co)到窦内腔(SL)的循环。环状iRBC的无结节基底膜与窦壁基底膜(白箭头)非常接近。对于图a、b和c：*、**、#分别表示统计学上的显著差异，p＜0.05，p＜＝0.01，p＜0.0001。

图5：iRBC的变形能力。(a)在不同切应力测量的红血球细胞的伸长指数(EI)(a1-2)。(a3)在30帕斯卡增加寄生虫感染量时培育的环状iRBC和裂殖体iRBC的EI(4个独立实验的平均值和标准偏差(SD))。在100％寄生虫感染量时环状iRBC的外推EI的平均值[95％置信区间(CI)]是0.47[0.43-0.51]。(b)在灌注末期处理的脾样本的扫描电镜。窦壁的腔内视图，显示内皮细胞典型的串状方面，其中含突入窦内腔的核(N)。细胞从内皮间间隙生出(箭头，横杠＝3μm)。左上方四方形：挤压通过内皮间间隙的RBC的显著变形。

图6：在灌注人脾的快和慢循环腔室中的热带疟原虫感染RBC。使用由人志愿者体内成像提取的循环特征为框架(图1)，用培育的iRBC刺激活体外人脾脏模型中观察结果的示意图(参见图2-5)。环状和裂殖体iRBC的主要表型特征不同，环状-iRBC在体外未表现出细胞粘连性质，并且没有可见的表面修饰。在快室中，对应于组织切片上的滤泡周围区域，只保留了裂殖体-iRBC，而环状和裂殖体-iRBC都保留在慢室中，对应于红髓(b)。这导致显著不同的清除率。流向慢室的血液比例(10.2％)和在相同的腔室中保留的可保留环状-iRBC的比例(11％)之间的相似性是惊人的。脾微循环框架的量化尺度很重要。因为，5％的心输出量去往脾，指定的RBC将每20分钟进入脾脏一次。慢室仅占脾血浆流的10％，相当于脾红血球细胞流的10-20％(依赖于血浆撇取效应的强度¹¹)。因此，指定RBC的变形能力的性质控制每100-200分钟发生一次。这与健康对照中先前观察到的僵化的加热RBC 60分钟的半衰期相吻合³⁸。这些先前临床观察的数量级与我们的框架完美吻合。

图7：(a1-6)在120分钟灌注过程中灌注液中热带疟原虫FUP裂殖体-iRBC(△三角)和环状-iRBC(·圆点)的寄生虫感染量(6个独立实验)。

图8.(a)使用来自成年非洲患者的超免疫血清池(1/100稀释)，对于为实验制备的培育裂殖体-iRBC(a1)和环状-iRBC(a2)群体进行的表面免疫荧光，并用Hoechst计数染色。典型的吉氏染色部分如插入部分所示。大多数裂殖体-iRBC可强烈染色，而环状-iRBC未染色(横杠＝10μm)。(a3)来自表面碘化的培育裂殖体-iRBC(S)和环状-iRBC(R)的Triton-SDS提取物的PAGE自动放射摄影。仅在裂殖体-iRBC提取物中观察到正确地对应于PfEMP1的290kDa条带(箭头)。

图9.能够用于筛选可增加热带疟原虫环状感染RBC的刚性的化合物的实验步骤示意图。

图10.用多孔通道膜进行的重力驱动过滤：常用装置和实验步骤。1.将柱充满过滤培养基(补加4％白蛋白和5％的RPMI，或补加1％人白蛋白的PBS)；2.过滤前将过滤单元(包含补加溶解白蛋白的悬浮培养基)阻断10分钟；3.将样品(过滤培养基中血细胞比容为2％-2.5％)载入柱；4.过滤步骤；5.从过滤单元的上游和下游取得样本；6.处理样本用于Pf-iRBC浓度和红血球溶解的定量。

图11.多孔通道膜过滤。A-C，E.使用的过滤单元；A.使用的聚碳酸酯膜的类型；B.膜模具；C.膜；E.与柱连接的过滤单元(不断过滤)；D.在穿过Sterlitech^o聚碳酸酯膜时RBC的理论性状改变；F.在分别通过2和3μm宽通道连接的膜下游的样本的上清液颜色。2μm样本表现出温和至中等的红血球溶解。

图12和13.珠层过滤。A.珠来源；B.用于保持珠层的吸头(Barrier吸头1000；Neptune)；C.在倾析前(C1)和倾析后(C2)用尺度减小的珠载入吸头；D.吸头中珠层的示意图；E.7-mm 5-25珠层的图。

图14和15.通过自然和人工内皮间间隙时RBC的形状变化。

图14.A1.脾红髓中的索(co)和窦内腔(sl)；A2-3.在通过窦壁时RBC发生挤压(箭头)(离体-灌注人脾的吉氏染色涂片)。B和C.在离体-灌注人脾中从索到窦内腔通过内皮间间隙时RBC发生挤压(箭头)(投射和扫描电镜)。D1-2.通过聚碳酸酯膜通道(D1)或珠间空间(D2)时RBC挤压的示意图。

图15.A.在人脾红髓中的内皮间间隙观察到的RBC和内皮细胞(EC；虚线)的形状(透射电镜)；B.在珠间空间(相同尺寸的珠的混合物)中最窄处的最大直径的几何计算。

图16.用于过滤的注射密封回路参照方法-原理。

图17.用于过滤的注射密封回路参照方法-三次过滤的装置。1.具有控制屏幕的电子注射泵(从左到右)，可显示流量(ml/分钟)、终体积(ml)和压力；2.3-三通管；3.过滤膜(箭头)；4.收集管。

图18.基于离心的过滤。1.Eppendorf管中过滤单元的装置；2.离心前过滤单元中的上游样本；3.离心机中的过滤单元和Eppendorf管；4.第一轮离心结束时的过滤单元；5.第一轮离心结束后的收集管(下游样本)。

图19.用于定量寄生虫感染量的基于液相荧光的方法-荧光强度和寄生虫感染量之间的线性关联，如根据吉氏染色涂片或液相荧光所平行确定的。对10％寄生虫感染量的培育样品进行梯度2倍稀释的三次重复分析。

图20.用于定量寄生虫感染量的基于液相荧光的方法-基于吉氏染色和基于荧光对寄生RBC浓度降低(或增加)的估计值之间的线性关联。上游到下游(下半部)或上游到珠层(上半部)分析。X轴：过滤器中的保留率，如根据吉氏染色涂片所估计的；Y轴：过滤器中的保留率，如通过荧光所估计的。

图21.来自图20中用于定量寄生虫感染量的基于液相荧光的方法的子部分-上游到下游保留率的详细分析，确证寄生虫阶段对于过滤器中保留具有强烈依赖性。X轴：过滤器中的保留率，如根据吉氏染色涂片所估计的；Y轴：过滤器中的保留率，如通过荧光所估计的。

具体实施方式本发明涉及筛选能增加受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球细胞(RBC)刚性的化合物的方法，所述方法包括或由下述步骤组成：

a)培育受所述寄生虫感染的RBC，并可选地和单独地培育未感染RBC，每种培育均在存在和不存在待测试化合物的情况下进行，其中测试化合物增加且具体为选择性增加受感染RBC(iRBC)的刚性的能力，和；

b)测定在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC的变形能力，和不存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC的变形能力；和，

c)可选地，测量在存在所述化合物的情况下一种或几种未感染RBC的变形能力，和不存在所述化合物的情况下一种或几种未感染RBC的变形能力，

其中与在不存在相同化合物的情况下培育的iRBC相比，在存在化合物的情况下培育的iRBC的变形能力下降至少5％，优选至少10％，并且更优选至少15％(具体地，刚性增加至少5％，优选至少10％，并且更优选至少15％)，则表明所述化合物能增加iRBC的刚性。

在具体的实施方案中，所述筛选方法包括或由下述步骤组成：

a)培育受所述寄生虫感染的RBC，并可选地和单独地培育未感染RBC，每种培育均在存在和不存在待测试化合物的情况下进行，其中测试化合物增加且具体为选择性增加iRBC刚性的能力，和；

b)测定下述的变形能力：

-在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC，

-不存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC，

-在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种未感染RBC，和

-不存在所述化合物的情况下培育的一种或几种未感染RBC，

其中与在不存在相同化合物的情况下培育的iRBC相比，在存在化合物的情况下培育的iRBC的变形能力下降至少5％，优选至少10％，并且更优选至少15％，则表明所述化合物能增加iRBC的刚性。

本文使用的“化合物”可以是任何化学化合物、免疫球蛋白(Ig)、多肽、肽，或其它能增加iRBC刚性的生物治疗剂。化学试剂，在本领域中指“小分子”化合物，其通常是有机、非肽分子，分子量最高10,000，优选最高5000，更优选最高1000，并且最优选最高500道尔顿。可以使用已知方法产生Ig，并且Ig可以是示例性多克隆、单克隆、人化或嵌合抗体、单链抗体或Fab片段。“肽”或“多肽”是两个或更多氨基酸(“肽”是2-20个氨基酸，而“多肽”是多于20个氨基酸)的任何链，包括天然发生或非天然发生的氨基酸残基和氨基酸残基类似物，无论是否进行翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。这种化合物可以从任何合适的来源获得或者由任何合适的来源产生，无论来源是否天然。只要适当，可以通过任何化学或生物合成技术合成所述化合物。

根据特定的实施方案，筛选化合物库。具体地，可以筛选来自Sanofi Aventis的库。

根据特定的实施方案，筛选的化合物能与包括其皮质细胞骨架的RBC膜(至少包括其皮质细胞骨架的iRBC膜)相互作用和/或进入RBC(至少进入iRBC)，特别是穿过RBC的脂双层(至少是iRBC脂双层)，或者与修饰的脂双层本身相互作用。

根据特定的实施方案，筛选的化合物通过增加其刚性而选择性地与iRBC相互作用。通过“选择性地与iRBC相互作用”，在本文表示筛选的化合物与iRBC相互作用并增加其刚性，而不增加未感染RBC并优选其它类型细胞的刚性。这意味着人们筛选在化合物存在的情况下培育的未感染RBC的变形能力，其与在不存在化合物的情况下培育的未感染RBC的变形能力相同或者相差小于5％。

在特定的实施方案中，通过“iRBC”，或“疟原虫感染iRBC”，在本文表示环状-RBC(或环状-宿主RBC)和/或配子体-宿主RBC，特别是成熟配子体-宿主RBC。

根据特定的实施方案，筛选的化合物通过增加其刚性而选择性地与环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC特别是成熟配子体-宿主RBC相互作用。通过“选择性地与环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC相互作用”，在本文表示筛选的化合物与环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC相互作用并增加其刚性，而不增加未感染RBC和优选其它类型细胞的刚性。这意味着人们筛选(1)在化合物存在的情况下培育的裂殖体-iRBC的变形能力，其与在不存在化合物的情况下培育的裂殖体-iRBC的变形能力相同或者相差小于5％，和(ii)在化合物存在的情况下培育的未感染RBC的变形能力，其与在不存在化合物的情况下培育的未感染RBC的变形能力相同或者相差小于5％。

根据特定的实施方案，筛选的化合物通过增加其刚性而选择性地与环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC特别是成熟配子体-宿主RBC相互作用。通过“选择性地与环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC相互作用”，在本文表示筛选的化合物与环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC相互作用并增加其刚性，而不增加配子体阶段iRBC(配子体-iRBC)的刚性，也不增加未感染RBC和优选其它类型细胞的刚性。这意味着人们筛选(1)在化合物存在的情况下培育的裂殖体-iRBC的变形能力，其与在不存在化合物的情况下培育的裂殖体-iRBC的变形能力相同或者相差小于5％，和(ii)在化合物存在的情况下培育的未感染RBC或其它类型细胞的变形能力，其与在不存在化合物的情况下培育的未感染RBC或其它类型细胞的变形能力近似相同或者相差小于5％。

通过“增加iRBC刚性的能力”，在本文表示将iRBC刚性增加至少5％，优选至少10％和更优选至少15％的能力。化合物增加iRBC刚性的能力可以特别地通过测量在所述化合物存在和不存在的情况下培育的iRBC变形能力而评价。因此，根据特定的实施方案，“增加刚性”表示“降低变形能力”和特别地“将变形能力降低至少5％，优选至少10％和更优选至少15％”。

通过“由疟原虫属的原生动物寄生虫感染”，在本文表示包含至少一种疟原虫属的寄生虫[即，所述原生动物寄生虫的子细胞，其是无性繁殖的结果]的红血球细胞。

根据一个实施方案，寄生虫选自下足：热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、猪尾猴疟原虫、食蟹猴疟原虫、似蛋形疟原虫、巴西疟原虫、许氏疟原虫和吼猴疟原虫，优选选自下组：热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫和三日疟原虫，和更优选选自下组：热带疟原虫和间日疟原虫。

在特定的实施方案中，所述寄生虫是热带疟原虫，具体为热带疟原虫的Palo Alto I菌株。

根据特定的实施方案，寄生虫，特别是包含感染RBC的裂殖体已发育成为环状；因此，所述感染RBC处于环状阶段。具体地，可以收集新鲜的环状-感染RBC(环状-iRBC)，即少于14小时的环形-iRBC，少于8天或者8天的RBC(优选少于8天的RBC)。

可替换地或者渐渐地，RBC可以是配子体-宿主RBC，并且优选成熟配子体-宿主RBC。

可以通过在发育疟原虫寄生虫时人工同步化而筛选环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC。本领域中已知几种方法，例如使用山梨醇或甘露醇处理；用5％山梨醇处理iRBC(例如37℃5分钟)引起包含晚期在内的iRBC裂解，并且优先筛选早期环状阶段的iRBC。可以重复处理(至少两次，例如，2、3、4或5次或者多于5次)，例如在34小时后，以进一步筛选早期阶段并促进同步化。其它技术包括分离晚期阶段寄生虫，例如在Plasmagel或结冷胶中沉降。因此，在一个实施方案中，本发明的筛选方法的步骤a)后面进行iRBC培育物的同步化的步骤。

根据一个实施方案，RBC(未感染和/或感染RBC)是人RBC。还可以使用来自灵长类猿猴的RBC，但是更优选使用人RBC。所有血型的人RBC都适合于疟原虫生长，并且特别适合于热带疟原虫生长。O型RBC特别适用，因为它们与所有其它血型的人血清或血浆相容。

进行的筛选可以是低通量筛选或高通量筛选。可替换地，本发明的筛选方法可以包括低通量筛选的一个或几个步骤和高通量筛选的一个或几个步骤。

可以将RBC或iRBC变形能力定义为在微循环期间不破裂或损失完整性而发生充分变形的能力，和承受动脉循环切应力的能力。

因此，RBC和iRBC变形能力的测量是表型测量。可以在群体细胞水平和/或个体细胞水平进行。因此，本发明的筛选方法包括在群体细胞水平变形能力分析的一个或几个步骤和/或在个体细胞水平变形能力分析的一个或几个步骤。

为了评价iRBC的变形能力，并且特别是评价环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC的变形能力，通常在37℃或38℃，在RPMI 1640培养基或补加的RPMI 1640培养基中培育RBC和iRBC，比如完全培养基(RPMI 1640培养基、碳酸氢盐、25mM谷氨酰胺、0.2％葡萄糖、100μM次黄嘌呤、10μg/ml庆大霉素和10％AB+未活化人血清池)。此外，这些细胞优选在低氧压力(低pO₂)条件(通常为1-5％O₂)中培育，例如，在1％O₂、3％CO₂和96％N₂的气氛下培育。

RBC和iRBC可以培育0.1至10小时，优选1至6小时，并且更优选1至3小时，例如用待测试化合物培育1、2或3小时。因此，在本发明的筛选方法中，步骤b)在步骤a)之后可以进行0.1至10小时，优选1至6小时，并且更优选1至3小时，例如1、2或3小时。

通常在(i)去除培育物上清液(例如通过在1500转每分钟离心5分钟)和(ii)将细胞团在1％白蛋白的PBS溶液或1％白蛋白的RPMI溶液中重悬后进行变形能力分析。

已经提出了测量RBC变形能力中的各种技术，特别是激光衍射术、检电术、微流体、微量吸管吸引术和光钳的使用。因此，根据一个实施方案，通过检电器、激光衍射器、微流体设备(特别是毛细管微流体系统)、微量吸管和/或光钳测量RBC和iRBC的变形能力。

激光衍射器在各种切应力水平下使用激光衍射分析。这种技术与其它技术相比有几点优势，它的操作相对简单，具有可接受的精确度，能在各种切应力操作，并且能使用极小量的血液(少于50μl)快速测量细胞变形能力。自动化的激光衍射器市场有售。在本发明的筛选方法中可以使用的模型包括LORCA(激光辅助光旋细胞分析仪；Mechatronics，Hoorn，Netherlands)和RHEODYN-S SD(Myrenne，Roetgen，Germany)。激光衍射器使用激光衍射仪和图像分析，通过测定流体切应力下细胞的伸长指数值而提供对细胞变形能力的测量。处理RBC以增加切应力并记录通过悬浮液时的激光衍射模式。随着切应力值增加，激光衍射模式从圆形变成椭圆形。根据这些测量结果，可以获得细胞的伸长指数。

根据特定的实施方案，用于测量RBC和iRBC变形能力的激光衍射器是商业旋转类型的激光衍射器，LORCA。使用这种激光衍射器，将RBC的粘性悬浮液在两个同轴圆柱体之间剪切。如实例部分所示，一个圆柱体的旋转引起RBC的变形(伸长)。用摄像机检测激光束衍射模式并通过计算机将其转化为数字值，伸长指数(EI)，而进行分析。

因此，在一个实施方案中，并且特别是当使用激光衍射器时，参照伸长指数(EI)进行变形能力的测量。这种度量，其通常定义为椭圆体衍射模式的两个轴之间的差和这两个轴的和的比例，通常使用椭圆拟合程序根据衍射模式中的强度曲线而确定。在群体细胞水平分析变形能力时，用于测量RBC变形能力的技术经常得到平均值的指标。

此外，在一个实施方案中，并且特别是当使用激光衍射器时，RBC和iRBC的变形能力，并且通常是伸长指数，通常在0至35帕斯卡(Pa)的切应力范围内测量，优选0.3至30Pa，例如1.7Pa至30Pa，并且特别是在1.7Pa和/或30Pa。

根据特定的实施方案，iRBC的寄生虫感染量水平为细胞群体的至少20％或30％，优选细胞群体的至少50％，和更优选细胞群体的至少70％。

通过“寄生虫感染量(parasitemia)”，指用培育物中包含至少一个环状或配子体的RBC的百分比表示的寄生虫的数量含量。可以计数寄生虫的数量，例如，使用光学显微镜，在薄血液图片(对于高寄生虫感染量)或厚血液斑点(对于低寄生虫感染量)上计数。

通常，并且特别是在群体细胞水平测量RBC和iRBC变形能力的时候(例如当使用激光衍射器时)，在不同寄生虫感染量(至少两个不同寄生虫感染量)测量EI，例如对于环状-iRBC为4％至76％寄生虫感染量，并且外推至100％寄生虫感染量。

根据一个实施方案，对于在存在待测试化合物的情况下培育的iRBC，在外推至100％寄生虫感染量时，在30Pa，低于0.43的EI，更优选低于0.42的EI，则表明所述化合物能增加iRBC刚性。

通过用iRBC的培育物，特别是用包含裂殖体阶段的iRBC的培育物感染(或再次感染)所述RBC可以在RBC(未感染或已经感染的RBC)的培育物中诱导或增加寄生虫感染量。可以将裂殖体阶段的iRBC富集在iRBC培育物中，例如通过悬浮在凝胶状溶液(

处理)中或通过本领域已知的其它技术，特别是使用细胞分离液梯度。

根据特定的实施方案，本发明的筛选方法的步骤a)中使用的iRBC群体已经通过用iRBC培育物，并且特别是其中例如通过

处理已经富集了裂殖体阶段iRBC的培养物，感染未感染RBC，特别是新鲜的未感染RBC(即，小于8天或8天的RBC，优选小于8天的RBC)。因此在特定的实施方案中，使用仅用于培育而不进行任何其它处理的iRBC测量变形能力。

因此，根据特定的实施方案，本发明的筛选方法包括或由下述步骤组成：

1)富集iRBC培育物中的裂殖体阶段iRBC，例如通过处理或通过本领域中已知的任何其它技术富集；

2)用步骤1)的裂殖体富集iRBC培育物感染RBC，特别是新鲜RBC(即，小于8天或8天的RBC，优选小于8天的RBC)(这第二步可以获得环状阶段的iRBC)；

3)培育步骤2)获得的iRBC，并且，可选地和单独地培育未感染RBC，每种培育均在存在和不存在待测试化合物的情况下进行，所述化合物用于测试其增加iRBC刚性的能力，和；

4)测量在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC和在不存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC的变形能力；和，

5)可选地，测量在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种未感染RBC和在不存在所述化合物的情况下培育的一种或几种未感染RBC的变形能力，

其中与在不存在相同化合物的情况下培育的iRBC的变形能力相比，在存在化合物的情况下培育的iRBC的变形能力降低至少5％，优选至少10％，并且更优选至少15％，则表明所述化合物能增加iRBC的刚性。

这种筛选方法的实例在实例部分中给出(参见实例B)。

此外，在上述特定的实施方案中，iRBC培育物的寄生虫，特别是裂殖体富集的iRBC培育物的寄生虫可以通过本领域任何已知的方法同步化，特别是通过本文所引用的任何同步化方法，例如通过一次或几次(2、3、4或5或多于5次)山梨醇处理。所述同步化步骤或至少一个同步化步骤优选在裂殖体-富集步骤前进行。

根据一个实施方案，本发明的筛选方法进一步包括用离体灌注人脾模型和/或离体灌注猪脾模型确认筛选的化合物的步骤。所述进一步的步骤通常在变形能力分析的步骤后进行。

根据本发明的特定实施方案，在上文公开的筛选方法中，使用本文定义的用于过滤RBC的方法进行RBC或iRBC变形能力的测量，优选参照RBC或iRBC保留率或保留比例(如后文所述)。

本发明还涉及本发明的筛选方法的应用，用于筛选选择性地与iRBC相互作用或选择性地与环状-iRBC相互作用和或与配子体-宿主RBC(特别是与成熟配子体-宿主RBC)选择性地相互作用并适合增加其刚性的化合物。

本发明还涉及用于过滤RBC的方法，其能在过滤单元中使具有异常具体为降低的变形能力的RBC保留，所述方法包含或由下述步骤组成：

a)使包含RBC的样品流过过滤单元；和

b)取得流过过滤单元之前所述样本的等分试样(上游等分试样)和流过过滤单元之后所述样本的等分试样(下游等分试样)；和

c)可选地取得已经在过滤单元中保留的RBC(保留等分试样)；和

d)可选地分析上游和下游等分试样和，可选地，保留等分试样，并且特别地确定上游和下游等分试样，和，可选地，保留等分试样中RBC或RBC子群体的浓度或密度。

本发明用于过滤RBC的方法在过滤单元中使通常可在脾中体内保留的RBC保留，并因此产生体内发生的脾过滤功能，特别是在人体内发生的脾过滤功能。

通过“降低的变形能力”，(或增加的刚性或僵化)，在本文表示变形能力的部分或全部损失。变形能力通常降低至少5％，优选至少10％和更优选至少15％。在本发明的特定实施方案中，“降低的变形能力”表示“增加的刚性”。

通常将取得的上游、下游和保留等分试样放在微孔板中。密度的确定可以通过自动化方法平行地对上游和下游等分试样进行。

在特定的实施方案中，用于过滤RBC的方法的步骤d)还包括计算过滤单元中RBC或RBC子群体的保留率(即，保留的RBC或RBC子群体的百分比)，例如使用下述公式：

(下游等分试样中RBC或RBC子群体的密度-上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度)/上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度

可替换地，方法可以包括比较下游和上游中RBC或RBC子群体的密度的步骤，例如通过确定保留比例(下游等分试样中RBC或RBC子群体的密度/上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度)进行比较。

在特定的实施方案中，步骤d)包括确定上游和下游等分试样，和，可选地，保留等分试样中的红血球溶解，例如通过从离心后的上游和下游等分试样，和，可选地，从离心后的保留等分试样定量上清液中的人乳酸脱氢酶(LDH)浓度而进行。

在本发明特定的实施方案中，RBC是人RBC。

包含具有异常并且特别是降低的变形能力的RBC的样品优选用于本发明的过滤RBC的方法中。这些RBC包括受疟原虫属原生动物寄生虫感染的RBC、加热RBC和来自患有遗传或后天的免疫障碍以及遗传或后天的RBC疾病的患者的RBC，并且优选来自患有遗传性或后天的疾病的患者的RBC，例如遗传性或后天的球形细胞增多症、椭圆形红细胞增多症、败血症、血红蛋白病(α或β地中海贫血、镰状细胞疾病和镰状细胞性状)、自免疫溶血性贫血、其它溶血性贫血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、其它红血球细胞酶)1。

在特定的实施方案中，步骤d)中分析的RBC或步骤d)中分析的至少一个RBC子群体是异常RBC或疟原虫感染RBC(iRBC)，和特别地环状-寄生iRBC或配子体-寄生iRBC，例如成熟配子体-寄生iRBC。

当分析iRBC，和特别是环状-寄生iRBC或配子体-寄生iRBC时，步骤d)通常包括或由下述组成：

-确定上游和下游等分试样，和，可选地，保留等分试样中的寄生虫感染量百分比；和

-可选地(i)使用下述公式确定过滤单元中的RBC保留率：(下游等分试样中的寄生虫感染量百分比-上游等分试样中寄生虫感染量百分比)/上游等分试样中寄生虫感染量百分比或(ii)保留比例(下游等分试样中寄生虫感染量百分比/上游等分试样中寄生虫感染量百分比)。

在本发明特定的实施方案中，寄生虫选自下组：热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、猪尾猴疟原虫、食蟹猴疟原虫、似卵形疟原虫、巴西疟原虫、许氏疟原虫和吼猴疟原虫，优选选自下组：热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫和三日疟原虫，和更优选选自下组：热带疟原虫(Pf)和间日疟原虫，例如热带疟原虫的Palo Alto I菌株。

在本发明的特定实施方案中，样品的RBC已经经过(已知或新)化合物的处理，特别是可能调节并优选增加RBC刚性的化合物，并且例如可以特异性调节和优选地增加iRBC刚性的化合物(特别是特异性作用于环状-寄生iRBC和/或配子体-寄生iRBC的化合物)。

在本发明的过滤方法中通常使用小体积样本，例如1-100微升积压红血球细胞的样本。

样本通常优选悬浮在悬浮培养基中，其包括、由或主要由补加4％白蛋白和5％

或1％albumax

的PBS或RPMI组成。

通过“主要由组成”，在本文表示可以在样本中加入少量成分而不具有显著影响。

在本发明特定的实施方案中，已经从血液样本(例如全血样本)并优选从外周血液样本取得RBC，所述样品先前获得自患者。

在本发明特定的实施方案中，未从血液样本获取RBC，但是优选通过稀释血液样本(例如全血样本)和优选稀释外周血液样本而区的RBC，所述样品先前获得自患者。

本发明的过滤方法中使用的RBC和特别是iRBC可以从患者的血液样本收集，所述患者已经用具有调节和优选如本文所述增加RBC刚性的能力的化合物治疗。例如，可以在用所述化合物治疗几小时后收集所述RBC。

可替换地，或累积地，本发明的过滤方法中使用的RBC和特别是iRBC可以通过体外培育而获得。

特别地，可以在体外接触具有调节和优选如本文所述增加RBC刚性的能力的化合物后，特别是在存在所述化合物的情况下体外培育RBC和特别是iRBC(例如环状-寄生iRBC和/或配子体-寄生iRBC)后，收集用药物处理的RBC。

当使用包含iRBC的样本时，可以通过用iRBC，特别是用其中已经富集配子体-阶段iRBC的iRBC培育物，感染RBC，优选小于8天的RBC，制备iRBC培育物，所述富集例如通过

处理进行。

在本发明的特定实施方案中，过滤单元的孔(或通道)的直径在1至10μm之间，并且优选在1.85至9.4μm或1至3或1至2μm之间，例如直径2μm。

在本发明的特定实施方案中，过滤单元的通道的厚度小于24μm，并且优选小于5μm。

在本发明的特定实施方案中，由重力、冲洗(例如通过施加恒压)、吸引或通过离心驱动经过过滤单元的流动。

过滤单元通常放在柱(例如当经过过滤单元的流动是由重力或冲洗驱动时)或管(例如当经过过滤单元的流动是由离心驱动时)中。

在本发明的特定实施方案中，样品的血细胞比容较低，例如小于5％，和更优选在2％-2.5％的范围内。

在本发明的特定实施方案中，过滤单元包含或由多孔通道膜组成，例如聚碳酸酯多孔通道膜。来自Sterlitech Corporation的多孔通道膜特别合适，其中通道直径在1至3μm范围内，并且通道长度是24μm。例如，可以使用来自Sterlitech Coporation的2μm宽和24μm厚的聚碳酸酯多孔通道膜。

当使用多孔通道膜时，经过过滤单元的流动通常是重力驱动。特别地，步骤a)可以是重力驱动并在恒压下，例如80-85cm水的恒压，和优选在约34-37℃的温度进行。

可替换地，过滤单元可以包含或由一个或几个珠层组成，并且优选锡珠，其中过滤单元中存在的珠的直径在2-25μm或5-25μm的范围内，并且其中由过滤单元内的珠间空间形成的通道(孔)优选在0.74和9.4μm或1.85μm和9.4μm之间变化。

在本发明的特定实施方案中，过滤单元中存在的每个珠层至少厚0.5-10μm，过滤单元中珠的总厚度至少为5mm，优选7mm。例如，厚度至少为5mm和优选7mm的层，由等重的珠的混合物组成，其直径在5至15μm的范围内，并且可以使用直径在15至25μm范围内的珠。在特定的实施方案中，使用直径从5至25μm的珠的7mm厚的层。在另一个特定的实施方案中，过滤单元包含直径从5至25μm的珠的7mm厚的层和包含小于5μm的较小直径的珠的上层。在过滤单元中，珠层堆积在适于保留珠的过滤膜上，并且其不影响过滤单元的保留能力。

当使用珠层时，通常使用注射压力流或通过离心(例如通过在1500-2500g离心1-2分钟)实现经过过滤单元的流动。例如，可以使用电泵在8分钟内(即终体积为8ml)产生经过层的悬浮培养基(例如PBS+1％Albumax II)的恒定1ml/分钟流体。压力上限可以是例如999mbar。可替换地，也可以使用其它技术实现经过过滤单元的流动，并且可以是，例如，重力驱动。

在本发明的特定实施方案中，使用珠层并在恒压下，例如80-85cm水的恒压，和优选在约20-25℃的温度进行步骤a)。

当本发明用于过滤RBC的方法包括取得已保留在珠层中的RBC的步骤c)时，这个步骤可以例如通过差异倾析(例如，在通过重力倾析1-3分钟的几个步骤后)进行。

使用本发明用于过滤RBC的方法，在群体细胞水平上进行RBC分析，特别是iRBC分析。

在本发明的特定实施方案中，步骤d)和具体的RBC密度或寄生虫感染量确定，通过液相荧光定量方法或在吉氏染色后进行。加热RBC或感染寄生虫的RBC的荧光定量可以通过分别用PKH-26或SYBR-1染色而进行。通常使用计数器定量荧光强度，例如FLX-800计数器。

本文公开的任何方法可以体外进行。

在另一个方面，本发明涉及本文公开的用于过滤RBC方法的应用，其用于筛选能调节RBC和特别是受疟原虫属原生动物寄生虫感染的RBC变形能力，并且特别是诱导或增加其刚性的化合物，例如在如本文所公开的筛选能增加疟原虫-iRBC的刚性的化合物的方法中的应用。在优选的实施方案中，根据增加受感染RBC的保留率或保留比例的能力筛选化合物。本发明的过滤方法允许进行低通量筛选或中或高通量筛选。

在本筛选方法的特定实施方案中，筛选的化合物能与包括其皮质细胞骨架的RBC膜相互作用(至少是包括其皮质细胞骨架的iRBC膜)和/或进入RBC(至少是进入iRBC)，特别是穿过RBC脂双层(至少是iRBC脂双层)，或者与修饰的脂双层本身相互作用。

在本发明的特定实施方案中，这种用于筛选化合物的方法包括或由下述步骤组成：

-将本发明用于过滤红血球细胞的方法用于包含RBC的样品的两个等分试样，其中只有一个等分试样先前已经接触过待测试化合物，其中要测试化合物调节和优选增加RBC刚性的能力(未接触的等分试样作为内部对照)；和

-比较两个样本等分试样确定的RBC保留率或保留比例，其中RBC保留率的绝对数值或保留比例之间至少5％，优选至少10％和更优选至少15％的变化说明所述化合物能调节RBC的刚性/变形能力，并且其中与未接触化合物的样本等分试样所获得的RBC保留率或保留比例相比，接触化合物的样本等分试样所获得的RBC保留率(绝对数值)或保留比例至少5％，优选至少10％和更优选至少15％的增加说明所述化合物能增加RBC的刚性/降低RBC的变形能力。

在另一个方面，本发明涉及本文公开的用于过滤RBC的方法的应用，其用于筛选可以选择性与受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球细胞(iRBC)相互作用，并且特别地与环状-iRBC和/或配子体-宿主RBC，特别是成熟配子体-宿主RBC相互作用，并且适合于调节和特别地增加其刚性(降低其变形能力)和还适合于根据本发明增加这些iRBC在过滤单元中的保留率或保留比例的化合物。

因此，本发明的过滤方法可以用于筛选能特异性地降低环状-宿主RBC和/或配子体-宿主RBC(特别是成熟配子体-宿主RBC)的变形能力(即，增加刚性)并且因此诱导、增加和/或加快这些细胞在脾中的保留并可能从循环血液将这些细胞进行脾依赖性的清除。因此筛选的化合物可用于治疗疟疾。活性定义为化合物诱导或增加过滤介导的iRBC保留的能力。

在另一个方面，本发明涉及本文公开的过滤RBC的方法的应用，用于分离和/或检测具有异常并且特别是降低的变形能力的RBC的应用，例如用于与异常RBC变形能力和特别地RBC变形能力降低有关的临床病症的体外诊断/检测。

在本发明的特定实施方案中，如本文所公开的用于过滤RBC的方法，用于分离和/或检测来自患者的血液样本中的iRBC和特别是环状-宿主RBC和/或配子体-宿主RBC(例如成熟配子体-宿主RBC)，所述患者已经受疟原虫属原生动物寄生虫(例如热带疟原虫)感染。

在本发明的另一个特定实施方案中，如本文所公开的用于过滤RBC的方法，用于分离和/或检测与后天或遗传疾病相关的RBC，诊断或预诊断影响RBC变形能力的后天或遗传疾病，例如遗传性或遗传的球形红细胞症(即，用于分离和/或检测球形红细胞症)、椭圆形红细胞增多症、败血症、血红蛋白病(α或β地中海贫血、镰状细胞疾病和镰状细胞性状)、自免疫溶血性贫血、其它溶血性贫血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、其它红血球细胞酶)。

在本发明的另一个特定的实施方案中，如本文所公开的用于过滤RBC的方法，用于分离具有异常特别是降低的变形能力的RBC进行实验研究。

本发明的用于过滤RBC的方法还可以用于分析和/或分离RBC子群体，和特别是iRBC，特别是环状-宿主RBC和/或配子体-宿主RBC。

在本发明的另一个特定的实施方案中，如本文所公开的用于过滤RBC的方法用于测试对患者施用的抗疟疾药物的效果。在用药几小时或几天后，对从患者收集的接触药物的疟原虫感染RBC使用过滤方法，观察到的用药前和用药后取得的疟原虫-iRBC样本的保留率或保留比例的变化说明药物降低由脾进行的疟原虫-iRBC的变形能力-依赖性的疟原虫-iRBC保留或消除。

最后，因为实验RBC过滤是脾过滤功能最好的替代品，所以可以提供体外分析患者脾功能的有用的测试基础，并且特别是分析患有遗传或后天免疫障碍以及遗传或后天RBC疾病的患者脾功能的有用的测试基础。

实施例

实施例A.在人脾的慢速、开放微循环中热带疟原虫环状-感染红细胞的保留

患者、材料和方法

人类志愿者的超声造影。根据下述入选标准招募16名18-50岁健康男性志愿者：无动脉粥样化风险因素(即，动脉压力正常，不抽烟或无抽烟史，血清胆固醇水平正常)，无腹部外科手术史，无重大健康问题或过去无重大健康问题(体检正常，血清肌酸酐、AST和胆红素水平正常，和无HIV、HBV和HCV抗体)，通过传统超声和Doppler评价为脾微血管结构正常，和无红血球细胞疾病的临床或生物症状-包括血细胞数、血清触珠蛋白和血红蛋白电泳正常。研究得到Necker医院研究审查委员会的批准，书面的知情同意书可从所有参加人员处获得。以1ml/分钟的恒定注射速率皮下注射超声造影剂(Sonovue^o，Bracco，Milano，Italy)。使用Philips HDI 5000(Philips US，Bothell，WA，USA)进行超声造影。使用反向脉冲成像以低机械指数用线性变换器(L10-5)将脾成像，使微泡破坏降至最小¹⁷，成像在灌注开始后2分钟开始。每次图像获取重复3次，并且将原始数据传送至PC进一步定量。使用HDILab(Philips US，Bothell，WA，USA)为每个回放片段定量，HDI Lab是考虑了压缩图并且允许以线性单位定量的软件。根据位于被膜下区域中的感兴趣区域(ROI)计算信号强度。移动ROI位置，以补偿呼吸移动和皮下假象。将时间-强度曲线导出至Deltagraph(Red Rock软件，Salt Lake City，UT，USA)。使用双指数模型拟合数据。使用数据和模型之间的关联系数估计拟合的质量。

人脾的取得。如述⁷取得并处理脾脏。未修改治疗和外科手术护理，并且获得患者书面知情同意书。计划由IIe-de-France II研究调查委员会批准。出现与外科手术有关的30至90分钟的热缺血时，一旦病理学家对脾脏进行了肉眼检查，并且在需要时进行了实验前切片处理，即可向脾脏主动脉中插管。为转移至实验室，脾脏中充满冷的Krebs-白蛋白溶液。

寄生虫。如述¹⁹培育热带疟原虫Palo-Alto(FUP-CB¹³)、D10¹⁸和FCR-3。重复进行人无黑色素的黑素瘤细胞(C32)²⁰的盘选分离(panning)，直至获得多于5个iRBC每个C32细胞的细胞粘连率。扩增细胞粘连iRBC，并粗略地通过凝胶浮选同步化，直至历时少于16小时发生完全的再侵入，然后储存在液氮中，每份等分试样＞3ml。在脾脏刺激前7天内，将等分试样解冻，并允许寄生虫再侵入未感染RBC。在脾脏刺激前14小时内，通过凝胶浮选方法消除环状，并且成熟形式可以在刚刚收集(＜7天)和洗涤过的RBC中再次侵入，获得2-7％寄生虫感染量的7-40ml积压的RBC，其在导入灌注液前在RPMI中洗涤一次。

活体脾灌注。如述⁷在由受调节暖空气维持在37℃的Plexiglas腔室中进行离体-灌注脾实验。简而言之，在实验室中(冷缺血时间，60-90分钟)，将脾脏与灌注设备相连接，并通过将Krebs-白蛋白培养基流量历时40-60分钟从1ml/分钟增加至50-150ml/分钟而进行从6-10℃至337℃的渐进式加温。在这个适应阶段，将患者的RBC从脾脏冲出(在加温末期血细胞比容＜0.1％)。当脾脏温度到达35℃时，加入未感染的O+RBC(最终的血细胞比容水平为5-10％)并使其循环30至60分钟。使用iStat设备(Abbott实验室，abbott Ppark，ILL，USA)，每10-30分钟监控静脉、动脉和储备库中的葡萄糖、Na和K浓度、O₂和CO₂分压，和pH。在稳态时，关键的生理标志维持在下述范围：灌注液流速0.8-1.2ml/克灌注脾软细胞组织/分钟，脾被膜的温度为36.7-37.2℃，Na为135-148mEq/l，K为4-5mEq/l，葡萄糖4-12mmol/l，pH 7.2-7.35，血细胞比容4-10％，而动-静脉氧分压延迟为60-120mmHg。最后，在将正常RBC冲出5-10分钟后(引入iRBC前的血细胞比容＜0.2％)，将0.2-6％寄生虫感染量的＞32小时的裂殖体-iRBC(侵入后40±8小时)和＜14小时的环状-iRBC(侵入后7±7小时)的混合物引入循环系统2小时。在用Hoechst 33342(1∶1000稀释；Molecular Probes，LSR，Becton-Dickinson，France)为iRBC染色后，根据吉氏染色薄涂片或通过流式细胞仪分析而定量寄生虫感染量。使用CELLQuest软件(B ecton-Dickinson，France)分析数据。

寄生虫分阶段和计数。完全如述¹固定并处理脾脏组织。脾脏组织内的个体寄生虫核、细胞质和疟疾色素易于鉴别。根据下述标准划分iRBC阶段。环状-iRBC：浅褐色点(核)＜1μm，薄的蓝色细胞质或灰色圆形区域＜1/2红细胞大小。裂殖体-iRBC：浅褐色点＞1μm或＞1(？)，厚的蓝色细胞质的褐色点≥1/2红细胞大小。红细胞外寄生虫残余：褐色点周围没有红色染料。对于每个脾脏切片，在滤泡周围带和邻近≥3个滤泡的红髓中计数RBC。选择可以清晰地与白髓相区分的红髓、邻近的滤泡周和红髓进行计数。计数环状和裂殖体-iRBC并且每个脾脏位于约150张照片(至少4000个RBC)上。

透射和扫描电子显微镜。在灌注末期，将脾脏样本(1mm³)在4℃于补加CaCl2(0.05％)的0.08M甲次砷酸盐缓冲液中的2.5％戊二醛和1％多聚甲醛中过夜固定。对于TEM，将固定的样本用0.1M甲次砷酸钠缓冲液漂洗三次，用1％四氧化饿、1.5％铁氰酸钾的0.1M甲次砷酸钠缓冲液溶液在室温后固定1小时，并再用0.1M甲次砷酸钠缓冲液洗涤。将样本通过梯度系列的乙醇浴(25％至100％)并于室温在Epon812/氧化丙烯混合物中过夜，使样本脱水。在嵌于Epon 812中后，将样本在60℃聚合48小时。使用Leica ultracut UCT薄片切片机制备超薄片，并用在80kV操作的JEOL 1200 EX电子显微镜检查。对于SEM，将固定切片在0.1M甲次砷酸钠缓冲液中洗涤三次，每次10分钟，在1％(w/v)四氧化饿、1.5％铁氰酸钾的0.1M甲次砷酸钠缓冲液的溶液中后固定1小时。在25％、50％、75％和90％梯度系列的丙酮溶液中脱水10分钟(每次)。然后将样品在100％丙酮中脱水3×10分钟，之后用CO2进行临界点干燥。用22nm金钯为干燥的切片镀膜，用在5kV或7kV操作的JEOL JSM 6700F场发射扫描电子显微镜检查并拍照。用上方的SE检测器(SEI)和下方的二级检测器(LEI)获得图像。

RBC变形能力的测量。使用激光辅助光旋细胞分析仪(

Mechatronics，Hoorn，The Netherlands)，如前所述²¹，通过激光衍射器测量RBC和iRBC变形能力。RBC变形能力的单位，即伸长指数(E.I.)，定义为椭圆体衍射模式的两个轴之间差和这两个轴之和之间的比例。在切应力(0.3至30帕斯卡)的范围内评价红血球细胞变形能力，所述范围包括1.7Pa，其近似对应于循环14动脉侧的静脉压力，和30Pa，其在RBC需要挤压通过小的细胞间间隙时出现在脾的正弦曲线中。

红细胞表面免疫荧光试验。如述，进行该试验以检测表面iRBC寄生虫蛋白。从培育物制备PBS中悬浮的iRBC。用来自过免疫非洲成年人的血清(由P.Druilhe惠赠；用PBS/1％BSA 1∶100稀释)进行RBC表面寄生虫抗原的标记，然后用结合Alexafluor 488的羊抗人亲和纯化IgG(1∶200稀释；Molecular Probes，Eugene，OR)标记。寄生虫核用Hoechst 33342(1∶1000稀释；Molecular Probes)染色。将玻片插在Vectashield培养基(Vector实验室，Burlingame，CA)中。使用由Zeiss Axiovision软件控制的Axiocam HRc照相机，在Zeiss Axiovert 200M显微镜上获得图像(全部来自Carl Zeiss，Heidelberg，Germany)。

iRBC的表面碘化。将先前通过盘选过程在细胞C32上筛选的高度同步化的成熟阶段iRBC，通过结冷胶浮选技术富集至80％，然后用新鲜红细胞稀释(即，小于8天或8天的红细胞，优选小于8天的红细胞)，在下一循环获得约20％的环状-iRBC。使用乳糖过氧化酶方法²²进行表面碘化。在再侵入后14小时培育停止。依次用1％Triton X-10、2％SDS提取蛋白质。如述²²进行样品的蛋白酶处理(TPCK-处理的trypsin和a-chymotrypsin TLCK(Sigma))。在5-17.5％梯度丙烯酰胺凝胶上分离碘化的样品。使用Kodak Bio Max MS1膜进行自放射线照相。预染色的蛋白质标记物购自Life Technologies(Gaithersburg，Maryland)和NewEngland BioLabs Inc.(Beverly，Massachusetts)。

细胞粘连试验。如前所述²⁰，研究了iRBC对C32细胞的细胞粘连，其表达推定的受体分子CD36和胞内粘连分子1(ICAM-1)。总而言之，在25cm3的细胞培育摇瓶(Corning Incorporated，USA)中制备单层C32细胞。将以5x106iRBC/ml的浓度悬浮于pH 6.8的细胞粘连培养基中的RBC加入细胞培育摇瓶并通气(1％O₂，3％CO₂和96％N₂)15秒，并每5分钟轻轻摇动，在37℃孵育15分钟。在孵育结束时，轻轻将细胞培育摇瓶在RPMI 1640培养基中漂洗四次。单层固定在甲醇中，用2％吉氏染色剂染色，并通过显微镜检查。计数1000个黑素瘤细胞上粘连的iRBC的数目。用100个C32细胞上粘连的iRBC数目表示结果。

统计分析。我们使用student成对t-测试进行统计分析；p值＜0.05认为显著。使用WinNonLin软件(5.1版本；Pharsight Corp.，Moutain View，CA，USA)进行分区数据分析。

结果

人脾中的循环腔室

使用超声造影在16名志愿者中研究人脾的循环模式。开始注入造影剂后两分钟(即，一旦获得微泡的稳定浓度)，使用低机械指数脉冲反向成像研究脾脏。除了使用这种较低的声能外，随着脾脏持续接触超声波束，一定量的微泡被破坏。时间-强度曲线反映了信号强度的下降(图1，材料与方法部分)。显示出对于16名志愿者中实验延迟的最佳拟合的模型包括两个指数项(所有案例中的关联系数R2＞0.96)。双指数函数可以表示为N(t)＝V₁(C₀exp(-β₁t))+V₁2(B+(C₀-B)exp(-β₂t))，其中第一和第二项分别对应于慢速和快速流动腔室。C₀指初始微泡浓度，并且认为在两个腔室中相等。V₁和V₂表示相对分数体积(V₁+V₂＝1)，并且β₁和β₂分别表示每个腔室中的微泡平均粘度。对实验曲线的分析得到下述数值：每个单腔室指数曲线的Y截距(Y1₀和Y2₀)对应于C₀V₁和C₀V₂，其中1/β₁和1/β₂对应于指数-特征时间。在慢室中，慢室的平均(SD，范围)相对分数体积是70.6％(9.6，51.5-84.4)并且平均(SD，范围)相对分数流量是10.12％(4.40，3.99-16.47)(图1)。总之，这些观察结果强烈支持人脾双重微循环组织的存在(图1)，其中约10％的血液输入经过慢室流动(图1和6)。

通过离体-灌注人脾清除iRBC

用处于裂殖体阶段(侵入后40±8小时)或环状阶段(侵入后7±7小时)的高度同步化寄生虫培育物灌注离体-灌注人脾。对灌注液的连续吉氏染色薄膜显示，循环的裂殖体-iRBC和出人意料的，环形-iRBC寄生虫感染量迅速降低。在10和20分钟内，裂殖体-和环形iRBC寄生虫感染量分别降至其初始数值的4.5％(范围：0-12.9)和26.3％(范围：22.9-35.4％)(图2a)。裂殖体-iRBC的完全清除很迅速，尽管环状-iRBC寄生虫感染量下降的速率更慢并且到达平台期(图2a)。与裂殖体-iRBC相反，环形-iRBC在其表面既未显示出结节寄生虫蛋白，也未显示出碘化寄生虫蛋白质(图8)，并且在C32人黑素瘤细胞上和脾组织学检查都未注意到有细胞粘连(数据未给出)(图4)。

脾脏刺激揭示的环状-iRBC的不均一性

环状-iRBC的部分清除反映它们通过脾脏的较慢循环或其在脾脏中稳定的保留。为了阐释这个问题，将环状-iRBC制备物分开，一部分立即灌注进入脾脏，而第二部分在Krebs-白蛋白培养基中保持37℃(对照“脾原初”细胞)。开始灌注后四十分钟(即40次脾脏传代)，从灌注液收集未保留的细胞。这些“脾传代”和“脾原初”群体各自用不同的PKH标记、汇集并重新引入脾脏。接着使用流式细胞仪分析来自灌注系统的连续样本(图3)。“脾原初”环状-iRBC的评价(SD)半衰期(5.7±3.1分钟，两次独立实验)与先前6次试验中观察到的结果相似(参见结果的下一部分“iRBC清除的模型建立”)。相反，“脾传代”环状-iRBC未清除(图3b，c)。这表明环状-iRBC事实上由两个不同的子群体组成，一个保留在脾中而一个流走。环状-iRBC群体的这种与脾脏保留有关的不均匀性在我们的培育条件下长时间稳定，并且与灌注脾中引入的初始寄生虫感染量无关(图2a)。它还与寄生虫菌株无关，因为用D10获得了相似的结果。

图3a1-3.数据来自循环实验(a-f，图2和图7)或循环-再循环实验(e’和f’，图3b1和b2)。

iRBC清除的模型建立

使用单或双室模型，没有或有残留寄生虫感染量(平台期)，建立模型模拟灌注液中iRBC寄生虫感染量的动力学(图3a1-3)。无残留寄生虫感染量的单室模型具有描述裂殖体-iRBC动力学的最佳性能(图3a3)。灌注液中环状-iRBC的动力学通过“可保留的”子群体(～输入量的74％)和并存的”流通”子群体的自由循环(～输入量的26％)的一级清除阶段可得到最佳的描述(图3和表1)。

这个模型符合循环-再循环观察(参见前面部分)的结果，并且此外可以简单确定保留iRBC部分。这与上述作为论据的用于刺激的环状-iRBC群体的初始不均一性一致。“可保留”环状-iRBC子群体的平均清除半衰期(5.9分钟，CI95％；2.0-9.4)比裂殖体-iRBC的清除半衰期(2.8分钟，CI95％；1.5-3.9)高2倍，表明各自的清除机制至少部分不同。假设每分钟一个RBC穿过离体-灌注人脾，可保留环状-iRBC的5.9分钟的清除半衰期符合每次脾脏传代时可保留输入损失～11％的结果。

人脾中环状-iRBC的保留

在实验结束时，处理脾组织用于组织分析，并定量RP和滤泡周围带(PFZ)中环状和裂殖体-iRBC的分布(图4)。在吉氏染色(2.8％v.1.1％，p＝0.00009，图4a1-2)和过碘酸Schiff(PAS)染色(3.0％vs.1.1％，p＝0.007，图4b 1-2)部分，RP中环状-iRBC组织寄生虫感染量均显著高于PFZ中。RP中定义为比例(“组织寄生虫感染量”)/(实验结束时循环寄生虫感染量)的平均(CI_95％)环状-iRBC保留指数(3.7；1.9-5.4)显著高于PFZ中(1.4；0.8-2.0，p＝0.002，图4a3)。脾中环状-iRBC的评价总体保留指数(包括两个区域)是2.5。有趣的是，PFZ中环状-iRBC的保留指数接近1，表明-如先前对于接触青蒿琥酯的iRBC所观察到的⁷-与保留/处理区域相比，对于环状-iRBC而言，PFZ更是一个运输区域。在两个区域中，裂殖体-iRBC的评价保留指数都很高(＞8)，并具有在RP中保留更强的趋势。使用PAS，其可将静脉窦的奇特的螺旋状基底膜强烈染色²³，可以分析RP，特别是索、窦腔和窦壁近侧的子腔室中的环状-iRBC的分布(图4c1)。在索中观察到了大多数环状-iRBC(86.0±6.9％)，同时14.0±6.9％在窦腔中。明显地，直接接触静脉窦的PAS染色基底膜的环状-iRBC多于RP其它子腔室中(图4c2)。通过透射电子显微镜证实了无结节环状-iRBC距离窦基底膜和内皮间间隙非常近(图2b3和图4d1-2)。

iRBC的变形能力

使用LORCA测量环状-或裂殖体-iRBC群体的伸长指数(EI)。为了推测单个iRBC水平的变形能力，我们测定了不同寄生虫感染量(对于裂殖体为3％至80％，对于环状为4％至76％，图5A)时同步化群体的EI，并外推至100％寄生虫感染量。如所期望的，在所有切应力情况下，裂殖体-iRBC的伸长指数非常低(在30帕斯卡，80％寄生虫感染量时＜0.1)。在30帕斯卡(与脾正弦曲线中遇到的相似²⁴)，环状-iRBC的变形能力适度但显著低于共培育共灌注的未感染RBC(图4A)。在外推至100％iRBC群体时，环状-iRBC的平均(CI95％)EI是0.47(0.43-0.51)，而对照未感染RBC为0.58(p＜0.0001图4A3)。

讨论

本文使用的安全的方法为人脾生理学和疟疾病原生理学提供新的、相互连接的视角，并且提出新的范例，其中环状阶段群体是不均一的，变形能力较弱的部分保留在脾中。超声造影显示为双室微循环组织，10％的血液输入量流经慢室。环状-iRBC的主要部分由离体-灌注人脾快速清除。可保留环状-iRBC群体的5.9分钟的清除半衰期与每次脾传代输入中约10％的去除相符，与它们在慢速循环腔室中的保留一致。作为解释，环状-iRBC只在RP中沿着窦壁的近侧积累。环状-iRBC的变形能力适度但显著降低。那些环状很小，无结节，体外不会细胞粘连，而且除了PfEMP-1介导的保留机制以外，未显示出任何可观察到的寄生虫诱导的表面修饰。根据宿主细胞的新的生物物理性质，总体图片表明变形能力降低的环状-RBC保留在狭窄的内皮间间隙的上游(即，严紧刺激RBC变形能力的慢室微循环结构^11，25)，可能反映了微生物清除的初始机制。

除了一些例外情况^20，26，已经认为环状-iRBC是人热带疟原虫感染期间体内总寄生虫生物量的唯一循环组分²⁷。它们降低的变形能力为人所知已有几十年^15，28，但是似乎太过温和而不能触发脾保留。然而，实验和临床观察支持这种现象在急性人类疟疾期间发生的假设。活体外脾模型以与患者体内的清除速率相似的速率过滤接触药物的iRBC⁷，并且本文观察到的裂殖体-iRBC的有效清除进一步证实确认了这种实验装置。重要的是，近来对于死于热带疟原虫感染的严重疟疾的患者尸体解剖样本的研究报告了无结节iRBC无法解释的脾保留，脾中平均收留指数为2.19(与肝脏中的0.63相比)²⁹，与本文确定的2.5的保留指数一致。我们因此将这些解剖观察结果解读为在这些患者体内早期环状-iRBC脾保留的证据。我们的发现重新触及到了疟疾病原发生机理中的另一个难题。热带疟原虫感染的患者体内的寄生虫生物量，根据循环环状-iRBC计算，结果比根据HRP-2的血浆水平计算低2倍，其中HRP-2是成熟-iRBC释放的寄生虫蛋白²⁷。根据循环环状阶段估计的寄生虫生物量的相对不足可能由保留在脾中未检测到的环状-iRBC池所造成。特别重要的是，变形能力降低的环状-iRBC在脾中的保留与关联RBC遗传疾病患者体内RBC机械变形能力降低和脾清除的数据相符。事实上，脾-完整和脾切除地中海贫血患者体内基于LORCA的测量只提供了EI的近似值，低于该值时RBC在脾中发生保留，即30帕斯卡时为0.45³⁰。这与本文针对环状-iRBC估计的数值(30帕斯卡时0.47)非常接近。

因为LORCA测定RBC群体的EI，所以个体环状-RBC的EI分布(单或多态)和个体变异的程度未知。使用单细胞工具的变形能力研究已经记载，与来自相同培育物的未感染RBC相比，环状-iRBC的变形能力降低^{15，19，28，31}，并且此外证明了个体细胞之间较大的变异。多种寄生虫和/或宿主-细胞因素会导致环状-iRBC变形能力不均一的降低。红细胞群体已知为不均一的，循环红细胞表现出不同水平的成熟和衰老³²。对于寄生虫，有越来越多的证据表明表面分子阵列的个体裂殖子进行的异源表达暗示了在RBC裂殖子侵入时的配体-受体相互作用和分子释放^18，33。其中一些与红细胞的细胞骨架相互作用，并导致早期阶段宿主-细胞膜重新建模和侵入后的红细胞膜僵化^13，19。其它，比如环状表面蛋白-2²⁰主要与未感染RBC的表面相关，使其不可能直接参与环状-iRBC脾保留。

保留在脾RP中的环状-iRBC的最终命运如何：扩增还是毁灭？尽管认为RP索内的微环境对于RBC并不友好，但导致脾内再侵入的环状-iRBC完整的脾内成熟过程理论上能够发生³⁴。脾保留的环状-iRBC可能最终发生细胞吞噬，因为在静态体外实验过程中已经观察到环状-iRBC最终的细胞吞噬³⁵。脾中环状-iRBC的破坏预计对每个循环的体内扩增因子(IMF)产生影响，有趣的是，根据计数循环环状iRBC估计的患者体内的IMF(即3-16)^36，37低于根据理论再侵入率预计的结果(即18-24)³⁶。这种差异，通常解读为体内的无效侵入，也可视为由于部分环状-iRBC的脾保留/清除而导致的。无论脾内环状-iRBC的命运如何，它们的局部保留可降低寄生虫生物质，其在重要器官中几小时后会降低，比如在脑或肺中。

此外，脾中隐性环状-iRBC的保留可以解释为什么在急性疟疾中，只有少部分观察到的总RBC损失能归因于iRBC的逐渐损失³⁸，因为这是根据计数循环环状-iRBC而得到的，忽略了环状-iRBC的脾保留池。

因为它们均暗示着变形能力-感应机制，所以环状-iRBC的脾处理/清除和未感染RBC的脾处理/清除是相关的。已经阐述了脾RBC过滤和寄生虫扩增速率之间的关联^15，39，40，但是，在由热带疟原虫感染的人类中，未鉴别保留的进行脾过滤过程的iRBC群体。事实上，尽管已知成熟-iRBC可以通过隔离躲过脾过滤，但是并未认为患者外周血中见到的循环环状-iRBC可以脾保留。我们发现，在侵入后，热带疟原虫环状-iRBC立即进行脾保留，这一发现为RBC过滤和寄生虫扩增之间的联系提供了新的有力证据。我们因此推断RBC变形能力的后天或遗传性改变，以及脾的RBC保留阈值的后天或遗传性变异，可能影响热带疟原虫感染的临床结果。环状-iRBC的低水平脾保留可能导致寄生虫负荷快速增长，引起大脑疟疾或多器官衰竭，之后可能发展成为贫血和脾肿大。相反，RBC和环状-iRBC的高水平脾保留可能产生伴随脾内溶血性贫血的亚急性感染，并且容易发生急性疟疾，其常与明显的脾肿大相关。这可以解释为什么急性疟疾和大脑疟疾极少在相同患者体内同时发生。这个新概念引发了疟疾研究领域的转变，比如感染动力学的模型模拟、寄生虫负荷的估计、靶向RBC变形能力的辅助疗法⁴¹、急性临床形式的风险因素分析⁴²(包括患者年龄)，或与球蛋白遗传障碍有关的先天防护的研究。

实施例B.筛选可增加热带疟原虫环状-感染红血球细胞(环状-iRBC)的刚性的化合物的筛选方法实例

寄生虫培育。使用热带疟原虫(FUP)的Palo-Alto菌株⁴⁴。如前所述培育热带疟原虫环状-iRBC⁴⁵。总而言之，通过用5％(w/v)山梨醇(37℃5分钟)连续处理(至少两次连续处理)，以在4小时内获得完全再侵入而筛选环状阶段，从而将寄生虫同步化。然后在75cm²摇瓶中，在包含O+RBC完全培养基(RPMI 1640培养基，重碳酸盐，25mM谷氨酰胺，0.2％葡萄糖，100μm次黄嘌呤，10μg/ml庆大霉素和10％AB+未活化人血清池)而在37℃孵育，用1％O₂、3％CO₂和96％N₂的气氛处理30秒。

体外测试。通过悬浮在胶状溶液中而富集裂殖体(44至48小时)。然后使它们在37℃再侵入完全培养基中新鲜O+RBC(即小于8天或8天的O+RBC，优选小于8天的O+RBC)。开始孵育后十小时(环状-阶段RBC 80-90％时)，将待测试化合物加入培育物，然后进一步在37℃孵育2小时。在去除培育物上清(通过在1500转每分钟分钟5分钟)后，将细胞团重悬于PBS(血细胞比容水平为50％)并用于分析环状-iRBC的变形能力。

环状-iRBC变形能力的分析

用几个步骤进行变形能力评价(见图9)：

1.使用LORCA，设定平均EI降低10％为筛选阈值。

2.通过LORCA技术，利用更精确的技术分析，其能评价个体细胞水平的环状-iRBC的变形能力(利用LORCA，分析是在群体细胞水平进行的)，例如，通过微量吸管/光钳或微流体设备，对鉴定为能增加环状-iRBC刚性的化合物进行分析，这些技术允许更精确地评价EI离差，从而评价在接触所筛选化合物后保留在脾中的环状-iRBC的百分比。

3.可选地，使用离体灌注人脾模型测试少量候选化合物。

如前所述进行LORCA技术⁴⁶。这种方法的原理包括对RBC群体和未感染RBC群体施加切应力和恒温，所述群体悬浮于粘性溶液(5％聚乙烯吡咯烷酮的PBS溶液，37℃时的粘度＝30mPa.秒)并且导入位于两个同轴圆柱之间的间隙。一个圆柱体(外侧圆柱体)旋转而产生的剪切力导致RBC以椭圆体形式伸长。从激光二极管发出的激光光束穿过RBC或iRBC悬浮液，并由这些细胞衍射。投射到投射屏幕上的激光光束衍射模式由数字摄像机捕获并传送至计算机。然后软件将椭圆体衍射模式转换成数字数值：伸长指数(EI)。因此，变形能力单位定义为椭圆高度与[椭圆高度+宽度]的比例^46，47。这个数值是悬浮液中包含的RBC群体(感染RBC群体或未感染RBC群体)的平均IE数值。在剪切力范围内(0.3至30帕斯卡)评价感染RBC和未感染RBC的变形能力，所述范围包括1.7Pa(深部组织的微脉管中的剪切力)和30Pa(红髓窦中的剪切力)。如果考虑到寄生虫制备和储存所产生数据的步骤，使用一台LORCA，一个技术人员能每天测试30个化合物，即每周至少100个化合物。

实施例C.RBC和热带疟原虫-感染RBC(Pf-iRBC)的过滤，其作为脾过滤功能的替代

材料与方法

寄生感染的RBC：临床样本和培育物。如述⁶¹体外培育热带疟原虫(D10/3D7或FUP/Palo Alto菌株)。洗涤RBC并在4-8℃保存1-10天。收集后将患者血液中存在的Pf-iRBC在4-8℃保存，保存时间少于24小时。

正常RBC的来源和保存。RBC来自正常血液供体(血库，Rungis，France)。通过离心去除白细胞。RBC在4℃保存，并在保存少于8天后使用。

用多孔通道膜过滤

在引入Pf-iRBC前的15分钟内，用悬浮培养基(RPMI+4％白蛋白+5％)堵塞柱表面和膜。在以2％-2.5％血细胞比容悬浮于补加4％白蛋白和5％

的RPMI中后，使培育或“临床”Pf-iRBC流经用0.8-8μm宽通道灌注的24μm厚的聚碳酸酯膜(Sterlitech Corporation；见图10和11)。在34-37℃恒压下(80-85cm水)进行过滤。初步实验表明当通道直径≥3μm时流动不受影响，而直径数值≤1μm的孔则没有观察到流动。后续实验用2μm宽的通道进行。当通道宽度≥3μm时，为观察到Pf-iRBC的保留。从2μm宽通道膜流出的流量应为0.1-1ml/分钟。

取得“上游”和“下游”RBC子群体(如图10所阐释的)并离心(1500g，2分钟)，并使用获得的RBC细胞团定量。

珠过滤

在以2-2.5％血细胞比容悬浮于PBS或补加1％(Gibco)的RPMI中后，使培育或“临床”Pf-iRBC流经0.5-2mm厚、直径渐增(从2-12μm、5-15μm、15-25μm和大于40μm；见图12和13)的锡珠层(Industrie des poudresspheriques(IPS)，Annemasse，France)。过滤在恒压(80-85cm水)下在20-25℃进行。在引入Pf-iRBC前15分钟内用悬浮培养基(PBS+1％Albumax

)堵塞柱表面和珠层。初步实验表明对于由直径5-15或15-25或大于40μm的珠组成的薄珠层，没有发生Pf-iRBC的保留，或者只在用于保持珠层的吸头中的过滤膜处有保留。进一步的实验表明，只要层的厚度＞5mm，等重量的5-15μm和15-25μm混合物(后文称作“5-25μm层”)就可以诱导iRBC的保留。然后通过使用直径5-25μm的珠的7mm厚层而修正过滤方案。

使用直径5-25μm的珠，通道宽度(即珠间空间)在1.85μm(由三个直径5μm的珠并排放置形成的通道宽度)和9.4μm(由三个直径25μm的珠并排放置形成的通道宽度)之间变化。由三个直径7μm的珠并排放置形成的通道宽度是2.6μm(见图15B)。如果同等地表示每类不同直径的珠，直径5-7μm的珠占所用珠的10％。因此，通道的(0.1)³＝0.1％将是1.85-2.6μm宽。而且，产生既长(＞4μm)且窄(＜2.6μm)的通道的可能性很低。

将600μl 2-2.5％血细胞比容样品(对应于12-15μl细胞团)通过三通活塞引入珠层上游的密封回路(参见图16)。然后使用电子泵在8分钟内产生通过层的PBS-Albumax II恒定的1ml/分钟流量(8ml终体积)。压力上限为999bar。

基于离心的过滤。可供选择地，将用作过滤单元的含珠吸头调整为1.5至2ml Eppendorf管(见图18)，然后在1500-2500离心1-2分钟(直至全部样本流过)。通过相同的离心方法用600-800μl将珠层漂洗两次。如下所述获得上游、下游和保留的RBC子群体并处理以定量。

“上游”、“下游”和“保留”RBC子群体的取得：

-在过滤前保留至少300μl“上游”样本，离心(1500g，15分钟)，并使用获得的RBC细胞团定量；

-将流过珠层的包含RBC的8ml“下游”样本在1500g离心5分钟，并且使用由此获得的10-14μl RBC细胞团定量。

-在过滤过程结束时取得1.5ml Eppendorf管中的珠层。通过重力进行三步1-3分钟的倾析，从而取得包含小于3％珠的1-5μl RBC细胞团。

红血球溶解的控制。在选择的实验中，定量来自离心后的“上游”、“下游”和“保留”样本上清中的人乳酸脱氢酶(LDH)浓度，以确定红血球溶解程度。使用相似体积的悬浮培养基作为100％红血球溶解对照，其中已经用0.2％皂素溶解2-2.5％血细胞比容的RBC。

样本中疟原虫-宿主RBC或异常RBC的定量

吉氏染色：用10％吉氏染料为甲醇固定的薄涂片染色10分钟，并以2000个RBC为单位计数寄生感染的RBC部分。将结果用阶段-特异性的寄生虫感染量表示。

异常(经加热)RBC的基于荧光定量。在50℃加热5-20分钟前用PKH-26(红色荧光细胞连接子试剂盒；Sigma)为RBC染色。通过计数黑白照片上PKH-阳性RBC部分而进行定量。

寄生感染RBC的荧光定量。为了用寄生感染RBC的浓度表示结果(从而相当于吉氏染色涂片上的寄生虫感染量)，小心吸入三份4μl细胞团样本(来自上游、下游或保留样本)并用包含0.1％SYBR-1(SYBRgreen 1：Molecular Probes，Invitrogen，Carlsbad，CA)的裂解缓冲液(Tris20mM(pH 7.5)EDTA 5mM，皂素0.008％，Triton-X1000.08％)稀释。用FLX-800计数器(FLX-800微孔板荧光读板仪；Biotek instruments，Winooski，VT，USA)，在室温孵育30分钟后定量荧光强度。初步实验表明，寄生虫感染量和荧光强度之间为线性关联(见图19)。这种新的荧光方法提供的结果与参照的吉氏定量方法的结果相似，可估计从上游到下游(或从上游到珠层)寄生感染RBC浓度的降低(或增加)(见图20和21)。

结果

使用了两种不同的过滤技术(见图10-18)：

-用多孔通道膜的重力驱动过滤；和

-珠层过滤。

实验过滤与Pf-iRBC的明显保留有关(见表II)。

Pf-iRBC与过滤有关的保留显示出在离体-灌注人脾和患者脾内均具有强保留的特点。我们事实上观察到：

(i)滋养体/裂殖体(成熟形式)-寄生RBC的完全/几乎完全的保留(见表II和图21)；

(ii)环状-寄生RBC的部分保留(见表II和图21)；

(iii)成熟配子体-寄生RBC没有或部分保留(见表II)；

(iv)与来自患者外周血的环状-寄生RBC相比，来自体外培育的环状-寄生RBC的保留更强(患者血液中存在的环状-寄生RBC或者(i)尚未进行“IES刺激”(一个RBC平均每2-3小时穿过IES一次⁵⁴)或(ii)尽管进行了这种刺激，但变形能力/过滤能力足以保证循环)(见表II和图21)；和

(v)珠层-其几何尺度模拟优于多孔通道膜的脾红髓循环床(见图14和15)-显示出更好的模拟脾过滤特性，特别是没有红血球溶解(见表II)和RBC形状保持得更好。

经由珠层的实验过滤与加热RBC的显著保留(总保留)有关(见表II)，表示方法有潜力通用于几种RBC异常情况中。

根据本发明方法进行的RBC和Pf-iRBC的实验过滤(特别是如图10-18所阐述的)是生理/病原生理脾过滤的最佳可用替代方法。

保留在珠层中的RBC可以在过滤过程结束时通过非常简单的倾析方法取得，这为确定表型的RBC子群体的分子分析开辟了道路。

在患者外周血循环的Pf-寄生RBC，即环状-寄生RBC和成熟配子体-寄生RBC的两个阶段可能发生脾保留。因此降低循环Pf-iRBC变形能力的药物会触发/增加它们在脾中的保留。

高通量筛选方法是针对发现特异性降低Pf-iRBC变形能力的活性化合物的方法，并且实验过滤提供了方法来设置这种中/高通量筛选系统。活性定义为化合物诱导/增加过滤介导的Pf-iRBC保留(降低Pf-iRBC的可过滤能力)的能力。3个主要的筛选步骤，即，(i)接触化合物，(ii)过滤，和(iii)过滤前后寄生虫密度的计数，适于中至高通量筛选的限制。

表II

表II.以过滤器(多孔通道膜或锡珠层)中Pf-iRBC的百分比表示的保留率平均值(SD；范围)。使用下述公式计算以百分比表示的保留率：[(过滤单元下游的寄生虫感染量-过滤单元上游的寄生虫感染量)/过滤单元上游的寄生虫感染量]×100。(*)：配子体-寄生RBC自相矛盾的富集现象可能与成熟配子体-寄生RBC保留的变形能力和患者外周血中未感染RBC部分降低的变形能力有关。

通过短时间离心(1-2分钟×1500-2500g；见图18)进行的过滤引起的Pf-寄生RBC的保留率与通过参照的注射器-压力流过滤在密封回路中获得的保留率相似(见表III)。这个结果为这个实验步骤的自动化开辟了道路。

由液相荧光定量方法，根据寄生虫核酸SYBR-I染色确定的保留率^56-60，与通过计数吉氏染色图片对寄生虫密度参照定量而确定的保留率相关(见图19和20)。这种对于来自过滤器(例如，多孔通道膜或珠层)的上游和下游寄生虫密度的荧光定量方法为这个实验步骤的自动化开辟了道路。

表III

表III.保留在珠层中的Pf-iRBC的保留率(用百分比表示)平均值(SD；范围)(使用基于离心的过滤方法)。使用下述公式计算保留率：[(过滤单元下游的寄生虫感染量-过滤单元上游的寄生虫感染量)/过滤单元上游的寄生虫感染量]×100。

在特定的实施方案中，使用本文公开的实验过滤方法的本发明的筛选方法应该表现出下述特性：

a.过滤单元应该具有窄(0.2-2μm)而短(优选＜5μm)的孔；

b.读数应该基于包含在样本中待测试红血球细胞的浓度的变化(例如，不同阶段的Pf-感染红血球细胞)；

c.应使用小体积(1-100μl积压红血球细胞)样本；

d.经由过滤单元的流动应该是重力驱动或通过冲洗或吸取或离心或任何允许样本流经过滤膜的方法进行，优选以低血细胞比容(＜5％)进行；

e.应根据3个主要步骤的过程进行筛选：

-使培育的环状-或成熟配子体-寄生RBC接触微孔板中来自文库的已知或新的化学个体；

-通过过滤单元吸取部分体积的药物处理RBC，并在另一个微孔板中保存下游样本；

-通过自动化的方法平行进行上游和下游微孔板中寄生虫浓度的定量。结果用下游/上游浓度比例表示。然后将与内部未处理对照相比可引起这个比例显著降低的化合物视为阳性化合物(hit)；

f.尽管可以修饰过滤单元的本质，但是其结构应该适合于获取1μl至1ml保留RBC。

讨论

只有在成熟雄性和雌性配子体-寄生RBC存在于血液中时，疟蚊种才可以作为疟原虫种的宿主和载体。在用其它方法和工具的低传播区域，有疗效的抗疟疗法(基于青蒿素的组合疗法，ACT)已经表现出可以导致血液感染性降低。ACT减少可产生配子体的数目并直接杀死未成熟非循环-配子体的寄生虫。然而，ACT在成熟循环配子体中无活性¹。在地方病高发区域，很多人类客体携带成熟配子体但是没有症状：因为这些客体未经过治疗，所以ACT对于传播的影响有限。伯氨喹是对于成熟配子体有活性的唯一可用抗疟疾药物。尽管伯氨喹的大量用药已经在某些选定的领域成功，但是用药计划和对于G6PD-缺陷客体中的毒性使其不适于在非洲的地方病高发地区大规模使用¹。因此开发对于成熟配子体有活性，适合大量用药的新药物至关重要。

诱导成熟配子体-寄生RBC从循环血液中脾依赖性清除的化合物是开发为传播-阻断药物的候选化合物。这种药物事实上使配子体不能到达疟蚊，从而从传播循环中将其排除。

诱导环状-寄生RBC从循环血液进行脾依赖性清除的药物应该是快速作用药物，用于治疗临床突发病并防止发展成为重症疾病。去除环状阶段的Pf-iRBC(即，在成熟为Pf-EMP1表达滋养体阶段之前)可防止它们隔离在微动脉、毛细管和微静脉中。滋养体-和配子体-携带RBC的隔离与人体内热带疟原虫感染的严重临床症状密切相关。

表现出上述两种性质的药物会产生主要影响。

在治疗后几小时或体外接触药物后几小时收集的药物处理Pf-iRBC的实验过滤可以是用于药物敏感性表型确定的基础。对现有抗疟药物(例如，青蒿素衍生物)处理的Pf-iRBC的加速清除可能部分是由于其在脾内的变形能力依赖性的保留或破坏(例如，通过陷坑作用，pitting)而引起的。

因为可以浓缩环状-寄生RBC，所以如本文所公开的实验过滤可以提供用于诊断疟疾以及实验研究的廉价、用户友好的工具。

从更广的角度来看，实验过滤可以加速遗传RBC疾病的诊断或预诊断估计，所述疾病会影响RBC变形能力，特别是在用基因型/表型相关性不能进行诊断的时候。

因为实验RBC过滤是脾过滤功能现有最好的替代品，所以它可以为估计患有遗传或后天的免疫功能障碍以及遗传或后天的RBC疾病的患者体内脾功能的有用测试提供基础。

因为可以从珠层获得僵化的RBC，所以可以用现有的不同子群体(上游＝“母本”，下游＝“变形”和珠层中保留的子群体＝“不变形”)进行细胞、子细胞和分子水平的比较分析。这种新的过滤方法还易于自动化并可以清除或浓缩僵化RBC，在遗传或后天的RBC疾病(包括疟疾)中具有广泛的实验和医疗应用。

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Claims (46)

1.筛选能增加受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球细胞(RBC)刚性的化合物的方法，所述方法包含下述步骤或由下述步骤组成：

a)培育受所述寄生虫感染的RBC，并可选地和单独地培育未感染RBC，每种培育均在存在和不存在待测试化合物的情况下进行，其中测试所述化合物增加且具体为选择性增加受感染RBC(iRBC)的刚性的能力；和，

b)测定在存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC的变形能力，和不存在所述化合物的情况下培育的一种或几种iRBC的变形能力；和，

c)可选地，测量在存在所述化合物的情况下一种或几种未感染RBC的变形能力，和不存在所述化合物的情况下一种或几种未感染RBC的变形能力，

其中与在不存在相同化合物的情况下培育的iRBC相比，在存在化合物的情况下培育的iRBC的变形能力下降至少5％，优选至少10％，并且更优选至少15％，则表明所述化合物能增加iRBC的刚性。

2.根据权利要求1的方法，其中所述iRBC是环状-宿主RBC和/或配子体-宿主RBC，特别是成熟配子体-宿主RBC。

3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤a)使用的iRBC通过下述步骤获得：

-用iRBC，特别是用其中裂殖体阶段iRBC已经富集的iRBC培育物，感染RBC，优选小于8天的RBC，所述富集例如通过用凝胶溶液例如

处理而进行。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤a)和/或权利要求3的步骤之前进行下述步骤：

-例如通过一次或几次山梨醇处理而进行iRBC的寄生虫或裂殖体富集iRBC培育物的寄生虫的同步化，。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中

-筛选在存在所述化合物的情况下培育的未感染RBC的变形能力，其与在不存在所述化合物的情况下培育的未感染RBC的变形能力相同或者相差小于5％，和

-可选地，筛选在存在所述化合物的情况下裂殖体-iRBC的变形能力，其与在不存在所述化合物的情况下裂殖体-iRBC的变形能力近似相同或者相差小于5％。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中进行的所述筛选是低通量筛选或高通量筛选。

7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中在群体细胞水平和/或个体细胞水平测定RBC和iRBC的变形能力。

8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中RBC和iRBC的变形能力通过检电器、激光衍射计、微流体设备、微量吸管和/或光钳测定。

9.根据权利要求8的方法，其中激光衍射计是商业自动化仪器，优选为激光辅助光旋转细胞分析仪(LORCA；Mechatronics，Hoorn，Netherlands)或RHEODYN-SSD(Myrenne，Roetgen，Germany)，并且更优选LORCA。

10.根据权利要求8或9的方法，其中RBC和iRBC的变形能力在从0.3至30帕斯卡(Pa)的切应力范围内测定，包括1.7Pa和30Pa。

11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中iRBC的寄生虫感染量水平是占细胞群体的至少20％或30％，优选为占细胞群体的至少50％，并且更优选为占细胞群体的至少70％。

12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中通过参照伸长指数(EI)进行变形能力的测定。

13.根据权利要求12的方法，其中在100％寄生虫感染量，30Pa外推时，对于在存在所述化合物的情况下培育的iRBC，EI低于0.43，更优选低于0.42，则表明所述化合物能增加iRBC的刚性。

14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中所述未感染和感染RBC是人RBC。

15.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中所述寄生虫选自下组：热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、猪尾猴疟原虫、食蟹猴疟原虫、似卵形疟原虫、巴西疟原虫、许氏疟原虫和吼猴疟原虫，优选选自下组：热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫和三日疟原虫，和更优选选自下组：热带疟原虫和间日疟原虫。

16.根据权利要求1至15中任一项的方法，其中所述寄生虫是热带疟原虫，具体为热带疟原虫的Palo Alto I菌株。

17.根据权利要求1至16中任一项的方法，其还包括用离体灌注人脾模型和/或离体灌注猪脾模型验证筛选的化合物的步骤。

18.根据权利要求1至17中任一项的方法，其中所述筛选的化合物能与包括其皮质细胞骨架的iRBC膜相互作用和/或进入iRBC，特别是穿过iRBC脂双层，或者与修饰的脂双层本身相互作用。

19.根据权利要求1至18中任一项方法的应用，其用于筛选选择性地与受疟原虫属原生动物寄生虫感染的红血球细胞(iRBC)进行相互作用或者选择性地与环状阶段的iRBC和/或配子体-宿主RBC特别是成熟配子体-宿主RBC进行相互作用，并且适合于增加它们的刚性的化合物。

20.用于过滤红血球细胞(RBC)的方法，其使具有异常并且特别是降低的变形能力的RBC在过滤单元中保留，所述方法包含下述步骤或由下述步骤组成：

a)使包含RBC的样品流过过滤单元；

和

b)取得在流过过滤单元之前所述样本的等分试样(上游等分试样)和在流过过滤单元之后的所述样本的等分试样(下游等分试样)；和

c)可选地取得保留在过滤单元中的RBC(保留等分试样)；和

d)可选地分析上游和下游等分试样和，可选地，保留等分试样，并且特别地确定RBC或上游和下游等分试样和可选地保留等分试样中RBC子群体的密度。

21.根据权利要求20的方法，其中步骤d)还包括计算(i)过滤单元中的RBC保留率，例如使用下述公式：(下游等分试样中RBC或RBC子群体的密度-上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度)/上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度，或(ii)过滤单元中的RBC保留率，使用下述公式：下游等分试样中RBC或RBC子群体的密度/上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度。

22.根据权利要求20或21的方法，其中步骤d)包括确定上游和下游等分试样中的红血球溶解，以及可选地，确定保留等分试样中的红血球溶解，例如通过定量离心后的上游和下游等分试样，以及可选地，离心后的保留等分试样上清液中人乳酸脱氢酶(LDH)的浓度。

23.根据权利要求20至22中任一项的方法，其中样品包含具有降低的变形能力的RBC，特别是选自下述的RBC：

-受寄生虫感染的RBC，优选疟原虫属的原生动物寄生虫，和特别为环状-寄生iRBC或配子体-寄生iRBC，例如成熟配子体-寄生iRBC；

-经加热的RBC，和

-来自患者的RBC，所述患者患有遗传或后天的免疫机能障碍以及遗传或后天的RBC疾病，和优选来自患有下述疾病的患者的RBC：遗传性或后天的球形红细胞症、椭圆形红细胞增多症、败血症、血红蛋白病(α或β地中海贫血、镰状细胞疾病和镰状细胞性状)、自免疫溶血性贫血、其它溶血性贫血、酶缺陷(葡萄糖6磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶、其它红血球酶)。

24.根据权利要求23的方法，其中所述寄生虫选自下组：热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫、猪尾猴疟原虫、食蟹猴疟原虫、似卵形疟原虫、巴西疟原虫、许氏疟原虫和吼猴疟原虫，优选选自下组：热带疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫和三日疟原虫，和更优选选自下组：热带疟原虫和间日疟原虫，例如热带疟原虫的Palo Alto I菌株。

25.根据权利要求20至24中任一项的方法，其中步骤d)中分析的RBC或步骤d)中分析的至少一个RBC子群体是异常RBC或疟原虫感染RBC(iRBC)，和特别是环状-寄生iRBC或配子体-寄生iRBC，例如成熟配子体-寄生iRBC。

26.根据权利要求25的方法，其中步骤d)包括或由下述组成：

-确定上游和下游等分试样中寄生虫感染量的百分比，以及可选地，保留等分试样中寄生虫感染量的百分比；和

-可选地，计算(i)过滤单元中的RBC保留率，例如使用下述公式：(下游等分试样中RBC或RBC子群体的密度-上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度)/上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度，或(ii)过滤单元中的RBC保留率，使用下述公式：下游等分试样中RBC或RBC子群体的密度/上游等分试样中RBC或RBC子群体的密度。

27.根据权利要求20至26中任一项的方法，其中所述RBC是人RBC。

28.根据权利要求20至27中任一项的方法，其中样本的RBC已经接触过化合物，特别是能调节和优选增加RBC刚性的化合物，和例如可以特异性调节和优选增加iRBC刚性的化合物。

29.根据权利要求20至28中任一项的方法，其中已从血液样本获得RBC，并且优选获得自先前从患者获得的外周血样本。

30.根据权利要求28或29的方法，其中RBC先前已经在体外接触化合物，例如，通过在存在所述化合物的情况下体外培育RBC。

31.根据权利要求20至30中任一项的方法，其中过滤单元的通道的直径在1至10μm的范围中，并且优选在1.85至9.4μm或1至3μm的范围中，例如直径2μm。

32.根据权利要求20至31中任一项的方法，其中过滤单元的通道的厚度小于24μm，和优选小于5μm。

33.根据权利要求20至32中任一项的方法，其中由重力、冲洗、吸引或离心驱动通过过滤单元的流动。

34.根据权利要求20至33中任一项的方法，其中样品的血细胞比容较低，例如小于5％，并且更优选在2％-2.5％的范围内，所述样品优选悬浮在悬浮培养基中，所述培养基包含、由下述组成或主要由下述组成：补加4％白蛋白和5％

或1％albumax

的PBS或RPMI。

35.根据权利要求20至34中任一项的方法，其中过滤单元包含或由多孔通道膜组成，例如聚碳酸酯多孔通道膜。

36.根据权利要求35的方法，其中步骤a)由重力驱动并在恒压下进行，例如80-85cm水的恒压，并且优选在约34-37℃的温度进行。

37.根据权利要求20至35中任一项的方法，其中过滤单元包含或由一层或多层珠组成，并且优选锡珠，其中过滤单元中存在的珠的直径在2-25μm或5-25μm的范围内，并且其中在所述过滤单元中由珠间空间形成的通道优选在0.74和9.4μm之间或1.85μm和9.4μm之间变化。

38.根据权利要求20至35或37中任一项的方法，其中过滤单元中存在的每层珠至少为0.5-10μm厚，过滤单元中珠总厚度至少为5mm，优选7mm。

39.根据权利要求37或38的方法，其中通过过滤单元的流动是压力注射流或通过离心引起的流动。

40.根据权利要求37至39中任一项的方法，其中步骤a)在恒压下进行，例如80-85cm水的恒压，并且优选在约20-25℃的温度进行。

41.根据权利要求20至40中任一项的方法，其中步骤d)和特别是密度或寄生虫感染量确定通过液相荧光定量方法进行或者在吉氏染色后进行。

42.根据权利要求20至41中任一项的方法在用于筛选化合物调节变形和具体为诱导或增加红血球细胞(RBC)刚性的能力，特别是受疟原虫属原生动物寄生虫感染的RBC刚性的能力的方法中，例如在根据权利要求1至18中任一项的方法中的应用。

43.根据权利要求42的应用，其中化合物的筛选包括或由下述步骤组成：

-将根据权利要求20至41中任一项的用于过滤RBC的方法，应用于包含RBC的样本的两个等分试样，其中只有一个等分试样先前已接触过待测试其调节和优选增加RBC刚性能力的化合物；和

-比较两个样本等分试样确定的RBC保留率或保留比例，其中两个RBC保留率或保留比例之间至少5％，优选至少10％和更优选至少15％的差异表明所述化合物能调节RBC的刚性，并且其中与未接触化合物的样本等分试样获得的RBC保留率(绝对数值)或保留比例相比，对于已接触化合物的样本等分试样获得的RBC保留率(绝对数值)或保留比例中至少5％，优选至少10％和更优选至少15％的增加表明所述化合物能增加RBC的刚性。

44.根据权利要求1至18中任一项的筛选方法，其中RBC或iRBC的变形能力的测量使用根据权利要求20至41中任一项的过滤RBC的方法进行，优选参照RBC或iRBC保留率或保留比例。

45.根据权利要求20至41中任一项的过滤RBC的方法的应用，其用于分离和/或检测具有异常和特别是降低的变形能力的RBC，特别是用于实验研究和/或诊断或检测疟原虫感染RBC是否存在，例如环状-宿主RBC和/或配子体-宿主RBC，或者诊断或预知影响RBC变形能力的后天或遗传的疾病，例如后天或遗传性球形红细胞症。

46.根据权利要求20至41中任一项的过滤RBC的方法的应用，其用于患者脾功能的体外分析，和特别是具有遗传或后天的免疫功能障碍以及遗传或后天的RBC障碍的患者脾功能的体外分析。

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