DK167957B1 - Anvendelse af cyaninfarvestof til fremstilling af et diagnostisk middel - Google Patents
Anvendelse af cyaninfarvestof til fremstilling af et diagnostisk middel Download PDFInfo
- Publication number
- DK167957B1 DK167957B1 DK570487A DK570487A DK167957B1 DK 167957 B1 DK167957 B1 DK 167957B1 DK 570487 A DK570487 A DK 570487A DK 570487 A DK570487 A DK 570487A DK 167957 B1 DK167957 B1 DK 167957B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- cells
- labeled
- platelets
- use according
- red blood
- Prior art date
Links
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 title description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 title description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 155
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 53
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 24
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 16
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 14
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 13
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 9
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 9
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 claims description 9
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 6
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 5
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 3
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 claims description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 claims 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 claims 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 claims 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 80
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 16
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 15
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 15
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- -1 di-substituted methylenes Chemical class 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 7
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 7
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 7
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 7
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 7
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 7
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 5
- XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-hydroxyethyl)azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)CS(O)(=O)=O XCBLFURAFHFFJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N HEPPS Chemical compound OCCN1CCN(CCCS(O)(=O)=O)CC1 OWXMKDGYPWMGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N HEPPSO Chemical compound OCCN1CCN(CC(O)CS(O)(=O)=O)CC1 GIZQLVPDAOBAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 3
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 3
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 2
- FNPBHXSBDADRBT-UHFFFAOYSA-M 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].C[N+](C)(C)CCO FNPBHXSBDADRBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HSXUNHYXJWDLDK-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound CC(O)CS(O)(=O)=O HSXUNHYXJWDLDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 3-(n-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN1CCOCC1 NUFBIAUZAMHTSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 3-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound OCC(CO)(CO)NCC(O)CS(O)(=O)=O RZQXOGQSPBYUKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 2
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000001210 retinal vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 2
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 2
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 2
- LZXHHNKULPHARO-UHFFFAOYSA-M (3,4-dichlorophenyl)methyl-triphenylphosphanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(Cl)C(Cl)=CC=C1C[P+](C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 LZXHHNKULPHARO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 229940058020 2-amino-2-methyl-1-propanol Drugs 0.000 description 1
- UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-methylpropane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(C)CO UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000979 2-amino-2-oxoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- ACERFIHBIWMFOR-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-[(1-hydroxy-2-methylpropan-2-yl)azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound OCC(C)(C)NCC(O)CS(O)(=O)=O ACERFIHBIWMFOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SNKZJIOFVMKAOJ-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-propanesulfonic acid Natural products NCCCS(O)(=O)=O SNKZJIOFVMKAOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- 108700016232 Arg(2)-Sar(4)- dermorphin (1-4) Proteins 0.000 description 1
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N N-[tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCS(O)(=O)=O YNLCVAQJIKOXER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021204 NaH2 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000003441 Transfusion reaction Diseases 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 231100000131 acute cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N aminomethyl propanol Chemical compound CC(C)(N)CO CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000298 carbocyanine Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000005465 channeling Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-M propane-1-sulfonate Chemical compound CCCS([O-])(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008337 systemic blood flow Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000003582 thrombocytopenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
- A61K49/0058—Antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
- A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
- A61K49/0097—Cells, viruses, ghosts, red blood cells, viral vectors, used for imaging or diagnosis in vivo
Description
DK 167957 B1 i
Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af cyaninfarve-stof med formlen CH3 <»3 hvor Y er oxygen, svovl, methylen eller alkyl substitueret methylen, m er 0-3, og n er 12-22, til fremstilling af et 5 diagnostisk middel til brug ved fremgangsmåder til in vivo sporing af celler og fremgangsmåder til in vivo bestemmelse af cellelevetid.
In vivo cellesporing og levetidsbestemmelse kræver, at celler mærkes med en markør, som er stabil i cellen, dvs. ikke tabes 10 fra cellen, og som ikke indgriber signifikant i celle- funktionen. Hidtil anvendte markører kan ikke tilvejebringe de nødvendige karakteristika. Fluorescerende antistoffer f.eks. egner sig ikke, idet disse nemt dissocierer fra cellerne. Andre potentielle markører kan ikke anvendes, idet disse ind-15 griber i cellefunktionen.
Cyaninfarvestoffer blev brugt til forskellige biologiske anvendelsesområder. Dioxacarbocyaninfarvestoffer blev anvendt til differentialtællinger af hvide blodlegemer. Gunter Valet,
Max Planck Wissenschaftliche Gesellschaft; DE-patentansøgning 20 nr. 3238353, indleveret 15. oktober 1982, svarende til US-patentskrift nr. 4.751.188, Simultaneous Quantitative Determination of Blood Cells by Selective Staining and Measuring Volume and Fluorescens. De ved disse undersøgelser anvendte farvestoffer er imidlertid kortkædede carbocyaninfarvestoffer 25 (mindre end 10 carbonatomer) og reagerer på forandringer i membranpotentialer. Endvidere er de kortkædede carbocyaninfarvestoffer, der indtrænger i cellernes mitochondrier, cyto-toksiske og når cellerne vaskes, siver disse farvestoffer nemt ud af cellerne, hvad enten cellemembranpotentialet forandres 2 DK 167957 B1 eller ej. Andre kortkædede cyaninfarvestoffer anvendes til mahge andre biolo- giske undersøgelser. De kortkædede molekyler reagerer imid- lertid på membranpotentialer, krydser cellemembranen og træn- ger ind i mitochondrierne. Η. M. Shapiro, 5 U.S. patentskrift nr. 4.343.782. De kortkædede farvestoffer er også toksiske for celler og kan ikke anvendes til at spore celler in vivo.
Tricarbocyaninfarvestoffer (I. J. Fox et al., Proc. Mayo Clinic, 32, 1957, side 478-484) og Evans-Bluefarvestof (H. Schad 10 et al., Pfluegeres Arch. Eur. J. Physiol., 370(2), 1977, side 139-144) blev anvendt in vivo til at bestemme minutvolumen ved hjælp af en fortyndingsmetode. Dow ( Dow, P., Physiol. Rev., 36, 1956, side 77-102) beskriver metoden som injektion af en kendt mængde af nogle intravaskulære indikatorer på lungernes 15 veneside, og som måling af tidsforløbet i indikatorens arterielle koncentration, for at bestemme volumenet mellem injektionsstederne og prøvetagning. Disse farvestoffer anvendes ikke til celleindfarvning.
Der anvises her en anvendelse af cyaninfarvestoffer ved hidtil 20 ukendte cellesporingsfremgangsmåder, hvor cellerne først mærkes med et cyaninfarvestof og herefter injiceres i et individ, og hvor cyaninfarvestoffet anvendes til at lokalisere cellerne. Desuden bestemmes cellelevetiden ved at måle hastigheden af de mærkede cellers forsvinden.
25 Opfindelsen angår således anvendelse af cyaninfarvestof med formlen OO-' • CH3 hvor: Y er oxygen, svovl, methylen eller alkylsubstitueret methylen; ^ — # __ 3 DK 167957 B1 m er 0-3; og n er 12-22, til fremstilling af et middel til in vivo mærkning af celler, der er beregnet til in vivo diagnosticering.
Alkyl-substitueret methylen, som anvendes heri, betegner mono-5 eller di-substituerede methylener, med hvilken som helst kombination af methyl, ethyl eller propylsubstituenter.
Forbindelser med den ovenfor viste struktur, betegnes med den følgende almindelige anvendte kortformel:
DiYCn(2m+l) 10 P. J. Sims et al., Biochem., 13 (1974) side 3315. Således betegnes f.eks. forbindelsen, hvori Y er svovl og som har 3 car-bonatomer, der forbinder ringene og to alifatiske kæder med hver 14 carbonatomer, som DiSC14(3).
På lignende måde viser DiIC14(5) forbindelsen hvori Y er iso-15 propyl, og hvor fem carbonatomer forbinder ringene og som har to alifatiske kæder med hver 14 carbonatomer.
Indbefattet i disse forbindelser, der betegnes heri som cya-ninfarvestoffer, er forbindelser med den ovenfor viste struktur, der har en eller flere substituenter, med det forbehold, 20 at de substituerede forbindelser er opløselige i cellemærken-de medier, i det mindste den tid, der er nødvendig for mærkning, og at de har en tilstrækkelig høj membranfordelingskoefficient for at forblive bundet til de mærkede cellemembraner. Sådanne forbindelser skal ligeledes ikke indvirke signifikant 25 på cellelevedytigheden i de koncentrationer, der kræves til mærkning. Opløselighed i cellemærkende medier bestemmes, som vist forneden, ved at fordele et cyaninfarvestof i de mærkende medier og ved at måle fluorescensintensiteten i et tidsrum, ved hjælp af standardspektrofluorometrisk teknik. Aftagende 30 fluorescensintensitet tyder på farveudfældning og vedhæftning til beholdervægge. Om farvestofferne forbliver bundet til 4 DK 167957 B1 cellemembranerne bestemmes f.eks. ved at anvende kendte strøm-ningscytometriske procedurer, for at måle fluorescens intensiteten af røde blodlegemer, der injiceredes i donordyret efter mærkning. I alt væsentligt konstant fluorescensintensitet af 5 de mærkede celler efter injektion viser farvestabiliteten i cellemembraner.
Ligeledes indbefattet i forbindelser, der betegnes heri som cyaninfarvestoffer, er forbindelser med ovenfor viste struktur, der har inkorporeret et atom, som kan detekteres ved 10 hjælp af magnetisk resonansafbildning. Sådanne forbindelser fremstilles ved hjælp af kendt teknik, f.eks. ved at indbygge et fluoratom i en af de alifatiske kæders methylgrupper. Forbindelser med ovenfor viste struktur, der er forsynet med en γ-stråleudsender, såsom 125j, betegnes heri ligeledes som cya-15 ninfarvestoffer.
Cyaninfarvestoffer, der anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, kan erhverves fra forskellige leverandører, såsom Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, og kan fremstilles ud fra tilgængelige udgangsmaterialer ved anvendelse af kendte 20 syntesemetoder.
F. M. Hamer, The cyanine Dyes and Related Compounds, Intersci-ence Publishers (1964).
Ved udøvelse af opfindelsen kan hvilke som helst levedygtige celler mærkes med cyaninfarvestoffer. Som anvendt heri indbe-25 fatter udtrykket "celle" eukariotiske celler med en cellekerne, såsom hvide blodlegemer, forskellige tumorceller, andre pattedyrsceller (f.eks. vævskulturer af kinesiske ham-steræggestokceller), gær; og celler uden cellekerne, såsom røde blodlegemer og blodplader. En celle med cellerkerne er 30 levedygtig, hvis den er i stand til at vokse eller virke i alt væsentligt som forventet for celler af denne type; en celle uden cellekerne er levedygtig, hvis den er i stand til at udføre dens forventede funktioner, f.eks. er et levedygtigt 5 DK 167957 B1 rødt blodlegeme i stand til at transportere oxygen og carbondioxid; levedygtige blodplader arbejder i alt væsentligt som forventet ved f.eks. aggregationsundersøgelser og frigivelsesundersøgelser .
5 Cellemærkning udføres i et medium, som er ikke lethal for celler, og som egner sig til reproducerbar cellemærkning. For at opnå mediet med de nødvendige karakteristika anvendes osmola-ritetsregulerende midler, i hvilke cyaninfarvestoffer danner stabile opløsninger i det mindste så længe som det er nødven-10 digt til mærkning. Acceptable osmolaritetsregulerende midler indbefatter midler, såsom sukkerarter, f.eks. monosaccharider, såsom glucose, fructose, sorbose, xylose, ribose, og disaccha-rider, såsom saccharose, sukkeralkoholer, såsom mannitol, glycerol, inositol, xylitol og adonitol, aminosyrer, såsom glycin 15 og arginin, og visse Good's puffere, såsom N-tris-(hydroxymethyl) -methyl-3-aminopropansulfonsyre. (N. E. Good et al., Biochem. 15, 467-477 (1966), N. E. Good og S. Izawa, Methods Enzymol., 24, del B, 53 (1968), W. J. Feguson et al., Anal. Biochem. 104 (1980) side 301-310). Nogle cellelinier kan imid-20 lertid være følsomme for en eller flere af de osmolaritetsre-gulerende midler, navnlig sukkeralkoholer. Således gennemføres standardundersøgelser før mærkningen for at sikre, at cellerne er levedygtige i det tiltænkte osmolaritetsregulerende middel. Endvidere kan mindre mængder puffermidler sættes til det mar-25 kerende medium for at regulere hydrogenionkoncentrationen.
Virkningen på cellelevedygtighed efter udsættelse for diverse osmolaritetsregulerende midler bestemtes ved at måle fordoblingstiden af Yac-celler efter cellerne blev udsat i 30 minutter for en række osmolaritetsregulerende midler. Yac-celler er 30 muselymfomavævskulturcellelinier, der kan leveres fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og er beskrevet i European Journal og Immunology 5 (1975) side 112-117. Som dataene i tabel 1 viser, resulterer udsættelse for saccharose, glucose og Good's pufferne: TAPS, CAPS, EPPS, HEPPSO og DIPSO, 35 sammenlignet med pufret saltopløsning, i negligerbare virknin- 6 DK 167957 B1 ger på cellefordoblingstid, hvilket tyder på fravær af udsættelsesbetinget celletoksicitet.
\ 7 DK 167957 B1
Tabel 1
Osmolaritetrequlerende middel Fordoblinqstid (timer) phosphatpufret saltopløsning 31,0 saccharose 41,0 5 glucose 34,5 TAPS 32,7 CAPS 45,8 EPPS 32,2 HEPPSO 23,4 10 DIPSO 36,7 3-amino-l-propansulfonsyre 99,6 natrium 3-(N-morpholino)propan-
sulfonsyre (MOPS) A
2- amino-2-methyl-1,3-propandiol B
15 2-amino-2-methyl-l-propanol B
N-tris (hydroxymethyl) methy lamino-
ethansulfonsyre (TES) B
N, N-bis(2-hydroxyethyl)-2-amino-
ethansulfonsyre (BES) A
20 3-(cyklohexylamino)-2-hydroxy-1-
propansulfonsyre (CAPSO) A
triethanolamin B
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (TRIZMA) B
Bis-tris-propan B
25 2-(N-morpholino)ethansulfonsyre (MES) B
3- [dimethyl (hydroxymethyl) methy lamino] -
2- hydroxypropansulfonsyre (AMPSO) A
N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycin (BICINE) 57,7 3- [ (-3-cholamidpropyl)dimethylammonio]-
30 l-propansulfonat (CHAPS) B
3 - [N-tris(hydroxymethyl)methylamino]- 2- hydroxypropansulfonsyre (TAPSO) 63,6 3- (N-morpholino) -2-hydroxypropansulfonsyre (MOPSO) 178,4 35 2—[(2-amino-2-oxoethyl)amino]ethansulfonsyre (ACES) 1038,4 bis(2-hydroxyethyl)imino-tris-
(hydroxymethyl)methan (BIS-TRIS) A
2-(N-cyklohexylamino)ethansulfonsyre (CHES) 51,5
40 N-tris-(hydroxymethyl)methylglycin (TRICINE) A
glucosamin 288,4
imidazol B
glycylglycin 66,9 A - ingen vækst eller partiel cytotoksicitet 45 B - akut cytotoksicitet.
Tabel II viser forskellige osmolaritetsregulerende midler, som blev afprøvet med henblik på cyaninfarvestofopløselighed. Alle koncentrationsmålinger udførtes efter bundfaldet var fjernet 8 DK 167957 B1 ved hjælp af centrifugering og ved at opløse små portioner af osmolaritetsregulerende midler, der indeholder cyaninfarve-stoffer i ethanol til spektrofluorometrisk analyse. De anvendte farvestoffer var DiSC14(5) og DiOC14(3), og de osmolari-5 tetsregulerende midler var i iso-osmotiske koncentrationer. Nedsættelse i fluorescensintensitet i ethanol-standardopløs-ningen korrelerer direkte med nedsættelse i cyaninfarvestof-opløselighed.
9 DK 167957 B1
Tabel II
Relativ fluorescensintensitet (CONC)
Osmolaritetsreoulerende middel PiSC14 (5) Pioc14(3) 5 ethanol 100 100 glucose 31 100 fructose 35 loo sorbose 40 100 saccharose 41 100 10 xylose 36 19-52 ribose 24 100 lyxose 0,12 1,8 glycin 31 93 arginin 17 17,2 15 glycerol 39 99,5 inositol 42 92 xylitol 34 76,4 mannitol 29 *
adonitol 34 ND
20 tris (hydroxymethyl) -methylami-
nopropansulfonsyre (TAPS) 18 ND
3-(cyklohexylamino)-1-
propansulfonsyre (CAPS) 40 ND
N- (2-hydroxethyl) piperaz in-
25 N'-3-propansulfonsyre (EPPS) 18 ND
N-2-hydroxyethylpiperaz in-N'-
2- hydroxypropansulfonsyre (HEPPSO) 20 ND
3- [N-N-bis(2-hydroxyethy1)-amino]
-2-hydroxypropansulfonsyre (DIPSO) 43*** ND
30 NaCl 6 1,7 phosphatpufret saltvand 2,1 6,5
Na2S04 7,4 1,6
Nal 1,1 0,14 cholinchlorid 11** 6,3 35 cholinjodid 0,16 2,3 * udfælder ethanol, ingen data opnåelige.
** artifact, som skyldes for store krystaller, der ikke pelle-terer.
*** udfælder i ethanol (data tvivlsomme) 40 ND ikke bestemt.
Som man kan se fra tabel II er cyaninfarvestoffer betydelig mere opløselige i nærværelse af klassiske salte end i nærværelse af sukkerarter, undtagen lyxose, sukkeralkoholer, aminosyrer og Good's puffere, TABS, HEPPSO, DIPSO CAPS og EPPS.
45 Endvidere bestemtes stabiliteten af DiSC14(5) opløsninger i 10 DK 167957 B1 sukkerarter, såsom glucose, fructose, ribose, sorbose, saccharose og xylose, sukkeralkoholer, såsom glycerol, inositol, xy-litol og adonitol, og aminosyrer, såsom glycin og arginin. Cy-aninfarvestoffet var stabil i de undersøgte opløsninger i det 5 mindste i 20 minutter, som er tilstrækkelig tid for reproducerbar mærkning, og i mange af midlerne var mængden af cyanin-farvestof i opløsning ikke aftaget signifikant efter 60 minutter.
Endvidere måltes cyaninfarvestoffers opløselighed i et medium, 10 der indeholdt klassiske salte og er osmolaritetsregulerende stoffer, hvori farvestofferne er opløselige. Opløseligheden af DiSC14(5) i iso-osmotisk glucoseopløsning var ikke signifikant påvirket ved fortynding med destilleret vand. DiSC14(5) opløselighed i is'o-osmotisk glucoseopløsning var imidlertid sig-15 nifikant nedsat ved fortynding med kun ca. 20% iso-osmotisk natriumchloridopløsning. Således kan reproducerbar cellemærkning med cyaninfarvestoffer gennemføres i medier, der kun indeholder små mængder klassiske salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, calciumchlorid, natriumacetat, kaliumacetat, 20 natriumsulfat, natriumjodid, cholinchlorid eller cholinjodid og' fortrinsvis gennemføres mærkningen i et medium, der ikke indeholder klassiske salte som osmolaritetsregulatorer.
Celler, der mærkes med cyaninfarvestof, blev analyseret, for at bestemme mærkningens virk- ning på cellelevedygtighed.
25 V79-celler, som er tilgængelige fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og er beskrevet i D.M. Prescott, Ann. New York Acad. Sci., 397 (1982), side 101-109, mærkedes med en opløsning, der indehol- der DiOC14(3) i en koncentration på 10-5 eller 4 x 10“5 og de farvede cellers 30 vækstkinetik sammenlignedes med uf arvede cel- lers og en lige stor blanding af farvede og ufarvede celler. Cellefordoblingstiden var upåvirket af cyaninfarvestofmærk- ning. Således udviste mærkning ingen virkning på cellevækst. Også forskellige andre standardundersøgelser af celleleve- dyg-35 tighed, såsom Trypan Blue udelukkelse og Propidium lodide 11 DK 167957 B1 udelukkelse, bekræftede fraværet af virkning på cellelevedygtighed ved cyaninfarvestofmærkning ifølge de beskrevne fremgangsmåder .
Virkningen af cyaninfarvestofmærkning på cellelevedygtighed 5 bestemtes ligeledes ved at måle røde blodlegemers fragilitet. Mærkede og ikke-mærkede røde blodlegemer suspenderedes i na-triumchloridmedium af forskellig osmotisk styrke ved at forandre saltkoncentrationen. Cellernes rumfangsfordelinger måltes ved at anvende en Coulter Counter® med kanaliseringstil-10 behør. Gennemsnitlige rumfang bestemtes og registreredes for hver saltkoncentration, og rumfang forøgedes når natrium-chloridkoncentrationen nedsattes til ca. 0,5 g/100 ml, hvor volumenet viser et brat fald. Ved dette punkt lyseres de røde blodlegemer. Endvidere er volumenforandringerne de samme, hvad 15 enten cellerne mærkes med et cyaninfarvestof eller ej. På samme måde registreres hemolyse i parallelle prøver som en funktion af natriumchloridkoncentrationen. Efter de røde blodlegemer var anbragt i natriumchlorid i ca. 2-3 minutter, centrifugerede opløsningerne for at pelletere enhver ulyseret celle.
20 Supernatantopløsninger underkastes herefter spektrofotometrisk analyse, for at bestemme hæmoglobulinkoncentrationer. Lyseringsprocentdelen bestemtes ved at sammenligne hæmoglobinkoncentrationer i hver prøve mod en fuldstændig lyseret kontrol.
Fri hæmoglobinkoncentration var relativ lav, indtil der nåedes 25 ca. 0,5 g natriumchlorid/100 ml og herefter frigaves hæmoglobin omgående. Sammenlignet med fragilitetsresultaterne i røde blodlegemer korrelerede volumenforandringerne direkte med frigivelsen af hæmoglobin. Endvidere var hæmoglobinfrigivelsen den samme i mærkede og ikke-mærkede celler.
30 For at undersøge in vivo stabilitet af celler, der er mærket med det ifølge den foreliggende opfindelse anvendte cyaninfarvestof, fjernedes røde blodlegemer fra kanin, mærkedes med DiSC14(5) og reinfuseredes. Herefter opsamledes periodevis blodprøver og analyseredes for procentdelen af mærkede celler 35 og fluorescensintensitet af de mærkede celler. Antallet af 12 DK 167957 B1 cirkulerende røde blodlegemer faldt lineært som en funktion af tid og målingen efter 52 dage livstid af mærkede celler korrelerede tæt med den angivne gennemsnitlige livstid af røde blodlegemer i kanin ved dag 40 til 60. Således indvirkede 5 cyaninfarvestofmærkning ikke på clearancehastigheden af røde blodlegemer.
Hos alle undtagen en af de fem undersøgte kaniner var fluorescensintensiteten af de farvede celler i alt væsentligt uforandret 60 døgn efter mærkning og reinjektion. Hos det 10 femte dyr var ikke mere end 20% af cyaninfarvestoffet vandret væk fra de mærkede celler efter 60 døgn i kaninens blodcirkulation. Disse data sammen med data fra vævskulturer viser ingen overflytning af farvestof fra mærkede til umærkede celler og demonstrerer, at cellerne er stabilt mærkede med farve-15 stofferne.
Levedygtige celler, der er mærket med cyaninfarvestoffer, anvendes til in vivo cellesporing og in vivo cellelivstidsbestemmelse i pattedyr, indbefattet mennesker. Som anvendt heri indbefatter in vivo cellesporing bestemmelse af cellers loka-20 lisering i individets legeme og måling af hastigheden, hvormed celler passerer et bestemt sted, f.eks. hastigheden, hvormed celler strømmer gennem blodkar.
Overførte røde blodlegmers livstid bestemmes, ved at medtage i transfusionen en portion af cyaninfarvestofmærkede røde blod-25 legemer. Straks efter transfusion ved standardteknik udføres en bestemmelse af mærkede røde blodlegemers fraktion i den systemiske blodcirkulation. Herefter bestemmes procentdelen af mærkede celler, for at beregne livstid for de overførte cel ler. Endvidere adskilles posttransfusionsblødning fra immuno-30 logisk reaktion, ved at sammenligne forandringer hos fraktionen af mærkede celler med forandringer i hæmatocritten. Ækvivalente rater ved reduktion i pneumatisk og procentisk mærkede' celler, tyder på at blodtab skyldes blødning, hvorimod forholdsvis højere rater ved reduktion i mærkede cellers antal DK 167957 Bl 13 tyder på en immunologisk reaktion mod de overførte celler. For at undgå autofluorescens og selvudslukning gennem hæmoglobin, mærkes røde blodlegemer fortrinsvis med et cyaninfarvestof, som exciteres indenfor det røde bølgelængdeområde og tilbage-5 stråler længere væk fra det røde område, end excitationsbølge-længderne af hæmoglobin. Eksempler på sådanne farvstoffer indbefatter DiC14(5) og DiSC14(3).
Under anvendelse af lignende teknik, som den, der anvendes til røde blodlegemer, udføres in vivo livstidbestemmelser for 10 blodplader og skelnes mellem blødning og immunologisk reaktion, som skyldes thrombocytopenia. Idet blodplader mangler molekyler, som absorberer eller udstråler lys inden for de anvendte bølgelængder, anvendes en bredere vifte af cyaninfarve-stoffer til udførelse af blodplademålinger. Sådanne blodplade-15 livstidsbestemmelser udføres, for at skelne posttransfusionsblødning fra immunologiske reaktioner, idet man anvender den metologi, som beskrives ovenfor for røde blodlegemer, og målingerne anvendes til diagnosticering af arterosklerosis eller andre sygdomme, hvor de angrebne patienters blodplade-20 livstid afviger fra den af patienter, der ikke er angrebet af sygdommen. Endvidere anvendes de beskrevne fremgangsmåder til bestemmelse af andre cellers in vivo livstid, indbefattet hvide blodlegemer.
Ved in vivo cellesporingsanalyser mærkes celler med cyaninfar-25 vestoffer, som kan påvises eksternt. Sådanne eksternt påviselige farvestoffer indbefatter cyaninfarvestoffer, såsom 125I-mærket DiOC14(3). Cellesporing kan ligeledes gennemføres ved at anvende cyaninfarvestoffer med en nuklear magnetisk resonanssonde, idet man således er i stand til at anvende nuklear-30 magnetisk resonansafbildning til mærkede cellers lokalisering. Endvidere anvendes cyaninf arvestof fer nes fluorescens til cellesporing i områder af legemet, der er synlige fra legemets yderside. Mest almindeligt anvendes fluorescens til cellesporing i macula, retina og blodkar i øjet. Som beskrevet i de 35 følgende eksempler anvendes in vivo cellesporing, som indbe- 14 DK 167957 B1 fatter påvisning af primære ondartede tilstande og metastatisk malignante celler, til påvisning af infektionssteder, til afbildning af arterielle konstriktioner og til bestemmelse af transplantatudstødelse.
5 De følgende eksempler belyser den foreliggende opfindelse.
Eksempel 1
Fremgangsmåde til indfarvning af vævskultur cel ler.
I. Cellepræparation
Logfasevævskulturceller anvendes til opnåelse af de bedste rβίο sultater. Kultursuspensioner fjernes fra dyrkningsbeholderen og. anbringes i polypropylencentrifugeglas.
Når man anvender monolagkulturer skal supernatanterne fjernes og de vedhæftede celler vaskes med calcium- og magnesiumfri phosphatpufret saltopløsning for at fjerne serumproteiner fra 15 kolben. Trypsin-EDTA opløsning (Gibco Laboratories, Grand Island, New York, artikel nr. 610-5300) tilsættes, indtil kolbebunden er overdækket og får lov til at inkubere ved stuetemperatur indtil cellemonolaget er løsnet og opløst. Den resulterende cellesuspension overflyttes til et po lypr opy lencentr i-20 fugerør og et lige stort rumfang kulturmedium med 10% føtal kalveserum (FBS) (Hazelton) tilsættes, for at fastlukke tryp-sinets enzymatiske virkning. Cellerne centrifugeres ved 400 g i 10 min. ved stuetemperatur. Supernatanterne bortsuges og den resulterende cellepellet resuspenderes i et tilsvarende volu-25 men isoosmotisk mannitolop løsning. Denne mannitolskylning fjerner plasmaproteinerne fra cellesuspensionen og tilvejebringer celler til indfarvning. Cellerne centrifugeres en gang til ved 400 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanterne bortsuges, og den resulterende cellepellet resuspenderes i 30 mannitolopløsning med en koncentration på 2 x 106 celler/ml til indfarvning. Nogle cellelinier er imidlertid følsomme over for 15 DK 167957 B1 anvendelse af en sukkeralkohol (mannitol); i sådanne tilfælde kan anvendes en iso-osmotisk glucoseopløsning (MW 180,16, 54,05 g/1).
II. Fremstilling af farvestof stamoplysninger 5 2 x 10-3M stamopløsninger fremstilles som følger i absolut ethanol.
Di0-C14(3) MW 800 (1,600 mg/ml)
Dis-c14(5) MW 814 (1,628 mg/ml)
DiO-C18(3) MW 936 (1,872 mg/ml) 10 Dil-C14(5) MW 850 (1,700 mg/ml)
Alle farvestoffer er leveret fra Molecular Probes, Eugene, Oregon.
Fatvestofstamopløsninger behandles i ultralydbadet for at sikre fuldstændig opløsning af farvestoffet og at minimere ved-15 hæftning til rørene. Polystyrenrør anvendes til fremstilling af stamopløsninger, så at farvestoffets opløselighed kan iagttages. Polypropylenrør anvendes imidlertid til cellefarvning, idet cyaninfarvstoffer i et vandigt miljø har meget mindre tilbøjelighed til vedhæftning til polypropylen, sammenlignet 20 med polystyren.
III. Cellefarvning
Celler indstilles til en koncentration på 2 x 106 celler/ml i iso-osmotisk mannitol. For at farve celler sættes 2 x 10-3M farvestamopløsning til indfarvningsopløsninger med 5 μΐ farve-25 stof pr. 1 ml cellesuspension. Prøven, der skal farves, pipetteres eller indrøres, for at opnå en intim prøveblanding. Cellerne inkuberes med farvestoffet i 10 minutter, hvorefter en mindre portion fjernes til undersøgelse under et fluorescensmikroskop, for at sikre, at intens og ensartet farvning er 30 fremkommet. For DiO farvestofrækken anvendes mikroskopfiltre, 16 DK 167957 B1 som er selektive for 488 nm excitationslys, mens Dis og Dil farvestofrækken kræver excitation nærved 575 nm for at man kan se fluorescens.
Efter inkubationsperioden sættes et lige stort rumfang PBS til 5 suspensionen af indfarvede celler. Cellerne centrifugeres ved 400 g i 10 min. ved 20°C. Supernatanten bortsuges og pelleten resuspenderes i PBS. Centrifugeringsproceduren gentages, og den resulterende supernatant undersøges for tilstedeværelse af farvestof. Hvis farvestof findes i supernatanten gentages 10 vaskning, indtil supernatanterne er fri for ikke-bundet farvestof, som måles ved hjælp af spektrofluorornetri. Efter den sidste vask fjernes supernatanten, og pelleten resuspenderes til den ønskede koncentration i et passende dyrkningsmedium. Alle procedurer udføres under sterile forhold.
17 DK 167957 B1
Eksempel 2
Indfarvning af rade blodlegemer I. Fremstilling af reagens A. Citratantikoaoulant 5 1,66 g Nacitrat 0,206 g citronsyre 0,140 g NaH2P04 1,61 g glucose
De anførte bestanddele opløses i 63 ml destilleret vand og op-10 løsningen indstilles til en pH på 5,6. Den endelige opløsning føres gennem et 0,22 mikronfilter til sterilisering.
B. Iso-osmotiskglucoseopløsning
Glucose (54,05 g) opløses ill destilleret vand. Osmolarite-ten undersøges ved at anvende et Fiskeosmometer, og indstil-15 les til 320 mOsm om nødvendigt.
II. Fremstilling af farvestofstamopløsning
En stamopløsning på 2 x 10-½ Diic14(5) fremstilles ved at opløse 1,628 mg/ml farvestof i absolut ethanol. Ultralydsbehandling kan være nødvendig for at opnå en fuldstændig far-20 vestofopløsning.
III. Indfarvningsprocedure
Helblod opsamles aseptisk, ved at anvende vakuumbeholdere, som indeholder natriumcitrat, eller en sprøjte som indeholder fremstillet citratantikoagulant i en mængde, som svarer til 25 1/10 af sprøjtens totale rumfang. En lille portion beholdes for at udføre strømningscytometriske eller funktionalitetsun- DK 167957 B1 18 dersøgelse. Blodet centrifugeres ved 100 g i 10 min. ved stuetemperatur for at pelletere røde blodlegemer. Plasmaet, som indeholder blodplader, fjernes, og sættes til side, og de røde blodlegemer vaskes ved at tilsætte iso-osmotisk glucose i en 5 mængde svarende til 5 gange volumenet af den pakkede røde blodlegemepellet. Cellerne bør igen centrifugeres ved 100 g i 10 min. ved stuetemperatur, og supernatanten bortsuges. Denne vask, som fjerner plasmaproteiner og tillader en mere intens og ensartet indfarvning, gentages en gang til. Efter den sid-10 ste centifugering og bortsugning af supernatanten, resuspen-deres de røde blodlegemer i iso-osmotisk glucose til en koncentration på 4 X 108 celler/ml.
Før man tilsætter farvestof, bliver prøven pipetteret eller iblandet, for at sikre at bundfældning ikke forekommer. 15 15 mikroliter stamopløsning af DiSC14(5) (2mM i ethanol) sættes til hver ml suspension af de røde blodlegemer. Prøven blandes straks for at sikre en hurtig og ensartet fordeling af farvestoffet i opløsningen. Efter ca. 5 minutter fjernes en lille portion til mikroskopisk undersøgelse. Man tegner en ring på 20 et mikroskopobjektglas med voksstift og en lille prøve af cellerne i farveopløsning anbringes i voksringen. Et dækglas anbringes på objektglasset og prøven iagttages. Anvendelsen af voksringen nedsætter discocyte-echinocytomdannelse, som skyldes objektog dækglasset. Anvendelse af plastikobjektglas og 25 plastikdækglas vil ligeledes forhindre denne omdannelse. På denne måde kan man sikre sig, at de røde blodlegemers struktur bibeholdes ved farvningsproceduren, mens man sikrer sig, at intens og ensartet indfarvning er tilvejebragt. Celler bør være ensartet indfarvet efter 5 minutter og udsættelsestider, 30 der er længere end 10 minutter, bør ikke være nødvendige.
Efter at man har undersøgt, om cellerne er ensartet indfarvet, sættes et lige stort rumfang phosphatpufret saltopløsning til indfarvningssupensionen. Celler centrifugeres ved 400 g i 10 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes. Der 35 vil normalt findes synlige spor af ikke-bundet farvestof i 19 DK 167957 B1 supernatanterne efter centrifugering og derfor skal vaskeproceduren med phosphatpufret saltopløsning, som indeholder calcium og magnesium, gentages, indtil supernatanterne er fri for ikke-bundet farvestof, som målt ved spektrofluorometri.
5 Ved dette punkt kan celler enten suspenderes i en passende opløsning til undersøgelser eller blodpladefattige plasmer til reinjektion i et modtagerdyr. Til reinjektion er den almindelige fremgangsmåde, resuspendering af indfarvede røde blodlegemer i det volumen af plasma, som opnåedes ved den første 10 centrifugering af det indsamlede helblod og som blev centrifugeret ved 4000 g, for at fjerne blodplader. Alle procedurer gennemføres ved hjælp af sterile teknikker.
Eksempel 3
Indfarvning af blodplader 15 I. Celleprsoaration
Helblod opsamles i vakuumbeholdere, som indeholder natriumcitrat eller i sprøjter, som indeholder fremstillet natriumci-tratantikoagulant i en mængde, som svarer til 1/10 af sprøjtens totale rumfang. Cellerne centrifugeres ved 100 g i 10 20 minutter ved stuetemperatur, for at opnå blodpladerig plasma. Plastikpipetter og polypropylencentrifugerør anvendes til alle procedurer, som indbefatter blodplader for at undgå aktivering.
Det blodpladerige plasma bortsuges og overføres til et andet 25 centrifugerør. Blodpladerne udfældes herefter af plasma ved hjælp af centrifugering ved 1000 g i 10 minutter ved 20°C. Plasmaet opsamles herefter og sættes til side til enten funk-ti.onalitetsundersøgelse eller som et suspensionsmedium til rein jekt ionsf ormål. Dette plasma bør centrifugeres ved 4000 g i 30 10 minutter, for at sikre at alle resterende blodplader er fjernet, før anvendelse som et resuspensionsmedium, og beteg- 20 DK 167957 B1 nes som blodpladefattig plasma (PPP).
Blodpladepelleten, som fremkommer efter centrifugering ved 1000 g, bør resuspenderes forsigtig i et lille rumfang citrat-antikoagulans, for at opnå en koncentreret ensartet suspen-5 sion. Efter dette er gennemført, kan iso-osmotisk glucose herefter tilsættes som et fortyndingsmiddel, i en mængde, som svarer til det oprindelige tilstedeværende plasma. Blodpladerne centrifugeres herefter ved 300 g i 5 minutter, og superna-tanterne bortsuges. Denne glucosevaskning fjerner resterende 10 plasmaproteiner og tillader ensartet og mere intens indfarvning. Blodpladepelleten resuspenderes i glucoseopløsningen og er nu færdig til indfarvning.
Blopladekoncentrationen indstilles til 4 x 108 celler/ml og 15 μΐ stamopløsning af DiOC14(3) (2mM i absolut ethanol) tilsæt-15 ter pr. ml blodpladesuspension. Suspensionen blandes straks forsigtig og fuldstændig for at sikre lige fordeling af farvestoffet. Blodpladerne observeres under et fluorescensmikroskop for at sikre, at ensartet indfarvning er sket og i sådanne tilfælde, om disse nu er klar til adskillelse fra det ikke-20 bundne farvestof i suspensionen.
II. Anvendelse af Sephadex G-100 kolonne til adskillelse af mærkede blodplader.
Sepharose 2B blev almindeligvis anvendt for at isolere blodplader fra blodpladerig plasma. Man har nu fundet frem til, at 25 Sephadex G-100 ligeledes er velegnet til isolering af blodplader. Denne teknik anvendes sammen med indfarvningsteknolo-gien og virker på følgende måde. En blodplade-farvestofsuspension anbringes på kolonnen. De lavmolekylære farvestofmo-lekyler bliver indfanget i partiklerne, mens de store blod-30 plader passerer direkte gennem kolonnen. På denne måde kan Sephadex G-100 anvendes til adskillelse af fluorescensmærkede blodplader fra frie farvestoffer i suspension.
21 DK 167957 B1 A. Kolonnefremstillinq
Sephadex G-100 (Pharmacia Laboratories, Piscataway, New Jer-sey) hydratiseres ifølge leverandørens anvisninger, og vaskes i acetone (100%) for præparering til anvendelse som et præpa-5 rationsmedium for blodplader. Vaskeproceduren gennemføres ved at centrifugere Sephadex ved 300 G i 10 minutter ved stuetemperatur, og ved at fjerne supernatanten og resuspendere i Hanks afbalanceret saltopløsning. Sephadex bør gentagne gange vaskes med Hanks afbalanceret saltopløsning, indtil lugten af 10 acetonen ikke længere er detekterbar. Den resulterende opløsning afgasses ved at anbringe den i et bad med kogende vand eller under vakuum.
Sephadex opslæmningen hældes derefter i en kolonne. En 10 cm3 sprøjte uden stempel anvendes som kolonnemateriale. En silico-15 neslange anbringes på sprøjtens stempelrum og en lille indstil- lelig slangeklemme anvendes for at regulere væskens strøm gen- nem kolonnen. 47 μ nylonmasker anvendes som støttemateriale ved bunden af sprøjten for at tilbageholde Sepha-dexartiklerne. Konventionelle glaskolonner forsynet med glas-20 filterfritter bør undgås, idet disse kan aktivere blodpladerne. Kolonnen fyldes med Hanks afbalanceret saltopløsning og små mængder Sephadex opslæmning anbringes i kolonnen. Klemmen åbnes tilstrækkelig, for at tillade en langsom, men konstant gennemstrømning. Denne procedure pakker Sephadex jævnt og 25 ensartet og forhindrer, at der opstår luftkanaler. Proceduren ved tilsætning af HBSS og Sephadexopslæmning gentages, indtil den ønskede pakningsstør- relse af kolonnen er opnået. Kolonnen bør skyldes med HBSS (2 gange tomvolumen) før anvendelse.
B., Adskillelse af blodplader.
30 Blodpladefarvestoffet og suspensionen lægges forsigtig på Se-phadexmaterialet. Klemmen ved bunden af kolonnen bør være åben og vaskestanden i kolonnen tillades til at falde, indtil den når toppen af Sephadexopslæmningen. Gennemstrømning fortsættes 22 DK 167957 B1 for at tillade suspensionen at gennemtrænge Sephadexmateria-let. Herefter indskrænkes gennemstrømningen, når niveauet når toppen af Sephadexmaterialet. Tilstrækkelig HBSS tilsættes forsigtig på toppen af kolonnen, for at danne en puffer så at 5 yderligere HBSS nemt kan tilsættes uden at forstyrre Sephadexmaterialet. Igen genoptages gennemstrømningen af kolonnen. Ved at anvende denne metode, opnår man, at blodpladesuspensionen danner et afgrænset bånd i gelen og bevæger sig med en rimelig ensartet hastighed gennem hele søjlen. På denne måde opnås en 10 mere koncentreret blodbladeeluent. Gennemstrømning fortsætter gennem kolonnen og man opsamler 0,5 til 1,0 ml fraktioner. De blodpladeholdige fraktioner ville være synlige ved deres opa-citet og kan forenes. De forenede fraktioner centrifugeres herefter ved 300 g i 10 minutter. Supernatanten bortsuges og 15 pelleten kan resuspenderes i passende medium til undersøgelse eller analyse, eller blodpladefattig plasmasupernatant anvendes til funktionalitetsundersøgelser eller reinjektion.
Eksempel 4
Skelnen mellem oost-transfusionsblødning 20 οσ immunologiske reaktioner
Et lille antal røde blodlegemer fra hver blodenhed, som skal overføres, mærkes med en fluorescerende form af markørmolekylerne før infusion. Straks efter operation og blodtransfusion fjernes en lille portion venøst blod og en bestemmelse af de 25 procentisk mærkede (procentisk fluorescerende) celler udføres ved hjælp af strømningscytometriske eller spektrofluorome-triske metoder. Ved bestemte tidsintervaller efter den begyndende venøse aftapning fjernes yderligere portioner af blod og analyseres på lignende måde. Hvis interne blødninger finder 30 sted forandres forholdet af farvede og ufarvede celler ikke, selv om hæmatokritten er faldende. Hvis patienten udviser en post-transfus ionreaktion er de indfarvede celler (som er de overførte celler) fortrinsvis ødelagt og forholdet af farvede til ufarvede celler falder. Denne måling gør det muligt, at 23 DK 167957 B1 skelne mellem blødning og post-transfusionsimmunreaktioner.
Eksempel 5
Diagnose af idiopathisk thrombocytopenia
Fremgangsmåden er den samme som beskrevet i eksempel 4 med den 5 undtagelse, at blodpladelivstiden og blodpladedannelseshastig-heden bestemmes, således mærkes patientens egne blodplader (se eksempel 3) før infusion. Straks efter blodpladernes infusion fratages en lille portion venøst blod, og en bestemmelse af antallet mærkede (procentisk fluorescerende) blodplader pr. ml 10 udføres ved hjælp af standardstrømningscytometriske- eller spektrofluorometriske metoder. Til bestemte tidsintervaller efter den første venøse aftapning fjernes yderligere blodportioner og analyseres for procentisk positiv fluorescens. Afsætning af procentdelen indfarvede blodplader og ikke-farvede 15 blodplader som en funktion af tiden, giver klinikeren et mål for destruktionshastigheden af de mærkede blodplader og dannelseshastigheden af de umærkede blodplader. Hastigheden af dannelse eller nedbrydning af blodplader er et dynamisk mål for den thrombocytopeniske proces. På denne måde bestemmer 20 klinikeren, om det idiopathisk thrombocytopenialignende syndrom er på højde med blodpladedannelsen eller blodpladelivstiden.
Overførte blodplader mærkes ligeledes med disse farvestoffer. Endvidere gennemføres livstidsmålinger af donorblodplader på 25 samme måde som beskrevet for autologe blodplader.
Eksempel 6
Diagnose af arteriosklerosis
Diagnose af arteriosklerosis ved hjælp af denne fremgangsmåde baserer sig på hypotesen, at livstiden af en arteriosklerotisk 30 blodplade er kortere end livstiden af normale blodplader. En 24 DK 167957 B1 ringe mængde af patientens blodplader mærkes (ifølge anvisningerne i eksempel 3) med den fluorescerende, NMR eller radio-mærkende form af cellemarkørfarvestoffet.
Blodplader, der er mærket (for fremgangsmåden se eksempel 3) 5 med den fluorescerende form af molekylet reinjiceres og blodpladernes livstid bestemmes ved serielt venepunktur og bestemmelse af det resterende antal mærkede blodplader, som en funktion af tid (se eksempel 5). Blodpladelivstidsmålinger, der viser nedsat livstid, diagnosticeres ved arterosklerosis.
10 En anden diagnostisk fremgangsmåden er, at anvende en radio-isotopisk form af molekylet (γ-emitter) og at mærke patienternes blodplader in vitro (under anvendelse af fremgangsmåder, der beskrives i eksempel 3). Mærkede blodplader reinfuseres og enten måles blodpladernes livstid, ved hjælp af standardiso- 15 toptællingsmetoder, eller patienten afbilledes ved hjælp af et standard 7-kamera, for at bestemme om de mærkede blodplader hæfter sig til blodkarvægge.
Eksempel 7 Påvisning af primære tumorer eller metastaser 20 To forskellige cellulare metoder anvendes sammen med γ-emitter eller en NMR-følsom form af molekylet. Ved begge metoder anvendes tumorcellesøgende celler. En metode anvender aktiverede eller ikke-aktiverede lymfocytter og den anden metode anvender monocytter, som er neutrofil eller blodpladesporende.
25 Lymfocytter eller NK-celler aktiveres in vitro ved hjælp af kendt teknik under anvendelse af interleukin-2 eller et tilsvarende molekyle. Disse celler mærkes herefter med den radioaktive eller NMR-form af molekylet ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 1 og reinjiceres i patienten. Pa- 30 tienten anbringes herefter under det passende afbildningsudstyr, og lymfocytternes målsøgning registreres, for at loka- 25 DK 167957 B1 lisere tumorer af ukendt oprindelse.
Ved en lignende fremgangsmåde anvendes monocytter fra patienten, til afprøvelse i stedet for lymfocytter. Ved denne fremgangsmåde mærkes monocytter med human- eller musemonoklonalt 5 antistof, som er tumortypespecifikt, så at tumorcellegenken-delse bevares. G. Foris et al., Cell. Immuno. 78 (1983), side 276-284. Disse celler mærkes herefter med den radio-isotope-eller NMR-af bi Idende form af markørmolekylet og reinjiceres i patienten. Tidssekvensafbildning afslører hjemmestedet af 10 monocytterne.
Ved en anden fremgangsmåde til lokalisering af primære tumorer eller metastaser, mærkes monocytter, neutrofile celler eller blodplader, som beskrevet i eksempel 3, og anvendes til at opspore tumorer eller metastaser. Idet disse celler viser sig 15 tydeligt ved tumorstedet tillader afbildning af mærkede celler lokalisering af tumorerne.
Eksempel 8 Påvisning af infektionsstedet
Ved denne anvendelse følges sporet af neutrofiler fra patien-20 ten, som skal undersøges, fjernes og mærkes med den radio-isotope- eller NMR-afbildende form af markørmolekylet (fremgangsmåderne fra eksempel 1 og 2 anvendes til mærkning). Disse celler reinfusers herefter og afbildning af den neutrofile målsøgning ved hjælp af et γ-kamera eller nuklearmagnetisk af-25 bildningsteknik identificerer infektionsstedet. Sekventiel afbildning anvendes til identifikation af dynamiske forandringer i neutrofil ansamling og til registrering af forandringer som resultat af terapeutisk indgreb.
26 DK 167957 B1
Eksempel 9
Registrering af diabetisk retinopati ved hiælp af macula degenerationsreaistrerinq
Et ringe antal røde blodlegemer (type O eller autologe celler) 5 mærkes (se eksempel 2) med en form af markørmolekylet, som exciteres ved en bølgelængde af lys, der ligger uden for det synlige område (større end 700 nm). Cellerne injiceres herefter intravenøst i patienten. Ved hjælp af standardfluorescens retinalkameraer tages serielle fotografier af retinakarrene.
10 De celler, som bærer fluorescerende markører exciteres ved de passende bølgelængder og den udstrålede fluorescens opfanges på fotografisk film. Idet farvstoffet holdes tilbage i de røde blodlegemer og de røde blodlegemer ikke vil bevæge sig ud af vaskulaturen, af billedes alene fluorescensen af retinale blod-15 kar.
I en anden udførelsesform måles blodgennemstrømningshastigheden ved hjælp af en standarddobbeltstrålelaser excitations-apparat, som exciterer den samme celle i et kar ved to forskellige steder inden for dette kar. Afstanden mellem excita-20 tionspunkterne er imidlertid fastlagt. Fluorescens måles ved hvert excitationspunkt og den påkrævede tidslængde mellem de to excitationspunkter er et mål for strømningshastigheden af cellerne i karret.
Blodkarintegritet og blodstrømningshastigheder anvendes til at 25 måle maculadegeneration. Sådan et registreringsapparat anvendes til at bedømme graden af synssvækkelse og behandlings effektivitet hos diabetespatienter.
Eksempel 10 30 Påvisning af truende slagtilfælde hos patienter straks efter tidligere slagtilfælde.
27 DK 167957 B1
Blodplader fra patienten, der undersøges, mærkes (se eksempel 3) med en form af det markerende molekyle, som exciteres ved en lysbølgelængde, som ligger uden for det synlige område (større end 700 nm). De mærkede celler injiceres herefter in-5 travenøst i patienten. En standardfokuseret lyskilde (ved ex-citationsbølgelængde) rettes ned på et enkelt blodkar i det retinale leje. Fluorescens måles ved passende standardfokuserende optik og en lysforstærker. Lysforstærkerens udgangssignal digitaliseres og registreres i en computer. Fluorescens-10 intensiteten er et mål for antallet af enkle, dobbelte, tredobbelte osv. blodplader, som findes i venen. Forøget blod-pladeaggregation markerer høj risiko for et andet slagtilfælde.
Eksempel 11 15 Afbildning af arterial konstriktion
En radioisotopform af molekylet (γ-emitter) anvendes til mærkning af patientens egne blodplader in vitro (ifølge fremgangsmåden i eksempel 3) eller røde blodlegemer (ifølge fremgangsmåden i eksempel 2). Mærkede celler infuseres og patienten af-20 billedes ved hjælp af et standard γ-kamera, for at bestemme om blodkarrets volumen er forsnævret. Mærkning af de røde blodlegemer kan udføres med autologe eller type O-celler fra enhver donor.
Eksempel 12 25 Diagnose og stadiebestemmelse af arthritis
Radioisotope eller NMR-afbildende former af molekylet anvendes til at mærke (fremgangsmåden fra eksempel 1 eller 2) lymfocytter, monocytter ellet neutrofiler fra patienten, der skal undersøges. Disse mærkede celler reinfuseres herefter til pa-30 tienten og ophobning registreres ved standardafbildningsudstyr. Ved arthritis forventes monocytsporing at være mere nyt- 28 DK 167957 B1 tig, og ved degenerativ ledsygdom forventes lymfocytsporing at være mere nyttig. Dette tillader bestemmelse af antallet af febrile led og bedømmelse af terapiens virkning på patientens tilstand.
5 Eksempel 13
Hurtig bestemmelse af transplantatudstødelse
Lymfocytter, neutr of il legemer eller blodplader spiller hver en vigtig rolle ved transplantat- eller organudstødelse.
Patientceller fjernes og mærkes (ved at anvende fremgangsmåden 10 ifølge eksempel 1-3) med den radioisotope eller NMR-afbildende form af molekylet. Mærkede celler reinjiceres og sekventiel afbildning foretages på patienten. Ved eller før den tid, hvor der skal foretages reinjektion findes der en forøget stedfæstelse af den injicerede celletype i transplantatet, hvilket 15 påvises ved hjælp af denne metode.
Eksempel 14
Diagnose af multipel sklerose
Denne anvendelse har den samme metologi som eksempel 13, undtagen at lokalisering af celler i området af rygmarven eller 20 andre områder med højt myelinindhold bestemmes.
Eksempel 15 Måling af røde blodlegemers livstid, røde blodlegemer og blodvolumen Røde blodlegemers livstid bestemmes på samme måde, som beskre-25 vet ovenfor, ved skeining mellem blødning og post-transfusion-reaktion (eksempel 4). Den eneste forskel er, at patientens egne røde blodlegemer mærkes og reinjiceres. Antallet af mær-
Claims (16)
- 5 Massen af røde blodlegemer og blodvolumen bestemmes ved at indfarve et kendt antal røde blodlegemer (autologe eller type O) med den fluorescerende form af farvestoffet. Et kendt antal af farvede røde celler (109) injiceres i individet ved tid 0 og 5 minutter senere fjernes en portion blod. Fraktion af 10 mærkede celler bestemmes ved hjælp af strømningscytometriske-el.ler spektrofluorometriske metoder. Ud fra dette bestemmes fortyndingsfaktorer og det totale antal af celler pr. mm3, massen af de røde blodlegemer og blodvolumenet. De foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfindel-15 se er belyst ovenfor. Patentkrav.
- 1. Anvendelse af cyaninfarvestof med formlen (αΜ) πΓ® =( ΥΥΥ (Wri <®2>n-l . . · ch3 ch3 hvori J 20. er oxygen, svovl, methylen eller alkylsubstitueret methylen, m er 0-3, og n er 12-22, til fremstilling af et middel til in vitro mærkning af celler, der er beregnet til in vivo diagnosticering. DK 167957 B1
- 2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at cyaninfarvestoffet, som cellerne mærkes med, er forsynet med en γ-emitter eller en kernemagnetisk resonanssonde.
- 3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet 5 ved, at cellerne, der mærkes, er lymfocytter, naturlige dræberceller, monocytter, neutrofile legemer, røde blodlegemer eller blodplader.
- 4. Anvendelse ifølge krav 3, kendetegnet ved, at cellerne, der mærkes, er lymfocytter, naturlige dræberceller, 10 monocytter, neutrofile legemer eller blodplader, og at in vivo diagnosticeringen er en diagnosticering af primære eller meta-statiske tumorceller.
- 5. Anvendelse ifølge krav 3, kendetegnet ved, at cellerne, der mærkes, er neutrofile legemer, og at in vivo 15 diagnosticeringen er en diagnosticering af et infektionssted, hvorved de mærkede celler specifikt vekselvirker med en organisme, som inficerer individet, så at infektionsstedet bestemmes . 6. · Anvendelse ifølge krav 5, kendetegnet ved, at 20 cyaninfarvestoffet, hvormed cellerne mærkes, er forsynet med en 7-emitter.
- 7. Anvendelse ifølge krav 3, kendetegnet ved, at cellerne, der mærkes, er røde blodlegemer, og at in vivo diagnosticeringen er en diagnosticering af et individs retina for 25 tilstedeværelse af cyaninfarvestofmærkede røde blodlegemer for at påvise retinopati eller blodkardegeneration.
- 8. Anvendelse ifølge krav 3, kendetegnet ved, at cellerne, der mærkes, er monocytter, neutrofile legemer, lymfocytter eller blodplader, som er forsynet med en γ-emitter.
- 9. Anvendelse ifølge krav 8, kendetegnet ved, at DK 167957 B1 cellerne, der mærkes, anvendes sammen med afbildende metoder til bestemmelse af arteriel tillukning.
- 10. Anvendelse ifølge krav 8, kendetegnet ved, at cellerne, der mærkes, anvendes til stadiebestemmelse af ar- 5 thritis eller til overvågning af transplantat- eller organudstødelse .
- 11. Anvendelse af cyaninfarvestof med formlen ^2^-1 (C^n-l • Oi3 Oi3 hvori Y er oxygen, svovl, methylen eller alkylsubstitueret methylen, 10. er 0-3, og n er 12-22, til fremstilling af et middel til in vitro mærkning af celler ifølge krav 1 til anvendelse ved bestemmelse af cellers levetid in vivo i et individ, og til at måle hastigheden, hvormed 15 de mærkede celler bortkommer i individet.
- 12. Anvendelse ifølge krav 11, kendetegnet ved, at cellerne, der mærkes, er røde blodlegemer eller blodplader.
- 13. Anvendelse ifølge krav 11, kendetegnet ved, at cellerne, der mærkes, er røde blodlegemer, og at forsvin- 20 dingshastigheden af de mærkede blodlegemer sammenlignes med forandringer i hæmatokritten for at skelne mellem blødning og immunologisk reaktion mod de røde blodlegemer.
- 14. Anvendelse ifølge krav 11, kendetegnet ved, at de celler, der mærkes, er blodplader, og at forsvindingsha- DK 167957 B1 stigheden af de mærkede blodplader sammenlignes med totaltællingen af blodplader for at skelne mellem blødning eller nedsat blodpladedannelse og immunologisk reaktion mod blodpladerne.
- 15. Anvendelse ifølge krav 11, kendetegnet ved, at de celler, der mærkes, er blodplader, og at de mærkede blodpladers levetid bestemmes som et mål for atherosclerose.
- 16. Anvendelse ifølge krav 1 eller 11, kendetegnet ved, at cyaninfarvestoffets excitationsbølgelængde er uden for 10 det humane synlige spektrum.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/925,445 US4762701A (en) | 1986-10-31 | 1986-10-31 | In vivo cellular tracking |
| US92544586 | 1986-10-31 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK570487D0 DK570487D0 (da) | 1987-10-30 |
| DK570487A DK570487A (da) | 1988-05-01 |
| DK167850B1 DK167850B1 (da) | 1993-12-27 |
| DK167957B1 true DK167957B1 (da) | 1994-01-10 |
Family
ID=25451745
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK570487A DK167957B1 (da) | 1986-10-31 | 1987-10-30 | Anvendelse af cyaninfarvestof til fremstilling af et diagnostisk middel |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4762701A (da) |
| EP (1) | EP0266195B1 (da) |
| JP (1) | JP2872243B2 (da) |
| KR (1) | KR100298682B1 (da) |
| AT (1) | ATE125710T1 (da) |
| AU (1) | AU607165B2 (da) |
| CA (1) | CA1294545C (da) |
| DE (1) | DE3751434T2 (da) |
| DK (1) | DK167957B1 (da) |
| ES (1) | ES2076929T3 (da) |
| IE (1) | IE70749B1 (da) |
| IL (1) | IL84294A (da) |
| PH (1) | PH24539A (da) |
| PT (1) | PT86030B (da) |
| ZA (1) | ZA878116B (da) |
Families Citing this family (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3038339B2 (ja) * | 1988-05-02 | 2000-05-08 | ザイナクシス・テクノロジーズ・インコーポレーテッド | バイオ粒子の表面膜に対してバイオアフェクティング物質を結合する化合物 |
| US5135916A (en) * | 1989-06-12 | 1992-08-04 | Oklahoma Medical Research Foundation | Inhibition of complement mediated inflammatory response |
| FR2655546B1 (fr) * | 1989-12-11 | 1992-03-13 | Assistance Publique | Composition pour injection intratumorale, et utilisation pour le marquage prechimiotherapique et preoperatoire, en laserotherapie et en thermotherapie. |
| ATE171543T1 (de) * | 1991-07-16 | 1998-10-15 | Transmed Biotech Inc | Verfahren und zusammensetzungen für die gleichzeitige analyse einer vielzahl von analyten |
| CA2124329C (en) * | 1991-11-27 | 2008-11-18 | Gregory A. Kopia | Compounds, compositions and methods for binding bio-affecting substances to surface membranes of bio-particles |
| US5437274A (en) * | 1993-02-25 | 1995-08-01 | Gholam A. Peyman | Method of visualizing submicron-size vesicles and particles in blood circulation |
| AU6365894A (en) * | 1993-03-16 | 1994-10-11 | Alliance Pharmaceutical Corporation | Fluorocarbon compositions containing a visible or fluorescent label |
| US7255851B2 (en) * | 1994-07-01 | 2007-08-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal |
| US5650135A (en) * | 1994-07-01 | 1997-07-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal |
| US6649143B1 (en) | 1994-07-01 | 2003-11-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal |
| DE19500665A1 (de) * | 1995-01-12 | 1996-07-18 | Axel Prof Dr Haase | Verfahren zur ortsauflösenden Abbildung eines Bereiches eines biologischen Objektes mit Hilfe elektromagnetischer Strahlen unter Applikation von Kontrastmittel |
| CA2211470A1 (en) * | 1995-01-30 | 1996-08-08 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Diagnostic marker |
| DE19539409C2 (de) * | 1995-10-11 | 1999-02-18 | Diagnostikforschung Inst | Kontrastmittel für die Nahinfrarot-Diagnostik |
| US6004536A (en) * | 1995-11-14 | 1999-12-21 | Molecular Probes, Inc. | Lipophilic cyanine dyes with enchanced aqueous solubilty |
| US5804389A (en) * | 1995-12-29 | 1998-09-08 | Phanos Technologies, Inc. | Method for detecting abnormal epithelial cell shedding |
| DE19603033A1 (de) | 1996-01-19 | 1997-07-24 | Schering Ag | Perfluoralkylhaltige Metallkomplexe, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung in der NMR-Diagnostik |
| US8349602B1 (en) | 1996-04-19 | 2013-01-08 | Xenogen Corporation | Biodetectors targeted to specific ligands |
| US5672333A (en) * | 1996-05-13 | 1997-09-30 | Mallinckrodt Medical, Inc. | Delta1,6 bicyclo 4,4,0! functional dyes for contrast enhancement in optical imaging |
| US5723104A (en) * | 1996-05-13 | 1998-03-03 | Fung; Ella Y. | Monocyclic functional dyes for contrast enhancement in optical imaging |
| US5989835A (en) * | 1997-02-27 | 1999-11-23 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
| US6008010A (en) | 1996-11-01 | 1999-12-28 | University Of Pittsburgh | Method and apparatus for holding cells |
| ATE399568T1 (de) * | 1997-02-04 | 2008-07-15 | Phanos Tech Inc | Verfahren zur messung von epithelialzellenverlust |
| US6727071B1 (en) | 1997-02-27 | 2004-04-27 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
| EP0983498B1 (en) | 1997-02-27 | 2004-05-26 | Cellomics, Inc. | A system for cell-based screening |
| US7117098B1 (en) | 1997-02-27 | 2006-10-03 | Cellomics, Inc. | Machine-readable storage medium for analyzing distribution of macromolecules between the cell membrane and the cell cytoplasm |
| US5976502A (en) * | 1997-10-21 | 1999-11-02 | Gholam A. Peyman | Method of visualizing particles and blood cells containing a fluorescent lipophilic dye in the retina and choroid of the eye |
| US7294755B1 (en) | 1997-11-14 | 2007-11-13 | Cedars-Sinai Medical Center | Genetic modification of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies |
| ATE426036T1 (de) * | 1997-11-14 | 2009-04-15 | Cedars Sinai Medical Center | Transfektion und transfer nicht humaner mannlicher keimzellen zur generierung transgener nicht humaner saugetiere |
| US6734338B1 (en) | 1997-11-14 | 2004-05-11 | Cedars-Sinai Medical Center | Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies |
| US6986993B1 (en) * | 1999-08-05 | 2006-01-17 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
| US6351663B1 (en) | 1999-09-10 | 2002-02-26 | Akorn, Inc. | Methods for diagnosing and treating conditions associated with abnormal vasculature using fluorescent dye angiography and dye-enhanced photocoagulation |
| US6944493B2 (en) * | 1999-09-10 | 2005-09-13 | Akora, Inc. | Indocyanine green (ICG) compositions and related methods of use |
| US6443976B1 (en) | 1999-11-30 | 2002-09-03 | Akorn, Inc. | Methods for treating conditions and illnesses associated with abnormal vasculature |
| US6716588B2 (en) | 1999-12-09 | 2004-04-06 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
| ATE297981T1 (de) | 2000-01-11 | 2005-07-15 | Greenville Hospital System | Herstellung von vakzinen unter der verwendung von hybrid-zellen |
| US20090087450A1 (en) * | 2000-01-11 | 2009-04-02 | Greenville Hospital System | Combination therapy of hybrid cells with BCG injection for treating Cancer Patients |
| US20070212338A1 (en) * | 2000-01-11 | 2007-09-13 | Greenville Hospital System | Hybrid cells |
| US20030223935A1 (en) * | 2001-03-05 | 2003-12-04 | Gray Brian D. | Fluorescent membrane intercalating probes and methods for their use |
| WO2001066153A1 (en) * | 2000-03-03 | 2001-09-13 | Phanos Technologies, Inc. | Fluorescent membrane intercalating probes and methods for their use |
| US6689391B2 (en) | 2001-03-30 | 2004-02-10 | Council Of Scientific & Industrial Research | Natural non-polar fluorescent dye from a non-bioluminescent marine invertebrate, compositions containing the said dye and its uses |
| EP1383911A4 (en) * | 2001-04-02 | 2004-12-15 | Cytoprint Inc | METHOD AND APPARATUS FOR DISCOVERING, IDENTIFYING AND COMPARING BIOLOGICAL ACTIVITY MECHANISMS |
| US8521260B2 (en) * | 2002-12-02 | 2013-08-27 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Characterization of arteriosclerosis by optical imaging |
| US20060034943A1 (en) * | 2003-10-31 | 2006-02-16 | Technology Innovations Llc | Process for treating a biological organism |
| US7776529B2 (en) | 2003-12-05 | 2010-08-17 | Life Technologies Corporation | Methine-substituted cyanine dye compounds |
| AU2005285483A1 (en) * | 2004-08-05 | 2006-03-23 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for cell activation |
| TWI306401B (en) * | 2004-08-13 | 2009-02-21 | Nat Health Research Institutes | Benzothiazolium compounds |
| WO2006124816A1 (en) | 2005-05-11 | 2006-11-23 | Molecular Probes, Inc. | Fluorescent chemical compounds having high selectivity for double stranded dna, and methods for their use |
| AU2005234696B2 (en) | 2005-11-18 | 2012-02-16 | Phanos Technologies, Inc. | Fluorescent membrane intercalating probes and methods for their use |
| US11052141B1 (en) | 2008-10-02 | 2021-07-06 | Kode Biotech Limited | Method of modifying the immune response |
| GB2476767B (en) | 2008-10-02 | 2014-06-25 | Kode Biotech Ltd | Method of modifying the immune response |
| WO2012003334A2 (en) * | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Case Western Reserve University | Molecular probes for imaging of myelin |
| US20200193004A1 (en) * | 2018-12-12 | 2020-06-18 | Tesseract Health, Inc. | Biometric identification systems and associated devices |
| CN111334467A (zh) * | 2018-12-18 | 2020-06-26 | 北京大学 | 一种光磁双模态指示细胞，其制备方法，其检测方法及其在体内示踪中的应用 |
| US11737665B2 (en) | 2019-06-21 | 2023-08-29 | Tesseract Health, Inc. | Multi-modal eye imaging with shared optical path |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3673410A (en) * | 1969-06-25 | 1972-06-27 | John H Waite | Method of examination of cell samples using a radioactively tagged dye |
| US4343782A (en) * | 1978-04-20 | 1982-08-10 | Shapiro Howard M | Cytological assay procedure |
| US4424201A (en) * | 1978-11-28 | 1984-01-03 | Rockefeller University | Employment of a mereyanine dye for the detection of malignant leukocytic cells |
| US4311688A (en) * | 1979-10-29 | 1982-01-19 | Serono Laboratories Inc. | Composition and method for cancer detection in humans |
| US4401647A (en) * | 1980-03-03 | 1983-08-30 | The Regents Of The University Of Ca | Radiolabeled neoglycopeptides |
-
1986
- 1986-10-31 US US06/925,445 patent/US4762701A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-10-26 CA CA000550189A patent/CA1294545C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-27 IE IE287187A patent/IE70749B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-10-27 PH PH35986A patent/PH24539A/en unknown
- 1987-10-27 IL IL84294A patent/IL84294A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-10-28 AU AU80401/87A patent/AU607165B2/en not_active Ceased
- 1987-10-29 DE DE3751434T patent/DE3751434T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-29 AT AT87309555T patent/ATE125710T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-10-29 ES ES87309555T patent/ES2076929T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-29 ZA ZA878116A patent/ZA878116B/xx unknown
- 1987-10-29 PT PT86030A patent/PT86030B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-10-29 EP EP87309555A patent/EP0266195B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-30 JP JP62277257A patent/JP2872243B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-30 KR KR1019870012050A patent/KR100298682B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-10-30 DK DK570487A patent/DK167957B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK570487A (da) | 1988-05-01 |
| IE70749B1 (en) | 1996-12-30 |
| EP0266195B1 (en) | 1995-08-02 |
| IL84294A0 (en) | 1988-03-31 |
| ATE125710T1 (de) | 1995-08-15 |
| PH24539A (en) | 1990-08-03 |
| ZA878116B (en) | 1988-08-31 |
| DE3751434D1 (de) | 1995-09-07 |
| PT86030B (pt) | 1990-08-31 |
| IL84294A (en) | 1992-03-29 |
| AU8040187A (en) | 1988-05-05 |
| AU607165B2 (en) | 1991-02-28 |
| IE872871L (en) | 1988-04-30 |
| JPS63126833A (ja) | 1988-05-30 |
| DK167850B1 (da) | 1993-12-27 |
| DK570487D0 (da) | 1987-10-30 |
| EP0266195A1 (en) | 1988-05-04 |
| CA1294545C (en) | 1992-01-21 |
| ES2076929T3 (es) | 1995-11-16 |
| PT86030A (en) | 1987-11-01 |
| US4762701A (en) | 1988-08-09 |
| JP2872243B2 (ja) | 1999-03-17 |
| KR880005458A (ko) | 1988-06-29 |
| DE3751434T2 (de) | 1996-05-15 |
| KR100298682B1 (ko) | 2001-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK167957B1 (da) | Anvendelse af cyaninfarvestof til fremstilling af et diagnostisk middel | |
| US4783401A (en) | Viable cell labelling | |
| CA1294544C (en) | Cell growth rate determination | |
| Young et al. | Hemolytic reactions produced in dogs by transfusion of incompatible dog blood and plasma: I. Serologic and hematologic aspects | |
| Teare et al. | Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes | |
| JP6545198B2 (ja) | 周囲温度での血液サンプル中の代謝的に活性な細胞の安定化 | |
| Buckley et al. | Identification by fluorescent antibody of developmental forms of psittacosis virus in tissue culture. | |
| EP0639985A1 (en) | Method and composition for preserving antigens and process for utilizing cytological material produced by same | |
| Kazmierowski et al. | Herpes simplex antigen in immune complexes of patients with erythema multiforme: Presence following recurrent herpes simplex infection | |
| Yunis et al. | Cell Antigens and Cell Specialization: I. A Study of Blood Group Antigens on Normoblasts | |
| Bloch et al. | A comparison of the surfaces of human erythrocytes from health and disease by in vivo light microscopy and in vitro electron microscopy | |
| Ruppel et al. | Schistosoma mansoni: surface membrane stability in vitro and in vivo | |
| Schlegel et al. | [28] Phospholipid asymmetry of loaded red cells | |
| Sikpi et al. | Metabolic and ultrastructural characterization of guinea pig alveolar type II cells isolated by centrifugal elutriation | |
| Matthews | Serological techniques for plant viruses | |
| JPS6262292B2 (da) | ||
| CN87107218A (zh) | 体内细胞示踪 | |
| Baldini | Comprehensive three year progress report, August 1, 1975-October 31, 1978 | |
| Hiebl et al. | Influence of iodine-containing radiographic contrast media on the phenotype of erythrocytes from different laboratory animal species | |
| Naigaonkar | A manual of medical laboratory technology | |
| Rumbaut | Regulation of microvascular permeability by nitric oxide | |
| Crook et al. | Electrokinetic properties and surface membrane sialic acid status of platelets in idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) | |
| Levy et al. | Antigenicity of canine tissue cultures | |
| Kreier | A COMPARISON OF THE ANTIGENIC AND MORPHOLOGIC FEATURES OF ANAPLASMA MARGINALE WITH THOSE OF SEVERAL OTHER HEMOTROPIC PARASITES. | |
| Cassidy | The hematology of hog cholera |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed | ||
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |