ES2240417T3 - Procedimiento para la preparacion de vacunas mediante la utilizacion de celulas hibridas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de una vacuna contra el cáncer, que comprende: (a) poner en contacto una población de células neoplásicas con un primer colorante fluorescente, (b) poner en contacto una población de células que presentan un antígeno con un segundo colorante fluorescente, en el que dicho primer colorante es diferente a dicho segundo colorante, (c) poner en contacto dicha población de células neoplásicas y dicha población de células que presentan el antígeno una con otra en presencia de un agente que favorece la fusión celular, (d) purificar la población de células híbridas resultante mediante clasificación celular activada por fluorescencia, y (e) volver a poner en suspensión la población de células híbridas resultante en un vehículo farmacéuticamente aceptable; en el que dicha clasificación celular no implica la selección antibiótica o metabólica.

Description

Procedimiento para la preparación de vacunas mediante la utilización de células híbridas.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a células híbridas y a procedimientos para la preparación y utilización de células híbridas. Quizá la aplicación práctica más sustancial de las células híbridas consiste en la producción de hibridomas, que se utilizan para producir anticuerpos monoclonales. Además, se utilizan en varios casos con fines de investigación, pero su aplicación más amplia, por ejemplo, en un equipo de tratamiento clínico no ha sido práctica hasta ahora. Estas aplicaciones clínicas incluyen las vacunas celulares para el tratamiento o la prevención del cáncer y otros trastornos, así como la prevención del rechazo del trasplante. La presente invención responde a dichas carencias proporcionando procedimientos y reactivos que hacen realidad la aplicabilidad amplia de las células híbridas.

Aunque es un objetivo del tratamiento del cáncer durante más de medio siglo, los avances recientes en inmunología molecular convierten actualmente a la inmunoterapia en una opción verdaderamente viable para el tratamiento de pacientes con cáncer y con enfermedad metastásica. La década pasada ha visto la aprobación e introducción de varias estrategias inmunoterapéuticas para su utilización entre amplios límites contra varios cánceres metastásicos, Parkinson et al., en CANCER MEDICINE, 4ª ed., págs. 1213-1226 (Holland et al., eds. 1997). Quizá las estrategias mejor conocidas comprenden la terapia con IL-2 (Philip et al., Seminars in Oncology, 24(1 supl. 4): S32-8, feb. de 1997) y vacunas tumorales dirigidas contra el melanoma. Smith et al., Int. J. Dermatol. 1999; 38(7): 490-508. Aunque estas estrategias son eficaces contra algunos tumores, su potencia está limitada debido a que únicamente potencian la capacidad ya debilitada de las células tumorales para presentar sus epítopos "extraños" a los linfocitos T de CD8 y para generar de este modo una respuesta a los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos del tumor.

Inicialmente se utilizaron en inmunoterapia del melanoma maligno vacunas autólogas basadas en células tumorales completas. Dichas vacunas basadas en células tumorales completas presentan ventajas, porque contienen un gran número de antígenos, que eliminan la necesidad de dirigir la respuesta inmunitaria contra un antígeno al mismo tiempo. Esto es importante porque actualmente existe poca capacidad para identificar antígenos relacionados con tumores específicos (TAA) que sean útiles para provocar la regresión tumoral mediada por el sistema inmunitario. Boon et al., Immunol. Today 1997; 18: 267-268. Hasta la fecha, sin embargo, las vacunas autólogas solas basadas en células tumorales completas han demostrado únicamente algunos éxitos aislados o marginales. Smith et al., supra. Como se observa a continuación, el éxito marginal de las vacunas basadas en células tumorales completas procede probablemente de las mutaciones de las células tumorales que alteran su capacidad para actuar como células presentadoras de antígeno ("APC").

Las pruebas de muchos laboratorios de inmunología tumoral demuestran que las células tumorales persisten en parte porque han seleccionado una mutación que destruye parcial o completamente su capacidad para actuar como APC en el proceso de generación de linfocitos T citotóxicos, CTL. Stockert et al., J. Exp. Med. 1998; 187: 1349-1354; Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92: 11810-11813; Gabrilovich et al., Nature Med. 1996; 2: 1096-1103; Ishida et al., J. Immunol. 1998; 161: 4842-4851. Estas observaciones estimularon el desarrollo de estrategias que intentan sustituir las células tumorales como las APC, en lugar de tratar de potenciar el proceso de presentación del antígeno debilitado por el tumor. La mejor candidata para dicha sustitución es la célula dendrítica
("DC").

Las DC son células "profesionales" presentadoras de antígeno que desempeñan una función vital en la estimulación de las respuestas inmunitarias. Las DC no solamente pueden activar células cooperadoras CD4+ T naturales sino también estimular linfocitos T citotóxicos CD8+ no cebados. Steinman, R.M. Annu. Rev. Immunol. 1991; 9, 271-296; Macatonia, et al., J. Exp. Med. 1988; 169, 1255-1264; Mehta-Damani et al., J. Immunol. 1994; 153, 996-1003; Porgador et al., J. Exp. Med. 1995; 182, 255-260.

Debido a estas características, las DC han sido ampliamente estudiadas como células presentadoras de antígeno para la inmunoterapia del cáncer. Las DC se pueden cargar con antígenos tumorales pulsándolas con antígenos tumorales completos o con péptidos del antígeno tumoral. Young et al., J. Exp. Med. 1996; 183, 7-11; Mayordoma et al., Nat. Med. 1995; 1, 1297-1302; Bakkar et al., Cancer Res. 1995; 55, 5330-5334; Flamand et al., Eur. J. Immunol. 1994; 24, 605-610; Gong et al., Gene Ther. 1997; 4, 1023-1028; Song et al., J. Exp. Med. 1997; 186, 1247-1256; Specht et al., J. Exp. Med. 1997; 186, 1213-1256.

Se han utilizado células dendríticas pulsadas por péptidos o por lisado tumoral, por ejemplo, para pacientes vacunados contra el melanoma. Rosenberg et al., Nature Med. 1998; 4: 321-327; Wallack et al., Cancer 1995; 75:34-42; Bystryn, Rec. Results Cancer Res. 1995; 139: 337-348; Mitchell et al., Semin. Oncol. 1998; 25: 623-635; Morton et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1993; 690: 120-134; Berd et al., Semin. Oncol. 1998; 25: 646-653; Berd et al., J. Clin. Oncol. 1997; 15: 2359-2370.

Las DC cargadas con antígeno tumoral en tanto que cargadas con antígenos tumorales son capaces de provocar respuestas inmunitarias antitumorales, específicas del antígeno, tanto celulares como humorales. Shurin, M.R. Cancer Immunol. Immunother. 1996; 43, 158-164. Este enfoque, sin embargo, se limita a la aplicación contra los tumores que expresan conocidos antígenos tumorales. Véase, Haigh et al., Oncology 1999; 13, 1561-1573. Esto no es de aplicación en aquellos tumores sin antígeno tumoral identificado, como los tumores primarios de pacientes, que constituyen las situaciones mundiales más reales. Obviamente, se necesitan estrategias alternativas.

Un problema adicional con las técnicas que pulsan antígenos es que el sistema que presenta el antígeno de una APC actúa de manera más eficaz y eficiente cuando la proteína/antígeno se sintetiza dentro de la célula en lugar de fuera de la célula, un inconveniente sustancial de utilizar células pulsadas por antígenos. En un esfuerzo para evitar este problema, numerosos laboratorios han intentado utilizar la terapia génica para introducir antígenos tumorales específicos en el interior de las células dendríticas. Gong et al., 1997, Gene Ther. 4, 1023-28; Song et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1247-56; y Specht et al., 1997, supra. Sin embargo, este enfoque de terapia génica está también cargado de muchos inconvenientes, incluyendo: 1) la capacidad limitada para identificar todos los antígenos tumorales específicos importantes, 2) la capacidad limitada para cartografiar los genes de los antígenos tumorales específicos, 3) únicamente uno o un pequeño número de genes conocidos del antígeno tumoral se pueden introducir en la célula dendrítica y 4) el procedimiento lleva tiempo y es engorroso.

Por otra parte, las fusiones entre las DC y las células tumorales representan una vía alternativa para producir células presentadoras del antígeno tumorales eficaces al presentar las células inmunes con todos los posibles antígenos tumorales. Gong et al., Nat. Med. 1997; 3: 558-561; Wang et al., J. Immunol. 1998; 161, 5516-5524; Lespagnard et al., Int. J. Cancer 1998; 76, 250-258; Rowse et al., Cancer Res. 1998; 58, 315-321. Las DC se han fusionado con células tumorales y las células fusionadas presentaban de manera efectiva los antígenos tumorales a las células inmunes y estimulaban respuestas inmunitarias antitumorales específicas. Gong et al.; Wang et al.; Lespagnard et al., todos supra.

Estos esquemas de fusión, sin embargo, se basan en marcadores seleccionables (productos génicos que hacen resistentes a las células a toxinas celulares específicas o las permiten desarrollarse en determinadas condiciones metabólicas) en cada una de las DC y de las células tumorales para aislar el híbrido resultante. Los productos raros de la fusión celular se seleccionan mediante cultivos a largo plazo en presencia de ambas toxinas celulares en las que únicamente puede sobrevivir el producto de fusión, que contiene ambos marcadores seleccionables. Ya que los esquemas de introducción y selección que utilizan marcadores requieren cultivo y división celular múltiple, no pueden ser aplicados a las células dendríticas, porque las DC son células diferenciadas en el terminal, que no se dividen. Por lo tanto, no sorprende que el trabajo de fusión anterior se base en las líneas celulares tumorales bien definidas, que llevan dicho marcador y anticuerpos conjugados específicos de la DC y del tumor, que limitan la utilidad de esta estrategia en el tratamiento del cáncer.

En resumen, los protocolos de fusión anteriores basados en el cáncer presentan las limitaciones siguientes: 1) requieren líneas celulares tumorales demostradas que presenten marcador(es) específico(s); 2) requieren anticuerpos específicos celulares tanto de la DC como de la célula tumoral para seleccionar las células fusionadas; 3) la selección y expansión de las células fusionadas emplea una cantidad de tiempo poco práctica.

El área de prevención del rechace de trasplante que utiliza híbridos está aún menos desarrollada que el cáncer. De hecho, no se ha encontrado información sobre la misma.

Los procedimientos típicos para prevenir el rechace del trasplante utilizan fármacos inmunosupresores no selectivos que suprimen el sistema inmunitario completo. Abbas et al., CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, págs. 347-350. Dichos procedimientos presentan el inconveniente obvio de hacer sensibilizar más al paciente con respecto a los trastornos que de otro modo podrían haberse evitado mediante un sistema inmunitario intacto.

Se ha reconocido que, por lo menos, pueden tener lugar dos interacciones para que una célula presentadora del antígeno active un linfocito T. Estas interacciones se producen entre un antígeno con histocompatibilidad principal (MHC) cargada en el antígeno y el receptor del linfocito T, y entre determinadas moléculas accesorias y sus receptores afines en el linfocito T. La clase mejor estudiada de estas moléculas accesorias es la B7 (B7.1 y B7.2), que interactúan con CD28 y CTLA4 en los linfocitos T. Abbas et al., supra. Por lo tanto, la interrupción de la MHC o de la interacción accesoria comportaría una ausencia de respuesta útil, por ejemplo, en la prevención del rechazo de trasplante.

De hecho, la interrupción de la interacción de B7 no sólo impide una respuesta inmunitaria, produce tolerancia permanente a cualquier antígeno presentado durante la interrupción. Wei et al., 1996, Stem Cells 14: 232-38. Por lo tanto, en el contexto del rechazo de trasplante, el bloqueo de B7 produciría tolerancia, evitando el rechazo. El problema con dicho procedimiento, y la razón probable de que no se intente clínicamente, es que la tolerancia se aplicaría a cualquier antígeno presentado durante el tratamiento, no sólo a los antígenos del trasplante. En otras palabras, si un paciente estuviese expuesto a un patógeno durante la interrupción de B7, el sistema inmunitario del paciente resultaría tolerante al patógeno, de manera permanente. Esto impediría al paciente defenderse contra el patógeno, lo que quizás tiene consecuencias letales. Obviamente, se necesita un procedimiento más específico.

Un procedimiento prometedor se aprovecha de la presentación del antígeno por las células que carecen de moléculas accesorias, como B7. Estas células todavía presentan el antígeno en el contexto de la MHC, porque carecen de las interacciones accesorias necesarias para la activación, provocan tolerancia específica al antígeno presentado. Por lo tanto, es posible cargar estas células, que incluyen linfocitos B inmaduros (naturales), con un antígeno específico y producen la falta de energía específica del antígeno. Como en el ejemplo del cáncer descrito anteriormente, este procedimiento de antígeno por antígeno no tiene la aplicabilidad general necesaria para la utilización clínica práctica. Se necesita una metodología que sea aplicable a cualquier órgano de trasplante, independientemente de los antígenos inmunógenos que presenta el órgano.

En vista de lo anterior, es evidente que la técnica necesita procedimientos rápidos, de aplicación general para la producción y supresión de respuestas inmunitarias específicas a las células completas y reactivos específicos para llevar a cabo estos procedimientos.

Sumario de la invención

Por consiguiente, un objetivo de la invención consiste en proporcionar soluciones a las insuficiencias mencionadas anteriormente en la técnica.

La invención proporcionada según este objetivo es un procedimiento para la preparación de una vacuna contra el cáncer o de una vacuna antitumoral. El procedimiento de la invención implica poner en contacto por lo menos dos células diferentes en condiciones que favorezcan la fusión celular y a continuación purificar el híbrido resultante sin necesidad de selección antibiótica o metabólica. El procedimiento se realiza utilizando colorantes fluorescentes, como colorantes de cianina, y se aíslan los híbridos clasificando las células activadas por fluorescencia. El procedimiento implica la fusión de una célula dendrítica o de una célula presentadora del antígeno con una célula tumoral. El procedimiento se realiza preferentemente en menos de aproximadamente 48 horas. En las reivindicaciones se dan a conocer las formas de realización específicas de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra que las células híbridas según la invención, entre las células dendríticas y las células cancerosas son capaces de generar una respuesta a los linfocitos T citotóxicos específicos del tumor, que es aplicable a la inmunoterapia in vivo.

La Figura 2A representa la detección por FACS de los marcadores de presentación del antígeno en las células dendríticas de referencia. Se muestra una distribución normal.

La Figura 2B representa la detección por FACS de los marcadores de presentación del antígeno en híbridos de células dendríticas/tumorales. Se representa una distribución normal, en comparación con las células dendríticas de referencia, lo que significa que las células híbridas retienen todos los marcadores necesarios para la presentación del antígeno.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento rápido y eficaz para la preparación de células híbridas que son útiles en varias aplicaciones clínicas y no clínicas. Las células híbridas son útiles en regímenes de tratamiento que recurren al sistema inmunitario para tratar o prevenir el cáncer fusionando una célula cancerosa con una célula presentadora de antígeno. Se proporcionan también los kits para la generación de células híbridas y para poner en práctica los procedimientos de la invención.

Procedimiento para la preparación de células híbridas

La presente invención contempla un procedimiento para la preparación de células híbridas que es rápido, fácil de utilizar, y aplicable a células completamente diferenciadas, que no se dividen. El procedimiento de la invención implica poner en contacto por lo menos dos células diferentes ("células reactivas") en condiciones que favorezcan la fusión celular, y a continuación purificar el híbrido resultante ("célula producto") sin selección antibiótica o metabólica. En general, la purificación se realiza en un periodo de tiempo relativamente corto, por ejemplo, en menos de aproximadamente 24 a 48 horas, tras la exposición a condiciones que favorecen la fusión.

El procedimiento se realiza con la ayuda, por lo menos, de dos colorantes diferentes, que pueden ser colorantes fluorescentes. De este modo, el procedimiento puede comportar poner en contacto por separado, cada uno de los dos tipos de células que se deben fusionar con un colorante diferente. Este marcado por prefusión marca cada célula con un colorante diferente y permite la discriminación entre cada célula de fusión precursora y el producto híbrido de fusión: cada una de las células reactivas se tiñen con un colorante y las células producto se tiñen con ambos. De este modo, el producto híbrido de fusión se puede separar de las células reactivas, por ejemplo, mediante clasificación de las células activadas por fluorescencia (FACS) y similares.

Los colorantes útiles según la invención presentan la característica de asociación a una célula durante un tiempo suficiente para detectarlas en dicha asociación. Además, los colorantes útiles no disminuyen sustancialemente la viabilidad de las células, prefiriéndose una viabilidad de las células superior a aproximadamente el 50%. Normalmente, son colorantes fluorescentes. Una clase útil de colorantes comprende los denominados colorantes "de cianina". Los colorantes de cianina vienen en una variedad de tipos que proporcionan fluorescencia a diferentes longitudes de ondas de tal forma que se pueden detectar independientemente o conjuntamente cuando se asocian con una célula. Algunos colorantes de cianina se encuentran a título de ejemplo en Horan et al., patentes U.S. nº 4.783.401 (1998), nº 4.762.701 (1988) y nº 4.859.584 (1989), cuyas estructuras se incorporan específicamente a esta memoria como referencia.

Dos colorantes de cianina particularmente útiles son PKH26-GL y PHK2-GL, que se pueden adquirir en Sigma Chemical Co. Se prefieren estos colorantes porque han sido ampliamente estudiados y utilizados. Por ejemplo, han sido utilizados en estudios animales in vivo para estudios de tráfico de células. Horan et al., Nature 1989; 340, 167-168; Horan et al., Methods Cell Biol. 1990; 33, 469-490; Michelson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93, 11877-11882. En los animales de laboratorio se ha demostrado que estos colorantes no afectan el desarrollo o la función celular y no migran desde las células teñidas con estos colorantes a estas células (Horan et al., 1989), por lo tanto presentan baja toxicidad, una cualidad deseable para las aplicaciones in vivo.

Los colorantes empleados in vivo según la presente invención deberían estar exentos de endotoxina, medida, por ejemplo, por el análisis de amebocitos de Limulus (LAL). Normalmente, cuando la concentración de endotoxina medida es menor de aproximadamente 1 ng/\mug de colorante, y preferentemente menor de aproximadamente 0,1 ng/\mug de colorante, entonces el colorante se considera "exento de endotoxina".

Más generalmente, los colorantes están esencialmente exentos de pirógenos, si la endotoxina u otros pirógenos contribuyen a la pirogenicidad. Por lo tanto, un colorante se considera "esencialmente exento de pirógenos" cuando la formulación final de las células híbridas marcadas con el colorante (por ejemplo, en una forma que se deba inyectar a un paciente) proporciona aproximadamente menos de 1 unidad de endotoxina (EU)/dosis pero preferentemente menos de aproximadamente 0,1 EU/dosis y más preferentemente menos de aproximadamente 0,05 EU/dosis. Los umbrales de toxicidad están documentados por el hecho de que la mayoría de los procedimientos in vivo contemplados en la presente memoria producen menos de aproximadamente 10^{-8} g de estos colorantes, con relación a las células, que se introducen en un paciente cuando se emprenden los procedimientos de tratamiento de la invención.

Las metodologías convencionales de marcado con colorante de cianina requieren la presencia de estabilizantes celulares (agentes reguladores de osmolaridad), como azúcares (por ejemplo, glucosa o manitol), aminoácidos y/o determinados tampones de Goods. Véase, por ejemplo, Horan et al., patente U.S. nº 4.783.401 (1998). Los inventores descubrieron que el sulfóxido de dimetilo (DMSO) puede sustituir a dichos estabilizantes. En particular, para los colorantes de cianina se puede utilizar como disolvente DMSO diluido en un medio de cultivo patrón, y ello favorece la absorción eficaz y estable del colorante sin pérdida sustancial de viabilidad celular. Un intervalo generalmente útil de concentración de DMSO está comprendido entre aproximadamente el 10 y aproximadamente el 50%, pero un intervalo preferido está comprendido entre el 20 y aproximadamente el 40%. La invención por consiguiente también contempla procedimientos de marcado de células, y los correspondientes kits, con colorantes de cianina que utilizan DMSO en lugar de los estabilizantes convencionales.

Una vez marcadas las células reactivas, se ponen en contacto unas con otras, en condiciones que favorecen la fusión. Dichas condiciones que favorecen la fusión son bien conocidas por el experto en la materia e implican la adición de un agente que favorece la fusión celular. Estos agentes se cree que actúan por un mecanismo de aglomeración molecular para concentrar las células hasta el punto en que estén en suficiente íntima proximidad para producir la fusión de las membranas celulares. Mientras la invención contempla cualquier agente que reúna estas características, son agentes útiles a título de ejemplo los compuestos poliméricos, como los polietilenglicoles. Una cantidad eficaz de dicho agente generalmente estará comprendida aproximadamente entre el 20% y aproximadamente el 80% (p/v). Un intervalo preferido está comprendido entre aproximadamente el 40% y aproximadamente el 60%, siendo más preferido aproximadamente el 50%.

Tras la formación de la célula híbrida, normalmente es beneficioso aislarlas de las células reactivas no fusionadas. En el caso de las vacunas celulares, por ejemplo, esta purificación aumenta sustancialmente la potencia. La purificación se puede realizar, por ejemplo, mediante metodologías FACS convencionales.

El procedimiento contempla explícitamente células híbridas de orden superior, que son fusiones entre más de dos células. En cada caso, todo lo que se necesita es un colorante adicional que pueda servir como marcador para la selección del híbrido de orden superior. Por ejemplo, se utilizan tres células reactivas diferentes marcadas con tres colorantes diferentes para formar un "trihíbrido", y así sucesivamente. Por lo tanto, tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula híbrida" contempla las fusiones entre dos o más células reactivas.

Kits

Se dan a conocer también kits para marcar células y para preparar células híbridas. Estos kits son útiles en la ejecución del procedimiento de la invención para la preparación de células híbridas. Un kit de marcado, por ejemplo, contiene por lo menos un colorante, y puede contener DMSO e instrucciones para el marcado. El kit para la preparación de células híbridas, comprende por lo menos dos colorantes esencialmente exentos de endotoxinas y/o exentos de pirógenos e instrucciones para la preparación de células híbridas y/o comprende un agente que favorece la fusión celular.

Preparaciones de células híbridas

En general, la preparación de células híbridas estará sustancialmente exenta de células reactivas (menos de aproximadamente el 50% de células reactivas, pero preferentemente menos de aproximadamente del 10% al 25% de células reactivas, y más preferentemente menos de aproximadamente el 5% de células reactivas).

En una forma de realización, la preparación de las células híbridas de la invención, comprende una célula tumoral primaria y una célula presentadora de antígeno (APC) como reactivos. Dichos híbridos se pueden utilizar como vacunas celulares para provocar una respuesta inmunitaria contra un tumor. La célula tumoral puede ser de cualquier tipo, incluyendo las de los cánceres principales, como el de pulmón, próstata, ovario, piel, pulmón y similares. La APC preferentemente es una APC profesional, como un macrófago o una célula dendrítica. Debido a sus capacidades superiores de presentación de antígeno, se prefieren más las células dendríticas. Se contemplan tanto las fusiones isogénicas como halogénicas ya que los inventores han descubierto utilizando un modelo de ratón que ambas actúan igualmente bien.

La preparación de las células híbridas se realiza utilizando una combinación de colorantes, como se detalló anteriormente. De este modo, la célula híbrida de la invención se marca por lo menos con dos colorantes diferentes. Estos colorantes son fluorescentes y, de nuevo, están favorecidos los colorantes de cianina.

Procedimientos de tratamiento

Los procedimientos y los productos de la invención obtenidos por los procedimientos de la invención son útiles en los procedimientos de tratamiento y profilaxis, y el "tratamiento" se utiliza en la presente memoria para incluir la "profilaxis". Dicho procedimiento implica básicamente la administración a un paciente de un híbrido entre una célula "diana" y una segunda célula que presenta el antígeno. La célula "diana" es aquella contra la cual se pretende una respuesta inmunitaria. En el tratamiento del cáncer es deseable una respuesta inmunitaria positiva.

El procedimiento de tratamiento o de profilaxis incorporado corresponde al cáncer. Este procedimiento implica la administración a un paciente de células híbridas preparadas por el procedimiento de la invención. La célula híbrida está marcada por lo menos con dos colorantes.

A título de ejemplo, un procedimiento de tratamiento contra el cáncer implica el marcado de células neoplásicas e inmunitarias aisladas con diferentes colorantes y la formación de una célula híbrida entre las células marcadas. La célula híbrida se aísla y se administra a un paciente en un excipiente aceptable. Con el fin de evitar la administración de células cancerosas viables, es recomendable irradiar letalmente las células reactivas del tumor antes de la fusión. Esta etapa destruye la célula, pero no impide la presentación eficaz del antígeno o antígenos tumoral(es) por la célula híbrida resultante. Se contemplan las fusiones tanto isogénicas como halogénicas ya que los inventores han descubierto utilizando un modelo de ratón que ambas actúan igualmente bien.

Además, el tratamiento del cáncer se puede aumentar utilizando agentes antineoplásicos adicionales juntamente con las células híbridas. Una clase de dichos agentes son los inmunomoduladores. Éstos comprenden las citocinas y las linfocinas, especialmente interleucina-2 (IL-2) y los derivados de IL-2, como la aldesleucina (Proleucina, Chiron Corp.). Se prefiere la utilización de IL-2 porque debería aumentar más la respuesta inmunitaria generada por la célula híbrida. Tal como se utiliza en la presente memoria, "interleucina-2" se utiliza genéricamente para referirse a las moléculas naturales y a algunos derivados o análogos que conservan la actividad esencial de la interleucina-2, como favorecer el desarrollo de los linfocitos T. Se pueden utilizar también otras linfocinas y citocinas como auxiliares del tratamiento. Los ejemplos incluyen el interferón gamma (IFN-\gamma), el factor estimulante de la colonia de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), y similares.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "tratar" y sus diversas formas comprende también los procedimientos profilácticos.

La descripción detallada anterior y los ejemplos siguientes se ofrecen a título de ejemplo no limitativo. El especialista reconocerá que existen formas de realización adicionales que están comprendidas dentro de la invención, pero que no están descritas con particularidad.

Ejemplos Ejemplo 1 Estudios con animales

Este ejemplo demuestra la preparación de determinados híbridos entre células cancerosas y células dendríticas, denominados dendritomas. Estos híbridos se utilizan como vacuna celular para prevenir el cáncer en un sistema del modelo de cáncer metastásico murino.

Para preparar células dendríticas a partir de la médula ósea, se sacrificaron un número apropiado de ratones C57BL/6J hembra que soportan inyecciones de Dendritoma posteriormente (se inyecta a uno de cada dos ratones). Se extrajeron el fémur y la tibia de ambas patas traseras de cada ratón. Se enjuagó la médula ósea de los huesos utilizando una jeringuilla que contenía RPMI 1640 con HEPES 25 mM (Gibco BRL). El medio que contiene la médula ósea se filtró a través de un filtro de células de 40 \mum dentro de un tubo cónico de centrifugadora de 50 ml. Se sedimentaron las células de médula ósea por centrifugación a 1500 rpm durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante, se dieron golpecitos suaves al tubo para despegar el sedimento celular. Se consiguió la lisis de los glóbulos rojos añadiendo 5 ml/ratón de solución lisante ACK (NH_{4}Cl 0.15 M, KHCO_{3} 1 mM, Na_{2}EDTA 0,1 mM, pH 7,3) e incubando a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se sedimentaron las células por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante, y las células se volvieron a poner en suspensión poco a poco en 10 ml/ratón de medio de DC completo (RPMI 1640, suero bovino fetal al 10% (FDS), 100 \mug/ml de gentamicina, 10 ng/ml de GM-CFS y 10 ng/ml de IL-4). Se colocaron las células en placas en dos pocillos/ratón de una placa de cultivo de tejido de seis pocillos. Después de incubar los cultivos durante toda la noche a 37ºC, 5% de CO_{2}, se eliminaron las células flotantes de cada cultivo. Se lavaron las células adhesivas dos veces con solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS). Se alimentó a las células de cada pocillo con 5 ml de medio de DC completo. Se incubaron los cultivos durante 48 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%. Se recogieron las células dendríticas procedentes de la placa de 6 pocillos eliminando el sobrenadante que contenía las células a un tubo cónico de centrifugadora de 15 ml. Se lavó cada pocillo dos veces con 3 ml de 1X PBS. Se trataron las células ligeramente con tripsina añadiendo 1 ml de tripsina al 0,25%/EDTA (Gibco BRL) a cada pocillo. Después de agitar la placa para cubrir la superficie entera, la solución de tripsina se eliminó rápidamente de la placa. Se golpeó ligeramente la placa para separar algunas células que se adhieren débilmente. Se volvieron a poner estas células en suspensión en 2 ml de medio de DC completo y se añadieron al tubo de 15 ml. Se sedimentaron las células por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Tras la resuspensión de las células en 10 ml de medio de DC completo, se realizó un recuento celular.

Se consiguieron células B16F0 de melanoma murino del ATCC (CRL-6322) y se cultivaron utilizando técnicas normalizadas de cultivo de tejido. Cuando estuvieron listas las células para su utilización, se trataron con tripsina utilizando tripsina al 0,25%/EDTA. Tras el recuento celular, el número de células necesarias para la experimentación se decantó por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Se cultivaron las células restantes para su utilización ulterior.

Se utilizó un kit comercial de enlace de células fluorescentes para el marcado general de la membrana celular de las células dendríticas murinas y de las células B16F0 de melanoma. Se marcaron las células dendríticas con verde fluorescente utilizando el número de inventario PKH2-GL de Sigma; las células B16F0 se marcaron con rojo fluorescente utilizando el número de inventario PKH26-GL de Sigma. El procedimiento de tinción se realizó a 25ºC. Las células que se deben teñir se lavaron con medio exento de suero. La suspensión celular se centrifugó a 400 g durante cinco minutos para obtener un sedimento suelto. Se eliminó el sobrenadante dejando menos de 25 \mul de medio en el sedimento. El sedimento se volvió a poner en suspensión dando golpecitos al tubo y se añadió 1 ml de diluyente A o C para la coloración verde o roja respectivamente para volver a poner en suspensión las células. Inmediatamente antes de la coloración, se prepararon colorantes (2X) 4 \times 10^{-4} molar con diluyente A o C en tubos de polipropileno. Para minimizar los efectos del etanol, la cantidad de colorante añadida fue menos del 1% del volumen de muestra individual. Las células en el diluyente se añadieron rápidamente en 1 ml de colorante 2X. Las células y el colorante se mezclaron inmediatamente mediante pipeteado suave. Se incubó a continuación la mezcla a 25ºC durante cinco minutos. Se interrumpió el proceso de coloración añadiendo un volumen igual de FBS e incubando durante un minuto. Las células coloreadas se diluyeron con un volumen igual de medio de cultivo completo. Las células coloreadas se eliminaron de la solución de coloración por centrifugado a 400 g durante 10 minutos. Tras un total de tres lavados, se volvieron a poner en suspensión las células en medio completo a una concentración apropiada. La eficacia de la coloración se controló por microscopía fluorescente.

Antes del proceso de fusión, las células B16F0 de melanoma murino coloreadas con rojo fluorescente se irradiaron con 5.000 rads. Las células dendríticas murinas y las células B16F0 de melanoma se fusionaron conjuntamente mezclando los dos tipos de células en una proporción 1:1 en un tubo cónico de centrifugadora de 50 ml. El tubo se rellenó con RPMI 1640 exento de suero con HEPES 25 mM. La mezcla de células se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Obsérvese que durante el proceso de fusión, todas las soluciones así como el tubo en el que se realizó la fusión se mantuvieron a 37ºC utilizando baños de agua en doble vaso de precipitados. El sobrenadante del sedimento celular mezclado se aspiró y se descartó. Utilizando una pipeta serológica de 1 ml, se añadió gota a gota durante un minuto 1 ml de PEG/DMSO (Sigma) al 50% precalentado, que contiene 50% de PEG y 10% de DMSO en PBS (exento de Ca^{++} y Mg^{++}), al sedimento celular mezclado, agitando las células con la punta de la pipeta después de cada gota. Se agitó la mezcla durante un minuto adicional con la pipeta.

Utilizando una pipeta serológica limpia de 2 ml, se añadieron gota a gota a la mezcla celular durante dos minutos 2 ml de RPMI 1640 exento de suero precalentado con Hepes 25 mM, agitando después de cada gota. Con una pipeta serológica de 10 ml, se añadieron gota a gota durante dos a tres minutos 7 ml de RPMI 1640 exento de suero precalentado con Hepes 25 mM. Se sedimentaron las células por centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante, y se volvió a colocar el tubo dentro del baño de agua del vaso de precipitados. Con una pipeta serológica limpia de 10 ml, se volvió a poner en suspensión el sedimento celular en 10 ml de medio de DC completo descargando enérgicamente aproximadamente 3 ml de medio sobre el sedimento y a continuación añadiendo poco a poco el medio restante. Se volvieron a poner en suspensión las células en un matraz de cultivo de tejido T75. Los Dendritomas presentes (células dendríticas fusionadas con células de melanoma) se incubaron durante toda la noche a 37ºC, 5% de CO_{2}. Se colocó una gota de las células en un portaobjetos y se evaluó por microscopía de fluorescencia para asegurar la aparición de la fusión.

Los Dendritomas presentes se eliminaron del matraz de cultivo de tejido conservando el sobrenadante que contiene las células así como tratando con tripsina ligeramente las células adhesivas como se describió anteriormente. Se sedimentaron las células por centrifugación a 1500 rpm durante cinco minutos. Se volvió a poner en suspensión el sedimento celular en 2 ml de 1X PBS y se puso en un tubo Falcon esterilizado de 12 \times 75 mm, de fondo redondo, de poliestireno. Tras centrifugar las células a 1500 rpm durante cinco minutos, se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de 1X PBS. Se clasificaron los Dendritomas presentes basándose en una doble fluorescencia verde y roja que utiliza un calibre FACS (Becton Dickinson), utilizando procedimientos normalizados.

Las células clasificadas se sedimentaron por centrifugación a 2.000 rpm durante 30 minutos. Una vez eliminado el sobrenadante, se volvieron a poner en suspensión las células a una concentración de 50.000 células/0,5 ml de 1X PBS. Se colocó una gota de las células en una sección y se evaluó por microscopía fluorescente para asegurar la pureza general de la clase.

Tres días antes del proceso de fusión, se sometieron a una prueba ratones C57BL/6J hembra con 0,75 \times 10^{6} células B16F0 de melanoma en 0,4 ml de 1X PBS mediante inyección intravenosa. Una vez se sedimentaron los Dendritomas presentes y se volvieron a poner en suspensión, se inyectaron 50.000 células a cada ratón por vía intravenosa. Esto fue seguido de tratamiento con IL-2, que se administró por vía intraperitoneal a razón de 10.000 IU/día/ratón. Se controló la metástasis pulmonar en los ratones hasta cuatro semanas.

Al final de la cuarta semana, se sacrificaron los ratones y se hizo un recuento de la metástasis. Cada uno de los cuatro animales de referencia, que no habían sido tratados con los presentes Dendritomas, presentó más de 50 tumores. Por otra parte, solamente uno de los animales tratados presentaba metástasis mensurable. Estos datos indican que las células híbridas presentes son eficaces en el tratamiento del cáncer en un sistema de modelo animal probado. Los datos se recopilan en la tabla siguiente.

GRUPO	Número de metástasis
	(incluyendo los tumores en puntos no del pulmón)
\underline{Referencia}
A	>50
B	>50
C	>50
D	>50
\underline{Experimental}
A	0
B	3
C	0
D	0

Ejemplo 2 Estudios en el hombre

Este ejemplo demuestra que las células híbridas de Dendritoma de la invención provocan una respuesta a los linfocitos T citotóxicos específica de la célula cancerosa. Esto proporciona pruebas del principio de que estas células híbridas pueden provocar una respuesta inmunitaria terapéuticamente significativa contra un tumor.

A fin de aumentar el número de células dendríticas, que se aislaron de la sangre periférica, se utilizó una técnica de aglomeración que utiliza placas recubiertas con anti-CD14. Se volvieron a poner en suspensión quinientos microgramos de anticuerpo-CD14 en 5 ml de 1X PBS con BSA (700 \mug de BSA por 100 \mul de anticuerpo). Se recubrió una placa de cultivo de tejido de 100 mm con 5 ml del anticuerpo. Se agitó la placa y se incubó durante una hora a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4ºC. Se eliminó la solución de anticuerpo y se lavó la placa cinco veces con 5 ml de 1X PBS.

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de sangre completa extrayendo 50 ml de sangre periférica del paciente en tubos exentos de conservante o con heparina sódica. Se diluyó la sangre 1:1 con 1X PBS. Se estratificaron 8 ml de la sangre diluida en 4 ml de Ficoll-Paque Plus a temperatura ambiente en tubos cónicos de centrifugadora de 15 ml. Se centrifugaron los gradientes de Ficoll a 400 g a temperatura ambiente durante 40 minutos. Utilizando una pipeta Pasteur, se eliminaron con cuidado las capas de PBMC del gradiente Ficoll y se colocaron en un tubo limpio de centrifugadora de 15 ml. Se añadieron cuatro volúmenes de 1X PBS al tubo y se invirtieron varias veces para mezclar a fondo. Se centrifugaron las PBMC a 100 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras la eliminación del sobrenadante, se añadieron 10 ml de 1X PBS al sedimento celular y se invirtió para mezclar. Se sedimentaron las PBMC por centrifugación a 100 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se volvieron a poner en suspensión las PBMC en 5 ml de medio de DC completo (RPMI 1640, 10% de suero humano, 800 U/ml de GMCSF, 1000 U/ml de IL-4 y 100 \mug/ml de gentamici-
na).

Se pipetearon las PBMC (hasta 2 \times 10^{8}) resuspendidas en la placa recubierta con anti-CD14 y se agitó para cubrir la placa completa. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras agitación suave se eliminaron de nuevo en la placa las células no adheridas que contenía el sobrenadante. Las células adheridas se lavaron añadiendo 10 ml de 1X PBS y agitando. Este lavado se repitió durante un total de cuatro veces, pipeteando en el mismo lugar cada vez. Inmediatamente después de los lavados, se añadieron 10 ml de medio de DC completo a la placa. Se incubó el cultivo a 37ºC, 5% de CO_{2} durante 5 a 10 días para producir células dendríticas.

Se recibió una sección del tumor de un paciente que se había vuelto a seccionar inmediatamente después de la intervención quirúrgica. Se cortó la sección del tumor en varias piezas y se colocó en un tubo de centrifugadora cónico de 50 ml que contenía 1X PBS. Las piezas del tumor se cortaron aún más en piezas más pequeñas utilizando tijeras de bisección esterilizadas y se colocaron en un matraz de cultivo de tejido T75. Se añadieron al matraz diez ml de tripsina al 0,25%/EDTA, que se incubó a 37ºC con agitación durante una hora. Tras la incubación, se añadieron al matraz 15 ml de medio de células tumorales completo (DMEM, 10% de suero humano, 200 \mug/ml de gentamicina). Se eliminaron las piezas del tumor y se colocaron en un matraz T75 limpio, que se incubó durante toda la noche a 37ºC, 5% de CO_{2}.

La mezcla medio/tripsina procedente del matraz original contenía algunas células individuales del tumor. Se filtraron estas células a través de un filtro de células de 40 \mum y se sedimentaron por centrifugación a 1.500 rpm durante cinco minutos. Se volvieron a poner en suspensión las células en 10 ml de medio completo de células tumorales y se colocaron en un matraz de cultivo de tejido T75 y se incubaron a 37ºC, 5% de CO_{2}. Al matraz que contenía las piezas del tumor, se añadieron 20 ml de medio completo de células tumorales después de incubación durante toda la noche. En ambos matraces se controlaron con cuidado las células adhesivas. Después de varios días, se extrajeron del matraz las piezas de tumor. Las células tumorales adheridas se alimentaron cada tres días y se mantuvieron para su utilización experimental. Se subcultivaron utilizando técnicas de cultivo de tejido normalizadas para células adhesivas.

Se preparó el marcado de la membrana celular de las células dendríticas y de las células tumorales tal como se describió anteriormente en el Ejemplo 1.

Se prepararon linfocitos T citotóxicos (CTL), CD8+, por el procedimiento siguiente. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de sangre completa extrayendo 40 ml de sangre periférica del paciente en tubos exentos de conservante o con heparina sódica y 10 ml en tubos ACD. Se diluyó la sangre 1:1 con 1X PBS. Se estratificaron ocho ml de la sangre diluida en 4 ml de Ficoll-Paque Plus a temperatura ambiente en tubos cónicos de centrifugadora de 15 ml. Se centrifugaron los gradientes de Ficoll a 400 g a temperatura ambiente durante 40 minutos. Utilizando una pipeta Pasteur, se eliminaron con cuidado las capas de PBMC del gradiente Ficoll y se colocaron en un tubo limpio de centrifugadora de 15 ml. Se añadieron cuatro volúmenes de 1X PBS al tubo y se invirtieron varias veces para mezclar a fondo. Se centrifugaron las PBMC a 100 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras la eliminación del sobrenadante, se añadieron 10 ml de 1X PBS al sedimento celular y se invirtió para mezclar. Se sedimentaron las PBMC por centrifugación a 100 g a temperatura ambiente durante 10 minutos y se volvieron a poner en suspensión en medio de linfocitos completo (RPMI 1640, 10% de FBS y 100 \mug/ml de gentamici-
na).

Se aislaron las PBMC procedentes de pacientes en sangre exenta de conservantes o con heparina sódica. Se sometieron a la misma técnica de aglomeración descrita anteriormente con la excepción de que se utilizó anticuerpo anti-CD4 para recubrir la placa. Antes de la aglomeración las PBMC se enriquecieron con linfocitos T pasándolas a través de una columna con lana de nilón. Esto se realizó rellenando 0,5 g de lana de nilón cardada en una jeringuilla de 10 ml que tenía una llave de paso acoplada en la punta. Se lavó la columna dos veces a 37ºC con RPMI 1640 con FBS al 10%. Se cerró la llave de paso y se incubó a 37ºC durante una hora. Tras gotear el medio desde la columna hasta la parte superior de la lana, se añadieron las PMBC a la columna (hasta 2 \times 10^{8} en 2 ml del medio). Se abrió la llave de paso y se añadió el medio hasta que el volumen de células se introdujo en el relleno de lana. Una vez cerrada la llave de paso se añadió medio adicional hasta cubrir la parte superior de la lana. Se incubó la columna durante una hora a 37ºC. Se recogieron los linfocitos T no adhesivos mediante dos lavados del medio. Tras este enriquecimiento con linfocitos T, se aglomeraron los linfocitos T utilizando la placa recubierta con anti-CD4. Se recuperaron los linfocitos T que no se unieron mediante el anticuerpo CD4 y se supuso que eran células CD8+ (linfocitos T citotóxicos). Esto se confirmó por análisis FACS.

Con el fin de tener reestimuladores constantes para los CTL específicos de células tumorales, se inmortalizaron las PBMC aisladas de la sangre ACD mediante transformación con el virus de Epstein Barr (EBV). Esto se realizó volviendo a poner en suspensión las PBMC a una concentración de 1 \times 10^{6} células/ml de medio de linfocitos completo. Se añadieron a esto 1 ml de sobrenadante de EBV y 0,2 ml de fitohemoaglutinina. La mezcla celular se cultivó en un matraz de cultivo de tejido T25 a 37ºC, 5% de CO_{2}.

Los Dendritomas presentes obtenidos a partir de la clasificación FACS se mezclaron con los linfocitos T CD8+ enriquecidos y aglomerados en una proporción 1:10. Las células CD8+ que deben utilizarse se sedimentaron por centrifugación a 1500 rpm durante cinco minutos y se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de medio que contenía RPMI 1640, 10% de FBS, 1.000 U/ml de IL-6, 5 ng/ml de IL-12 y 10 U/ml de IL-2. Esto se añadió a los presentes Dentritomas colocados en placas tras la clasificación. Este cultivo se incubó a 37ºC, 5% de CO_{2} durante una semana. Durante esta semana se volvieron a alimentar las células con el mismo medio.

Después de una semana, se volvieron a estimular los linfocitos T CD8+ (CTL) cebados con linfocitos irradiados transformados con EBV que se pulsaron con lisado tumoral. Las células tumorales que se habían cultivado anteriormente, se sometieron a cuatro ciclos de congelación y descongelación para lisar las células. Para obtener el lisado que contiene antígenos tumorales, las células lisadas se centrifugaron a 600 g durante diez minutos. Se recogió el sobrenadante y se centrifugó a 13.000 g durante una hora. Se recogió el sobrenadante que contiene el lisado de los antígenos tumorales. Para volver a estimular los CTL se hizo un recuento de células viables utilizando la exclusión del azul de tripano. Una vez determinado el número de células viables se pulsó con el lisado tumoral el mismo número de linfocitos transformados por EBV incubando el lisado con los linfocitos a 37ºC, 5% de CO_{2} durante una hora. Se irradiaron los linfocitos pulsados con 5.000 rads y a continuación se mezclaron con los CTL en un medio que contenía RPMI 1640, 10% de FBS, 10 U/ml de IL-1\alpha, 5 U/ml de IL-2, 50 U/ml de IL-4, 125 U/ml de IL-6 y 30 U/ml de IL-7. Se incubó el cultivo a 37ºC, 5% de CO_{2} y se volvió a alimentar cada dos días. Esta reestimulación se realizó los días 7 y 14 posteriores al cebado inicial.

Se realimentaron diariamente los CTL y se eliminó el sobrenadante que se almacenó a -20ºC. Cuando fue posible, se realizó un análisis de interferón-gamma (IFN-\gamma) utilizando un kit IFN-\gamma humano OptEIA (PharMingen). Se realizó el protocolo exactamente según las instrucciones del fabricante. Se leyó el análisis utilizando un lector de microplacas Benchmark (BioRad).

Para determinar si los presentes Dendritomas estimulaban una respuesta a los CTL específicos de la célula tumoral, se realizó un análisis de los CTL utilizando las células tumorales cultivadas como células diana. Se recogieron cincuenta mil células tumorales y se sedimentaron en un tubo cónico de centrifugadora de 15 ml mediante centrifugación a 200 g durante cinco minutos. Se descartó el sobrenadante dejando 0,1 ml de medio en el sedimento. Se volvieron a poner en suspensión poco a poco las células en el medio restante. A continuación se marcaron las células tumorales con ^{51}Cr añadiendo 0,1 ml de solución 1 mCi/ml de ^{51}Cr y 10 \mul de FBS y mezclando suavemente. Se incubó esta mezcla quitando el tapón del tubo y colocándola a 37ºC, 5% de CO_{2} durante una hora. Tras la incubación, se lavaron dos veces las células tumorales marcadas con 14 ml de RPMI 1640 y se volvieron a poner en suspensión a una concentración de 5 \times 10^{4} células/ml en medio de linfocitos completo.

Se colocaron en placas las células de efector CTL en 4 pocillos de una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos, de fondo redondo a concentraciones que igualaron las proporciones 100:1, 30:1, 10:1 y 3:1 de efector a célula diana. Se añadieron cinco mil células diana marcadas a los pocillos que contenían las células de efector así como a dos pocillos adicionales para referencias de liberación naturales y máximas. Se mezclaron las células y se centrifugaron a 200 g durante 30 segundos. Se incubó a continuación la placa a 37ºC, 5% de CO_{2} durante cuatro horas. Treinta minutos antes del final de la incubación, se añadió 0,1 ml de Triton X-100 al pocillo de referencia de liberación máxima. Al final de la incubación, se centrifugaron las células en la placa a 200 g durante cinco minutos. Se añadió 0,1 ml de cada sobrenadante a los viales con contador líquido de centelleo que contenían 5 ml de mezcla de centelleo. Se midió la cantidad de liberación de ^{51}Cr utilizando un contador de centelleo universal LS6500 (Beckman).

Los resultados del análisis de CTL demostraron que como aumentó la proporción de CTL cebados con células híbridas a células tumorales, la liberación del isótopo aumentó, lo que indica una correlación positiva entre el número de CTL y la destrucción del tumor. Se observó una destrucción superior al 50% a una proporción de efector: diana 100:1. Por otra parte, no existe tal correlación con los linfocitos T de referencia que no se cebaron con las células híbridas de la invención. Aún a una proporción de 100:1, los linfocitos T de referencia no lisaron más células tumorales que a proporciones más bajas. Estos resultados demuestran que los CTL generados utilizando las células que presentan el antígeno híbrido de la invención son completamente operativos y específicos de las células tumorales. Los resultados se representan en la Figura 1.

De hecho, estos datos proporcionan pruebas capitales de que las presentes células híbridas se pueden utilizar en inmunoterapia in vivo. Se conoce que los CTL desempeñan una función vital en la respuesta inmunitaria mediada por la célula, es decir, son responsables principalmente de la destrucción de las células que llevan antígenos "extraños". Por ejemplo, un principio anterior que utiliza inmunoterapia para el tratamiento del cáncer, está basado en la estimulación de los CTL específicos de las células tumorales, que producen la destrucción de las células tumorales. El hecho de que las células híbridas de la invención puedan estimular una respuesta a los linfocitos T específicos del tumor proporciona pruebas convincentes de que serán útiles en la inmunoterapia in vivo, por el mismo mecanismo.

Ejemplo 3 Caracterización del dendritoma

Este ejemplo proporciona caracterización adicional de las células reactivas y de los dentritomas descritos en los Ejemplos 1 y 2.

Los análisis por microscopía fluorescente demostraron que el 100% de las células coloreadas eran marcadas acertadamente. Para probar si el colorante puede intercolorear entre los dos tipos diferentes de células, se mezclaron células DC verdes y tumorales rojas y se incubaron durante toda la noche. El examen microscópico fluorescente demostró que no existía intercoloración. El examen intermedio del producto de fusión demostró que las células DC verdes y las tumorales rojas se fusionaban y tras su recuperación durante toda la noche, las células fusionadas presentaban ambos colores. Las células doblemente coloreadas (aproximadamente el 10% de todas las células), los presentes dendritomas, se purificaron a continuación por clasificación FACS. Más del 95% de las células clasificadas eran células fusionadas doblemente coloreadas.

Los presentes dendritomas expresan todas las moléculas necesarias para la presentación del antígeno. El análisis de FACS demostró que los presentes dendritomas expresan las moléculas necesarias para la presentación del antígeno, tales como las moléculas MHC de clase I y II y coestimulantes CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2). Los datos se representan en la Figura 2. "Isotipo" es la referencia negativa; HLA-A,B,C es MHC de clase I y HLA-DR es MHC de clase II. Además, al microscopio, los presentes dendritomas presentan también aquellos gránulos oscuros que presentan las células tumorales de melanoma.

Para la Figura 2, se colorearon DC humanas de la sangre periférica con células con colorante verde y tumorales con el colorante rojo, respectivamente, y se fusionaron utilizando el protocolo anterior. Tras incubación durante toda la noche, las células se dividieron asimismo en 4 grupos. A continuación se colorearon con anticuerpos conjugados con Cy-Chrome incubando las células con los anticuerpos (1 millón de células/microgramo de anticuerpo, Becton/Dickinson) en hielo durante 30 minutos. Los diferentes grupos fueron los siguientes: HLA-A,B,C anti-humano [grupo I]; HLA-DR anti-humano [grupo II]; CD80 anti-humano [grupo III]; y CD86 anti-humano [grupo IV]. Los anticuerpos no unidos se eliminaron mediante dos lavados y el sedimento celular se volvió a poner en suspensión en 0,5 ml de tampón de coloración (PBS que contiene 0,1% de BSA y 0,1% de azida sódica). Se realizó el análisis de tres colores mediante FACS, utilizando el programa informático CellQuest. Se colorearon también las DC humanas de referencia con los mismos anticuerpos del mismo modo.

Ejemplo 4 Protocolo clínico

Este ejemplo proporciona a título de ejemplo un protocolo clínico para el tratamiento de pacientes humanos de cáncer con las preparaciones de células híbridas de la invención. Este régimen es útil, por ejemplo, para tratar pacientes de melanoma con un dendritoma, preparado según las formas de realización de la invención.

Se generaron células dendríticas maduras a partir de monocitos de la sangre periférica del paciente. Se extrajeron 50 ml de sangre periférica del paciente en tubos exentos de conservante o con heparina sódica. En resumen, se diluyó 1:1 la sangre con 1XPBS. A continuación se estratificaron 8 ml de la sangre diluida sobre 4 ml de Ficoll-Paque Plus a temperatura ambiente en tubos de centrifugadora de 15 ml y se centrifugaron a 40 g durante 40 minutos. Se eliminó la capa de PBMC del gradiente de Ficoll y se colocó en un tubo limpio de centrifugadora de 15 ml. Se añadieron 4 volúmenes de 1XPBS y se invirtió el tubo para mezclar. Se centrifugaron a continuación las PBMC a 100 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 10 ml de 1XPBS y se mezclaron las células invirtiendo el tubo. Se centrifugaron de nuevo las PBMC a 100 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se volvieron a poner en suspensión las PBMC en 5 ml de medio DC completo (RPMI 1640 + 10% de suero humano + 800 U/ml de GMCSF + 1000 U/ml de IL-4). A continuación se aglomeraron las células dendríticas con los precursores utilizando placas recubiertas con anti-CD14. Se colocaron en placas 2 \times 10^{8} PBMC en la placa recubierta con anti-CD14 y se agitó. Se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación se eliminaron las células no adhesivas. Se añadieron 10 ml de 1XPBS, se agitó la placa y se eliminó el PBS. Este lavado con PBS se repitió durante un total de cuatro veces, pipeteando en el mismo lugar cada vez. A continuación, se añadieron a la placa 10 ml de medio DC completo. Se incubaron a continuación a 37ºC, 5% de CO_{2} durante 5 a 10 días para producir células dendríticas.

Se obtuvo una sección tumoral en el momento de la biopsia o de la resección de la excisión. Las células tumorales se cultivaron utilizando la siguiente técnica. Después de separar la grasa y el tejido necrótico del tejido tumoral (1 a 5 gramos), se cortó el tumor en trozos pequeños y se colocaron en el interior de un matraz T75. Se añadieron 10 ml de 0,25% de tripsina-EDTA. Se agitó esta solución durante 1 hora a 37ºC y a continuación se añadieron 15 ml de medio completo (DMEM + 10% de suero humano + gentamicina). Se eliminaron a continuación los trozos y se colocaron en un matraz T75 limpio. Se dejó este matraz a 37ºC en 5% de CO_{2} durante toda la noche. A continuación se centrifuga la suspensión celular/tripsina/medio completo a 1.000 g durante 5 minutos. Se vuelven a poner en suspensión estas células en 15 ml de medio completo y se cultivan en un matraz T75 a 37ºC en 5% de CO_{2} durante 24 horas. Tras incubación durante toda la noche en ausencia del medio, se añadieron 20 ml de medio completo al matraz en trozos y esta solución se dejó durante dos días a 37ºC en 5% de CO_{2}. Se eliminaron los trozos y se cultivaron las células adhesivas. Las células tumorales utilizadas para la fusión dendrítica proceden de ambos cultivos.

La etapa siguiente implica la fusión de células tumorales y células dendríticas recibidas del paciente. La formación del híbrido por fusión celular se convierte en rutinaria tras la introducción de polietilenglicol como agente de fusión. El procedimiento bosquejado a continuación es una variación del descrito por Prado et al., 1989 FEBS Lett., 259: 149-52, para la fusión de las células somáticas en monocapas mediada por PEG.

En primer lugar, las células tumorales se exponen a una dosis única de 5.000 rads, suficiente para destruir todas las células. A continuación, se colorean de verde las células dendríticas utilizando el colorante fluorescente PKH2-GL (Sigma) y las células tumorales se colorean de rojo utilizando el colorante fluorescente PKH26 (Sigma). El procedimiento de coloración se realiza a 25ºC utilizando una modificación ligera del procedimiento de Sigma. Las células que se deben colorear se lavan con medio exento de suero. Se centrifuga la suspensión celular a 400 g durante cinco minutos para obtener un sedimento suelto y se elimina la fracción sobrenadante. Se vuelve a poner en suspensión el sedimento dando golpecitos al tubo de centrifugadora y se añade 1 ml de diluyente (20% de DMSO en RPMI exento de suero) para volver a poner en suspensión las células. Inmediatamente antes de la coloración, se prepararon colorantes (2X) 4 \times 10^{-6} molar con diluyente en tubos de polipropileno. Se añaden rápidamente las células en el diluyente en 1 ml de colorante 2X y la mezcla se combina inmediatamente mediante pipeteado suave. Se incuba a continuación la mezcla a 25ºC durante cinco minutos. Se interrumpe el proceso de coloración añadiendo un volumen igual de suero humano al 10%, que puede ser el propio suero del paciente e incubando durante 1 minuto. Se diluyen las células coloreadas con un volumen igual de medio de cultivo completo. Se eliminan las células coloreadas de la solución de coloración por centrifugado a 400 g durante 10 minutos.

Se mezclan las células dendríticas verdes con las células tumorales rojas en proporción 1:1 en un tubo cónico de centrifugadora de 50 ml. Se rellena el tubo con DMEM exento de suero completo. Se centrifuga la mezcla celular durante 5 minutos a 500 g. Mientras se centrifugan las células, se preparan tres baños de agua a 37ºC en vasos de precipitados dobles en la campana extractora de flujo laminar colocando un vaso de precipitados de 400 ml que contiene 100 ml de agua a 37ºC en un vaso de precipitados de 600 ml que contiene 75 a 100 ml de agua a 37ºC. Se colocan en la campana extractora los tubos de solución de PEG al 50% precalentada y de DMEM exento de suero completo en dos de los baños de agua a 37ºC. A continuación, se aspira el sobrenadante de la mezcla celular y se descarta. Se realiza la fusión celular a 37ºC colocando el tubo que contiene el sedimento celular mezclado en uno de los baños de agua del vaso doble de precipitados en la campana extractora de flujo laminar. A continuación, se añade 1 ml de PEG al 50% precalentado al sedimento celular mezclado gota a gota durante un minuto, agitando las células con la punta de la pipeta tras cada gota. Se agita la mezcla a continuación durante otro minuto.

Utilizando una pipeta limpia, se añade 1 ml de RPMI + HEPES precalentado a la mezcla celular gota a gota durante un minuto, agitando después de cada gota. Se repite esta etapa una vez con 1 ml adicional de solución RPMI + HEPES precalentada. Con una pipeta de 10 ml, se añaden gota a gota 7 ml de RPMI + HEPES precalentado durante 2 a 3 minutos. Se centrifuga a continuación la mezcla durante cinco minutos a 500 g. Mientras están las células en la centrifugadora, se vuelven a calentar los baños de agua a 37ºC y se colocan en la campana extractora. Se coloca el medio DC completo precalentado en el baño de agua del vaso de precipitados. A continuación se descarta de la mezcla el sobrenadante; se coloca el tubo en el baño de agua del vaso de precipitados. Se descargan de manera forzada con una pipeta 10 ml de medio DC completo precalentado sobre el sedimento celular y se colocan en un matraz T75. Se incuba éste durante toda la noche en un incubador humidificado a 37ºC, 5% de CO_{2}.

Al día siguiente, se analizan las células en un clasificador de células activado por fluorescencia calibre FACS utilizando el programa informático CELLQuest (Becton/Dickinson), que clasificará las células de la fusión tanto con el colorante verde como con el rojo. Estas células de fusión, dendritomas, se vuelven a poner a continuación en suspensión en 1 ml de NS (solución salina normal) y se inyectan en el paciente.

La vacuna estará constituida por 100.000 (o más) células tumorales irradiadas fusionadas a células dendríticas, es decir, dendritomas. Estos dendritomas se vuelven a poner en suspensión en 1 ml de NS y se inyectan por vía IV en el paciente.

También se puede administrar interleucina 2 (p. ej., Aldesleucina) en un régimen a baja dosis. Cuando se utiliza IL-2, se administra mediante inyección subcutánea a una dosis de 18 millones de unidades al día durante 5 días comenzando el día de la vacunación.

Claims (6)

1. Procedimiento para la preparación de una vacuna contra el cáncer, que comprende:

(a)

poner en contacto una población de células neoplásicas con un primer colorante fluorescente,

(b)

poner en contacto una población de células que presentan un antígeno con un segundo colorante fluorescente, en el que dicho primer colorante es diferente a dicho segundo colorante,

(c)

poner en contacto dicha población de células neoplásicas y dicha población de células que presentan el antígeno una con otra en presencia de un agente que favorece la fusión celular,

(d)

purificar la población de células híbridas resultante mediante clasificación celular activada por fluorescencia, y

(e)

volver a poner en suspensión la población de células híbridas resultante en un vehículo farmacéuticamente aceptable;

en el que dicha clasificación celular no implica la selección antibiótica o metabólica.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la población de células resultante contiene menos del 10% de células reactivas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la población de células resultante contiene menos del 5% de células reactivas.

4. Procedimiento para la preparación de una vacuna antitumoral, que comprende:

(a)

poner en contacto una población de células tumorales con un primer colorante fluorescente,

(b)

poner en contacto una población de células dendríticas con un segundo colorante fluorescente,

(c)

poner en contacto dicha población de células tumorales y dicha población de células dendríticas una con otra en presencia de un agente que favorece la fusión celular,

(d)

purificar la población de células híbridas resultante mediante clasificación celular, y

(e)

volver a poner en suspensión la población de células híbridas resultante en un tampón farmacéuticamente aceptable;

en el que dicha clasificación celular no implica la selección antibiótica o metabólica.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la población de células resultante contiene menos del 10% de células reactivas.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la población de células resultante contiene menos del 5% de células reactivas.