ES2288952T3 - Composiciones y metodos para producir celulas presentadoras de antigenos. - Google Patents

Abstract

Un método para producir células dendríticas inmaduras a partir de precursores de células dendríticas de monocitos in vitro o ex vivo, que comprende poner en contacto dichos precursores con una composición que comprende interleucina-15 y factor estimulador de colonia granulocito-macrófago durante aproximadamente entre 24 horas y 15 días.

Description

Composiciones y métodos para producir células presentadoras de antígenos.

Referencia cruzada a una solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Nº 60/203.571, presentada el 11 de mayo de 2000, que es una solicitud provisional utilizada como base para la presentación de la US 2004/0022761 A1.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para producir células presentadoras de antígenos, in vitro, ex vivo o in vivo. Más particularmente, la invención se refiere a métodos y composiciones para la producción de células presentadoras de antígenos usando interleucina-15 (IL-15), en combinación con un Factor Estimulador de Colonia Granulocito-Macrófago (GM-CSF, del inglés "Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor"). Esta invención está dirigida particularmente a la producción de células dendríticas procedentes de precursores de monocitos in vitro o ex vivo. La invención también se refiere a composiciones para implementar dichos métodos, así como a composiciones que comprenden células presentadoras de antígenos, y a usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

El sistema inmune comprende varias poblaciones celulares, incluyendo células presentadoras de antígenos, que están implicadas en la presentación de antígenos a células efectoras o reguladoras, tales como macrófagos, linfocitos B y células dendríticas. Las células dendríticas son potentes células presentadoras de antígenos, implicadas en la inmunidad innata, y capaces de inducir respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicas de antígeno. Por esta razón, las células dendríticas han sido propuestas para su uso en la inmunoterapia de diversas patologías, incluyendo tumores o enfermedades inmunes, a través de la producción de dichas células in vitro, de la sensibilización frente a un antígeno, y de la reinfusión en un paciente. Asimismo, se han descubierto y aislado vesículas de membrana derivadas de células dendríticas, que exhiben una actividad inmunogénica muy potente (Solicitud Internacional Nº WO99/03499). Los métodos actuales de producción de células dendríticas se basan esencialmente en la diferenciación a partir de células precursoras (esencialmente monocitos sanguíneos periféricos) mediante cultivo en presencia de una combinación de una citoquina y un factor de crecimiento, más específicamente interleucina-4 o interleucina-13 en combinación con Factor Estimulador de Colonia Granulocito-Macrófago (GM-CSF). En la técnica existe la necesidad de desarrollar métodos alternativos de producción, que produzcan células dendríticas funcionales o células presentadoras de antígenos funcionales para su uso en cualquier área terapéutica, diagnóstica, profiláctica o de investigación.

Resumen de la invención

En un aspecto, la presente invención es un método para producir células dendríticas inmaduras a partir de precursores de células dendríticas de monocitos in vitro o ex vivo, que comprende poner en contacto dichos precursores con una composición que comprende interleucina-15 y factor estimulador de colonia granulocito-macrófago durante aproximadamente de 24 horas a 15 días. Dichas células dendríticas inmaduras se pueden sensibilizar frente a un antígeno. Estas células dendríticas inmaduras se pueden administrar a un paciente para modular una respuesta inmune en el paciente. La invención también incluye una composición que comprende células dendríticas inmaduras producidas de acuerdo con este método.

En otro aspecto, la invención es un método para producir células dendríticas maduras a partir de precursores celulares in vitro o ex vivo, que comprende poner en contacto los precursores de células dendríticas con una composición que comprende interleucina-15 y factor estimulador de colonia granulocito-macrófago durante aproximadamente de 24 horas a 15 días, para formar células dendríticas inmaduras y cultivar las células dendríticas inmaduras en presencia de un agente de maduración y en las condiciones necesarias para promover la maduración de las células dendríticas inmaduras y que formen células dendríticas maduras. En una realización, las células dendríticas inmaduras son sensibilizadas frente a un antígeno antes, durante o después de la maduración. Los ejemplos de agentes de maduración para su uso in vitro incluyen lipopolisacáridos, CD40L, y poli(I):(C). Estas células dendríticas maduras se pueden administrar a un paciente para modular una respuesta inmune en el paciente. La invención también incluye una composición que comprende células dendríticas maduras producidas de acuerdo con este método.

En otro aspecto, la invención es un método para producir vesículas de membrana aisladas in vitro o ex vivo que comprende poner en contacto precursores de células dendríticas de monocitos con una composición que comprende interleucina-15 y factor estimulador de colonia granulocito-macrófago durante aproximadamente de 24 horas a 15 días para formar células dendríticas inmaduras, cultivar las células dendríticas inmaduras en presencia de al menos un factor de estimulación para promover la liberación de vesículas de membrana; y aislar las vesículas de membrana. En una realización, las células dendríticas inmaduras son sensibilizadas frente a un antígeno antes o después de la liberación de la vesícula de membrana. Los ejemplos de factores de estimulación incluyen una citoquina adecuada, irradiación y pH bajo. Estas vesículas de membrana se pueden administrar a un paciente para modular una respuesta inmune en el paciente. La invención también incluye una composición que comprende vesículas de membrana producidas de acuerdo con este método.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de células o vesículas que pueden obtenerse mediante dicho método para la preparación de una composición farmacéutica para modular una respuesta inmune en un paciente.

En otro aspecto, la invención es un método para producir linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno in vitro o ex vivo, que comprende proporcionar células dendríticas sensibilizadas a un antígeno preparadas poniendo en contacto precursores de las mismas con interleucina-15 y factor estimulador de colonia granulocito-macrófago durante aproximadamente de 24 horas a 15 días, y sensibilizando posteriormente las células dendríticas frente a un antígeno, y poniendo en contacto las células dendríticas sensibilizadas a un antígeno con una población de células que comprende linfocitos T para formar linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno activados. Dichos linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno se pueden administrar a un paciente para modular una respuesta inmune en el pacien-
te.

En otro aspecto, la invención es un método para producir linfocitos T CD4+ específicos de antígeno in vitro o ex vivo, que comprende proporcionar células dendríticas sensibilizadas a un antígeno preparadas poniendo en contacto precursores de las mismas con interleucina-15 y factor estimulador de colonia granulocito-macrófago durante aproximadamente de 24 horas a 15 días, y sensibilizando posteriormente las células dendríticas frente a un antígeno y poniendo en contacto las células dendríticas sensibilizadas a un antígeno con una población de células que comprende linfocitos T para formar linfocitos T CD4+ específicos de antígeno activados. Dichos linfocitos T CD4+ específicos de antígeno se pueden administrar a un paciente para modular una respuesta inmune en el paciente.

La interleucina-15 útil en los métodos y composiciones de la presente invención se selecciona preferiblemente a partir del grupo que consiste en interleucina-15 aislada, un polipéptido de interleucina-15 recombinante, un ácido nucleico, ya sea natural o diseñado artificialmente codificando interleucina-15 en un vector de expresión adecuado, y una población de células que expresa un ácido nucleico que codifica interleucina-15. El factor de crecimiento útil en los métodos y composiciones de la presente invención es factor estimulador de colonia granulocito-macrófago. El factor de maduración útil en la presente invención se selecciona preferiblemente a partir del grupo que consiste en lipopolisacáridos, CD40L y poli(I):(C).

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A y 1B muestran el desarrollo de células dendríticas (DCs) en presencia de GM-CSF y de IL-15 (GM-CSF+IL-15). Se cultivó células CD14+ enriquecidas en presencia de GM-CSF y de IL-15 durante más de seis días. La Figura 1A muestra células no adherentes recogidas y analizadas para determinar la presencia de CD1a, CD14, y HLA-DR mediante FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). La Figura 1 B muestra monocitos cultivados en GM-CSF y en IL-15 analizados con una metodología cinética respecto del tiempo mediante FACS Calibur.

Las Figuras 2A y 2B muestran la maduración de DCs derivadas de GM-CSF+IL-15 con lipopolisacáridos (LPS). La Figura 2A muestra los resultados obtenidos al 5º día cuando se activó una parte de las DCs derivadas de GM-CSF+IL-15 con LPS (100 ng/mL) y se analizaron para determinar la presencia de HLA-ABC, CD40, CD80, CD83 y CD86. La Figura 2B muestra los resultados de estudios de captación de FITC-Dextrano. Se incubaron DCs activadas (línea punteada) y no activadas (línea continua) con 100 \mug/mL de FITC-Dextrano durante 30 minutos a 37ºC. Del mismo modo, se incubaron DCs de control en hielo durante 30 minutos. Seguidamente, las DCs fueron lavadas tres veces con PBS y se analizó la captación de FITC-Dextrano mediante FACS Calibur.

La Figura 3A muestra la expresión parcial de Langerina (marcador de células de Langerhans, un tipo especial de células dendríticas) y de CCR6 (receptor de quemocina 6) en DCs derivadas de GM-CSF+IL-15. La Figura 3B muestra DCs inducidas por GM-CSF+IL-15 que expresan niveles superiores de Langerina cuando se comparan con DCs inducidas por GM-CFS+IL-4/TGF\beta. Como representante de tres experimentos, la Figura 3C muestra el hecho de que la generación de DCs de tipo célula de Langerhans con GM-CSF y con IL-15 es independiente de TGF\beta-1. Se cultivaron monocitos durante 6 días con las citoquinas mostradas encima de los histogramas con 300 ng/mL diarios o sin anticuerpo anti-TGF\beta-1, y se tiñeron como se indica. La Figura 3D muestra el hecho de que las células inducidas por GM-CSF+IL-15, pero no así las células inducidas por GM-CSF+IL-4, presentan el fenotipo de las células de Langerhans.

Las Figuras 4A, 4B y 4C muestran la capacidad aloestimuladora de las DCs derivadas de GM-CSF+IL-15. Las DCs activadas con poli (I):(C) o las DCs no activadas fueron cultivadas como se describe en la presente memoria, y fueron cultivadas conjuntamente con células T (1 x 10^{5}) alogénicas CD4^{+} (Figura 4A) o CD8^{+} durante 5 días (Figura 4B). Se añadieron pulsos de timidina a los cultivos durante 16 horas. La Figura 4C muestra una comparación de DCs cultivadas en GM-CSF+IL-15, en GM-CSF+IL-4, en GM-CSF+IL-4+TGF\beta-1, o sólo en GM-CSF en un MLR alogénico.

Las Figuras 5A y 5B muestran la presentación de TT (toxoide del tétanos) o de cuerpos celulares moribundas mediante DCs derivadas de GM-CSF+IL-15. Las DCs se cultivaron como se describe en la presente memoria. Las DCs derivadas de GM-CSF+IL-15 y las DCs derivadas de GM-CSF+IL-4 fueron tratadas con TT (Figura 5A) o con cuerpos celulares moribundos de Me 275 (Figura 5B) a 37ºC durante 2 horas. Las DCs fueron lavadas y cultivadas con 1 x 10^{5} células T CD4^{+} naïve durante 5 días. Los cultivos celulares fueron sometidos a pulsos de timidina durante las últimas 16 horas y se midió la incorporación de radionucleótidos mediante espectroscopía de centelleo \beta.

La Figura 6 muestra DCs de GM-CSF+IL-15 que inducen un modelo de citoquina distintivo en células T CD4+ alogénicas "naive". Se cultivaron DCs derivadas de GM-CSF+IL-15 (5 x 10^{3}) junto con células T CD4^{+} (1 x 10^{5}) durante 5 días. Se recogieron los sobrenadantes y las células fueron estimuladas con fitohemaglutinina (PHA) durante 24 horas. Se recogieron los sobrenadantes y se determinó la presencia de citoquinas usando kits ELISA. Cada punto representa un experimento independiente. Los histogramas representan las medias de todos los experimentos.

Las Figuras 7A y 7B muestran el hecho de que las DCs derivadas de GM-CSF+IL-15 inducen respuestas inmunes de recuerdo frente a antígenos víricos. Se activaron HLA-A201+DCs con una mezcla de citoquinas de macrófago (GM-CSF/IL-1/TNF-\alpha/IL-6) o con CD40L y se sometieron a pulsos durante 16 horas con péptido de matriz de gripe (Flu-MP). A continuación fueron recogidas y usadas como células estimuladoras de células T CD8^{+} autólogas. Las células T CD8^{+} efectoras específicas de antígeno Flu-MP fueron expandidas durante 14 días con re-estimulación con DCs cargadas de péptidos después de la primera semana de cultivo. Se recogieron las células efectoras y se determinó su capacidad para matar células T2 (HLA-A201+hibridoma deficiente en TAP), sin pulsos (control negativo) o con pulsos de péptido Flu-MP en un ensayo de liberación de cromo estándar. La lisis específica se determinó para las relaciones E:T 1:1; 1:2,5; 1:5; 1:1,75 y 1:30 (Figura 7A). Se recogieron las células efectoras y se determinó el número de células secretoras de IFN-\gamma por 100.000 efectores. Los datos representan el número de células IFN\gamma^{+} que responden a células T2 sometidas a pulsos de péptido Flu-MP (Figura 7B).

La Figura 8 muestra la falta de proliferación de células obtenidas mediante el cultivo de monocitos purificados mediante el protocolo de agotamiento negativo en presencia únicamente de IL-15 y únicamente de IL-4, y la proliferación de células obtenidas cultivando células obtenidas mediante el protocolo adherente en presencia únicamente de IL-15 y únicamente de IL-4. Posteriormente, las células fueron cultivadas en una placa de 96 pocillos durante otras 10 horas en presencia de ^{3}H-timidina. Entonces se midió la captación de timidina mediante un contador beta.

Las Figuras 9A, 9B, 9C, 9D, 9E y 9F muestran estudios cinéticos con respecto al tiempo que indican que las células obtenidas mediante el cultivo de monocitos purificados en presencia de IL-15 no son células dendríticas inmaduras. Los monocitos purificados mediante agotamiento negativo se cultivaron en placas de 6 pocillos en presencia de IL-15. Al segundo día (Figuras 9A y 9B), al cuarto día (Figuras 9C y 9D) y al sexto día (Figuras 9E y 9F), se extrajo una alícuota de células y se tiñeron con anti-HLA-DR, anti-CD1a, anti-CD14, anti-CD80, anti-CD83 y anti-CD86, y se analizaron mediante citometría de flujo.

Las Figuras 10A y 10B muestran que la IL-15 en combinación con GM-CSF puede inducir monocitos a partir de sangre de pacientes con melanoma en estadio IV para diferenciarse en células dendríticas en las condiciones aprobadas para uso clínico de células generadas, es decir, en un medio X-VIVO complementado con suero autólogo al 10%. Las células dendríticas inducidas se pueden activar/inducir hasta madurez mediante una mezcla de citoquinas de macrófago (GM-CSF/IL-1/TNF-\alpha/IL-6), las cuales están todas aprobadas para la generación de células destinadas a ser inyectadas a pacientes.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe composiciones y métodos de producción de células dendríticas inmaduras y de células dendríticas maduras, más preferiblemente células dendríticas presentadoras de antígenos, incluso más preferiblemente de origen humano, usando interleucina-15 (IL-15) en combinación con GM-CSF durante aproximadamente de 24 horas a 15 días, para provocar o estimular la diferenciación o la producción de células dendríticas completamente funcionales o de células dendríticas inmaduras, a partir de precursores de las mismas in vitro o ex vivo.

Tal como se demuestra en la presente memoria, la combinación de IL-15 y GM-CSF es capaz de provocar, inducir o estimular la diferenciación de monocitos y de transformar precursores de DC en células dendríticas ("DCs"). Células CD14^{+} sanguíneas adherentes enriquecidas cultivadas durante seis días con GM-CSF y con IL-15 se diferenciaron en DCs CD1a^{+}HLA-DR^{+}CD14^{-} típicamente inmaduras. Al contrario que los cultivos hechos con GM-CSF+IL-4, del 5 al 10% de las DCs derivadas de GM-CSF+IL-15 (DCs IL-15) expresan marcadores específicos de células de Langerhans (por ejemplo, LAG-Langerina y CCR6). Las células de Langerhans (LCs) de la piel y de otros epitelios mucosales representan una subcategoría de DCs inmaduras que migran al nodo linfático drenante tras la captura de antígenos procedentes de patógenos invasores. Si se desea, dicha subcategoría de LCs puede eliminarse de la composición mediante agotamiento.

Los resultados presentados en la presente memoria describen también que las DCs inmaduras obtenidas usando IL-15 en combinación con GM-CSF capturan de forma eficaz antígenos solubles y en partículas, tal como se demuestra usando FITC-Dextrano y cuerpos celulares moribundos. Además, agentes tales como LPS, TNF-\alpha y CD40L disminuyen la capacidad de captura de antígenos de las DCs IL-15, y promueven su maduración (CD83^{+} DC-LAMP^{+}). Estas DCs también son capaces de inducir la proliferación de células T CD4^{+} y CD8^{+} alogénicas y son capaces de procesar o de presentar antígenos solubles (TT) y en partícula (cuerpos celulares moribundos) a linfocitos T autólogos. Adicionalmente, las DCs maduras, cargadas con péptido Flu-MP, son capaces de inducir la expresión de células T CD8^{+} productoras de INF\gamma y de CTLs específicas de péptido. Las células T CD4+ cultivadas en presencia de estas DCs producen niveles elevados de IFN\gamma, bajos de IL-10 y nada de IL-4, lo que indica una desactivación de tipo Th_{1}. Considerados en conjunto, estos resultados demuestran por tanto un nuevo papel para la IL-15 en la generación de DCs, particularmente de LCs.

La interleucina-15 (IL-15) es una citoquina conocida, cuyo aislamiento, clonación y secuencia fueron publicados por Grabstein y col. (Patente de EE.UU. Nº 5.747.024; y Grabstein y col., 1994, Science 246: 965-968) y se presenta en la SEQ ID NO: 1 (la secuencia de aminoácidos se presenta en la SEQ ID NO: 2). La IL-15 usa la cadena IL-2R\gamma común a IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-13, y en la técnica se han descrito varias propiedades de la IL-15, tales como un potente efecto adyuvante cuando se administra en combinación con un antígeno de vacuna tal como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.747.024. En el contexto de la presente invención, la IL-15 se refiere al polipéptido, o al correspondiente ácido nucleico, tal como se describe en la SEQ ID NO: 1, así como a cualquier variante del mismo, incluyendo cualquier derivado u homólogo natural aislado a partir de diversas especies de mamíferos. De forma más general, las variantes abarcan cualquier polipéptido que tenga una o varias modificaciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1, incluyendo mutación(es), eliminación(es), inserción(es), sustitución(es), solas o en diversas combinaciones. Más particularmente, las variantes usadas en la presente memoria son cualquier polipéptido que tenga la propiedad de estimular o de inducir la producción de células dendríticas a partir de monocitos tal como se describe en la presente memoria, codificado por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida, bajo condiciones convencionales de severidad moderada, con la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEQ ID NO: 1. También preferiblemente, la IL-15 tiene una identidad de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2.

Más preferiblemente, la IL-15 es una IL-15 recombinante, es decir, producida mediante expresión, en cualquier célula hospedante adecuada, de una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido. Las células hospedantes adecuadas incluyen, por ejemplo, células de mamífero, células procarióticas o células de levadura. A este respecto, la IL-15 humana recombinante se encuentra disponible comercialmente a partir de diferentes suministradores, que incluyen R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, EE.UU.). Una IL-15 preferida para su uso en la presente invención es una IL-15 humana, incluso más preferiblemente una IL-15 humana recombinante. Para su uso en la presente invención, aunque se prefieren las preparaciones de IL-15 esencialmente puras, debe entenderse que puede usarse cualquier preparación de IL-15, en combinación con otros factores, diluyentes, adyuvantes, fluidos biológicos, etc. Además, aunque el proceso utiliza preferiblemente un polipéptido de IL-15, la invención también incluye el uso de cualquier molécula de ácido nucleico que codifique IL-15. En concreto, las células precursoras pueden ponerse en contacto directamente con un ácido nucleico que codifica IL-15 incorporado en un vector de expresión adecuado, o con una población de células que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica IL-15 y que expresa IL-15. Dichas células pueden producir adicionalmente un factor de crecimiento tal como el GM-CSF.

Para llevar a cabo la presente invención, los precursores de DC se ponen en contacto o se tratan con IL-15 y con GM-CSF, in vitro o ex vivo. Los precursores de DC incluyen cualquier célula o población de células que es capaz de diferenciarse en células dendríticas in vitro o ex vivo, cuando son tratadas de acuerdo con la presente invención. Los precursores de DC típicos incluyen monocitos y precursores de DC en circulación. Para los usos in vitro o ex vivo, los precursores de DC pueden obtenerse a partir de varios materiales biológicos, incluyendo sangre y médula ósea, preferiblemente sangre. Normalmente los precursores de DC comprenden células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) o monocitos sanguíneos periféricos aislados a partir de ellas. Las PBMC se pueden preparar mediante aféresis convencional, y los monocitos se pueden aislar mediante gradiente de Ficoll, opcionalmente acoplado a agotamiento de las células T, las células B y/o las células NK. Los ejemplos de métodos de aislamiento de precursores de DC útiles en la presente invención han sido publicados por Inaba y col. (Inaba y col., 1992, J Exp Med 175: 1157) y por Romani y col. (Romani y col., 1994, J Exp Med 180: 83).

Para las aplicaciones in vitro y ex vivo, los precursores de DC se pueden poner en contacto con IL-15 y con GM-CSF, en cualquier dispositivo apropiado, tal como una placa, un pocillo, un matraz, un tubo, etc., y preferiblemente en condiciones estériles. Normalmente se usan entre 1 x 10^{4} y 1 x 10^{8} células, más preferiblemente entre 1 x 10^{5} y 1 x 10^{7} células, dependiendo de la cantidad de precursores de DC disponibles o recogidos. La cantidad de citoquina y/o de GM-CSF puede ser ajustada por el especialista en la técnica. Normalmente, la IL-15 se usa en una concentración entre aproximadamente 50 ng/mL y aproximadamente 500 ng/mL, y más preferiblemente entre aproximadamente 100 ng/mL y aproximadamente 300 ng/mL. El GM-CSF se puede emplear en una concentración entre aproximadamente 10 ng/mL y aproximadamente 300 ng/mL, y más preferiblemente entre aproximadamente 50 ng/mL y aproximadamente 200 ng/mL. Las células se ponen en contacto in vitro con los anteriores reactivos durante aproximadamente de 24 horas a 15 días. Habitualmente, se producen DCs inmaduras y son recogidas entre el tercer y el séptimo Día tras la estimulación de los precursores de DC, preferiblemente entre el cuarto y sexto Día después del tratamiento. Normalmente, 1 x 10^{6} células precursoras de DC (por ejemplo, monocitos) dan lugar a aproximadamente 1 x 10^{3} DCs inmaduras. Las DCs inmaduras obtenidas se caracterizan particularmente por la expresión de CD1a y HLA-DR, por la ausencia de CD14, y por niveles mínimos o nulos de expresión de DC-LAMP (glicoproteína de membrana asociada a lisosoma de DC), de CD40, de CD80 y de CD83.

Las DCs inmaduras pueden recolectarse y mantenerse en cualquier medio de cultivo adecuado, tal como RPMI (GIBCO BRL, Grand Island, NY, EE.UU.), X-VIVO 15 (Bio Whittaker, Inc., Walkersville, MD, EE.UU.), AIMV (GIBCO BRL, Grand Island, NY, EE.UU.) y DMEM (GIBCO BRL, Grand Island, NY, EE.UU.), etc. Las células se pueden almacenar o congelar en condiciones convencionales. Se puede determinar la calidad, la pureza y la ausencia de contaminación usando métodos convencionales conocidos en la técnica, tal como el marcado con anticuerpos, el marcado con colorante, etc.

Un aspecto preferido de esta invención reside en la inducción o estimulación de la diferenciación de células dendríticas a partir de precursores de monocitos de las mismas, que comprende poner en contacto los precursores con una combinación de IL-15 y GM-CSF, in vitro o ex vivo. En una realización específica de esta invención, se producen células dendríticas inmaduras o células dendríticas activadas a partir de precursores de células dendríticas de monocitos poniendo en contacto los precursores con una combinación de IL-15 y GM-CSF, in vitro o ex vivo.

Las DCs inmaduras tienen utilidad en muchas aplicaciones, incluyendo diagnosis, terapia, vacunación, investigación, escrutinio, administración de genes, etc. En concreto, debido a sus potentes propiedades inmunogénicas, las DCs pueden sensibilizarse frente a un antígeno y usarse para modular una reacción o respuesta inmune in vivo, por ejemplo para inducir tolerancia específica de antígeno. Tal como se usa en la presente memoria, la modulación de la respuesta inmune mediante DCs incluye incrementos, disminuciones o cambios de otros tipos de respuestas inmunes.

Las DCs activadas tienen utilidad en muchas aplicaciones, incluyendo diagnosis, terapia, vacunación, investigación, escrutinio, administración de genes, etc. En concreto, debido a sus potentes propiedades inmunogénicas, las DCs pueden sensibilizarse frente a un antígeno y usarse para provocar, inducir o estimular una reacción o respuesta inmune in vivo. También pueden usarse para producir, escrutar o expandir, in vitro o ex vivo, linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno.

A este respecto, las DCs pueden sensibilizarse frente a uno o varios antígenos de acuerdo con los diversos procedimientos conocidos en la técnica, tal como poniendo las DCs en contacto con un antígeno ("pulso de antígeno"), con un péptido de antígeno ("pulso de péptido"), con un complejo proteico antigénico, con células o con membranas celulares que expresan antígenos o péptidos antigénicos, con texosomas, con liposomas que contienen antígenos o péptidos de antígenos, con ácidos nucleicos que codifican antígenos o péptidos antigénicos (posiblemente incorporados en vectores de plásmidos o víricos), o con ARNs totales de células tumorales. Estos métodos se han descrito, por ejemplo, en la Solicitud Internacional Nº WO99/03499. Los antígenos pueden ser antígenos tumorales, antígenos víricos, antígenos bacterianos, etc., de forma más general, cualquier péptido o polipéptido contra el que se busca una reapuesta o reacción inmune. El término "sensibilizado" indica que el antígeno, o una porción del mismo, es expuesto a la superficie de las DCs, preferiblemente formando un complejo con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, del inglés "major histocompatibility complex").

También se pueden usar células dendríticas inmaduras para producir vesículas de membrana (también denominadas dexosomas), tal como se describe en el documento WO99/03499, antes o después de la sensibilización a antígeno. A este respecto, un objetivo concreto de esta invención se refiere a un método para producir vesículas de membrana, que comprende (1) proporcionar células dendríticas inmaduras poniendo en contacto precursores de monocito de las mismas con IL-15 y GM-CSF, (2) cultivar las células dendríticas en condiciones que permitan la liberación de vesículas de membrana, y (3) aislar las vesículas de membrana. Incluso más preferiblemente, el método comprende, antes de la Etapa (2), una sensibilización de las DCs frente a uno o varios antígenos. En la Etapa (1), los precursores de DC se ponen en contacto con una combinación de IL-15 y GM-CSF, tal como se describe en la presente memoria. En la Etapa (2), las DCs se pueden cultivar en cualquier medio convencional, preferiblemente en presencia de un compuesto y/o tratamiento y/o entorno estimulante, para aumentar la liberación de vesículas de membrana. Las condiciones estimulantes preferidas incluyen el cultivo en presencia de citoquina(s), más preferiblemente IL-10, interferón gamma (IFN-\gamma) o IL-12, irradiación y/o pH bajo (por ejemplo, pH = 5), tal como se describe en WO99/03499. Las vesículas de membrana (o dexosomas) se pueden recuperar, por ejemplo, mediante centrifugación y/o métodos
cromatográficos.

Tal como se ha indicado antes, estas vesículas de membrana o células dendríticas se pueden usar para la preparación de una composición farmacéutica para modular una respuesta inmune en un paciente, en particular en un mamífero, más preferiblemente en un humano. A este respecto, la composición farmacéutica se destina para la administración al paciente de una cantidad eficaz de células dendríticas preparadas en presencia de IL-15 y de GM-CSF, o de vesículas de membrana derivadas de las mismas. Incluso más preferiblemente, las células dendríticas y/o las vesículas de membrana son sensibilizadas frente a uno o a varios antígenos. En una realización específica, las DCs se han preparado a partir de precursores sanguíneos, se han cultivado en presencia de IL-15 y de GM-CSF.

Las DCs preparadas de acuerdo con los anteriores métodos pueden además ser activadas o cultivadas in vitro o ex vivo en condiciones que permitan su maduración. A este respecto, un objetivo de la presente invención reside en un método para producir DCs maduras, que comprende (1) preparar células dendríticas inmaduras poniendo en contacto precursores de monocitos de las mismas con IL-15 en presencia de GM-CSF durante aproximadamente de 24 horas a 15 días, y (2) cultivar las células dendríticas en las condiciones que permitan su maduración, preferiblemente en presencia de lipopolisacáridos (LPS), CD40L o poli (I):(C). Las DCs maduras muestran una elevada expresión de CD80, CD83 y CD86. Las DCs maduras pueden sensibilizarse frente a antígenos, tanto antes como durante o después de la maduración.

Otro objetivo de la presente invención reside en un método de producción de CTL específico de antígeno in vivo o ex vivo, que comprende poner en contacto células dendríticas sensibilizadas frente a antígeno tal como se ha descrito antes con una población de células que comprenden linfocitos T, y recuperar los CTLs activados que son específicos del antígeno. La población que comprende linfocitos T puede estar constituida por linfocitos T CD8+ aislados o por células mononucleares sanguíneas periféricas. Los CTLs activados se pueden recuperar y seleccionar midiendo la proliferación clonal, mediante lisis celular dirigida y/o mediante liberación e citoquinas, tal como se describe en los ejemplos proporcionados en la presente memoria. Los CTLs específicos de antígeno pueden expandirse mediante cultivo en presencia de DCs sensibilizadas a antígeno. Este método también es aplicable a la producción de linfocitos T CD4+ activados. Además, el método también puede llevarse a cabo in vivo, para activar o para aumentar una respuesta de CTL o una respuesta de CD4+ frente a un antígeno in vivo.

La invención también incluye composiciones de materia que comprenden células dendríticas inmaduras para la preparación de una composición farmacéutica para modular vesículas de membrana derivadas de las mismas, obtenibles como se ha descrito anteriormente. En concreto, la invención se refiere a composiciones que comprenden células dendríticas inmaduras obtenidas poniendo en contacto in vitro o ex vivo precursores de monocitos de las mismas en presencia de IL-15 y de GM-CSF durante aproximadamente de 24 horas a 15 días, más particularmente células dendríticas inmaduras humanas. Dichas células dendríticas pueden sensibilizarse frente a uno o a varios antígenos, tal como se ha descrito antes.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden vesículas de membrana obtenidas a partir de células dendríticas obtenidas poniendo en contacto in vitro o ex vivo precursores de las mismas en presencia de IL-15 y de GM-CSF. Las composiciones pueden comprender cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un tampón, una disolución salina y adyuvantes. Se pueden usar para inducir o estimular una respuesta o una reacción inmune in vivo, por ejemplo, para tratar a un paciente con un tumor o una enfermedad inmune tal como alergia, asma, y/o enfermedades autoinmunes. Son especialmente adecuadas para tratar el cáncer en un paciente.

Otra realización específica de esta invención reside en un método para producir células dendríticas maduras a partir de precursores de monocitos de células dendríticas, que comprende poner en contacto dichos precursores con IL-15 y con GM-CSF como se describe en la presente memoria in vitro o ex vivo, y cultivar las células dendríticas inmaduras obtenidas de ese modo en presencia de un agente de maduración y en las condiciones necesarias para promover la maduración de dichas células dendríticas inmaduras para formar células dendríticas maduras. La invención también inclu-
ye composiciones de materia que comprenden células dendríticas maduras producidas de acuerdo con dicho método.

Anticuerpos monoclonales y factores de crecimiento recombinantes y reactivos

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) usados en este estudio fueron: CD14, HLA-DR (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.); CD86, (PharMingen, San Diego, CA, EE.UU.); CD40, HLA-AB, CCR6 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.), CD1a (Dako Corp., Carpinteria, CA, EE.UU.), CD80 y CD83 (Coulter/Immunotech, Fullerton, CA, EE.UU.).

Las citoquinas humanas recombinantes usadas en este estudio fueron: rhGM-CSF (100 ng/mL, Leukine, Immunex Corp., Seattle, WA, EE.UU.); rhIL-4 (20 ng/mL, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.); rhIL-15 (200 ng/mL, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.); TGF-\beta1 (10 ng/mL, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.); y huCD40L (Immunex Corp., Seattle, WA, EE.UU.).

El medio RPMI completo consistió en RPMI 1640, un 1% de L-Glutamina, un 1% de penicilina/estreptomicina, 2-ME 50 mM, un 1% de piruvato sódico, un 1% de aminoácidos esenciales y un 10% de suero fetal de ternero desactivado por calor (todos de GIBCO BRL, Grand Island, NY, EE.UU.). El poli (I):(C) se compró en Pharmacia (Piscataway, NJ, EE.UU.), y el lipopolisacárido (LPS) se compró a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.).

Cultivo celular y análisis fenotípico de células dendríticas derivadas de monocitos

Se aislaron monocitos sanguíneos periféricos mediante agotamiento inmunomagnético (Dynabeads; Dynal Biotech, Lake Success, NY, EE.UU.) después de la separación de células mononucleares sanguíneas seguida de un gradiente de Ficoll-Paque^{TM}. Se recuperó la partícula para realizar la purificación de células T, y se aislaron monocitos negativamente mediante agotamiento magnético positivo de células T, células B y células asesinas naturales (NK, del inglés "natural killer") usando anticuerpos purificados anti-CD3, anti-CD16, anti-CD19, anti-CD56 y anti-glicoforina A. Después de eso, se cultivaron monocitos CD14^{+} enriquecidos en placas de 6 pocillos (1 x 10^{6} células/pocillo). Estas células se cultivaron durante 6 días en presencia de 100 ng/mL de GM-CSF y de 200 ng/mL de IL-15 (GM-CSF+IL-15), o de 100 ng/mL de GM-CSF y de 20 ng/mL de IL-4 (GM-CSF+IL-4). Al sexto Día, se recogieron las células y se tiñeron con anti-CD14-PE, anti-CD83-PE, anti-HLA-DR-PerCP y anti-CD1a-FITC. En algunos experimentos, las DCs fueron activadas con LPS (300 ng/mL), y se analizaron sus fenotipos. El análisis se llevó a cabo mediante FACS Calibur.

Actividad endocitótica de DC CD1a+

La actividad endocitótica de DCs se determinó como se indica a continuación. A los seis días se recogieron DCs derivadas de GM-CSF+IL-15 activadas con LPS (300 ng/mL) o no activadas, y se incubaron con 100 \mug/mL de FITC-Dextrano durante 30 minutos a 37ºC. A modo de control, parte de las DCs se incubó con la misma cantidad de FITC-Dextrano en hielo. Las células fueron lavadas con disolución salina tamponada de fosfato (PBS) fría con un 10% de suero fetal de ternero, y se analizaron mediante FACS Calibur o mediante microscopía confocal.

Microscopía Confocal

La tinción de inmunofluorescencia intracelular se llevó a cabo como se ha descrito previamente (de Saint Vis, y col., 1998, Immunity 9: 325-336; Valladeau y col., 2000, Immunity 12: 71-81). Se fijó las células en cubreobjetos recubiertos de polilisina durante 15 minutos con un 4% de paraformaldehído en PBS. Después de eso, dichas células fueron lavadas dos veces en glicina 10 mM en PBS y dos veces en PBS, y permeabilizadas con PBS que contenía un 0,5% de saponina y un 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 30 minutos. Los cubreobjetos fueron cultivados durante 30 minutos a temperatura ambiente con 5 \mug/mL de anti-DC-LAMP o de anti-Langerina (donados por los Drs. Lebecque y Saeland, Schering-Plough, Dardilly, Francia). Después de tres lavados, las células fueron incubadas durante 30 minutos con anticuerpos secundarios anti-ratón de asno marcados acoplados a rojo de Texas (Jackson Immuno Research Laboratorios, Inc., West Grove, PA, EE.UU.), se lavaron, se incubaron con suero preinmune de ratón durante 30 minutos, se lavaron de nuevo, se incubaron durante 30 minutos con un segundo anticuerpo primario anti-HLA-DR acoplado directamente a fluoresceína (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). Los cubreobjetos se montaron sobre tiras de vidrio con Fluoromount (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, EE.UU.). La microscopía confocal se llevó a cabo usando un microscopio TCS SP equipado con láseres de iones de argón y de kriptón (Leica Microsystem, Heidelberg, Alemania).

Proliferación de células T

Las DCs cultivadas en GM-CSF+IL-15, GM-CSF+IL-4 ó GM-CSF+IL-4/TGF-\beta1 fueron recogidas, lavadas con RPMI completo y cultivadas con 1 x 10^{5} células T alogénicas CD4^{+} o CD8^{+} recién aisladas derivadas de sangre periférica. En algunos experimentos, las DCs fueron activadas con poli (I):(C) (6,5 \mug/mL) durante 16 horas. Los cultivos de células T y DC se prepararon para 5 días en RPMI completo más suero AB humano al 10%. Durante las últimas 16 horas las células se sometieron a pulsos con 0,5 mCi de [^{3}H]-timidina por pocillo, y se midió la incorporación del radionucleótido mediante espectroscopía de centelleo \beta. Para determinar la proliferación de células T autólogas, se recogieron DCs GM-CSF+IL-15 ó GM-CSF+IL-4, se lavaron, y a continuación fueron sometidas a pulsos de toxoide del tétanos (TT) durante 48 horas. Después de eso, las DCs fueron lavadas tres veces con PBS y a continuación fueron resuspendidas en RPMI completo más suero AB humano al 10%. Las células se añadieron por triplicado en diversas concentraciones a 1 x 10^{5} células T autólogas/pocillo en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (Falcon, Oxnard, CA, EE.UU.). Para evaluar la captura de cuerpos celulares moribundos por las DCs, éstas fueron incubadas durante dos horas con cuerpos de la línea celular Me275, que se prepararon mediante tratamiento con ácido betulínico (10 \mug/mL, Aldrich, Milwaukee, WI, EE.UU.) durante 48 horas. Después de eso, las DCs fueron clasificadas en base a la dispersión hacia delante/lateral usando un FACS Vantage. A continuación las DCs se cultivaron junto con células T CD4^{+} autólogas. Las células T CD4^{+} ó CD8^{+} fueron aisladas mediante el procedimiento estándar Ficoll-paque seguido de agotamiento magnético de las células que no eran T (Dynabeads; Dynal Biotech, Lake Success, NY, EE.UU.).

Análisis de Citoquinas

Para el análisis de citoquinas, se recogieron los sobrenadantes 5 días después del cultivo conjunto de DCs derivadas de GM-CSF+IL-15 y células T CD4^{+}, y las células fueron re-estimuladas con PHA (10 \mug/mL) en medio fresco durante 24 horas. Después de eso, los sobrenadantes fueron recogidos y se determinó la liberación de citoquinas utilizando kits ELISA de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE.UU.).

Generación de CTL específico de antígeno

Se estimularon CDs derivadas de GM-CSF+IL-15 ó CDs derivadas de GM-CSF+IL-4 con CD40L o con una mezcla de citoquinas de macrófago (GM-CSF/TNF-\alpha/IL-1/IL-6). A continuación las DCs fueron lavadas y sometidas a pulsos con 10 \mug/mL de Flu-MP^{58-66} durante otras 18 horas. Las células T efectoras CD8^{+} (1 x 10^{6}) fueron aisladas mediante separación magnética de partículas y se cultivaron conjuntamente con DCs no sometidas a pulsos o con DCs sometidas a pulsos de Flu-MP en 1 mL de RPMI completo más suero AB humano al 10%. Todos los cultivos de CTL recibieron IL-7 (10 ng/mL) en el momento de formar el cultivo, e IL-2 (10 UI/mL) al séptimo Día de cultivo. Los CTL se cultivaron durante 14 días antes del ensayo. Los CTL se usaron para el ensayo de citotoxicidad al decimocuarto Día. Se colocó células efectoras (30 x 10^{3}/pocillo) sobre placas de fondo redondo de 96 pocillos con células diana T2 (1 x 10^{3}/pocillo) incubadas durante la noche con Flu-MP^{58-66} y se marcaron con ^{51}Cr (Amersham Pharmacia, Biotech, Inc., Piscataway, NJ, EE.UU.). Después de 4 horas, los sobrenadantes fueron recogidos usando un marco de recogida y se midió la proteína marcada con cromo usando un contador \gamma (Packard Instruments Co, Meriden, CT, EE.UU.). A continuación se determinó el porcentaje de lisis específica de antígeno.

Ensayo de Inmunomancha ligado a Enzima de INF-\gamma

Para determinar las células T efectoras productoras de IFN-\gamma, específicas de antígeno, se empleó un ensayo de inmunomancha ligado a enzima (ELISPOT), tal como se describe en Dhodapkar, y col. (Dhodapkar, y col., 1999, J Clin Invest 104: 173-180). Se añadieron células T CD8^{+} (1 x 10^{5}/pocillo) por triplicado a placas de 96 pocillos con nitrocelulosa en el fondo (MAHA S4510; Millipore Corp., Bedford, MA, EE.UU.) cubiertas previamente con el mAb anti-IFN-\gamma primario (1-D1K; Mabtech AB, Nacía, Suecia) en 50 \muL de RPMI completo por pocillo. Para la detección de células T reactivas específicas, se añadieron 1 x 10^{4}/pocillo (volumen final de 100 \muL/pocillo) DCs derivadas de monocitos maduras autólogas sometidas a pulsos con péptidos restringidos MHC de clase I (Flu-MP). Después de incubar durante 20 horas, los pocillos fueron lavados 6 veces, se incubaron con mAb secundario biotinilado contra IFN-\gamma (7B6-1; Mabtech AB) durante 2 horas, se lavaron y se tiñeron con un kit Vectastain Elite (Vector Laboratories, Inc., Bulingame, CA, EE.UU.). Las respuestas se contabilizaron como positivas si se detectaba un mínimo de 10 células formadoras de manchas (SFC)/2 x 10^{5}, y si el número de manchas era al menos el doble que el de los pocillos de control negativos.

Comparación de la fuente de monocitos en respuesta a la presencia únicamente de IL-15

Para determinar si la fuente de monocitos puede afectar a los resultados obtenidos cuando los monocitos son tratados únicamente con IL-15, los monocitos se obtuvieron empleando los siguientes dos protocolos: (1) agotamiento negativo mediante partículas magnéticas, y (2) un protocolo adherente. En el protocolo de agotamiento negativo, se aislaron monocitos sanguíneos periféricos mediante agotamiento inmunomagnético (Dynabeads, Dynal Biotech, Lake Success, NY, EE.UU.) después de la separación de células sanguíneas mononucleares seguida de un gradiente de Ficoll-Paque^{TM}. Se recuperó la partícula para purificación de células T y los monocitos fueron aislados negativamente mediante agotamiento magnético positivo de células T, células B y células NK usando anticuerpos purificados anti-CD3, anti-CD16, anti-CD19, anti-CD56 y anti-glicoforina A. Después de eso, los monocitos CD14^{+} enriquecidos fueron cultivados en placas de 6 pocillos (1 x 10^{6}/pocillo). Se cultivó una alícuota de dichas células durante 6 días en presencia únicamente de IL-15 y únicamente de IL-4, respectivamente. Al segundo Día, al cuarto Día y al sexto Día, las células fueron recogidas, teñidas con anti-CD14, anti-CD83, anti-CD80, anti-HLA-DR, anti-CD1a, anti-CD40 y anti-CD86, y se analizaron mediante FACS Calibur. En el protocolo adherente, se cultivaron linfocitos crudos en placas de 6 pocillos durante 2 horas, y las células fueron lavadas tres veces con PBS que contenía un 2% de FSC para eliminar las células no adherentes. A continuación las células adherentes fueron cultivadas únicamente con IL-15 y únicamente con IL-4. Se añadió timidina marcada a las células obtenidas mediante el protocolo de agotamiento negativo
y mediante el protocolo adherente, y se midió la captación de timidina al sexto Día empleando un contador \beta.

Ejemplo 1 Los monocitos cultivados con GM-CSF+IL-15 dan lugar a DCs inmaduras (DCs IL-15)

Se llevó a cabo un estudio para determinar si la IL-15 puede estar involucrada en la diferenciación de DC inmaduras, y más particularmente de LCs. Los monocitos fueron purificados intensamente mediante agotamiento negativo usando partículas magnéticas negativas (98%) y se cultivaron con IL-15 en combinación con GM-CSF. Después de seis días de cultivo en un medio que contenía GM-CSF+IL-15, la morfología de contraste de fases características de las DCs de IL-15 indicó una agregación celular extensiva. Se observó una agregación celular similar en los cultivos que contenían una combinación de GM-CSF+IL-4. El contraste de fases representativo y la tinción de Giemsa de las DCs de IL-15 revelaron velos extendidos, una morfología que sugiere la presencia de DCs. El análisis de citometría de flujo mostró que todas las células habían adquirido CD1a, habían perdido CD14 y habían expresado niveles relativamente altos de HLA-DR (Figura 1A). Por tanto, los monocitos cultivados con GM-CSF+IL-15 se diferenciaron en células con un fenotipo de DCs inmaduras. Los monocitos requirieron de 4 a 6 días de cultivo para diferenciarse completamente en DCs inmaduras (Figura 1B) (de aquí en adelante estas células se denominarán IL-15-DCs). Después de seis días, 1 x 10^{6} monocitos dieron lugar a una media de 0,53 x 10^{6} DCs inmaduras (media de 5 experimentos, SD = 176,86). La generación de DCs derivadas de IL-15 fue independiente de la producción de IL-4 endógena, determinado mediante adiciones diarias de anti-IL4 neutralizante. Dicho tratamiento impidió la diferenciación de monocitos en DCs como respuesta a GM-CSF+IL-4, pero no como respuesta a GM-CSF+IL-15, mientras que la adicción de anti-IL-15 o de cadena anti-IL-2R\gamma bloqueó significativamente la generación de DCs CD1a^{+} en respuesta a GM-CSF+IL-15.

Ejemplo 2 Las DCs de IL-15 pueden activarse a DCs maduras

Tal como se muestra en la Figura 2A, las DCs derivadas de IL-15 expresan HLA-ABC de Clase I, niveles bajos de CD86 y niveles mínimos de CD40, CD80 y CD83. Tras activación con LPS, las células muestran una expresión incrementada de CD40, CD80, CD86 y CD83. Las secciones de microscopía confocal revelaron la acumulación de DC-LAMP intracelular en la condición GM-CSF/IL-15, un marcador de DCs maduras. La maduración de DCs derivadas de IL-15 podría inducirse igualmente con LPS y con CD40L. Al contrario que las DCs generadas con IL-4, las DCs derivadas de IL-15 siempre muestran algunas células activadas tal como demuestra la expresión espontánea de DC-LAMP en el 5-10% de las células. Como DCs inmaduras, las DCs derivadas de IL-15 fueron capaces de capturar antígenos de forma eficaz, por ejemplo, FITC-Dextrano (Figura 2B). Sin embargo, perdieron dicha capacidad después de la maduración, por ejemplo, con LPS (Figura 2A).

Ejemplo 3 Las DCs de IL-15 incluyen LCs

Las células progenitoras hematopoyéticas CD34^{+} cultivadas con GM-CSF+TNF-\alpha dieron lugar tanto a DCs como a LCs intersticiales. Los monocitos cultivados con GM-CSF+IL-4 no se diferenciaron en LCs a menos que se añadiera a los cultivos TGF-\beta1. Hasta la fecha, dos marcadores distinguen LCs: CCR6, el receptor de defensina MIP-3 \alpha/\beta, y LAG/Langerina, una lectina implicada en la formación de gránulos Birbeck. Tal como se muestra en la Figura 3A, hasta el 10% de las DCs derivadas de IL-15 expresaron CCR6, mientras que las DCs generadas con GM-CSF+IL-4 no lo hicieron. Se llevó a cabo la microscopía confocal de inmunofluorescencia de HLA-DR/Langerina sobre DCs derivadas de monocitos cultivadas in vitro durante 6 días con GM-CSF+IL-4, GM-CSF+IL-15 y GM-CSF+IL-4/TGF-\beta1. Las secciones confocales revelaron la acumulación de Langerina intracelular en DCs generadas cultivando monocitos con GM-CSF+IL-15 y GM-CSF+IL-4/TGF-\beta1, pero no con GM-CSF+IL-4.

Ejemplo 4 Las DCs de IL-15 presentan antígenos solubles y particulados frente a células T

Las DCs de IL-15 son células presentadoras eficaces de antígenos que pueden inducir la proliferación de células T CD4^{+} y CD8^{+} alogénicas (Figuras 4A y 4B). Las DCs generadas mediante el cultivo de monocitos con GM-CSF+IL-15, GM-CSF+IL-4 o GM-CSF+IL-4/TGF-\beta1 fueron comparables en cuanto a su capacidad para inducir reacción de linfocitos mixtos alogénicos (MLR, del inglés "mixed lymphocyte reaction") (Figura 4C). Fueron considerablemente más eficaces que las células generadas únicamente con GM-CSF (Figura 4C). Las DCs de IL-15 activadas durante 24 horas con poli (I):(C) (Figuras 4A, 4B), CD40L ó LPS mostraron una capacidad de alo-estimulación incrementada. También se determinó la capacidad para presentar antígenos a las células T CD4^{+} autólogas. De este modo, las DCs de IL-15 cargadas con toxoide del tétanos soluble (TT) indujeron la proliferación de células T CD4^{+} (Figura 5A). Adicionalmente, las DCs de IL-15 que habían capturado cuerpos celulares moribundos también indujeron la proliferación de linfocitos T autólogos (Figura 5B).

Ejemplo 5 Las DCs de IL-15 inducen la producción de INF-\gamma en células T CD4^{+}

La capacidad de las DCs de IL-15 para orientar la diferenciación de células T se determinó cultivándolas con células T naive CD4^{+}CD45RA^{+}T durante cinco días. Después de eso, las células fueron lavadas y estimuladas con PHA, y se evaluó la producción de citoquinas de los sobrenadantes. Las DCs de IL-15 no activadas indujeron a las células T a producir grandes cantidades de IFN-\gamma, pero no de IL-4 o de IL-10 (Figura 6). Los cultivos conjuntos de células T y de DCs de IL-15 estimuladas con Poli (I):(C) contenían niveles superiores de IFN-\gamma (Figura 6). A continuación se pudo observar IL-10 en los sobrenadantes (Figura 6).

Ejemplo 6 Ensayo de citotoxicidad

Se evaluó la capacidad de las DCs de IL-15 para estimular respuestas de CTL restringidas a MHC de clase I. Las DCs de IL-15 fueron sometidas a pulsos con péptido Flu-MP y se usaron para estimular células T CD8^{+} purificadas. Después de dos ciclos de cultivos de siete días llevados a cabo en presencia de IL-7 (ambos ciclos) y de IL-2 (sólo el segundo ciclo), las células T excitadas fueron capaces de matar eficazmente células T2 cargadas con péptido Flu-MP (lisis específica al 55% con una relación E:T 2,5:1 y lisis específica al 60% con una relación E:T de 5:1). Las líneas celulares, generadas mediante cultivo conjunto con DCs de IL-15 no cargadas (DCs de control) indujeron menos de un 5% de lisis específica (Figura 7A). Sin embargo, tal como se muestra en la Figura 7B, las DCs de IL-15 cargadas con péptido de Flu-MP fueron comparables a las DCs de GM-CSF+IL-4 en lo que se refiere a la estimulación de la generación de precursores de CTL específicos de péptido capaces de producir IFN-\gamma. Las DCs no sometidas a pulsos no indujeron células específicas productoras de IFN-\gamma (Figura 7B).

Ejemplo 7 Cultivo de monocitos en presencia únicamente de IL-15

Cuando se cultivan monocitos purificados, obtenidos mediante el protocolo de agotamiento negativo, en presencia de IL-15 y de GM-CSF, las DCs de GM-GSF+IL-15 resultantes fueron CD1a^{+} y CD14^{-}, lo cual es indicativo de células dendríticas inmaduras. Sin embargo, cuando estos monocitos se cultivaron únicamente con IL-15, las células resultantes fueron CD1a^{+} y CD14^{+}, indicativo de células dendríticas precursoras y no de células dendríticas inmaduras. Tal como se muestra en la Figura 8, los monocitos purificados obtenidos mediante el protocolo de agotamiento negativo no proliferaron cuando se cultivaron en presencia de IL-15 o de IL-4. Los estudios cinéticos con el tiempo presentados en las Figuras 9A-9F demuestran además que las células obtenidas después de cultivar dichos monocitos purificados únicamente en IL-15 no eran células dendríticas inmaduras.

Tal como demuestran los estudios de captación de timidina ilustrados en la Figura 8, cuando se cultivaron células adherentes obtenidas mediante el protocolo adherente en presencia únicamente de IL-15, el cultivo celular resultante mostró evidencias de proliferación. Estos resultados indicaron que las células adherentes no sólo incluyeron monocitos sino también contaminaciones de células T, células B y células NK, que responden a la IL-15 mediante proliferación.

Tal como se ha indicado antes, la IL-15 en combinación con GM-CSF induce la diferenciación de monocitos altamente purificados en DCs inmaduros. Las células generadas en estas condiciones son comparables en muchos sentidos a las DCs generadas con GM-CSF+IL-4: 1) el mismo fenotipo; 2) la misma capacidad para capturar FITC-Dextrano y cuerpos celulares moribundos; 3) la misma capacidad para madurar como respuesta a diversos estímulos; 4) la misma capacidad para procesar y presentar antígenos solubles y particulados; 5) la misma capacidad para inducir la diferenciación de células T en el mecanismo Th1; y 6) la misma capacidad para inducir la diferenciación de células T CD8 en CTL específicas. Se observaron dos diferencias entre las DCs generadas en presencia de IL-4 y las DCs generadas en presencia de IL-15: 1) los cultivos de IL-15 incluyeron algunas DCs maduras tal como demuestra la expresión de DC-LAMP; y 2) los cultivos de IL-15 contenían células de Langerhans. Esta última observación es relevante para la IL-15, que es un producto de KCs, las células que rodean por completo las LCs dentro de la epidermis. Por tanto, los monocitos que salen al exterior de los vasos se diferenciarían en DCs intersticiales cuando se encontraran con el GM-CSF y la IL-4 producidos por las células mast dermales; pero se diferenciarían en células de Langerhans cuando se encontraran con el GM-CSF y la IL-15 producidos por KCs.

Ejemplo 8 La IL-15 induce la diferenciación de monocitos procedentes de pacientes con cáncer metastático en células dendríticas

Tal como se muestra en la Figura 10, la fracción adherente de las células mononucleares sanguíneas periféricas da lugar, al cultivarla con IL-15 y GM-CSF, a células con el fenotipo de las células dendríticas que incluyen el componente celular de Langerhans determinado mediante expresión superficial de Langerina. Dichas células se obtiene en un cultivo llevado a cabo en las condiciones aprobadas para uso clínico y para la re-inyección de células cultivadas a un paciente. Las células se generan en un medio de cultivo X-VIVO complementado con entre un 2 y un 10% de suero autólogo.

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\hskip1.05cmMohamadzadeh, Manssur

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<120> Composiciones y Métodos para Producir Células Presentadoras de Antígenos

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<130> 10347/21604

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<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 1202

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (317)..(805)

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 162

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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3

Claims (15)

1. Un método para producir células dendríticas inmaduras a partir de precursores de células dendríticas de monocitos in vitro o ex vivo, que comprende poner en contacto dichos precursores con una composición que comprende interleucina-15 y factor estimulador de colonia granulocito-macrófago durante aproximadamente entre 24 horas y 15 días.

2. El método de la Reivindicación 1, en donde dicha interleucina-15 se encuentra en una forma seleccionada del grupo que consiste en interleucina-15 aislada, un polipéptido recombinante de interleucina-15, un ácido nucleico que codifica interleucina-15, natural o diseñada artificialmente, en un vector de expresión adecuado, y una población celular que expresa un ácido nucleico que codifica interleucina-15.

3. El método de la Reivindicación 1, en donde dicho factor estimulador de colonia granulocito-macrófago se encuentra en una forma seleccionada del grupo que consiste en factor estimulador de colonia granulocito-macrófago aislado, un polipéptido recombinante de factor estimulador de colonia granulocito-macrófago, un ácido nucleico que codifica factor estimulador de colonia granulocito-macrófago en un vector de expresión adecuado, y una población celular que expresa un ácido nucleico que codifica factor estimulador de colonia granulocito-macrófago.

4. El método de las Reivindicaciones 1 a 3, que además comprende la sensibilización de dichas células dendríticas inmaduras frente a un antígeno.

5. Un método para la producción de células dendríticas maduras, que comprende la producción de células dendríticas inmaduras de acuerdo con el método de las Reivindicaciones 1 a 3, y el cultivo de dichas células dendríticas inmaduras en presencia de un agente de maduración y en las condiciones necesarias para promover la maduración de dichas células dendríticas inmaduras y formar células dendríticas maduras.

6. El método de la Reivindicación 5, que además comprende sensibilizar dichas células dendríticas frente a un antígeno antes, durante o después de la maduración.

7. El método de la Reivindicación 5 ó 6, en donde dicho agente de maduración se selecciona del grupo que consiste en lipopolisacárido, CD40L, poli (I) : (C) y una mezcla de citoquinas de macrófagos (GM-CSF/TNF-\alpha/IL-1/IL-6).

8. Un método para producir vesículas de membrana aisladas in vitro o ex vivo, que comprende producir células dendríticas inmaduras de acuerdo con el método de las Reivindicaciones 1 a 3, cultivar dichas células dendríticas inmaduras en presencia de al menos un factor estimulador para promover la liberación de vesículas de membrana; y aislar dichas vesículas de membrana.

9. El método de la Reivindicación 8, que además comprende sensibilizar dichas células dendríticas inmaduras frente a un antígeno antes o después de la liberación de las vesículas de membrana.

10. El método de las Reivindicaciones 8 ó 9, en donde dicho factor estimulador se selecciona del grupo que consiste en una citoquina adecuada, irradiación y pH bajo.

11. El uso de células dendríticas inmaduras mediante el método de las reivindicaciones 1 a 4, o de las vesículas de membrana que se pueden obtener mediante el método de la reivindicación 8, 9 ó 10, para la preparación de una composición farmacéutica para modular la respuesta inmune en un paciente.

12. Un método para producir linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno in vitro o ex vivo, que comprende proporcionar células dendríticas sensibilizadas a antígeno preparadas produciendo células dendríticas inmaduras según el método de las reivindicaciones 1 a 3, y posteriormente sensibilizar dichas células dendríticas frente a dicho antígeno, y poner en contacto dichas células dendríticas sensibilizadas a antígeno con una población de células que comprende linfocitos T para formar linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno activados.

13. Un método para producir linfocitos T CD4+ específicos de antígeno in vitro o ex vivo, que comprende proporcionar células dendríticas sensibilizadas a antígeno preparadas produciendo células dendríticas inmaduras según el método de las reivindicaciones 1 a 3, y posteriormente sensibilizar dichas células dendríticas frente a dicho antígeno, y poner en contacto dichas células dendríticas sensibilizadas a antígeno con una población de células que comprende linfocitos T para formar linfocitos T CD4+ específicos de antígeno activados.

14. Una composición que comprende células dendríticas inmaduras que incluyen un componente celular de Langerhans, determinado mediante la expresión de Langerina producida de acuerdo con el método de la Reivindicación 1 a 4.

15. Una composición que comprende vesículas de membrana producidas de acuerdo con el método de la Reivindicación 8, 9 ó 10.