ES2643943T3 - Potenciación de la capacidad de las células presentadoras de antígeno humanas para estimular células T tanto in vitro como in vivo y su uso en la vacunación - Google Patents
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Abstract
Una vacuna que comprende una o más moléculas de ARNm o ADN que codifican todas las proteínas inmunoestimuladoras funcionales CD40L, CD70 y caTLR4 (TLR4 constitutivamente activo) para usar en la inducción de una respuesta inmunitaria hacia un tumor en un sujeto, caracterizada porque dicha vacuna se administra a través de inyección intratumoral.
Description
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de ovario, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de mama, glioma, cáncer de colon, cáncer de vejiga, sarcoma, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepático, cáncer óseo, cáncer de la médula ósea, cáncer de estómago, cáncer de duodeno, cáncer esofágico, cáncer de tiroides, cáncer hematológico y linfoma. Los antígenos específicos para el cáncer pueden ser, por ejemplo, MelanA/MART1, antígenos de la línea germinal del cáncer, gp100, tirosinasa, CEA, PSA, Her-2/neu, survivina, telomerasa.
El término "enfermedad infecciosa" o "infección" utilizados a lo largo de la descripción no pretende limitarse a los tipos de infecciones que pueden haberse ejemplificado en la presente. Por lo tanto, el término abarca todos los agentes infecciosos contra los que la vacunación sería beneficiosa para el sujeto. Ejemplos no limitantes son las siguientes infecciones o trastornos causados por virus: Síndrome de inmunodeficiencia Adquirida -Infecciones por Adenoviridae -Infecciones por Alfavirus -Infecciones por Arbovirus -Parálisis de Bell -Enfermedad de Borna -Infecciones por Bunyaviridae -Infecciones por Caliciviridae -Varicela -Resfriado Común -Condiloma Acuminado -Infecciones por Coronaviridae -Infecciones por Coxsackievirus -Infecciones por Citomegalovirus -Dengue -Infecciones por Virus de ADN -Ectima Contagioso, -Encefalitis, Encefalitis, Arbovirus -Encefalitis, Herpes Simple -Infecciones por Virus de Epstein-Barr -Eritema Infeccioso -Exantema súbito -Síndrome de Fatiga, Crónico -Infecciones por Hantavirus -Fiebres Hemorrágicas Virales -Hepatitis Viral, en humanos -Herpes Labial -Herpes Simple -Herpes Zoster -Herpes Zoster ótico -Infecciones por Herpesviridae -Infecciones por VIH -Mononucleosis Infecciosa -Influenza en Aves -Influenza Humana -Fiebre de Lassa -Sarampión -Meningitis Viral -Molusco Contagioso -Viruela de los monos -Paperas -Mielitis -Infecciones por Papillomavirus -Infecciones por Paramyxoviridae -Fiebre de Phlebotomus -Poliomielitis -Infecciones por Polyomavirus -Síndrome Postpoliomielitis -Rabia -Infecciones Respiratorias por Virus Sincitial -Fiebre del Valle del Rift -Infecciones por Virus de ARN -Rubéola -Síndrome Respiratorio Agudo Severo -Enfermedades Virales Lentas -Viruela -Panencefalitis Esclerosante Subaguda -Enfermedades transmitidas por garrapatas -Infecciones por Virus Tumorales -Verrugas -Fiebre del Nilo Occidental -Enfermedades Virales -Fiebre Amarilla -Zoonosis -etcétera. Los antígenos específicos para los virus pueden ser HIV-gag, -tat, -rev o -nef, o antígenos de la Hepatitis C.
Otros ejemplos no limitantes son las siguientes infecciones o trastornos causados por bacterias u hongos: Abscesos -Actinomicosis -Anaplasmosis -Ántrax -Artritis Reactiva -Aspergilosis -Bacteriemia -Infecciones bacterianas y micosis
– Infecciones por Bartonella -Botulismo -Absceso Cerebral -Brucelosis -Infecciones por Burkholderia -Infecciones por Campylobacter -Candidiasis -Candidiasis, Vulvovaginal -Enfermedad por Rasguño de Gato -Celulitis -Infecciones del Sistema Nervioso Central -Chancroide -Infecciones por Chlamydia -Infecciones por Chlamydiaceae -Cólera -Infecciones por Clostridium -Coccidioidomicosis -Úlcera Corneal -Infección Cruzada -Criptococosis -Dermatomicosis -Difteria -Ehrlichiosis -Enfisema, Pleural -Endocarditis Bacteriana -Endoftalmitis -Enterocolitis, Pseudomembranosa – Erisipela -Infecciones por Escherichia coli -Fascitis necrotizante -Gangrena de Fournier -Forunculosis -Infecciones por Fusobacterium -Gangrena Gaseosa -Gonorrea -Infecciones Bacterianas Gram-negativas -Infecciones Bacterianas Gram-positivas -Granuloma Inguinal -Hidradenitis Supurativa -Histoplasmosis -Orzuelo -Impétigo -Infecciones por Klebsiella -Legionelosis -Lepra -Leptospirosis -Infecciones por Listeria -Angina de Ludwig -Absceso Pulmonar -Enfermedad de Lyme -Linfogranuloma Venéreo -Maduromicosis -Melioidosis -Meningitis, Bacteriana -Infecciones por Mycobacterium -Infecciones por Mycoplasma -Micosis -Infecciones por Nocardia -Onicomicosis -Osteomielitis -Paroniquia – Enfermedad inflamatoria pélvica – Peste -Infecciones Pneumocócicas -Infecciones por Pseudomonas -Psitacosis -Infección Puerperal -Fiebre Q -Fiebre por la Mordedura de Rata -Fiebre Recidivante -Infecciones del Tracto Respiratorio -Absceso Retrofaríngeo -Fiebre Reumática -Rinoescleroma -Infecciones por Rickettsia -Fiebre Maculosa de las Montañas Rocosas -Infecciones por Salmonella – Fiebre escarlata – Fiebre Tsutsugamushi – Sepsis – Enfermedades de transmisión sexual – Enfermedades de transmisión sexual, bacterianas – Choque séptico – Enfermedades cutáneas, bacterianas – Enfermedades cutáneas, infecciosas – Infecciones por estafilococos -Infecciones por estreptococos -Sífilis -Sífilis Congénita -Tétanos -Enfermedades transmitidas por garrapatas -Tiña -Tiña Versicolor -Tracoma -Tuberculosis -Tuberculosis de la médula espinal -Tularemia -Fiebre Tifoidea -Tifus, Epidémico transmitido por Piojos -Infecciones del tracto urinario -Enfermedad deWhipple -Tos ferina -Infecciones por Vibrio -Pian -Infecciones por Yersinia -Zoonosis -Cigomicosis -etcétera.
El término "trastorno inmunitario" abarca cualquier trastorno inmunitario, que incluye todos los trastornos o síndromes que implican una respuesta inmunitaria afectada o reducida. Ejemplos no limitantes de trastornos o síndromes que implican una respuesta inmunitaria afectada o reducida son las denominadas deficiencias inmunitarias primarias tales como: defectos congénitos del sistema inmunitario, deficiencia selectiva de IgA, inmunodeficiencia variable común, agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (tipo Bruton, infantil ligada al cromosoma X o agammaglobulinemia congénita), Enfermedad Granulomatosa Crónica, Síndrome Hiper-IgM y SCID (la clásica enfermedad del "niño burbuja"). Además, pueden ocurrir inmunodeficiencias adquiridas, tales como, pero sin limitarse a: SIDA o a sujetos que reciben quimioterapia o medicamentos inmunosupresores, tales como sujetos con cáncer y sujetos sometidos a un trasplante de órgano, o para otras diversas afecciones. Además, los pacientes con diabetes pueden sufrir de supresión inmunitaria leve y las personas mayores o los niños y los recién nacidos pueden tener un sistema inmunitario debilitado
o más débil. Todas estas afecciones, síndromes o trastornos se entiende que están cubiertos por el término "trastornos inmunitarios".
La presente solicitud proporciona nuevos métodos para potenciar las capacidades inmunoestimulantes de las CD humanas mediante la transfección con al menos dos moléculas diferentes de ARNm o ADN que codifican adyuvantes moleculares seleccionados de la lista de CD40L, CD70, caTLR4, IL12p70, EL-selectina, CCR7 y/o 4-1BBL; o en
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alfa, lo que indica que la adición de citocinas exógenas a las estimulaciones de células T puede alterar el resultado de las técnicas demonitoreo.
El uso de los métodos de la solicitud tiene una ventaja adicional sobre la técnica anterior en que la manipulación in vitro de las CD se reduce al mínimo para evitar la excreción de citocinas fisiológicamente relevantes en el medio de cultivo in vitro. Esto se logra mediante el uso de un método de transducción de una sola etapa altamente eficiente, preferentementemedianteelectroporación deARNm, quepermitela introducción simultánea deal menos dosmoléculas de ARNm que codifican adyuvantes moleculares (posiblemente en combinación con un antígeno específico de una diana). Esto permite a las CD liberar sus citocinas naturales en su ambiente futuro, ya sea in vitro para los experimentos
o in vivo en el paciente, dandolugar a un aumento de la respuesta inmunitaria de células T.
En otra modalidad, las CD de la solicitud son útiles en métodos para identificar nuevos marcadores específicos de una diana. Las CD modificadas pueden usarse para estimular células T de donantes sanos o pacientes que tienen cáncer o una enfermedad infecciosa, que fueron vacunados previamente o no con una vacuna que contenía un antígeno específico de la diana. Posteriormente, después de una o más estimulaciones con las CD modificadas, se pueden identificar las células T específicas para el antígeno diana y se puede caracterizar el epítopo derivado del antígeno diana contra el cual responden las células T.
Se demostró por primera vez que las CD humanas, derivadas demonocitos sometidas a electroporación con ARNm que codifica CD40L, CD70 y caTLR4 (creando así las CD con TriMix), adquieren un fenotipo maduro, aumentan su secreción decitocinas y quimiocinas y tienen una mayor capacidad para sesgar una respuesta decélulas CD4+ vírgenes a Th1 y para inducir células T CD8+ específicas para MelanA cuando se someten a pulsos con el péptido inmunodominante MelanA-A2.
Además, los inventores muestran que las CD con TriMix pueden someterse a co-electroporación con ARNm que codifica un antígeno (tumoral) en lugar de ser sometidas a pulsos con péptidos antigénicos. Este enfoque ofrece varias ventajas adicionales. En primer lugar, la maduración y la carga del antígeno (tumoral) de las CD pueden combinarse en una sola etapa. Evitar la etapa de pulsos con péptidos en la producción de vacunas da como resultado menos manipulación de las células y menos pérdida de células y riesgo de contaminación. En segundo lugar, con el uso de un ARNm que codifique un antígeno tumoral de longitud completa, se presentarán todos los epítopos antigénicos posibles del antígeno (tumoral) en lugar de algunos epítopos seleccionados. Por consiguiente, esta estrategia podría inducir una respuesta más amplia de células T específicas para el antígeno (tumoral) y no depende del conocimiento del haplotipo HLA de cada paciente ni de la identificación previa de los epítopos derivados del antígeno tumoral. En tercer lugar, el plásmido que codifica el antígeno (tumoral) puede modificarse genéticamentemediante la adición de una secuencia que se dirige al HLA clase II. Esto no sólo encamina el antígeno (tumoral) a los compartimentos de HLA clase II para su procesamiento y presentación de péptidos derivados del antígeno (tumoral) y restringidos a HLA clase II, sino que además potencia el procesamiento y la presentación en el contexto de moléculas de HLA clase I. Por supuesto, esto también es válido para antígenos no tumorales tales como antígenos derivados de virus, bacterias u hongos.
Los inventores confirmaron que no hay diferencias en la eficacia de la electroporación, el potencial de maduración y la secreción de citocinas cuando las CD con TriMix se prepararon como tal o se sometieron a co-electroporación con ARNm del antígeno tumoral.
Además, los inventores mostraron la capacidad de las CD con TriMix sometidas a co-electroporación con ARNm del antígeno tumoral para estimular las células T CD8+ específicas para MelanA, restringidas a HLA-A2 y se compararon con las CD con TriMix sometidas a pulsos con péptido. Se observó que las CD con TriMix sometidas a coelectroporación con ARNm de sig-MelanA-DCLamp de hecho fueron capaces de cebar las células T CD8+ específicas para MelanA, derivadas de la sangre de donantes sanos y que, al igual que sus contrapartes sometidas a pulsos con péptido, éstas eranmuchomás potentes quelas CD inmaduras omaduradas con cocteles de citocinas.
Cuando se compararon con las CD con TriMix sometidas a pulsos con péptido, los inventores observaron que después de 1 o 2 estimulaciones, las CD con TriMix sometidas a co-electroporación con ARNm del antígeno tumoral eran ligeramente menos potentes que las CD con TriMix sometidas a pulsos con péptido, mientras que después de 3 estimulaciones eran igualmente potentes en 2 de 4 experimentos. Aunque las CD con TriMix sometidas a coelectroporación parecen inducir una menor cantidad de células T específicas de un epítopo que sus contrapartes sometidas a pulsos con péptido en este contexto, esto no significa necesariamente que serán menos eficientes cuando se usen con fines de vacunación y esto tiene varias razones. En primer lugar, al investigar la funcionalidad cualitativa de las células T inducidas, observamos consistentemente que las células T estimuladas con CD con TriMix sometidas a coelectroporación indujeron más células que secretaban IFN-gamma y TNF-alfa. Además, la intensidad de fluorescencia media de la tinción intracelular de IFN-gamma aumentó, lo que indica que se había producido más citocina por célula. Estos datos sugieren que estas células T son multifuncionales, lo que se ha correlacionado con una mejor función efectora. En segundo lugar, como se analizó anteriormente, mediante la electroporación de ARNm de un antígeno tumoral de longitud completa unido a una señal orientadora a HLA clase II en las CD, se introducen todos los epítopos antigénicos, incluidos los epítopos no identificados y los epítopos restringidos a todos los haplotipos de HLA posibles tanto HLA clase I como clase II. Por lo tanto, este enfoque es propenso a inducir una respuesta más amplia de células T específicas para TAA.
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- % de células T CD8+ Intrámero de MelanA+/número de células T CD8+ (103)‡ Número absoluto de células T CD8+ tetrámero de MelanA+ (103)‡
- Exp 1
- Exp 2 Exp 3 Exp 4 Exp 1 Exp 2 Exp 3 Exp 4
- NGFR inm
- 0.4/3.4 0.5/2.1 0.1/2.8 0.1/1.35 13.7 10.7 2.8 1.35
- CD40L
- 60.2/5.4 6.7/2.1 5.6/2.8 1.1/1.5 3271 141 157 16.5
- CD70
- 3.3/3.6 0.9/1.7 0.2/2.2 0.2/1.65 120 15.4 4.4 3.3
- caTLR4
- 20.8/4.3 40.3/4.0 1.3/2.2 9.3/1.8 892 1596 29.1 167
- CD40L + CD70
- 65/8.9 17.3/2.0 17.1/4.0 1.8/1.75 5792 348 677 31.5
- CD40L + caTLR4
- 64/6.7 49.5/4.7 39.9/4.0 16.8/2.2 4301 2317 1612 370
- CD40L + CD70 + caTLR4
- ND/ND 60.5/5.5 40.2/6.2 63.2/1.1 ND 3303 2506 695
- NGFR mad
- 0.7/3.1 1.2/3.4 0.4/3.2 0.1/1.7 21.7 41.0 12.9 1.7
- † La población de células T generada después de 3 estimulaciones semanales con electroporación. Las CD sometidas a pulsos con péptido de Melan4 se tiñeron con tetrámeros de MelanA HLA-A2 y anti-CD6. Después se identificaron las células T CD6+ específicas para MelanA mediante citometría de flujo. La tinción de fondo con tetrámeros de HLA-A2 específicos para MAGE-A3 que nunca reaccionaron por encima de 0,5 %, se restó. La cantidad de células vivas se determinó por exclusión de azul de tripán.
- ‡ el número absoluto de células T CD8+ específicas para MelanA se calculó con la siguiente fórmula: (número de células T CD8+/100) x % de células T CD8+ tetrámero de MelanA+.
Propiedades funcionales y fenotípicas de las células T CD8+ estimuladas.
Finalmente, se evaluaron las propiedades funcionales y fenotípicas de las células T CD8+ estimuladas 3 veces con CD sometidas a pulsos con péptido de MelanA-A2 y electroporación de manera diferencial. Se investigaron los principales mecanismos efectores de las células T CD8+ estimuladas, es decir, citolisis y producción de citocinas. Primero realizamos un ensayo de movilización de CD107a (Figura 4B), que mide la exposición de CD107a, presente en la membrana de gránulos citotóxicos, sobre la superficie de células T como resultado de la desgranulación tras la estimulación antigénica. Se ha demostrado que la movilización de CD107a puede usarse como un marcador para la actividad lítica. En segundo lugar, se realizaron tinciones intracelulares de citocinas para enumerar la cantidad de células secretoras de IFN-gamma y/o TNF-alfa, ambos mediadores principales de la respuesta inmunitaria, tras la estimulación antigénica (Figura 4C). Para todos los donantes evaluados se observó que el porcentaje de células T específicas para MelanA, se correlacionó con el porcentaje de células T líticas y con el porcentaje de células T productoras de IFN-gamma/TNF-alfa. Por otra parte, también se analizó el fenotipo de las células T CD8+ específicas para MelanA inducidas. Las células T CD8+ específicas paraMelanA estimuladas eran todas CD45RA-CD45RO+ CD27+ CD28+, junto con una expresión variable de CD62L y CCR7 (Figura 4D). En general, no hubo diferencias significativas en el fenotipo de las células T CD8+ específicas para MelanA de los diferentes donantes, independientemente del tipo de CD que se utilizó para la estimulación.
Ejemplo 4: Las CD con TriMix pueden someterse a co-electroporación con ARNm de TAA sin afectar su eficacia de electroporación, fenotipomaduro y secreción de citocinas.
Materiales y métodos:
Construcciones genéticas.
Se han descrito los plásmidos pGEM-CD40L, pGEM-CD70, pGEM-caTLR4 que codifican CD40L, CD70 y la forma constitutivamente activa de TLR4 (que contiene los fragmentos intracelular y transmembrana de TLR4), respectivamente; el plásmido pGEM-NGFR que codifica una forma truncada del receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR, que contiene los fragmentos extracelular y transmembrana); y el plásmido pGEM-sig-MelanA-DCLamp que codifica el antígeno de MelanA de longitud completa, que contiene el epítopo MelanA-A2 inmunodominante optimizado y unido a la señal dirigida a CD-Lamp.
Generación in vitro de CD derivadas de monocitos humanos, transcripción in vitro de ARNm con caperuza y electroporación delas CD con ARNm.
La generación, maduración y crioconservación de CD inmaduras y maduradas con coctel de citocinas, la producción de ARNm con caperuza y la electroporación con ARNm de las CD TriMix sometidas a pulsos con péptido de MelanA se
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