ES2640813T3 - Linfocitos T de memoria central antiterceros, métodos para producirlos y uso de los mismos en un trasplante y el tratamiento de enfermedades - Google Patents
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Abstract
Un método para generar una población aislada de células que comprende células antiterceros que no inducen injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo dichas células, células inductoras de tolerancia y/o dotadas con actividad antienfermedad, y capaces de dirigirse a los ganglios linfáticos después del trasplante, comprendiendo el método: (a) tratar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con un agente capaz de agotar células CD4+ y/o CD56+ para obtener células T CD8+; (b) poner en contacto dichas células CD8+ con un tercer antígeno o terceros antígenos en presencia de IL-21 durante 12 horas hasta 5 días para permitir el enriquecimiento de células reactivas a antígeno; y (c) cultivar dichas células resultantes de la etapa (b) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin antígenos durante 5-20 días para permitir la proliferación de células que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de este modo la población aislada de células.
Description
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DESCRIPCION
Linfocitos T de memoria central antiterceros, metodos para producirlos y uso de los mismos en un trasplante y el tratamiento de enfermedades
Campo y antecedentes de la invencion
La presente invencion, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a celulas antiterceros reactivas para injerto contra leucemia y/o inductoras de tolerancia que comprenden el fenotipo de linfocitos T de memoria central y, mas particularmente, pero no exclusivamente, a metodos para generarlos y al uso de los mismos en el trasplante y en el tratamiento de enfermedad.
El trasplante de medula osea (MO) ofrece un tratamiento curativo para muchos pacientes con tumores malignos hematologicos y otros trastornos hematologicos. Sin embargo, el injerto de MO contiene celulas T donantes que responden a los anffgenos del hospedador (Ag) y provocan enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) multisistemica. A principios de los anos 80 se demostro el trasplante de medula osea (TMO), sin el efecto deletereo de GVHD, en situaciones haploidenticas (tres loci de HLA desapareados), en pacientes con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). El problema de la GVHD, que es casi uniformemente letal en dichas situaciones, se evito completamente por agotamiento de celulas T.
Sin embargo, en pacientes con leucemia, el resultado clrnico de MO con agotamiento de celulas T fue decepcionante, ya que el beneficio de la prevencion de la GVHD se compenso por un aumento notable de la tasa de rechazo de injertos. Se mostro que el rechazo estaba mediado por celulas T procedentes del hospedador resistentes a radioquimioterapia [Reisner et al., Proc Natl Acad Sci USA. (1986) 83: 4012-4015]. Un modo de superar este problema es realizar TMO despues de acondicionamiento supraletal e inactivacion funcional de celulas T hospedadoras usando farmacos inmunosupresores. No obstante, esta estrategia esta dificultada por infecciones oportunistas debido a la reconstitucion inmunitaria lenta y considerables toxicidades de los inmunosupresores.
Aunque en pacientes con leucemia de alto riesgo dicha mortalidad relacionada con el trasplante puede ser aceptable, seffa intolerable si se aplicara a pacientes con una larga esperanza de vida. Por lo tanto, el uso de acondicionamiento de intensidad reducida, con ablacion inmunitaria menos grave, para permitir la realizacion de injertos de MO con agotamiento de T (MOAT), que se asocia con riesgo reducido para GVHD, esta justificado. El establecimiento de quimerismo de tipo donante en dicho acondicionamiento reducido representa un objetivo mas deseable en la biologfa de trasplantes, ya que se asocia en general con tolerancia duradera a celulas o tejidos del donante original. Sin embargo, los niveles notables de celulas inmunitarias del hospedador que sobreviven a los regfmenes preparatorios suaves, representan una barrera diffcil para el injerto de celulas donantes.
Un enfoque para superar el rechazo de MOAT alogenica hizo uso de dosis celulares grandes. Se demostro en primer lugar en modelos de roedores que una “megadosis” de trasplante de MOAT puede superar el rechazo de injerto mediado por celulas T [Lapidot et al., Blood (1989) 73: 2025-2032; Bachar-Lustig et al., Nat Med. (1995) 1: 1268-1273; Uharek et al., Blood (1992) 79: 1612-1621]. Sin embargo, un aumento significativo en el inoculo de MO ha sido diffcil de conseguir en seres humanos. Para superar este problema se ha usado factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), que facilita la movilizacion de celulas madre hematopoyeticas (HSC, celulas CD34+ en seres humanos) de la MO, para aumentar la produccion de HSC recogidas de la sangre y se complemento la MOAT convencional con HSC con agotamiento de celulas T [Aversa et al., N Engl J Med. (1998) 339: 1186-1193; Aversa et al., J Clin Oncol. (2005) 23: 3447-3454; Reisner y Martelli, Immunol Today (1999) 20: 343-347; Handgretinger et al., Bone Marrow Transplant. (2001) 27: 777-783].
Los trasplantes de “megadosis” de CD34 plantearon dudas interesantes acerca de como estas celulas superan la barrera presentada por precursores de linfocitos T citotoxicos de los hospedadores (CTL-p). Esta duda no recibio respuesta, en parte, por el hallazgo de que las celulas dentro de la fraccion CD34 estan dotadas de una potente actividad de veto [Gur et al., Blood (2005) 105: 2585-2593; Gur et al., Blood (2002) 99: 4174-4181; Rachamim et al., Transplantation (1998) 65: 1386-1393]. Tambien se ha mostrado que otros tipos celulares median en la actividad de veto incluyendo linfocitos T (por ejemplo CTL CD8+), celulas citolfficas naturales y celulas dendffticas. La comparacion directa de la reactividad de veto de diversos tipos celulares revelo que los CTL comprenden el efecto de veto mas fuerte [Reich-Zeliger et al., J Immunol. (2004) 173: 6654-6659].
Un enfoque desarrollado para generar CTL de veto sin reactividad de GVH se describio por Reisner y colaboradores, en el que se estimularon CTL contra terceros estimulantes en ausencia de IL-2 exogena. Este enfoque se baso en la observacion de que solamente los CTLp activados eran capaces de sobrevivir a la privacion de IL-2 en el cultivo primario. Se ha mostrado in vitro e in vivo que este metodo agota la reactividad de GVH de los CTL de veto antiterceros [publicacion de PCT n.° WO 2001/049243, Bachar-Lustig et al., Blood. 2003;102: 1943-1950; Aviner et al., Hum Immunol. (2005) 66: 644-652]. La introduccion de estos CTL de veto antiterceros en un receptor (junto con un trasplante) evito el rechazo de injerto sin inducir GVHD (publicacion de PCT n.° WO 2001/049243).
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Se han contemplado diversos enfoques para trasplante de injertos sin rechazo de injertos y/o enfermedad de injerto contra hospedador, algunos de los cuales se resumen a continuacion.
La publicacion de PCT n.° WO 2007/023491 desvela el uso de celulas tolerogenicas para reducir o prevenir el rechazo de injertos de un injerto no singenico en un sujeto. Las celulas tolerogenicas desveladas (por ejemplo celulas CD4+CD25+) pueden proceder de cualquier donante que no sea singenico tanto para el sujeto como para el injerto ("terceras" celulas tolerogenicas). El injerto (por ejemplo medula osea) puede proceder de cualquier donante de injerto que sea alogenico o xenogenico con el sujeto.
La publicacion de PCT de patente n.° WO 2002/102971 desvela el uso de celulas progenitoras hematopoyeticas (HPC) cultivadas que comprenden actividad de veto potenciada para inducir tolerancia a un trasplante trasplantado de un donante a un receptor. Las celulas tolerogenicas desveladas expresan preferentemente CD33 y se administran antes de, simultaneamente con o despues del trasplante (por ejemplo trasplante de celulas u organo).
La publicacion de PCT de patente n.° WO 2002/043651 desvela el uso de una poblacion no inductora de GVHD de celulas efectoras inmunitarias para tratamiento de enfermedad. Para llegar a una poblacion no inductora de GVHD de celulas efectoras inmunitarias, se cocultiva una primera poblacion de celulas (por ejemplo linfocitos T) con una segunda poblacion de celulas que no es singenica con el sujeto y no es singenica con la primera poblacion de celulas (por ejemplo linfocitos B infectados por VEB) en condiciones que incluyen privacion de IL-2 seguida de complementacion con IL-2. Las celulas efectoras inmunitarias resultantes pueden usarse para tratar enfermedades tales como enfermedades malignas, enfermedades vmcas y enfermedades autoinmunitarias.
La patente de Estados Unidos n.° 6.759.035 desvela metodos para inhibir el rechazo de injertos e inducir tolerancia de celulas T en un receptor de trasplante de organos solido. Los metodos desvelados comprenden retirar celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de un donante y un receptor, cultivar las celulas donantes y receptoras juntas en presencia de un compuesto que induce actividad supresora de celulas T (por ejemplo TGF-p, IL-15 e IL-2) y administrar las celulas T supresoras receptoras al receptor junto con el trasplante para evitar que las celulas T del receptor destruyan celulas donantes, induciendo de este modo tolerancia y supervivencia a largo plazo del trasplante.
La patente de Estados Unidos n.° 6.803.036 desvela metodos para tratar celulas donantes para aliviar la enfermedad de injerto contra hospedador en un paciente receptor. Los metodos desvelados comprenden retirar PBMC de un donante y tratar las celulas con una composicion supresora (por ejemplo IL-10, IL-2, IL-4, IL-15 y TGF-p) durante un tiempo suficiente para inducir tolerancia a celulas T. Las celulas se introducen despues en un paciente receptor. Las celulas tratadas pueden anadirse a celulas madre donantes antes de la introduccion en el paciente.
La publicacion de PCT n.° WO 2010/049935 desvelo una poblacion aislada de celulas que comprenden celulas antiterceros no inductoras de GVHD que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas celulas inductoras de tolerancia y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues del trasplante.
Sumario de la invencion
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un metodo para generar una poblacion aislada de celulas que comprenden celulas antiterceros que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas celulas inductoras de tolerancia y/o dotadas de actividad antienfermedad, y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de trasplante, comprendiendo el metodo: (a) poner en contacto celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con un tercer anrtgeno o terceros anrtgenos en presencia de IL-21 para permitir el enriquecimiento de celulas reactivas a anrtgeno; y (b) cultivar las celulas resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin anrtgenos para permitir la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de este modo la poblacion aislada de celulas.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un metodo para generar una poblacion aislada de celulas que comprenden celulas antiterceros que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas celulas inductoras de tolerancia y/o dotadas con actividad de injerto contra leucemia (GVL) y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de trasplante, comprendiendo el metodo: (a) tratar celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) no adherentes con un agente capaz de agotar celulas CD4+ y/o CD56+ para obtener celulas T CD8+; (b) poner en contacto las celulas T CD8+ con terceras celulas dendnticas en presencia de IL-21 durante 12 horas hasta 5 dfas para permitir el enriquecimiento de celulas reactivas a anrtgeno; (c) cultivar las celulas resultantes de la etapa (b) con las terceras celulas dendnticas en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 durante 12 horas hasta 3 dfas; y (d) cultivar las celulas resultantes de la etapa (c) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin anrtgenos durante 5-20 dfas para permitir la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de este modo la poblacion aislada de celulas.
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De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un metodo para generar una poblacion aislada de celulas que comprenden celulas antiterceros que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), estando las celulas dotadas de actividad antienfermedad, y siendo las celulas capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues del trasplante, comprendiendo el metodo: (a) tratar celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) no adherentes con un agente capaz de agotar celulas CD4+ y/o CD56+ para obtener celulas T CD8+; (b) poner en contacto las celulas T CD8+ con celulas dendnticas no singenicas en presencia de IL- 21 durante 12 horas hasta 5 dfas para permitir el enriquecimiento de celulas reactivas a antfgeno; (c) cultivar las celulas resultantes de la etapa (b) con las celulas dendnticas no singenicas en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 durante 12 horas hasta 3 dfas; y (d) cultivar las celulas resultantes de la etapa (c) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin antfgenos durante 5-20 dfas para permitir la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de este modo la poblacion aislada de celulas.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona una poblacion aislada de celulas que comprenden celulas antiterceros que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), en las que al menos el 50 % de la poblacion aislada de celulas son celulas CD3+CD8+ de las que al menos el 50 % comprenden una identificacion CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA', CD45RO+ y ademas en las que las celulas son celulas inductoras de tolerancia y/o dotadas con actividad antienfermedad, y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues del trasplante.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona una poblacion aislada de celulas que comprenden celulas antiterceros que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas celulas inductoras de tolerancia y/o dotadas de actividad antienfermedad, y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de trasplante, generados de acuerdo con los presentes metodos.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un metodo para tratar una enfermedad en un sujeto que lo necesite, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad maligna, una enfermedad vmca y una enfermedad autoinmunitaria, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de la poblacion aislada de celulas de la presente invencion, tratando de este modo al sujeto.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un metodo para tratar un sujeto que necesite un trasplante celular o tisular, comprendiendo el metodo: (a) realizar un trasplante celular o tisular al sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de la poblacion aislada de celulas de la presente invencion, tratando de este modo al sujeto.
De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invencion se proporciona un metodo para tratar un sujeto que necesite un trasplante de celulas hematopoyeticas inmaduras, comprendiendo el metodo: (a) trasplantar celulas hematopoyeticas inmaduras al sujeto; y (b) administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de la poblacion aislada de celulas de la presente invencion, tratando de este modo al sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas agotar celulas no adherentes de las PBMC antes de la etapa (a).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas agotar celulas CD4+ y/o CD56+ de las PBMC antes de la etapa (a).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas seleccionar celulas CD45RA+ y/o CD45RO de las PBMC antes de la etapa (a).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las PBMC comprenden celulas T CD8+.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas cultivar las celulas resultantes de la etapa (a) con un tercer antfgeno o antfgenos en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el tercer antfgeno o los terceros antfgenos comprenden celulas dendnticas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas dendnticas son celulas dendnticas irradiadas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el tercer antfgeno o los terceros antfgenos se seleccionan del grupo que consiste en terceras celulas, un antfgeno celular, un antfgeno vmco, un antfgeno bacteriano, un extracto proteico, una protema modificada y un peptido sintetico presentado por celulas presentadoras autologas, celulas presentadoras no autologas o en un vetnculo artificial o en celulas presentadoras de antfgenos artificiales.
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De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las terceras celulas son celulas estimulantes seleccionadas del grupo que consiste en celulas purificadas de linfocitos de sangre periferica, bazo o ganglios linfaticos, PBL movilizadas por citocinas, celulas presentadoras de antfgenos (APC) expandidas in vitro, celulas dendrfticas expandidas in vitro y celulas presentadoras de antigenos artificiales.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas seleccionar celulas CD45RA+ y/o CD45RO- de las PBMC despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas T CD8+ comprenden celulas T CD8+ no tratadas previamente.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas dendrfticas comprenden celulas dendrfticas expandidas in vitro.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas dendrfticas comprenden celulas dendrfticas irradiadas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el contacto en presencia de IL-21 se efectua durante 12 horas a 5 dfas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el contacto en presencia de IL-21 se efectua durante 2-3 dfas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el contacto en presencia de IL-21 se efectua durante 3 dfas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas seleccionar celulas activadas despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas seleccionar celulas activadas despues de la etapa (b) y antes de la etapa (c).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la seleccion de celulas activadas se efectua por seleccion de celulas CD137+ y/o celulas CD25+.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la seleccion de celulas activadas se efectua 12-72 horas despues del contacto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el cultivo con el tercer antfgeno o los terceros antfgenos en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 se efectua durante 12 horas a 3 dfas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en el ambiente sin antfgenos se efectua durante 5-20 dfas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el cultivo en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en el ambiente sin antfgenos se efectua durante 7-11 dfas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas agotar celulas alorreactivas despues de la etapa (b).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas agotar celulas alorreactivas despues de la etapa (d).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el agotamiento de celulas alorreactivas se efectua por agotamiento de celulas CD137+ y/o CD25+ despues de poner en contacto las celulas que comprenden el linfocito T de memoria central (Tcm) con celulas presentadoras de antfgenos (APC) hospedadoras.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) son singenicas con respecto a un sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) no son singenicas con respecto a un sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las PBMC no singenicas son xenogenicas o alogenicas con respecto a un sujeto.
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De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las terceras celulas que tienen un fenotipo de memoria central T comprenden una identificacion CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, al menos el 50 % de la poblacion aislada de celulas son celulas CD3+CD8+ de las que al menos el 50 % tienen la identificacion.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la enfermedad maligna comprende una leucemia o un linfoma.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la poblacion aislada de celulas son singenicas con el sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la poblacion aislada de celulas no son singenicas con el sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas acondicionar el sujeto en condiciones subletales, letales o supraletales antes del trasplante.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el trasplante celular o tisular es singenico con el sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el trasplante celular o tisular procede de un donante seleccionado del grupo que consiste en un donante alogenico de HLA identico, un donante alogenico de HLA no identico y un donante xenogenico.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el trasplante celular o tisular comprende celulas hematopoyeticas inmaduras.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el trasplante celular o tisular se selecciona del grupo que consiste en un hngado, un pancreas, un bazo, un rinon, un corazon, un pulmon, una piel, un intestino y un tejido u organo linfoide/hematopoyetico.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el trasplante celular o tisular comprende un cotrasplante de varios organos.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el cotrasplante comprende el trasplante de celulas hematopoyeticas inmaduras y un organo solido.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas hematopoyeticas inmaduras y el organo solido u obtenido del mismo donante.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas hematopoyeticas inmaduras se trasplantan antes de, simultaneamente con o despues del trasplante del organo solido.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la poblacion aislada de celulas se administra antes de, simultaneamente con o despues del trasplante celular o tisular.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la poblacion aislada de celulas son singenicas con el sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la poblacion aislada de celulas no son singenicas con el sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el trasplante celular o tisular y la poblacion aislada de celulas proceden del mismo donante.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el trasplante celular o tisular es singenico con el sujeto y la poblacion aislada de celulas no son singenicas con el sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el trasplante celular o tisular es singenico con el sujeto y la poblacion aislada de celulas son singenicas con el sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, la poblacion aislada de celulas se administra antes de, simultaneamente con o despues de las celulas hematopoyeticas inmaduras.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas hematopoyeticas inmaduras y la poblacion aislada de celulas proceden del mismo donante.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el donante no es singenico con el sujeto.
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De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las celulas hematopoyeticas inmaduras y la poblacion aislada de celulas proceden del sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el metodo comprende ademas acondicionar al sujeto en condiciones subletales, letales o supraletales antes del trasplante.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el sujeto es un sujeto humano.
A no ser que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y/o cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la invencion. Aunque pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica o el ensayo de realizaciones de la invencion, se describen posteriormente metodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, tendra prevalencia la memoria descriptiva de la patente, incluyendo las definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean necesariamente limitantes.
Breve descripcion de los dibujos
Algunas realizaciones de la invencion se describen en el presente documento, solamente como ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia espedfica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son ejemplos y para fines de analisis ilustrativo de realizaciones de la invencion. A este respecto, la descripcion tomada con los dibujos hace evidente para los expertos en la materia como pueden practicarse realizaciones de la invencion.
En los dibujos:
Las Figuras 1A-B son diagramas esquematicos que representan situaciones autologas (Figura 1A) y alogenicas (Figura 1B) humanas. Debe observarse que las dos situaciones difieren entre sf en el origen del donante de medula osea (MO) (hospedador frente a alogenico), los agentes de respuesta (hospedadores frente a alogenicos) y estimulantes (cualquier donante alogenico frente a tercero no reactivo de forma cruzada con MHC del hospedador) que estan implicados en la generacion de Tcm.
Las Figuras 2A-B son diagramas esquematicos que representan situaciones singenica (Figura 2A) y alogenica (Figura 2B) de raton. Debe observarse que las dos situaciones difieren entre sf en el origen del donante de MO (singenico o F1 frente a alogenico), los agentes de respuesta (singenicos o F1 frente a alogenicos) y estimulantes (alogenicos frente a terceros) que estan implicados en la generacion de Tcm.
Las Figuras 3A-B son diagramas esquematicos que representan el protocolo humano autologo para la generacion de Tcm (Figura 3A) en comparacion con el protocolo de raton singenico (Figura 3B).
Las Figuras 4A-C representan la cinetica de generacion de memoria central antiterceros ("experimentos de control de referencia "). Las celulas T CD8 sin tratamiento previo se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en un medio que contema lL-21 durante 3 dfas. A continuacion, las celulas no recibieron ninguna activacion adicional y se expandieron en un medio que contema IL-7 e IL-15 hasta el dfa 12,5. Los dfas 7,5, 10,5 y 12,5, las celulas se evaluaron con respecto al fenotipo (expresion de marcador de superficie) (Figura 4A) y porcentaje de Tcm (CD62L+CD45RO+) de celulas T CD8 usando analisis de FACS (Figura 4B) y con respecto a numeros de celulas por exclusion de azul de tripano (Figura 4C). Para cada punto temporal los datos representan el promedio ± ET de n experimentos independientes.
Las Figuras 5A-C representan un experimento tfpico que demuestra el papel de la sensibilizacion con CD alogenicas. Debe observarse que IL-21 solo o IL-7 mas IL-15 sin sensibilizacion de CD no induce fenotipo de memoria central en celulas T CD8 sin tratamiento previo y apenas apoya su expansion. La Figura 5A ilustra celulas T CD8 sin tratamiento previo que se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en un medio que contema IL-21 durante 3 dfas. A continuacion, las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 13 ("grupo de control de referencia” = d(0-3) IL21+DC d(3-13)IL7+IL15); las Figuras 5B-C ilustran celulas T CD8 T sin tratamiento previo que se cultivaron con IL-21 (Figura 5B) o con una combinacion de IL-7 e IL-15 (Figura 5C) en ausencia de estimulacion hasta el dfa 10 o el dfa 13, respectivamente.
Las Figuras 6A-B representan el papel de la sensibilizacion con CD alogenicas demostrado por la influencia relativa promedio en el nivel de Tcm y el factor de expansion en comparacion con el grupo de control de referencia. Se estimularon celulas T cD8 sin tratamiento previo con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en un medio que contema IL-21 durante 3 dfas. A continuacion, las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 13 ("grupo de control de referencia" = d(0-3) IL21+DC d(3-13)IL7+IL15). Como alternativa, se cultivaron celulas T CD8 sin tratamiento previo con IL-21 o con combinacion de IL-7 e IL-15 en ausencia de estimulacion hasta el dfa 13. Las celulas se evaluaron con respecto a numeros de celulas por exclusion con azul de tripano (Figura 6A) y porcentaje de Tcm (CD62L+CD45RO+) de celulas T CD8 usando analisis de FACS (Figura 6B). Para cada punto temporal, los datos representan el promedio ± ET de n experimentos independientes.
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Las Figuras 7A-C representan un experimento tipico que demuestra el papel de IL-21 en las fases de sensibilizacion y expansion de Tcm antiterceros. Debe observarse que la retirada de IL-21 de la fase de sensibilizacion redujo tanto la expansion como la induccion de Tcm, mientras que la presencia de IL-21 a lo largo del cultivo aumento la induccion de Tcm. La Figura 7A ilustra celulas T CD8 sin tratamiento previo que se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en un medio que contema IL-21 durante 3 dfas. A continuacion, las celulas no recibieron ninguna activacion adicional y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el d^a 13 ("grupo de control de referenda" = d(0-3) IL21+DC d(3-13)IL7+IL15); las Figuras 7B-C ilustran celulas T CD8 sin tratamiento previo que se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en ausencia de IL-21 durante 3 dfas. A continuacion las celulas no recibieron ninguna activacion adicional y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 13 (Figura 7B) o se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 con presencia continua de IL-21 tanto en la fase de sensibilizacion (IL-21 sola) como en la fase de expansion (junto con IL-7 e IL-15) (Figura 7C).
Las Figuras 8A-B representan el requisito para IL-21 de rendimiento de Tcm optimo (promedio de varios experimentos independientes). Se trataron celulas T CD8 sin tratamiento previo como anteriormente y los cultivos se evaluaron con respecto al numero de celulas por exclusion de azul de tripano (Figura 8A) y porcentaje de Tcm (CD62L+CD45RO+) de celulas T CD8 usando analisis de FACS (Figura 8B). Los resultados de cada experimento se muestran por separado y las lmeas indican los resultados promedio sobre n experimentos.
Las Figuras 9A-B representan la relacion de celulas reactivas/CD optima para la induccion de fenotipo Tcm y expansion robusta. Se estimularon 4 x 105 celulas T CD8 sin tratamiento previo frente a terceras CD alogenicas irradiadas a numeros crecientes en presencia de IL-21 durante 3 dfas. A continuacion las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 13 (“grupo de control de referenda” = d(0-3) IL21 + 100,00 CD d(3-13) IL7+IL15). Los cultivos se evaluaron con respecto a numeros de celulas por exclusion de azul de tripano (Figura 9A) y el porcentaje de Tcm (CD62L+CD45RO+) de celulas T CD8 usando analisis de FACS (Figura 9B). Los resultados de cada experimento se muestran por separado y las lmeas indican los resultados promedio sobre n experimentos.
La Figura 10 representa una evaluacion del efecto de diferentes reactivos de uso en GMP en el enriquecimiento de celulas T CD8+ y CD8+CD45RA+ sin tratamiento previo. Se agotaron las PBMC donantes de celulas adherentes por incubacion durante una noche en placas disenadas espedficamente para retirar celulas mieloides adherentes (panel superior), y el dfa 0, se dividieron celulas no adherentes en cuatro grupos de ensayo, cada uno sometido a un protocolo de clasificacion magnetica diferente. Las celulas se evaluaron con respecto a composicion celular y fenotipo de Tcm por analisis de FACS. Los resultados en la columna izquierda (CD45RO y CD45RA) se seleccionan en celulas CD3+CD8+. Los resultados representan un experimento tfpico de dos experimentos independientes realizados.
La Figura 11 representa un experimento tfpico que muestra el efecto de diferentes reactivos de uso de GMP usados para aislar celulas T CD8, en la proporcion de celulas T CD8+ con un fenotipo de Tcm, y contaminacion con celulas NK y NKT, 7 dfas despues de la simulacion con terceras CD. Las celulas no estimuladas mantenidas en cultivo con IL-7 solamente (panel superior) se usaron como referencia. Los resultados en la columna izquierda (CD45RO y CD45RA) y en la columna derecha (CD62L y CD45RO) se seleccionan en celulas CD3+CD8+.
La Figura 12 representa un experimento tfpico que muestra el efecto de diferentes reactivos de uso en GMP usados para aislamiento de celulas T CD8, en la proporcion de celulas T CD8+ con un fenotipo de Tcm, y contaminacion con celulas NK y NKT, 14 dfas despues de la estimulacion con terceras CD. Las celulas no estimuladas mantenidas en cultivo con IL-7 solamente (panel superior) se usaron como referencia. Los resultados en la columna izquierda (CD45RO y CD45RA) y en la columna derecha (CD62L y CD45RO) se seleccionan en celulas CD3+CD8+.
Las Figuras 13A-B representan el efecto de diferentes reactivos de uso en GMP usados para aislamiento de celulas T CD8 en los niveles de celulas T CD8 con un fenotipo de Tcm despues de 7 dfas se estimulacion frente a terceras CD. El porcentaje promedio de celulas T NKT CD3+CD8+ (Figura 13A) y Tcm (Figura 13B) se muestra como porcentaje de los niveles obtenidos en el grupo de control optimo haciendo uso de los 4 reactivos (CD4/CD56/CD19/CD45RA).
Las Figuras 14A-C representan el efecto de diferentes reactivos de uso en GMP usados para aislamiento de celulas T CD8 en la produccion final de celulas T CD8 con un fenotipo de Tcm despues de 10 dfas de estimulacion frente a terceras CD. El factor de expansion promedio del dfa 0 al dfa 10 (Figura 14A), y el rendimiento promedio despues de clasificacion magnetica (Figura 14B) se muestran como porcentaje de los niveles obtenidos en el grupo de control optimo haciendo uso de los cuatro reactivos de seleccion (CD4/CD56/CD19/CD45RA). El rendimiento de Tcm el dfa 10 (Figura 14C) se calculo multiplicando el rendimiento despues de la clasificacion magnetica (el dfa 0) con el factor de expansion desde el dfa 0 (al dfa 10). La Figura 15 representa que el cambio de la fuente de estimulantes de CD alogenicas tuvo solamente efectos menores en el potencial de expansion de las celulas Tcm. Las celulas T CD8 se enriquecieron a partir de leucoferesis descongelada por agotamiento de celulas CD4+ y CD56+ usando el sistema CliniMacs. Las celulas T CD8 enriquecidas se dividieron despues en dos grupos de ensayo, cada uno estimulado con diferentes terceras CD alogenicas irradiadas, a una relacion de 6:1 en un medio que contema IL-21 durante 3 dfas en bolsas de cultivo. A continuacion, las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron en medio que contema IL-7, IL-15 e IL-21 hasta el dfa 11. Los dfas 5, 7, 9 y 11 de cultivo se determino el numero de celulas por exclusion de azul de tripano.
Las Figuras 16A-B representan que el cambio de la fuente para estimulantes de CD alogenicas tuvo solamente efectos menores en la composicion celular. Las celulas T CD8 se enriquecieron a partir de leucoferesis
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descongelada por agotamiento de celulas CD4+ y CD56+ usando el sistema CliniMacs para aislamiento a gran escala. Las celulas T CD8 enriquecidas se dividieron despues en dos grupos de ensayo, cada uno estimulado con diferentes terceras CD alogenicas irradiadas (Figuras 16A y 16B, respectivamente), a una relacion de 6:1 en un medio que contema IL-21 durante 3 d^as en bolsas de cultivo. A continuacion, las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron en medio que contema IL-7, IL-15 e IL-21 hasta el dfa 11. Los d^as 0, 5, 9 y 12 de cultivo las celulas se evaluaron con respecto a la composicion celular por analisis de FACS. Todos los resultados se seleccionan a partir de linfoseleccion y seleccion en vivo (7AAD-).
Las Figuras 17A-B representan que el cambio de la fuente de estimulantes de CD alogenicas tuvo solamente efectos menores en la composicion celular. Se enriquecieron celulas T CD8 a partir de leucoferesis descongelada por agotamiento de celulas CD4+ y CD56+ usando el sistema CliniMacs. Las celulas T CD8 enriquecidas se dividieron despues en dos grupos de ensayo, cada uno estimulado con diferentes terceras CD alogenicas irradiadas, a una relacion de 6:1 en un medio que contema IL-21 durante 3 dfas en bolsas de cultivo. A continuacion, las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron en medio que contema IL-7, IL-15 e IL- 21 hasta el dfa 11. Los dfas 0, 5, 9 y 12 de cultivo las celulas se evaluaron con respecto a la composicion de fenotipo de Tcm (CD45RO+CD62L+) por analisis de FACS. Todos los resultados se seleccionan a partir de linfoseleccion y seleccion en vivo (7AAD-) y celulas T CD8 (CD3+CD8+CD56-CD16-).
La Figura 17C representa el porcentaje de celulas apoptoticas despues de 22 horas de reaccion de linfocitos mixtos (RLM) con linfoma de celulas B y lmeas celulares de leucemia de celulas plasmaticas. Se incubaron lmeas celulares mutante H.My2 C1R HlA A2 K66A, Daudi, premarcadas con calcemaAM o L363 durante 22 horas con o sin exceso quintuple de Tcm antiterceros. Se determinaron las celulas anexina V+ por FACS. Los datos se muestran como la media ±DT de cultivos quintuplicados. Los valores de ***p < 0,001 indican cambios estadfsticamente significativos en comparacion con muestras cultivadas en ausencia de Tcm.
La Figura 18 representa un experimento tfpico que muestra enriquecimiento con respecto a celulas T CD8, el dfa 14 antes del ensayo de injerto contra leucemia (GVL), agotando exhaustivamente las celulas no T CD8 (es decir, celulas T CD4+, celulas T y/§, celulas B, celulas NK, celulas dendnticas, monocitos, granulocitos y celulas eritroides) usando clasificacion por perlas magneticas.
Las Figuras 19A-D representan lmeas celulares linfoblastoides de celulas B H.My C1R ("Neo") y transfectante mutante H.My C1R HLA A2 K66A ("K66A") que se marcaron con calcemaAM, un colorante vital que se libera tras la muerte celular y despues se incubaron durante 22 horas con o sin celulas Tcm antiterceros a una relacion 1 a 5 en favor de celulas Tcm antiterceros. Despues de 22 horas, las celulas se recuperaron y se analizaron con respecto a supervivencia midiendo el numero de celulas tenidas calcema+ supervivientes, y con respecto a apoptosis por celulas anexinaV+ de la poblacion calcema+ por FACS. Las Figuras 19A-B y las Figuras 19C-D representan dos experimentos independientes, respectivamente; las Figuras 19A y 19C muestran destruccion mientras que las Figuras 19B y 19D muestran apoptosis.
El porcentaje de destruccion de celulas de la lmea de linfoblasto B se calculo por la siguiente formula:
el miswre fiE e£ tolas e!e ftoewEfo Ito/’pt'ifrs'fps pettlTe esotofrie
Ei1 wilmara e£e dialss llE itffEC? ElE litifoiflss fiK & liilieu Ef? e 1 yet tftp eIe cvfitrst-
.-cLW
Los valores negativos significan que las lmeas celulares linfoblastoides de celulas B proliferaron en presencia de Tcm.
El porcentaje de celulas de lmeas de linfoblastos B que experimentan apoptosis espedfica se calculo par la siguiente formula: = (% de celulas de lmea de linfoblastos B calcema+anexinaV+ en el pocillo evaluado) - (% de celulas de lmea de linfoblastos B calcema+anexinaV+ en el pocillo de control).
La Figura 20 representa el efecto de diferentes reactivos de uso de GMP usados para aislar celulas T CD8 en los niveles de destruccion de K66A. Las lmeas celulares transfectadas mutantes H.My C1R HLA A2 K66A se incubaron durante 22 horas con o sin celulas Tcm antiterceros a una relacion 1 a 5 en favor de celulas Tcm antiterceros. Despues de 22 horas, las celulas se recuperaron y se analizaron con respecto a supervivencia midiendo el numero de celulas tenidas calcema+ supervivientes por FACS (media de dos experimentos independientes). El porcentaje promedio de destruccion de celulas mutantes H.My C1R HLA A2 K66A se muestra como porcentaje de los niveles obtenidos por el grupo de control optimo aislado haciendo uso de los cuatro reactivos (CD4/CD56/CD19/CD45RA).
Las Figuras 21-22 son ilustraciones esquematicas que representan protocolos para la generacion de Tcm para trasplante autologo (Figura 21) y alogenico (Figura 22).
Las Figuras 23A-D representan un experimento tfpico que demuestra el papel del momento de adicion de citocinas en la induccion de fenotipo de Tcm en celulas T CD8 estimuladas por terceras CD maduras derivadas de monocitos alogenicas. La Figura 23A ilustra celulas T CD8 sin tratamiento previo que se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en un medio que contema IL-21 durante 3 dfas. A continuacion, las celulas no recibieron activacion adicional y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 13 (“grupo de control de referenda” = d(0-3) IL21+CD d(3-13)IL7+IL15); la Figura 23B ilustra celulas T CD8 sin tratamiento previo que se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 durante 7 dfas. A
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continuacion las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el d^a 13; la Figura 23C ilustra celulas T CD8 que se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 con presencia continua de IL-21 tanto en la fase de sensibilizacion (IL21 solamente) como en la fase de expansion (junto con IL-15); la Figura 23D ilustra celulas T CD8 que se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 con privacion de citocinas durante 7 dfas. A continuacion, las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron con IL-15 solamente hasta el dfa 13.
Las Figuras 24A-B representan el papel del momento de adicion de citocinas en el modelo alogenico humano; sumario de experimentos. Las celulas T CD8 sin tratamiento previo se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en un medio que contema IL-21 durante 3 dfas. A continuacion las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 13 (“grupo de control de referenda” = d(0-3) IL21—» d(3-13)IL7+IL15). Los otros grupos se trataron como se indica en las graficas. Los cultivos se evaluaron con respecto a numeros de celulas por exclusion de azul de tripano (Figura 24A), y porcentaje de Tcm (CD62L+CD45RO+) de celulas T CD8 usando analisis de FACS (Figura 24B). Para cada punto temporal los datos representan el promedio ± ET del numero indicado (n) de experimentos independientes.
La Figura 25 representa el enriquecimiento de celulas T CD8 espedficas antiterceros por seleccion positiva de celulas CD137+. Se estimularon celulas T CD8 sin tratamiento previo con terceras CD alogenicas irradiadas (a una relacion de 5,7:1) en presencia de IL-21. Despues de 14 horas de activacion, las celulas CD137+ se seleccionaron positivamente por clasificacion magnetica. La expresion de CD 137 en celulas T CD8 se evaluo por FACS.
La Figura 26 representa que el enriquecimiento de celulas T CD8 espedficas antiterceros por seleccion positiva de celulas CD137+ no reduce la adquisicion de fenotipo Tcm. Se estimularon celulas T CD8 sin tratamiento previo con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 durante 3 dfas. A continuacion, las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 10 (“Grupo de control de referenda”). Como alternativa, se estimularon celulas T CD8 sin tratamiento previo con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 5,7:1 en presencia de IL-21. Despues de 14 horas de activacion, Las celulas CD137 se seleccionaron positivamente por clasificacion magnetica. Las celulas CD137 se volvieron a estimular despues con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 hasta el dfa 3. A continuacion las celulas se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 10. Las celulas se evaluaron con respecto a porcentaje de Tcm (CD62L+CD45RO+) de celulas T CD8 por analisis de FACS.
La Figura 27 representa una comparacion de cinetica de proliferacion. Las celulas T CD8 sin tratamiento previo se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 durante 3 dfas. Las celulas no recibieron mas activacion a continuacion y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 14 (“grupo de control de referenda”). Como alternativa, las celulas T CD8 sin tratamiento previo se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 5,7:1 en presencia de IL-21. Despues de 14 horas de activacion, las celulas CD137+ se seleccionaron positivamente por clasificacion magnetica. Las celulas CD137+ se volvieron a estimular con terceras CD alogenicas irradiadas en una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 hasta el dfa 3. A continuacion, las celulas se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 10. El dfa 10, las celulas se dividieron en dos grupos de ensayo. En el primer grupo las celulas continuaron expandiendose con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 14 (“CD137+ antiterceros”) mientras que las celulas en el segundo grupo de ensayo se activaron con PBMC hospedadoras irradiadas en presencia de IL-7 e IL-15 (a una relacion de 1 a 2). Despues de 24 horas, las celulas CD137+ se agotaron por clasificacion magnetica. Las celulas CD137 agotadas se volvieron a sembrar con IL-7 e IL-15 y se cultivaron hasta el dfa 14 ("CD137+ antiterceros y CD137- antihospedador"). Los dfas indicados, las celulas se contaron por exclusion de azul de tripano.
La Figura 28 representa agotamiento de clones espedficos antihospedador por agotamiento de celulas CD137+ despues de activacion con PBMC hospedadoras irradiadas. El dfa 10 de cultivo, 9 dfas despues de la seleccion positiva de clones espedficos antiterceros, las celulas se activaron por PBMC hospedadoras irradiadas (a una relacion 1:2, en favor de las PBMC hospedadoras) en presencia de IL-7 e IL-15. Despues de 24 h, se agotaron las celulas CD137+ de las celulas. La expresion de CD137 en celulas T CD8 se evaluo por analisis de FACS.
La Figura 29 representa una tecnica de clasificacion magnetica de dos estadios, basandose en la regulacion positiva de CD137 despues de activacion espedfica de antfgeno de celulas T CD8 que agota con exito clones antihospedador y aumenta el porcentaje de celulas espedficas para terceros antfgenos. Las celulas T CD8 sin tratamiento previo se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 durante 3 dfas. Las celulas no recibieron mas activacion en lo sucesivo y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 14 (“grupo de control de referenda”). Como alternativa, se estimularon celulas T CD8 sin tratamiento previo con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 5,7:1 en presencia de IL-21. Despues de 14 horas de activacion, las celulas CD137+ se seleccionaron positivamente por clasificacion magnetica. Las celulas CD137+ se volvieron a estimular con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 hasta el dfa 3. A continuacion, las celulas se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 10. El dfa 10, las celulas se dividieron en dos grupos de ensayo. En el primer grupo las celulas continuaron expandiendose con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 14 (“CD137+ antiterceros”) mientras que las celulas en el segundo grupo de ensayo se activaron con PBMC hospedadoras irradiadas en presencia de IL-7 e IL-15 (a una relacion de 1 a 2). Despues de 24 horas, las celulas
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CD137+ se agotaron por clasificacion magnetica. Las celulas CD137 agotadas se volvieron a sembrar con IL-7 e IL- 15 y se cultivaron hasta el dfa 14 ("CD137+ antiterceros y CD137- antihospedador"). El d^a 14, se evaluo la alorreactividad antiterceros y antihospedador mediante ensayo de CFSE contra terceros o PBMC hospedadoras irradiadas. Para el ensayo de CFSE, se incubaron 1 x 106 celulas que respondfan CFSE+ con o sin 2 x 106 estimulantes de PBMC irradiados (20 Gy) durante 84 h en presencia de IL-7. Despues de 84 h, las celulas se recuperaron y se analizaron con respecto a division celular midiendo el numero de celulas T CD8 con baja tincion de CFSE (CD3+CD8+CD56-) por FACS. Para obtener valores absolutos de celulas, las muestras se suspendieron en un volumen constante y se obtuvieron recuentos citometricos de flujo para cada muestra durante un periodo de tiempo constante, predeterminado. El numero de celulas en division espedficas = (numero de celulas en division con APC) - (numero de celulas en division sin APC). Los valores negativos significan que el numero de celulas en division en respuesta a la activacion con PBMC hospedadoras fue incluso mas bajo que el numero de celulas en division sin ninguna activacion.
Descripcion de realizaciones espedficas de la invencion
La presente invencion, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a celulas antiterceros inductoras de tolerancia y/o reactivas para injerto contra leucemia que comprenden fenotipo de linfocito T de memoria central y, mas particularmente, pero no exclusivamente, a metodos para generarlas y al uso de las mismas en el trasplante y en el tratamiento de enfermedad.
Los principios y la operacion de la presente invencion pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y las descripciones adjuntas.
Antes de explicar al menos una realizacion de la invencion en detalle, debe entenderse que la invencion no esta limitada necesariamente en su aplicacion a los detalles expuestos en la siguiente descripcion o ejemplificada en los ejemplos. La invencion tiene capacidad para otras realizaciones o puede practicarse o llevarse a cabo de diversas maneras. Ademas, debe entenderse que la fraseologfa y terminologfa empleada en el presente documento es para fin de describir y no debena interpretarse como limitante.
Al reducir la presente invencion a la practica, los presentes inventores han descubierto una poblacion mejorada de celulas T de memoria central (Tcm) antiterceros que se dirige a los ganglios linfaticos despues de trasplante e induce tolerancia y actividad antienfermedad (por ejemplo actividad de injerto contra leucemia (GVL)) sin inducir una reaccion de injerto contra hospedador (GVH).
Como se muestra posteriormente en el presente documento y en la seccion de ejemplos a continuacion, los presentes inventores han proporcionado nuevos metodos para generar celulas Tcm para aplicaciones alogenicas y autologas. Como se muestra en las Figuras 1A y 21, se generaron celulas Tcm autologas, que estan dotadas de actividad antienfermedad (por ejemplo actividad antitumoral) exponiendo en primer lugar celulas T CD8+ a estfmulos alogenicos (por ejemplo, celulas dendnticas) en presencia de lL-21 durante 3 dfas y anadiendo posteriormente IL-15 e IL-7 a las celulas con los estfmulos antigenicos durante otros 1-2 dfas. A continuacion, las celulas resultantes se cultivaron en un ambiente sin antfgenos en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 durante 6-8 dfas adicionales.
Como se representa en las Figuras 1B y 22, se generaron celulas Tcm alogenicas, que son celulas inductoras de tolerancia y estan dotadas de actividad GVL, exponiendo en primer lugar celulas T cD8+ a terceros estfmulos (por ejemplo celulas dendnticas) en presencia de IL-21 durante 3 dfas. Aproximadamente 14 horas despues del comienzo del cultivo, las celulas activadas se seleccionaron por seleccion positiva de CD137+, y estas celulas se volvieron a cultivar con IL-21. Posteriormente, se anadieron IL-15 e IL-7 al cultivo de IL-21 con los estfmulos antigenicos durante otros 1-2 dfas. A continuacion, las celulas resultantes se cultivaron en un ambiente sin antfgenos en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 durante 6-8 dfas adicionales. Al final del cultivo, las celulas Tcm se empobrecieron con respecto a celulas alorreactivas por agotamiento de celulas CD137 despues de contacto de las celulas Tcm con celulas presentadoras de antfgenos de tipo hospedador (por ejemplo celulas dendnticas).
Las celulas generadas por los presentes inventores comprendfan mas del 50 % de celulas CD3+CD8+ de las que mas del 50 % son celulas Tcm (es decir comprenden una identificacion CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA', CD45RO+, vease por ejemplo el Ejemplo 1 de la seccion de ejemplos a continuacion) y comprendfan actividad antileucemica independiente de TCR (vease Ejemplo 2).
Tomados juntos, estos resultados justifican el uso de celulas Tcm antiterceros como celulas facilitadoras de injertos y para uso en el tratamiento de enfermedades y situaciones en las que esta justificado el trasplante alogenico (por ejemplo trasplante de celulas madre hematopoyeticas o en trasplante de organos solidos). Ademas, estos resultados fundamentan el uso de celulas Tcm antiterceros en el tratamiento de enfermedad en situaciones en las que es necesario trasplante autologo, tal como para tumores malignos hematologicos.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invencion se proporciona una poblacion aislada de celulas que comprenden celulas antiterceros no inductoras de GVHD que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria
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central (Tcm), siendo las celulas inductoras de tolerancia y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de trasplante.
La expresion “poblacion aislada de celulas” como se usa en el presente documento se refiere a celulas que se han aislado de su ambiente natural (por ejemplo, el cuerpo humano).
La expresion “no GVHD” como se usa en el presente documento se refiere a tener sensibilidad inductora de injerto contra hospedador sustancialmente reducida o no tener sensibilidad inductora de injerto contra hospedador. Por lo tanto, las celulas de la presente invencion se generan para no provocar significativamente enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) como se demuestra por la supervivencia, el peso y la apariencia general del sujeto trasplantado 100 dfas despues del trasplante.
Como se usa en el presente documento, el termino “singenico” se refiere a una celula o a un tejido que procede de un individuo que es, en esencia, geneticamente identico al sujeto. Tfpicamente, son singenicos mairnferos en esencia totalmente endogamicos, clones de mai^eras o mai^eras gemelos homocigoticos.
Los ejemplos de celulas o tejidos singenicos incluyen celulas o tejidos procedentes del sujeto (tambien denominado en la tecnica “autologo”), un clon del sujeto o un gemelo homocigotico del sujeto.
Como se usa en el presente documento, la expresion “no singenico” se refiere a una celula o un tejido que procede de un individuo que es alogenico o xenogenico con los linfocitos del sujeto.
Como se usa en el presente documento, el termino “alogenico” se refiere a una celula o un tejido que procede de un donante que es de la misma especie que el sujeto, pero que es sustancialmente no clonal con el sujeto. Tfpicamente, los mai^eras no gemelares cigoticos, exogamicos de la misma especie son alogenicos entre sf. Se apreciara que un donante alogenico puede ser HLA identico o HLA no identico con respecto al sujeto.
Como se usa en el presente documento, el termino “xenogenico” se refiere a una celula o un tejido que expresa sustancialmente antfgenos de una especie diferente en relacion con la especie de una proporcion sustancial de los linfocitos del sujeto. Tfpicamente, los mai^eras exogamicos de diferentes especies son xenogenicos entre sf.
La presente invencion preve que celulas o tejidos xenogenicos proceden de una diversidad de especies tales como, pero sin limitacion, bovinos (por ejemplo, vaca), equinos (por ejemplo, caballo), porcinos (por ejemplo cerdo), ovinos (por ejemplo, cabra, oveja), felinos (por ejemplo, Felis domestics), canidos (por ejemplo, Canis domestics), roedores (por ejemplo, raton, rata, conejo, cobaya, gerbo, hamster) o primates (por ejemplo, chimpance, mono rhesus, macaco, titf).
Las celulas o tejidos de origen xenogenico (por ejemplo origen porcino) se obtienen preferentemente de una fuente que se sabe que esta libre de zoonosis, tales como retrovirus endogenos porcinos. De forma similar, las celulas o los tejidos procedentes de seres humanos, se obtienen preferentemente de fuentes sustancialmente sin patogenos.
La expresion “celulas antiterceros” como se usa en el presente documento, se refiere a linfocitos (por ejemplo, linfocitos T) que se dirigen (por ejemplo, por reconocimiento de celulas T) contra un tercer antfgeno o terceros antfgenos.
Como se usa en el presente documento la expresion “tercer antfgeno o terceros antfgenos” se refiere a un antfgeno o antfgenos solubles o no solubles (tales como asociados a membrana), que no estan presentes en el donante o el receptor, como se representan en detalle posteriormente.
Por ejemplo, terceros antfgenos pueden ser terceras celulas, antfgenos de virus, tales como por ejemplo, virus de Epstein-Barr (VEB) o citomegalovirus (CMV) o antfgenos de bacterias, tales como flagelina. Los antfgenos vmcos o bacterianos pueden ser presentados por celulas (por ejemplo, lmea celular) infectadas con los mismos o a las que se ha hecho de otro modo expresar protemas vmcas/bacterianas. Las celulas presentadoras de antfgenos autologas o no autologas pueden usarse para presentar peptidos sinteticos cortos fusionados o cargados con las mismas. Dichos peptidos cortos pueden ser peptidos procedentes de virus o peptidos que representan cualquier otro antfgeno.
Puede usarse software dedicado para analizar secuencias vmcas u otras para identificar peptidos cortos inmunogenicos, es decir, peptidos presentables en el contexto de MHC de clase I o MHC de clase II.
Las terceras celulas pueden ser alogenicas o xenogenicas con respecto al receptor (explicado en mas detalle posteriormente en el presente documento). En el caso de terceras celulas alogenicas, dichas celulas tienen antfgenos de HLA diferentes del donante pero que no reaccionan de forma cruzada con los antfgenos del HLA del receptor, de modo que las terceras celulas generadas contra dichas celulas no son reactivas contra un trasplante o antfgenos receptores.
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De acuerdo con una realizacion de la presente invencion las terceras celulas alogenicas o xenogenicas son celulas estimulantes seleccionadas del grupo que consiste en celulas purificadas de linfocitos de sangre periferica (PBL), bazo o ganglios linfaticos, PBL movilizados por citocinas, celulas presentadoras de antigenos (APC) expandidas in vitro, celulas dendrfticas expandidas in vitro (CD) y celulas presentadoras de antfgenos artificiales.
La APC artificial de la presente invencion puede modificarse tecnicamente para mostrar MHC autologo con un tercer peptido o un tercer MHC sin someterse a pulsos con un peptido exogeno. Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion, la APC artificial comprende celulas tumorales K562 transfectadas con un tercer determinante de MHC y una molecula coestimulante [como se ha descrito previamente por ejemplo en Suhoski MM et al., Mol Ther. (2007) 15(5): 981-8], o fibroblastos transfectados con las mismas.
Pueden presentarse terceros antfgenos en las superficies celular, vftica o bacteriana u obtenerse y/o purificarse de las mismas. Adicionalmente, puede presentarse un antigeno vftico o bacteriano en una celula infectada y puede presentarse un antfgeno celular en un vehnculo artificial tal como un liposoma o en una celula presentadora de antfgeno artificial (por ejemplo lrnea celular leucemica o fibroblastica con el tercer antigeno o los terceros antigenos).
El tercer antigeno puede comprender ademas un peptido sintetico presentado por celulas presentadoras autologas, celulas presentadoras no autologas o en un vehnculo artificial o en celulas presentadoras de antfgenos artificiales.
Ademas, los terceros antfgenos pueden, por ejemplo, ser protemas extrafdas o purificadas de una diversidad de fuentes. Un ejemplo de una protema purificada que puede actuar como un tercer antfgeno de acuerdo con la presente invencion es ovoalbumina. Se preven otros ejemplos.
La utilizacion de celulas, virus, bacterias, celulas infectadas por virus, infectadas por bacterias, presentadoras de peptidos vfticos o de peptidos bacterianos como terceros antfgenos es particularmente ventajosa ya que dichos terceros antfgenos incluyen una serie diversa de determinantes antigenicos y como tales dirige la formacion de celulas antiterceros de una poblacion diversa, que pueden actuar adicionalmente en reconstitucion mas rapida de celulas T en casos en los que se requiera dicha reconstitucion, por ejemplo, despues de irradiacion letal o subletal o procedimiento quimioterapeutico.
Ademas, cuando se dirigen celulas antiterceros contra terceros antfgenos, las celulas estan dotadas de actividad antienfermedad. La expresion “actividad antienfermedad” se refiere a la actividad (por ejemplo capacidad de destruccion) de las celulas Tcm contra una celula enferma (por ejemplo celula cancerosa, tal como actividad de injerto contra leucemia, GVL). Esta actividad se debe tfpicamente a destruccion independiente de TCR mediada por union con LFA1-I/CAM1 [Arditti et al., Blood (2005) 105(8):3365-71. Epub 6 Jul 2004].
De acuerdo con una realizacion, las terceras celulas comprenden celulas dendrfticas.
De acuerdo con una realizacion, las terceras celulas comprenden celulas dendrfticas maduras.
Los metodos para generar terceras celulas dendrfticas, que pueden usarse como celulas estimulantes para inducir celulas Tcm, se conocen bien en la tecnica. Por lo tanto, como ejemplo no limitante, pueden obtenerse celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) a partir de un tercer donante de celulas no singenicas [por ejemplo en el caso de que las celulas Tcm sean singenicas, por ejemplo autologas, las celulas dendrfticas (CD) pueden no ser singenicas, por ejemplo alogenicas, con respecto al sujeto; mientras que si las celulas Tcm son no singenicas, por ejemplo alogenicas, las CD se seleccionan de un donante que no es singenico, por ejemplo alogenico y HLA desapareado tanto con el sujeto como con las celulas Tcm]. Los monocitos pueden despues aislarse por adherencia a plastico y cultivarse (por ejemplo en placas de cultivo celular) usando medio de celulas CD (por ejemplo medio de CD Cellgro) complementado con suero humano (por ejemplo suero humano al 1 %), penicilina/estreptomicina y GM- CSF (800 Ul/ml) e IL-4 (20 ng/ml) (disponible de por ejemplo Peprotech, Hamburgo, Alemania). Despues de aproximadamente 48 h de cultivo, puede anadirse medio de CD que comprende GM-CSF (1600 Ul/ml) e IL-4 (20 ng/ml). Aproximadamente 24 h despues, pueden recogerse celulas no adherentes, y pueden resuspenderse celulas grandes (principalmente CD inmaduras) en medio nuevo que contiene GM-CSF (800 Ul/ml), IL-4 (20 ng/ml), LPS (por ejemplo de E. coli O55:B5 a 10 ng/ml) e IFNy 100 Ul/ml) (disponible de por ejemplo Peprotech, Hamburgo, Alemania), sembrarse en placas e incubarse durante una noche. Al dfa siguiente, las celulas no adherentes pueden descartarse, y pueden retirarse suavemente CD adherentes usando, por ejemplo PBS fno/HS 1 % despues de incubacion en hielo durante 20 minutos, obteniendo de este modo celulas grandes que consisten en CD maduras.
De acuerdo con una realizacion, las terceras celulas comprenden celulas dendrfticas irradiadas.
Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion, las CD se irradian con aproximadamente 5-10 Gy, aproximadamente 10-20 Gy, aproximadamente 20-30 Gy, aproximadamente 20-40 Gy, aproximadamente 20-50 Gy, aproximadamente 10-50 Gy. De acuerdo con una realizacion espedfica, las CD se irradian con aproximadamente 10-50 Gy (por ejemplo 30 Gy).
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De acuerdo con algunas realizaciones, las celulas antiterceros de la presente invencion comprenden un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm).
La expresion “fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm)” como se usa en el presente documento se refiere a un subconjunto de celulas T citotoxicas que se dirigen a los ganglios linfaticos. Las celulas que tienen el fenotipo Tcm, en seres humanos, tipicamente comprenden una identificacion CD3+/CD8+/CD62L+/CD45RO+/CD45RA-. Se apreciara que las celulas Tcm pueden expresar todos los marcadores de identificacion en una unica celula o pueden expresar solamente parte de los marcadores de identificacion en una unica celula.
Se apreciara al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o incluso 100 % de la poblacion aislada de celulas son celulas CD3+CD8+. De acuerdo con una realizacion espedfica, la poblacion aislada de celulas comprende aproximadamente 70-90 % de celulas CD3+CD8+.
Se apreciara que al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o incluso 100 % de las celulas CD3+CD8+ tienen la identificacion de celulas Tcm. De acuerdo con una realizacion espedfica, aproximadamente 30-80 % de las celulas CD3+CD8+ tienen la identificacion celular de Tcm (por ejemplo 40-50 %).
De acuerdo con una realizacion, se proporciona una poblacion aislada de celulas que comprenden celulas antiterceros que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), en el que al menos el 50 % de la poblacion aislada de celulas son celulas CD3+CD8+ de las que al menos el 50 % comprenden una identificacion CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+, y ademas en las que las celulas son celulas inductoras de tolerancia y/o estan dotadas de actividad antienfermedad (por ejemplo actividad de injerto contra leucemia (GVL)), y son capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de trasplante.
Como se ha mencionado, las celulas Tcm tfpicamente se dirigen a los ganglios linfaticos despues del trasplante. De acuerdo con algunas realizaciones las celulas Tcm antiterceros de la presente invencion pueden dirigirse a cualquiera de los ganglios linfaticos despues del trasplante, como por ejemplo, los ganglios linfaticos perifericos y ganglios linfaticos mesentericos. La naturaleza dirigida de estas celulas permite que ejerzan su efecto de tolerancia de una manera rapida y eficaz.
Por lo tanto, las celulas Tcm antiterceros de la presente invencion son celulas inductoras de tolerancia.
La expresion “celulas inductoras de tolerancia” como se usa en el presente documento se refiere a celulas que provocan reduccion de la sensibilidad de las celulas receptoras (por ejemplo celulas T receptoras) cuando entran en contacto con las mismas en comparacion con la sensibilidad de las celulas receptoras en ausencia de celulas inductoras de tolerancia administradas. Las celulas inductoras de tolerancia incluyen celulas de veto (es decir celulas T que conducen a la apoptosis de celulas T hospedadoras tras el contacto con las mismas) como se ha descrito previamente en las publicaciones de PCT n.° WO 2001/049243 y WO 2002/102971.
De acuerdo con algunas realizaciones, las celulas Tcm de la presente invencion pueden ser celulas no modificadas geneticamente o celulas modificadas geneticamente (por ejemplo celulas que se han modificado por ingeniena genetica para expresar o no expresar genes, marcadores o peptidos espedficos o para secretar o no secretar citocinas espedficas). Puede implementarse cualquier metodo conocido en la tecnica en la modificacion por ingeniena genetica de las celulas, tal como por inactivacion del gen o los genes relevantes o por insercion de un ARN antisentido que interfiere con la expresion polipeptfdica (vease por ejemplo, documento WO/2000/039294, que se incorpora por la presente por referencia).
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion se proporciona un metodo para generar la poblacion aislada de celulas, comprendiendo el metodo: (a) poner en contacto celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con un tercer antfgeno o terceros antfgenos en presencia de IL-21 para permitir el enriquecimiento de celulas reactivas a antfgenos; y (b) cultivar las celulas resultantes de la etapa (a) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin antfgenos para permitir la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm).
Las celulas Tcm antiterceros de la presente invencion se generan tfpicamente poniendo en contacto en primer lugar celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) singenicas o no singenicas con un tercer antfgeno o terceros antfgenos (tal como se ha descrito anteriormente) en un cultivo complementado con IL-21 (de otro modo en cultivo sin citocinas, es decir, sin la adicion de cualquier citocina adicional). Esta etapa se lleva a cabo tfpicamente durante aproximadamente 12-24 horas, aproximadamente 12-36 horas, aproximadamente 12-72 horas, 24-48 horas, 24-36 horas, aproximadamente 24-72 horas, aproximadamente 48-72 horas, 1-2 dfas, 2-3 dfas, 1-3 dfas, 2-4 dfas, 1-5 dfas, 2-5 dfas, 2-6 dfas, 1-7 dfas, 5-7 dfas, 2-8 dfas, 8-10 dfas o 1-10 dfas y permite el enriquecimiento de celulas reactivas a antfgenos. De acuerdo con una realizacion espedfica, la puesta en contacto de PBMC singenicas o no singenicas con un tercer antfgeno o terceros antfgenos (tal como se ha descrito anteriormente) en un cultivo complementado con IL-21 (de otro modo cultivo sin citocinas) se efectua durante 1-5 dfas (por ejemplo 3 dfas. Esta
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etapa se lleva a cabo tfpicamente en presencia de aproximadamente 0,001-3.000 ng/ml, 0,001-1.000 ng/ml, 0,01
1.000 ng/ml, 0,1-1.000 ng/ml, 1-1.000 ng/ml, 10-1.000 ng/ml, 10-500 ng/ml, 10-300 ng/ml, 10-100 ng/ml, 1001000 ng/ml, 1-100 ng/ml, 1-50 ng/ml, 1-30 ng/ml, 10-50 ng/ml, 10-30 ng/ml, 10-20 ng/ml, 20-30 ng/ml, 20-50 ng/ml, 30-50 ng/ml, 30-100 ng/ml, 1-10 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml-100 ng/ml de IL-21. De acuerdo con una realizacion espedfica, la concentracion de IL-21 es de 10-50 ng/ml (por ejemplo 30 ng/ml).
De acuerdo con una realizacion espedfica, la puesta en contacto de las PBMC singenicas o no singenicas con un tercer antfgeno o terceros antigenos se efectua en un cultivo sin citocinas (por ejemplo complementado solamente con IL-21). Dicha condicion de cultivo permite la supervivencia y el enriquecimiento solamente de las celulas que experimentan estimulacion y activacion por el tercer antfgeno o los terceros antfgenos (es decir de celulas reactivas a antfgenos) ya que estas celulas secretan citocinas (por ejemplo IL-2) que permiten su supervivencia (todas las demas celulas mueren en estas condiciones de cultivo).
La relacion de tercer antfgeno o terceros antfgenos (por ejemplo celulas dendnticas) con respecto a PBMC es tfpicamente de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:10 tal como aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:8 o aproximadamente 1:10. De acuerdo con una realizacion espedfica, la relacion de tercer antfgeno o terceros antfgenos (por ejemplo celulas dendnticas) con respecto a PBMC es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:8 (por ejemplo 1:4).
A continuacion, las celulas antiterceros se cultivan en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin antfgenos para permitir la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo Tcm. Esta etapa se lleva a cabo tfpicamente durante aproximadamente 12-24 horas, aproximadamente 12-36 horas, aproximadamente 12-72 horas, 24-48 horas, 24-36 horas, aproximadamente 24-72 horas, aproximadamente 48-72 horas, 1-20 dfas, 1-15 dfas, 1-10 dfas, 1-5 dfas, 5-20 dfas, 5-15 dfas, 5-10 dfas, 1-2 dfas, 2-3 dfas, 1-3 dfas, 2-4 dfas, 2-5 dfas, 2-8 dfas, 2-10 dfas, 4-10 dfas, 4-8 dfas, 6-8 dfas, 8-10 dfas, 7-9 dfas, 7-11 dfas, 7-13 dfas, 7-15 dfas, 10-12 dfas, 10-14 dfas, 12-14 dfas, 14-16 dfas, 14-18 d^as, 16-18 d^as o 18-20 dfas. De acuerdo con una realizacion espedfica, las celulas antiterceros se cultivan en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin antfgenos durante aproximadamente 7-11 dfas (por ejemplo 8 dfas).
Esta etapa se lleva a cabo tfpicamente en presencia de IL-21 a una concentracion de aproximadamente 0,001
3.000 ng/ml, 0,001-1.000 ng/ml, 0,01-1.000 ng/ml, 0,1-1.000 ng/ml, 1-1.000 ng/ml, 10-1.000 ng/ml, 10-500 ng/ml, 10300 ng/ml, 10-100 ng/ml, 100-1000 ng/ml, 1-100 ng/ml, 1-50 ng/ml, 1-30 ng/ml, 10-50 ng/ml, 10-30 ng/ml, 1020 ng/ml, 20-30 ng/ml, 20-50 ng/ml, 30-50 ng/ml, 30-100 ng/ml, 1-10 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 1 ng/ml- 100 ng/ml de IL-21. De acuerdo con una realizacion espedfica, la concentracion de IL-21 es de 10-50 ng/ml (por ejemplo 30 ng/ml).
Esta etapa se lleva a cabo adicionalmente en presencia de IL-15 a una concentracion de aproximadamente 0,001
3.000 ng/ml, 0,001-1.000 ng/ml, 0,01-1.000 ng/ml, 0,05-1.000 ng/ml, 0,1-1.000 ng/ml, 0,5-1.000 ng/ml, 0,05500 ng/ml, 0,5-500 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 0,5-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 5-100 ng/ml, 1-50 ng/ml, 550 ng/ml, 1-10 ng/ml, 5-10 ng/ml, 1-5 ng/ml, 2-3 ng/ml, 2-5 ng/ml, 2-7 ng/ml, 3-5 ng/ml, 3-7 ng/ml, 4-5 ng/ml, 56 ng/ml, 5-7 ng/ml, 1-8 ng/ml, 10-100 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 100-1000 ng/ml. De acuerdo con una realizacion espedfica la concentracion de IL-15 es 1-10 ng/ml (por ejemplo 5 ng/ml).
Esta etapa se lleva a cabo adicionalmente en presencia de IL-7 a una concentracion de aproximadamente 0,001
3.000 ng/ml, 0,001-1.000 ng/ml, 0,01-1.000 ng/ml, 0,05-1.000 ng/ml, 0,1-1.000 ng/ml, 0,5-1.000 ng/ml, 0,05500 ng/ml, 0,5-500 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 0,5-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 5-100 ng/ml, 1-50 ng/ml, 550 ng/ml, 1-10 ng/ml, 5-10 ng/ml, 1-5 ng/ml, 2-3 ng/ml, 2-5 ng/ml, 2-7 ng/ml, 3-5 ng/ml, 3-7 ng/ml, 4-5 ng/ml, 56 ng/ml, 5-7 ng/ml, 1-8 ng/ml, 10-100 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 100-1000 ng/ml. De acuerdo con una realizacion espedfica la concentracion de IL-7 es 1-10 ng/ml (5 ng/ml).
Los presentes inventores han recogido mediante experimentacion laboriosa y exploracion varios criterios que pueden aprovecharse para mejorar la proliferacion de celulas antiterceros que comprenden un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm) que esta desprovisto de celulas reactivas para injerto contra hospedador (GVH) y/o que estan potenciadas con respecto a celulas reactivas antienfermedad (por ejemplo GVL).
De acuerdo con una realizacion, las PBMC se empobrecen con respecto a celulas no adherentes antes de poner en contacto con un tercer antfgeno o terceros antfgenos en presencia de IL-21.
De acuerdo con una realizacion, las PBMC se empobrecen con respecto a celulas CD4+ y/o CD56+ antes de poner en contacto con un tercer antfgeno o terceros antfgenos en presencia de IL-21.
De acuerdo con una realizacion, las PBMC se seleccionan con respecto a celulas CD45RA+ antes de poner en contacto con un tercer antfgeno o terceros antfgenos en presencia de IL-21.
El agotamiento de celulas CD4+ y/o CD56+ puede llevarse a cabo usando cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como por purificacion basada en afinidad (por ejemplo tal como mediante el uso de perlas MACS, clasificador de
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FACS y/o marcaje de ELISA de captura). Dicha etapa puede ser beneficiosa para aumentar la pureza de las celulas CD8+ dentro del cultivo (es decir eliminar otros linfocitos dentro del cultivo celular por ejemplo celulas T CD4+ o celulas NK) o para aumentar el numero de celulas T CD8+.
De acuerdo con una realizacion, las PBMC comprenden celulas no adherentes.
De acuerdo con una realizacion, las PBMC comprenden celulas T CD8+.
De acuerdo con una realizacion, las PBMC comprenden celulas T CD8+ sin tratamiento previo.
La seleccion de celulas T CD8+ sin tratamiento previo puede efectuarse por seleccion de celulas que expresan CD45RA+ y/o celulas que expresan CD45RO- y puede llevarse a cabo usando cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como por purificacion basada en afinidad (por ejemplo tal como mediante el uso de perlas MACS, clasificador de FACS y/o marcaje de ELISA de captura).
De acuerdo con una realizacion, las PBMC comprenden celulas CD45RA+.
Una etapa adicional que puede llevarse a cabo de acuerdo con las presentes ensenanzas incluye cultivar las celulas PBMC con un tercer antfgeno o terceros antfgenos en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 antes de retirar el tercer antfgeno o los terceros antfgenos del cultivo celular (es decir antes de generar un ambiente sin antigenos). Esta etapa se lleva a cabo tfpicamente durante aproximadamente 12-24 horas, aproximadamente 12-36 horas, aproximadamente 12-72 horas, 24-48 horas, 24-36 horas, aproximadamente 24-72 horas, aproximadamente 48-72 horas, 1-2 dfas, 2-3 dfas, 1-3 dfas, 2-4 dfas, 1-5 dfas o 2-5 dfas, y se efectua a las mismas dosis de IL-21, IL-15 e IL- 7 indicadas anteriormente. De acuerdo con una realizacion espedfica, el cultivo de las celulas PBMC con un tercer antfgeno o terceros antfgenos en presencia de IL-21, IL-15 e iL-7 se lleva a cabo durante 12 horas hasta 4 dfas (por ejemplo 1-2 dfas).
Adicionalmente o como alternativa, puede llevarse a cabo un proceso de dos etapas adicional que permite la seleccion y el aislamiento de celulas activadas. Dicha etapa de seleccion ayuda a retirar celulas T reactivas a hospedadores potenciales en situaciones en las que las PBMC no son singenicas con respecto al sujeto (como se describe en mas detalle posteriormente).
Por lo tanto, el aislamiento de celulas activadas puede llevarse a cabo en un enfoque de dos estadios. En el primer estadio las celulas activadas se seleccionan antes de cultivar las celulas en presencia de IL-15 e IL-7. Este primer estadio se lleva a cabo tfpicamente despues de la puesta en contacto inicial de las PBMC con un tercer antfgeno o terceros antfgenos en presencia de IL-21. Este proceso de seleccion selecciona solamente las celulas que se activaron por el tercer antfgeno (por ejemplo expresan marcadores de activacion como se describe posteriormente) y se efectua tfpicamente aproximadamente 12-24 horas, aproximadamente 24-36 horas, aproximadamente 12-36 horas, aproximadamente 36-48 horas, aproximadamente 12-48 horas, aproximadamente 48-60 horas, aproximadamente 12-60 horas, aproximadamente 60-72 horas, aproximadamente 12-72 horas, aproximadamente 72-84 horas, aproximadamente 12-84 horas, aproximadamente 84-96 horas, aproximadamente 12-96 horas, despues del contacto inicial de las PBMC con un tercer antfgeno o terceros antigenos. De acuerdo con una realizacion espedfica, el proceso de seleccion se efectua aproximadamente 12-24 horas (por ejemplo 14 horas) despues del contacto inicial de las PBMC con un tercer antfgeno o terceros antfgenos.
Puede efectuarse aislamiento de celulas activadas por purificacion basada en afinidad (por ejemplo tal como mediante el uso de perlas MACS, clasificador de FACS y/o marcaje de ELISA de captura) y puede efectuarse hacia cualquier marcador de activacion incluyendo marcadores de superficie celular tales como, pero sin limitacion, CD69, CD44, CD25, CFSE, CD137 o marcadores que no estan en superficie celular tales como, pero sin limitacion, IFN-y e IL-2. Tambien puede efectuarse aislamiento de celulas activadas por purificacion basada en morfologfa (por ejemplo aislando celulas grandes) usando cualquier metodo conocido en la tecnica (por ejemplo mediante FACS). Tfpicamente, las celulas activadas tambien se seleccionan para expresion de celulas CD8+. Ademas, puede utilizarse cualquier combinacion de los metodos anteriores para aislar eficazmente celulas activadas.
De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, se efectua seleccion de celulas activadas por seleccion de celulas CD137+ y/o CD25+.
El segundo estadio de aislamiento de celulas activadas se lleva a cabo tfpicamente al final del cultivo (es decir despues de cultivar en un ambiente sin antfgenos con IL-21, IL-15 e IL-7). Este estadio agota celulas alorreactivas por agotamiento de las celulas que se activaron despues del contacto del linfocito T de memoria central (Tcm) con celulas presentadoras de antfgenos del hospedador irradiadas (APC, por ejemplo celulas dendnticas). Como se ha mencionado anteriormente, el aislamiento de celulas activadas puede efectuarse por purificacion basada en afinidad (por ejemplo tal como mediante el uso de perlas MACS, clasificador de FACS y/o marcaje de ELISA de captura) y puede efectuarse hacia cualquier marcador de activacion incluyendo marcadores de superficie celular tales como, pero sin limitacion, CD69, CD44, CD25, CFSE, CD137 o marcadores que no estan en superficie celular tales como, pero sin limitacion, IFN-y e IL-2.
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De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, el agotamiento de las celulas alorreactivas se efectua por agotamiento de celulas CD137+ y/o cD25+.
A continuacion hay varios ejemplos no limitantes de protocolos que pueden usarse de acuerdo con algunas realizaciones de la invencion.
De acuerdo con una realizacion de la invencion, se proporciona un metodo para generar una poblacion aislada de celulas que comprenden celulas antiterceros que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo las celulas celulas inductoras de tolerancia y/o estando las celulas dotadas de actividad antienfermedad (por ejemplo actividad de injerto contra leucemia (GVL)), y que son capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de trasplante, comprendiendo el metodo: (a) tratar celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) no adherentes con un agente capaz de agotar celulas CD4+ y/o CD56+ para obtener celulas T CD8+; (b) poner en contacto las celulas T CD8+ con terceras celulas dendnticas en presencia de IL-21 durante 12 horas hasta 5 dfas para permitir el enriquecimiento de celulas reactivas a antfgeno; (c) cultivar las celulas resultantes de la etapa (b) con las terceras celulas dendnticas en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 durante 12 horas hasta 3 dfas; y (d) cultivar las celulas resultantes de la etapa (c) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin antfgenos durante 5-20 dfas para permitir la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm).
El protocolo descrito anteriormente se usa tipicamente para trasplante no singenico y por lo tanto las PBMC usadas son tfpicamente alogenicas con respecto al sujeto (por ejemplo de un donante alogenico).
De acuerdo con una realizacion de la invencion, se proporciona un metodo para generar una poblacion aislada de celulas que comprenden celulas antiterceros que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), estando las celulas dotadas de actividad antienfermedad (por ejemplo actividad anti celulas tumorales) y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de trasplante, comprendiendo el metodo: tratar celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) no adherentes con un agente capaz de agotar celulas CD4+ y/o CD56+ para obtener celulas T CD8+; (b) poner en contacto las celulas T CD8+ con celulas dendnticas no singenicas en presencia de IL-21 durante 12 horas hasta 5 dfas para permitir el enriquecimiento de celulas reactivas a antfgeno; (c) cultivar las celulas resultantes de la etapa (b) con las terceras celulas dendnticas no singenicas en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 durante 12 horas hasta 3 dfas; y (d) cultivar las celulas resultantes de la etapa (c) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin antfgenos durante 5-20 dfas para permitir la proliferacion de celulas que comprenden el fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm).
El protocolo descrito anteriormente se usa tfpicamente para trasplante singenico y por lo tanto las PBMC usadas son tfpicamente autologas con respecto al sujeto (por ejemplo del sujeto).
Por lo tanto, como se ha mencionado, las PBMC pueden ser singenicas o no singenicas con respecto a un sujeto.
De acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, las PBMC no singenicas de la presente invencion pueden ser alogenicas o xenogenicas con respecto al sujeto (explicado en mas detalle posteriormente en el presente documento).
La fuente de las PBMC se determinara con respecto al uso pretendido de las celulas (vease mas detalles posteriormente en el presente documento) y esta dentro de la capacidad de un experto en la materia, especialmente a la luz de la divulgacion detallada proporcionada en el presente documento.
El uso de celulas inductoras de tolerancia es especialmente beneficioso en situaciones en las que existe la necesidad de eliminar el rechazo de injertos y superar la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD), tal como en el trasplante celular o tisular alogenico o xenogenico.
Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para tratar a un sujeto que necesite un trasplante celular o tisular, comprendiendo el metodo realizar un trasplante celular o de organo al sujeto y administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de la poblacion aislada de celulas.
Como se usa en el presente documento, el termino “tratar” incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o invertir la progresion de una afeccion, sustancialmente aliviar los smtomas clmicos o esteticos de una afeccion o prevenir sustancialmente la aparicion de smtomas clmicos o esteticos de una afeccion.
Como se usa en el presente documento, la expresion “sujeto” o “sujeto que lo necesite” se refiere a un mairnfero, preferentemente un ser humano, hombre o mujer de cualquier edad que necesite un trasplante celular o tisular o que padezca una enfermedad que pueda tratarse con las celulas Tcm. Tfpicamente el sujeto necesita trasplante celular o tisular (tambien denominado en el presente documento receptor) debido a un trastorno o una afeccion, estado o smdrome patologico o no deseado, o una anomalfa ffsica, morfologica o fisiologica que sea susceptible de tratamiento mediante el trasplante celular o tisular. Se proporcionan posteriormente de forma adicional ejemplos de dichos trastornos.
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Como se usa en el presente documento, la expresion “trasplante celular o tisular” se refiere a una celula (por ejemplo, una unica celula o un grupo de celulas) o un tejido (por ejemplo tejidos/organos solidos o tejidos blandos, que pueden trasplantarse completamente o en parte) corporales. Los tejidos u organos ejemplares que pueden trasplantarse de acuerdo con las presentes ensenanzas incluyen, pero sin limitacion, tngado, pancreas, bazo, rinon, corazon, pulmon, piel, intestino y tejidos linfoides/hematopoyeticos (por ejemplo, ganglio linfatico, placas de Peyer, timo o medula osea). Las celulas ejemplares que pueden trasplantarse de acuerdo con las presentes ensenanzas incluyen, pero sin limitacion, celulas hematopoyeticas inmaduras incluyendo celulas madre. Ademas, la presente invencion tambien contempla trasplante de organos completos, tales como por ejemplo, rinon, corazon, hfgado o piel.
Dependiendo de la aplicacion, el metodo puede efectuarse usando una celula o un tejido que es singenico o no singenico con el sujeto.
De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, tanto el sujeto como el donante son seres humanos.
Dependiendo de la aplicacion y las fuentes disponibles, las celulas o los tejidos de la presente invencion pueden obtenerse de un organismo prenatal, organismo posnatal, un adulto o un donante fallecido. Ademas, dependiendo de la aplicacion necesaria, las celulas o los tejidos pueden ser celulas o tejidos sin tratamiento previo o modificados geneticamente. Dichas determinaciones estan dentro de la capacidad de un experto habitual en la materia.
Puede emplearse cualquier metodo en la tecnica para obtener una celula o un tejido (por ejemplo para trasplante).
El trasplante de la celula o el tejido al sujeto puede efectuarse de diversas formas, dependiendo de diversos parametros, tales como, por ejemplo, el tipo celular o tisular, el tipo, el estadio o la gravedad de la enfermedad del receptor (por ejemplo insuficiencia organica); los parametros ffsicos o fisiologicos espedficos del sujeto; y/o el resultado terapeutico deseado.
Puede realizarse un trasplante celular o tisular de la presente invencion trasplantando las celulas o el tejido a una de diversas localizaciones anatomicas, dependiendo de la aplicacion. El trasplante celular o tisular puede realizarse a una localizacion anatomica homotopica (una localizacion anatomica normal para el trasplante) o a una localizacion anatomica ectopica (una localizacion anatomica anomala para el trasplante). Dependiendo de la aplicacion, el trasplante celular o tisular puede implantarse provechosamente bajo la capsula renal o en el rinon, la grasa testicular, el tejido subcutaneo, el omento, la vena porta, el tngado, el bazo, la cavidad cardiaca, el corazon, la cavidad toracica, el pulmon, la piel, el pancreas y/o el espacio intraabdominal.
Por ejemplo, un tejido hepatico de acuerdo con las presentes ensenanzas puede trasplantarse al tngado, la vena porta, la capsula renal, el tejido subcutaneo, el omento, el bazo y el espacio intraabdominal. El trasplante de un tngado en diversas localizaciones anatomicas tales como estas se practica habitualmente en la tecnica para tratar enfermedades susceptibles de tratamiento mediante trasplante hepatico (por ejemplo insuficiencia hepatica). De forma similar, el trasplante de un tejido pancreatico de acuerdo con la presente invencion puede efectuarse provechosamente trasplantando el tejido a la vena porta, el tngado, el pancreas, la grasa testicular, el tejido subcutaneo, el omento, una asa intestinal (las subserosa de una asa en U del intestino delgado ) y/o el espacio intraabdominal. El trasplante de tejido pancreatico puede usarse para tratar enfermedades susceptibles de tratamiento mediante trasplante pancreatico (por ejemplo diabetes). De forma similar, puede llevarse a cabo trasplante de tejidos tales como un rinon, un corazon, un pulmon o tejido cutaneo a cualquier localizacion anatomica descrita anteriormente para el fin de tratar receptores que padecen, por ejemplo, insuficiencia renal, insuficiencia cardiaca, insuficiencia pulmonar o dano cutaneo (por ejemplo, quemaduras).
El metodo de la presente invencion tambien puede usarse, por ejemplo, para tratar a un receptor que padece una enfermedad que requiere trasplante de celulas hematopoyeticas inmaduras.
En este ultimo caso, pueden trasplantarse celulas hematopoyeticas autologas, halogenicas o xenogenicas inmaduras (incluyendo celulas madre) que pueden proceder, por ejemplo, de medula osea, sangre periferica movilizada (por ejemplo por leucoferesis), tngado fetal, saco vitelino y/o sangre del cordon umbilical de donante y que son preferentemente celulas hematopoyeticas inmaduras CD34+ con agotamiento de celulas T, a un receptor que padece una enfermedad. Dicha enfermedad incluye, pero sin limitacion, leucemia tal como leucemia linfoblastica aguda (LLA), leucemia no linfoblastica aguda (LNLA), leucemia mielodtica aguda (LMA) o leucemia mielodtica cronica (LMC), smdromes de inmunodeficiencia combinada grave (SCID), incluyendo adenosina desaminasa (ADA), osteopetrosis, anemia aplasica, enfermedad de Gaucher, talasemia y otras anomalfas hematopoyeticas congenitas o determinadas geneticamente.
Se apreciara que las celulas hematopoyeticas autologas, alogenicas o xenogenicas inmaduras de la presente invencion pueden trasplantarse a un receptor usando cualquier metodo conocido en la tecnica para trasplante de celulas, tal como pero sin limitacion, infusion celular (por ejemplo I.V.) o mediante una via intraperitoneal.
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Opcionalmente, cuando se realiza un trasplante celular o tisular de la presente invencion a un sujeto que tiene un organo defectuoso, puede ser provechoso en primer lugar retirar al menos parcialmente el organo defectuoso del sujeto para permitir el desarrollo optimo del trasplante y la integracion estructural/funcional del mismo con la anatom^a/fisiolog^a del sujeto.
De acuerdo con una realizacion, las celulas hematopoyeticas inmaduras y la poblacion aislada de celulas proceden del mismo donante.
De acuerdo con una realizacion, las celulas hematopoyeticas inmaduras y la poblacion aislada de celulas proceden del mismo sujeto.
El metodo de la presente invencion tambien preve el cotrasplante de varios organos (por ejemplo tejidos cardfacos y pulmonares) en caso de que el sujeto pueda verse afectado beneficiosamente por dicho procedimiento.
De acuerdo con una realizacion, el cotrasplante comprende el trasplante de celulas hematopoyeticas inmaduras y un tejido/organo solido o varios organos/tejidos solidos.
De acuerdo con una realizacion, las celulas hematopoyeticas inmaduras y el organo solido u obtenido del mismo donante.
De acuerdo con otra realizacion, las celulas hematopoyeticas inmaduras y el organo/tejido solido u organos/tejidos se obtienen de diferentes donantes (no singenicos).
De acuerdo con una realizacion, las celulas hematopoyeticas inmaduras se trasplantan antes de, simultaneamente con o despues del trasplante del organo solido.
De acuerdo con una realizacion, se induce en primer lugar quimerismo hematopoyetico en el sujeto por trasplante de celulas hematopoyeticas inmaduras junto con las celulas Tcm de la presente invencion, lo que conduce a tolerancia de otros tejidos/organos trasplantados del mismo donante.
De acuerdo con una realizacion, las celulas Tcm de la presente invencion se usan por sf mismas para reduccion de rechazo de tejidos/organos trasplantados del mismo donante.
En una realizacion adicional, el trasplante celular o tisular y la poblacion aislada de celulas proceden del mismo donante.
En una realizacion adicional, el trasplante celular o tisular es singenico con el sujeto y la poblacion aislada de celulas no son singenicas con el sujeto.
En una realizacion adicional, el trasplante celular o tisular es singenico con el sujeto y la poblacion aislada de celulas son singenicas con el sujeto.
Despues de realizar el trasplante celular o tisular en el sujeto de acuerdo con las presentes ensenanzas, es conveniente, de acuerdo con la practica medica convencional, supervisar la funcionalidad del crecimiento y la inmunocompatibilidad del organo de acuerdo con una cualquiera de diversas tecnicas convencionales en este campo. Por ejemplo, la funcionalidad de un trasplante de tejido pancreatico puede supervisarse despues de trasplante mediante ensayos de funcion pancreatica convencionales (por ejemplo analisis de niveles en suero de insulina). De forma similar, un trasplante de tejido hepatico puede supervisarse despues de trasplante por ensayos de funcion hepatica convencionales (por ejemplo analisis de niveles en suero de albumina, protema total, ALT, AST y bilirrubina y analisis de tiempo de coagulacion sangumea). El desarrollo estructural de las celulas o tejidos puede supervisarse mediante tomograffa computarizada o captura de imagenes por ultrasonidos.
Dependiendo del contexto del trasplante, para facilitar el injerto del trasplante celular o tisular, el metodo puede comprender ademas provechosamente acondicionar al sujeto en condiciones subletales, letales o supraletales antes del trasplante.
Como se usa en el presente documento, los terminos “subletal”, “letal” y “supraletal”, en relacion con el acondicionamiento de sujetos de la presente invencion, se refieren a tratamientos mielotoxicos y/o linfocitotoxicos que, cuando se aplican a una poblacion representativa de los sujetos, respectivamente, son tfpicamente: no letales para esencialmente todos los miembros de la poblacion; letales para algunos pero no todos los miembros de la poblacion; o letales para esencialmente todos los miembros de la poblacion en condiciones normales de esterilidad.
De acuerdo con una realizacion, la etapa de acondicionamiento se efectua acondicionando al sujeto en condiciones supraletales, tal como en condiciones mieloablativas.
Como alternativa, la etapa acondicionante puede efectuarse acondicionando al sujeto en condiciones letales o subletales, tal como acondicionando al sujeto en condiciones mielorreductoras.
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Los ejemplos de agentes acondicionantes que pueden usarse para acondicionar al sujeto incluyen, sin limitacion, irradiacion, agentes farmacologicos y celulas inductoras de tolerancia (como se describe en el presente documento).
Los ejemplos de agentes farmacologicos incluyen farmacos mielotoxicos, farmacos linfocitotoxicos y farmacos inmunosupresores.
Los ejemplos de farmacos mielotoxicos incluyen, sin limitacion, busulfan, dimetil milerano, melfalan y tiotepa.
El metodo puede comprender ademas provechosamente acondicionar al sujeto con un regimen inmunosupresor antes de, simultaneamente con o despues del trasplante celular o tisular.
Los ejemplos de tipos adecuados de regfmenes inmunosupresores incluyen la administracion de farmacos inmunosupresores, poblaciones celulares inductoras de tolerancia (como se describe en detalle posteriormente en el presente documento) y/o irradiacion inmunosupresora.
Se proporcionan en la bibliograffa de la tecnica amplias directrices para seleccionar y administrar regfmenes inmunosupresores adecuados para el trasplante (por ejemplo, refieranse a: Kirkpatrick CH. y Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. et al., 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. y Strom TB., 1996. New Engl. J. Med. 331,365; Midthun DE. et al., 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. et al., 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. et al., 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. et al., 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. et al. 1998. Lancet 351,623).
Preferentemente, el regimen inmunosupresor consiste en administrar al menos un agente inmunosupresor al sujeto.
Los ejemplos de agentes inmunosupresores incluyen, pero sin limitacion, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sales de oro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE), etanercept, bloqueadores de TNF.alfa., un agente biologico que se dirige a una citocina inflamatoria y farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Los ejemplos de AINE incluyen, pero sin limitacion, acido acetil salidlico, salicilato magnesico de colina, diflunisal, salicilato magnesico, salsalato, salicilato sodico, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, paracetamol, ibuprofeno, inhibidores de Cox-2, tramadol, rapamicina (sirolimus) y analogos de rapamicina (tales como CCI-779, RAD001, AP23573). Estos agentes pueden administrarse individualmente o en combinacion.
Independientemente del tipo de trasplante, para evitar el rechazo de injertos y enfermedad de injerto contra hospedador, el metodo de la presente invencion utiliza las nuevas celulas Tcm antiterceros (como se ha descrito en detalle anteriormente en el presente documento).
De acuerdo con el metodo de la presente invencion, estas celulas Tcm antiterceros se administran simultaneamente con, antes de o despues del trasplante celular o tisular.
Las celulas Tcm antiterceros pueden administrarse por cualquier metodo conocido en la tecnica para trasplante celular, tal como pero sin limitacion, infusion celular (por ejemplo I.V.) o mediante una via intraperitoneal.
Sin quedar ligado a la teona, una cantidad terapeuticamente eficaz es una cantidad de celulas Tcm antiterceros eficaz para obtener tolerancia, efecto antitumoral y/o reconstitucion inmunitaria sin inducir GVHD. Ya que las celulas Tcm de la presente invencion se dirigen a los ganglios linfaticos despues de trasplante, pueden ser necesarias cantidades menores de celulas (en comparacion con la dosis de celulas previamente usada, vease por ejemplo el documento WO 2001/049243) para conseguir el efecto o los efectos beneficiosos de las celulas (por ejemplo obtencion de tolerancia, efecto antitumoral y/o reconstitucion inmunitaria). Se apreciara que pueden ser necesarios niveles menores de farmacos inmunosupresores junto con las celulas Tcm de la presente invencion (tal como exclusion de rapamicina del protocolo terapeutico).
La determinacion de la cantidad terapeuticamente eficaz esta dentro de la capacidad de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgacion detallada proporcionada en el presente documento.
Para cualquier preparacion usada en los metodos de la invencion, la cantidad o dosis terapeuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro y de cultivo celular. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir una concentracion o un tftulo deseado. Dicha informacion puede usarse para determinar con mas precision dosis utiles en seres humanos.
Por ejemplo, en el caso del trasplante tisular el numero de celulas Tcm antiterceros infundidas en un receptor debena ser mayor de 1 x 104 /Kg de peso corporal. el numero de celulas Tcm antiterceros infundidas a un receptor debena estar tfpicamente en el intervalo de 1 x 103 /Kg de peso corporal a 1 x 104 /Kg de peso corporal, el intervalo de 1 x 104 /Kg de peso corporal a 1 x 105 /Kg de peso corporal, el intervalo de 1 x 104 /Kg de peso corporal a 1 x
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Por lo tanto, las nuevas celulas Tcm antiterceros de la presente invencion pueden usarse como terapia adyuvante para un trasplante celular o tisular (como se ha descrito anteriormente en el presente documento). Ademas, las nuevas celulas Tcm de la presente invencion tambien estan dotadas de actividad antienfermedad (por ejemplo actividad anticelulas tumorales, como se ha descrito en mas detalle anteriormente en el presente documento) y por lo tanto pueden usarse por sf mismas para tratamiento de enfermedad.
De acuerdo con una realizacion espedfica, para obtener una actividad de injerto contra celulas enfermas (por ejemplo efecto antitumoral tal como tratamiento antileucemia), pueden usarse celulas singenicas asf como celulas no singenicas.
Por lo tanto, el metodo de la presente invencion puede aplicarse para tratar cualquier enfermedad tal como, pero sin limitacion, una enfermedad maligna, una enfermedad asociada con trasplante de un injerto, una enfermedad infecciosa tal como una enfermedad vmca o una enfermedad bacteriana, una enfermedad inflamatoria y/o una enfermedad autoinmunitaria.
Las enfermedades que pueden tratarse usando los metodos de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, enfermedades malignas tales como leucemia [por ejemplo, linfatica aguda, linfoblastica aguda, de celulas pre B linfoblastica aguda, leucemia de celulas T linfoblastica aguda, megacarioblastica aguda, monodtica, mielogena aguda, mieloide aguda, mieloide aguda con eosinofilia, de celulas B, basofila, mieloide cronica, cronica, de celulas B, eosinofila, Friend, granulodtica o mielodtica, de celulas pilosas, linfodtica, megacarioblastica, monodtica, monodtica-macrofagos, mieloblastica, mieloide, mielomonocftica, de celulas plasmaticas, de celulas pre B, promielocftica, subaguda, de celulas T, neoplasia linfoide, predisposicion a tumor maligno mieloide, leucemia no linfoctica aguda, leucemia linfoctica aguda de celulas T (LLA-T) y leucemia linfoctica cronica de celulas B (LLC-B)], linfoma (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, de celulas B, de Burkitt, de celulas T cutaneo, histiocftico, linfoblastico, de celulas T, tfmico), carcinoma, blastoma y sarcoma; enfermedades asociadas con trasplante de un injerto (por ejemplo rechazo de injertos, rechazo de injerto cronico, rechazo de injerto subagudo, rechazo de injerto hiperagudo, rechazo de injerto agudo y enfermedad de injerto contra hospedador); enfermedades infecciosas incluyendo, pero sin limitacion, enfermedades infecciosas cronicas, enfermedades infecciosas subagudas, enfermedades infecciosas agudas, enfermedades vrncas (por ejemplo VEB, CMV, VIH), enfermedades bacterianas, enfermedades protozoarias, enfermedades parasitarias, enfermedades fungicas, enfermedades por micoplasma y enfermedades prionicas; enfermedades inflamatorias (por ejemplo enfermedades inflamatorias cronicas y enfermedades inflamatorias agudas); y enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo enfermedades cardiovasculares, enfermedades reumatoides, enfermedades glandulares, enfermedades gastrointestinales, enfermedades cutaneas, enfermedades hepaticas, enfermedades neurologicas, enfermedades musculares, enfermedades nefnticas, enfermedades relacionadas con la reproduccion, enfermedades de tejido conectivo y enfermedades sistemicas.
Por lo tanto, el metodo de la presente invencion puede aplicarse provechosamente ademas para tratar una enfermedad en un sujeto facilitando al mismo tiempo de forma simultanea el injerto de un trasplante de celulas o tejidos singenicos con las celulas Tcm antiterceros (por ejemplo situaciones en las que el trasplante celular o tisular y las celulas antiterceros proceden del mismo donante).
Como se usa en el presente documento el termino “aproximadamente” se refiere a ± 10 %.
Las expresiones “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “incluyendo pero sin limitacion”.
La expresion “que consiste en” significa “incluyendo y limitado a”.
La expresion “que consiste esencialmente en” significa que la composicion, el metodo o la estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solamente si los ingredientes, las etapas y/o las partes adicionales no alteran materialmente las caractensticas basicas y nuevas de la composicion, el metodo o la estructura reivindicados.
Como se usa en el presente documento, la forma singular “un”, “uno(a)”, “el” y “la”, incluyen referencias plurales a no ser que el contexto claramente dicte otra cosa. Por ejemplo, la expresion “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.
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A lo largo de la presente solicitud, pueden presentarse diversas realizaciones de la presente invencion en un formato de intervalo. Debena entenderse que la descripcion en formato de intervalo es unicamente por conveniencia y brevedad y no debena interpretarse como una limitacion inflexible del alcance de la invencion. En consecuencia, debena considerarse que la descripcion de un intervalo ha desvelado espedficamente todos los posibles subintervalos asf como valores numericos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debena considerarse que la descripcion de un intervalo tal como de 1 a 6 ha desvelado espedficamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., asf como numeros individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Siempre que se indique en el presente documento un intervalo numerico, se entiende que incluye cualquier numero citado (fraccional o integral) dentro del intervalo indicado. Las expresiones “que vana/vana entre” un primer numero indicado y un segundo numero indicado y “que vana/vana de” un primer numero indicado “a” un segundo numero indicado se usan en el presente documento indistintamente y se entiende que incluyen el primer y segundo numeros indicados y todos los numeros fraccionales e integrales entre medias.
Como se usa en el presente documento, el termino “metodo” se refiere a maneras, modos, tecnicas y procedimientos para realizar una tarea dada, incluyendo, pero sin limitacion, las maneras, los modos, las tecnicas y los procedimientos conocidos, o desarrollados facilmente a partir de maneras, medios, tecnicas y procedimientos conocidos por practicantes de la tecnica qmmica, farmacologica, biologica, bioqmmica y medica.
Se aprecia que ciertas caractensticas de la invencion, que se describen, para mas claridad, en el contexto de realizaciones separadas, tambien pueden proporcionarse en combinacion en una unica realizacion. Por el contrario, tambien pueden proporcionarse diversos elementos de la invencion, que se describen, para mayor brevedad, en el contexto de una unica realizacion, por separado o en cualquier subcombinacion adecuada o segun sea adecuado en cualquier otra realizacion descrita de la invencion. Ciertos elementos descritos en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse elementos esenciales de esas realizaciones, a no ser que la realizacion sea inoperante sin esos elementos.
Diversas realizaciones y aspectos de la presente invencion segun se ha delineado anteriormente en el presente documento y como se reivindica en la seccion de reivindicaciones posterior encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Se hace ahora referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invencion de una manera no limitante.
En general, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invencion incluyen tecnicas de ADN moleculares, bioqmmicas, microbiologicas y recombinantes. Dichas tecnicas se explican exhaustivamente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" volumenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 14, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologfas expuestas en las patentes de Estados Unidos n.° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", volumenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" volumenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a edicion), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); se describen exhaustivamente inmunoensayos disponibles descritos en la bibliograffa de patentes y cienfffica, vease, por ejemplo, patentes de Estados Unidos n.° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521;
"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas las cuales se incorporan por referencia como si se expusieran completamente en el presente documento. Se proporcionan otras referencias generales a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos del mismo se conocen bien en la tecnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la informacion contenida en el mismo se incorpora en el presente documento por referencia.
Materiales generales y procedimientos experimentales Celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC)
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Se aislaron PBMC de sangre completa de pacientes y de voluntarios sanos por centrifugacion en gradiente de densidad de Ficoll. Cuando se indica las celulas se tipificaron para HLA de clase I por metodos serologicos como se ha descrito previamente [Manual of Tissue Typing Techniques. Washington DC, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, publicacion de NIH DHEW 76-545, 1976, p 22].
Revestimientos celulares tumorales
Se usaron celulas transfectantes H.My2 C1R HLA A2 K66A y la lmea de celulas B transfectante H.My2 C1R HLA A2 w.t.
Se uso C1R, una lmea linfoblastoide de celulas B humana que carece de antigenos de HLA A y B en superficie, procedente de Hmy.2 B-LCL por irradiacion gamma seguida de seleccion para anticuerpos monoclonales de clase I y complemento como se ha descrito previamente [Storkus WJ, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 23612364].
Se uso C1R-neo, una lmea celular transfectante estable establecida en 1987 por electroporacion de la lmea celular C1R con un vector eucariota resistente a farmaco de neomicina modificado, pSP65-Neo (el vector no portaba un inserto), como se ha descrito previamente [Grumet FC, et al. Hum. Immunol. (1994) 40: 228-234].
Generacion de celulas dendrfticas
Se aislaron monocitos por adherencia a plastico y se cultivaron en placas de 6 pocillos usando 3 ml de medio de CD Cellgro complementado con suero humano 1 % y penicilina/estreptomicina mas GM-CSF (800 UI/ml) e IL-4 (20 ng/ml) (Peprotech, Hamburgo, Alemania). Despues de 48 h de cultivo, se anadieron 1,5 ml de medio (+GM-CSF a 1600 UI/ml e IL4 a 20 ng/ml). 24 h despues, se recogieron celulas no adherentes, y se contaron celulas grandes (la mayona CD inmaduras), se resuspendieron en medio nuevo que contema GM-CSF 800 UI/ml, IL-4 20 ng/ml, LPS de E. coli O55:B5 a 10 ng/ml (Sigma, Deisenhofen, Alemania) e IFNy (Peprotech, 100 UI/ml) y se sembraron en placas a aproximadamente 106 CD por pocillo en 2 ml y se incubaron durante una noche. Al dfa siguiente, se descartaron las celulas no adherentes y las CD adherentes se retiraron suavemente usando PBS fno/HS 1 % despues de incubacion en hielo durante 20 minutos. Se contaron celulas grandes que consistfan en CD maduras. Las celulas se irradiaron con 30 Gy para evitar el crecimiento de algunas celulas T de memoria o NK potencialmente contaminantes y se usaron despues para estimulacion de celulas T.
Aislamiento de celulas T CD8 sin tratamiento a partir de PBMC
Se aislaron celulas T CD8 sin tratamiento previo por seleccion negativa inicial usando un kit de seleccion CD8 negativo (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se agotaron despues las celulas T CD8+ expuestas a antfgeno usando perlas CD45RO y en columna LD.
Generacion de celulas T CD8 humanas de memoria central antiterceros
Se aislaron celulas T CD8 sin tratamiento previo y se resuspendieron en medio de celulas T complementado con IL- 21 (Peprotech, 30 ng/ml). Se anadieron CD irradiadas a una relacion CD:celulas T 1:4 con 4 x 105 celulas T por pocillo de una placa de 48 pocillos. El volumen total de cada pocillo fue de 500 pl.
72 h despues del inicio del cultivo, se anadieron 500 pl de medio de celulas T con IL-7 e IL-15 (Peprotech, concentraciones finales de 5 ng/ml) y las celulas se alimentaron posteriormente cada 2-3 dfas como se perfila en la seccion de resultados.
Ensayo de GVL
Se obtuvieron celulas de la lmea de linfoblastos B transfectante mutante H.My C1R ("Neo") y H.My C1R HLA A2 K66A ("K66A") mediante centrifugacion en gradiente de densidad de Ficoll y se marcaron con calcemaAM 0,15 pg/ml (Molecular Probes, Inc, Eugene, OR), un colorante vital que se libera tras la muerte celular, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuacion, se incubaron 2 x 105 celulas de la lmea de linfoblastos B marcada con calcema con o sin Tcm antiterceros durante 22 horas a una relacion 1 a 5 en favor de Tcm antiterceros en placas de 24 pocillos. Antes del cocultivo las Tcm antiterceros se enriquecieron con respecto a celulas T CD8+ por un kit de seleccion negativa (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania). No se anadio ninguna citocina exogena a la RLM. Las celulas se recuperaron y analizaron con respecto a supervivencia midiendo el numero de celulas de lmea de linfoblastos B tenidas con calcema supervivientes por FACs. Para la deteccion de apoptosis mediante anexinaV+ se incubaron muestras con 5 pl de anexinaV-APC (BD) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se retiro por lavado anexinaV no unida y las muestras se analizaron mediante FACS. Para obtener valores absolutos de celulas, las muestras se suspendieron en un volumen constante y se obtuvieron recuentos citometricos de flujo para cada muestra durante un periodo de tiempo predeterminado, constante, y se compararon
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con recuentos citometricos de flujo obtenidos con volumen fijo y numeros fijos de celulas de aporte. La tasa de supervivencia se presenta en relacion con la supervivencia de celulas de lmea de linfoblastos B solamente.
El porcentaje de celulas de lmea de linfoblastos B muertas se calculo por la siguiente formula:
f
1
El numero de celulas de linea de linfoblastos B vivas en el pocillo evaluado El numero de celulas de linea de linfoblastos B vivas en el pocillo de control ,
x 100
El porcentaje de celulas de lmea de linfoblastos B que experimentan apoptosis espedfica se calculo por la siguiente formula: = (% de celulas de lmea de linfoblastos B calcema+anexinaV+ en el pocillo evaluado) - (% de celulas de lmea de linfoblastos B calcema+anexinaV+ en el pocillo de control).
Un enfoque de clasificacidn magnetica de dos estadios para agotamiento de alorreactividad, basandose en el marcador de activacion de CD137
Se estimularon celulas T CD8 sin tratamiento previo con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 6:1 en presencia de IL-21 (Peprotech, 30 ng/ml). Despues de 14 horas de activacion, Las celulas CD137+ se seleccionaron positivamente por clasificacion magnetica (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania). Las celulas CD137+ se volvieron a estimular despues con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 (Peprotech, 30 ng/ml) hasta el dfa 3. A continuacion, las celulas se expandieron con IL-7 5 ng/ml e IL-15 5 ng/ml (Peprotech) hasta el dfa 10. El dfa 10, las celulas se dividieron en dos grupos de ensayo. En el primer grupo las celulas continuaron expandiendose con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 14, mientras que las celulas en el segundo grupo de ensayo se activaron con PBMC hospedadoras irradiadas en presencia de IL-7 e IL-15 (a una relacion de 1 a 2). Despues de 24 h, las celulas CD137+ se agotaron por clasificacion magnetica. Las celulas con agotamiento de CD137 se volvieron a sembrar en placas con IL-7 e IL-15 y se cultivaron hasta el dfa 14 ("CD137+ antiterceros y CD137- anti hospedadores"). El dfa 14, se evaluo la alorreactividad antiterceros y antihospedadores por ensayo de CFSE contra terceras PBMC o PBMC hospedadoras irradiadas. Para el ensayo de CFSe, se incubaron 1 x 106 celulas reactivas CFSE+ con o sin 2 x 106 estimulantes PBMC irradiadas (20 gy) durante 84 h en presencia de IL-7. Despues de 84 h, las celulas se recuperaron y se analizaron con respecto a division celular midiendo el numero de celulas T CD8 con baja tincion de CFSE (CD3+CD8+CD56-) por FACs. Para obtener valores absolutos de celulas, las muestras se suspendieron en un volumen constante y se obtuvieron recuentos citometricos de flujo para cada muestra durante un periodo predeterminado, constante. El numero de celulas en division espedficas = (el numero de celulas en division con APC) - (el numero de celulas en division sin APC). Los valores negativos significan que el numero de celulas en division en respuesta a activacion con PBMC hospedadoras fue incluso mas bajo que el numero de celulas en division sin ninguna activacion.
Ejemplo 1
Generacion y optimizacion de celulas T centrales de memoria (Tcm) antiterceros humanas
Para trasladar los estudios de ratones previamente presentados a aplicacion clinica, el procedimiento se optimizo para generar linfocitos T citotoxicos (cTl) humanos antiterceros. Para ese fin, se evaluaron diferentes parametros incluyendo diferentes reactivos para el aislamiento de celulas reactivas CD8, la composicion de los estimulantes y el medio de citocinas.
Posiblemente, como se ha descubierto en el modelo de raton previamente presentado, el tratamiento con celulas T de memoria central (Tcm) podna ser valioso en el contexto de trasplante de medula osea autologo [Lask A et al., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), (2010) 116: 424] o alogenico (TMO) [Ophir E et al., Blood. (2010) 115(10): 2095-104; Ophir E., 37° encuentro anual de la EBMT, 3-6 de abril de 2011, Pans, Francia. Resumen de la presentacion oral N.° 662].
En el entorno autologo humano (Figura 1A) pueden administrarse Tcm antiterceros junto con TMO autologo. Las celulas T CD8+ propias del paciente se afslan y se estimulan contra celulas dendnticas alogenicas de un donante alogenico.
En el entorno alogenico humano (Figura 1B), pueden trasplantarse Tcm antiterceros junto con celulas de la MO con agotamiento de T alogenicas. Las celulas T CD8+ sin tratamiento previo que se originan del donante de MO alogenico actuan como celulas reactivas y se usan terceras celulas dendnticas donantes para permitir la generacion de Tcm no reactivos hospedadores. Para evitar la GVHD, el tercer donante se selecciona para asegurar que ninguno de estos alelos del HLA de clase I este compartido con los alelos del HLA de clase I del hospedador.
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Aunque tanto en ratones como en seres humanos, el protocolo basico previsto comprendfa de forma similar aislamiento de celulas T CD8 seguido de estimulacion contra terceras celulas (Figuras 1A-B y 2A-B), hubo que modificar varios otros parametros en el protocolo humano, como se perfila en la Tabla 1, a continuacion.
Teniendo en cuenta que los Tcm autologos estan libres de riesgo de GVHD, la optimizacion del protocolo de produccion se concentro en gran medida en obtener una expansion eficaz de celulas T CD8 antiterceros con fenotipo de memoria central.
Como puede verse en la Figura 3A, se desarrollo un nuevo protocolo basandose en tres etapas principales: a) seleccion de celulas T CD8 a partir de PBMC; b) estimulacion contra celulas dendnticas (CD) alogenicas durante 3 dfas en presencia de IL-21; y c) expansion en un ambiente sin antigenos con IL-7, IL-15 e IL-21 durante 8 dfas adicionales.
Por lo tanto, en este protocolo recien desarrollado diversos parametros difieren del usado para la generacion de Tcm de raton (Tabla 1 y Figuras 3A-B). Las principales diferencias se refieren al tejido de origen para las celulas reactivas y estimulantes (PBMC frente a esplenocitos), las celulas estimulantes (celulas dendnticas frente a esplenocitos), asf como la composicion de citocinas.
Tabla 1: Comparacion de protocolo humano autologo frente al protocolo de raton singenico para la generacion de
Tcm
- Ser humano
- Raton Parametros Estadios principales
- PBMC congeladas
- Esplenocitos nuevos Tejido de origen Celulas reactivas
- Si
- NO Agotamiento de celulas adheridas (Adherencia en plastico durante una noche + IL-7)
- Si
- NO Agotamiento de celulas CD4+, CD56+
- Celulas T CD8+
- Esplenocitos completos Composicion celular final antes del cocultivo con celulas estimulantes
- Ser humano
- Raton Parametros Estadios principales
- PBMC congeladas
- Esplenocitos nuevos Tejido de origen Terceras celulas estimulantes
- Si
- NO Generacion de celulas dendnticas maduras derivadas de monocitos
- Celulas dendnticas
- Esplenocitos completos Composicion celular final antes del cocultivo con celulas sensibles
- Ser humano
- Raton Parametros Estadios principales
- Celulas T CD8+^CD irradiadas
- Esplenocitos^ esplenocitos irradiados Composicion celular Cocultivo: (sensibilizacion)
- 3 dfas
- 2,5 dfas Duracion del cocultivo
- D0: se anade IL-21.
- Sin citocinas Citocinas
- Se transfieren celulas no adherentes a una nueva placa
- Seleccion CD8+ positiva, de Ficoll, y siembra en un nuevo matraz. El cocultivo se detuvo por:
- IL-7, IL-15, IL-21
- IL-15 Citocinas Expansion sin antfgenos
- NO
- Si Seleccion positiva de celulas CD62L+ al final del cultivo
Optimizacion de un protocolo de uso en GMP para la generacion de Tcm humanos antiterceros:
Los intentos iniciales de desarrollar un protocolo humano para la generacion de Tcm antiterceros se baso en un estudio reciente de Wolfl et al. [Wolfl M et al., Cancer Immunol Immunother (2011) 60(2): 173-186], que describfa un procedimiento para la generacion de celulas T CD8 espedficas de antfgeno humano con un fenotipo de memoria central.
El presente enfoque se baso en la estimulacion contra CD con pulsos de antfgenos en presencia de IL-21 durante 3 dfas y posterior expansion en presencia de IL-7 e IL-15 durante 8 dfas adicionales.
En estos experimentos iniciales que dieron como resultado una expansion notable de Tcm antiterceros y sirvieron posteriormente como referencia para optimizacion adicional, se usaron las siguientes etapas: a) enriquecimiento de celulas T CD8 a partir de PBMC mediante agotamiento de celulas no CD8+. (es decir, celulas T CD4+, celulas T y/6,
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celulas B, celulas NK, celulas dendnticas, monocitos, granulocitos y celulas eritroides); b) enriquecimiento de celulas sin tratamiento previo mediante agotamiento de celulas activadas que expresan CD45RO; y c) estimulacion de celulas T CD8 sin tratamiento previo contra celulas dendnticas alogenicas en presencia de IL-21 durante 3 dfas seguido de expansion en un ambiente sin antigenos con IL-7 e IL-15 durante 8 d^as adicionales.
Los resultados de estos experimentos de referencia iniciales, mostrados en las Figuras 4A-C, permitieron la evaluacion del papel de diferentes parametros en el protocolo, definiendo la influencia de cada parametro en el nivel de expansion celular y nivel de expresion de fenotipo Tcm (como se describe en detalle posteriormente).
El papel de la sensibilizacidn con terceras CD
Teniendo en cuenta que las Tcm autologas estan libres de riesgo de GVHD por definicion, el primer parametro evaluado fue el papel de la estimulacion contra una tercera CD. Se pretendfa originalmente que esta etapa redujera el riesgo de GVHD en el entorno alogenico, mediante expansion selectiva de clones antiterceros en ausencia de estimulacion de clones antihospedador que median en GVHd.
Como se ilustra en las Figuras 5A-C y 6A-B, las celulas T CD8 sin tratamiento previo cultivadas con IL-21 en ausencia de estimulacion alogenica por celulas dendnticas mostraron bajo nivel de proliferacion (2,7 ± 1,1 % del mostrado por el grupo de control de referencia), que representa el dfa 7 aproximadamente una expansion de 0,4 veces desde el dfa 0 (la mayona de las celulas murieron antes del dfa 10) y que mantuvieron su fenotipo sin tratamiento previo (CD45RO-CD62L+, morfologfa pequena) (el nivel de Tcm fue solamente 10 % de el del grupo de control de referencia). Se descubrio un nivel de diferenciacion y expansion similarmente bajo cuando las celulas se mantuvieron con IL-7 e IL-15 en ausencia de estimulacion alogenica por celulas dendnticas; en estas condiciones, las celulas mantuvieron su fenotipo sin tratamiento previo (el nivel de Tcm fue solamente de 7 ± 1,6 % de el del grupo de control de referencia), aunque se indujo algo de proliferacion (12 ± 3,2 % del valor del grupo de control, que representa el dfa 13 aproximadamente una expansion de 6 veces desde el dfa 0). Por lo tanto, el papel de terceras CD alogenicas fue muy cntico para la induccion del fenotipo de Tcm y para expansion celular robusta.
El papel de IL-21 en las fases de sensibilizacidn y expansion de Tcm antiterceros
En general, en protocolos de expansion de celulas T convencionales, tanto en raton como en ser humano, la fase de expansion se realiza en ambiente sin antfgenos. Sin embargo, aunque en el protocolo de raton, solamente se anade IL-15 (Figura 3B), en el protocolo humano descrito en Wolfl et al. (Wolfl et al. 2011, mencionado anteriormente), se realiza expansion celular en presencia de IL-7 e IL-15. Ademas, teniendo en cuenta que se mostro que IL-21 era beneficiosa si se anadfa durante la fase de sensibilizacion inicial, se evaluo en el presente documento el papel de IL- 21.
Resulta interesante que, como se muestra en las Figuras 7A-C y 8A-B, mientras que la sensibilizacion de celulas T CD8 sin tratamiento previo mediante CD alogenicas en presencia o ausencia de IL-21 tuvo solamente efectos menores en la composicion celular (datos no mostrados), la sensibilizacion en ausencia de IL-21 dificulto la adquisicion de fenotipo Tcm (CD45RO+CD62L+) (solamente 69 ± 18 % del nivel de Tcm en el grupo de control de referencia) y tambien dio como resultado reduccion de la proliferacion (76 ± 23 % del nivel de expansion en el grupo de control de referencia) (Figuras 8A-B). Incluso en el unico experimento de cuatro en el que no se redujo la expansion (140 % del grupo de control de referencia), el fenotipo Tcm fue solamente el 35 % del nivel de Tcm en el grupo de control de referencia, lo que sugiere que la sensibilizacion en presencia de IL-21 es importante tanto para la expansion como para la induccion de fenotipo Tcm de la poblacion de celulas T CD8 sin tratamiento previo.
Resulta interesante que la presencia continua de IL-21 tanto en la fase de sensibilizacion (IL-21 solamente) como en la fase de expansion (junto con IL-7 e IL-15) mejoro uniformemente la induccion de celulas del fenotipo de memoria central (108 ± 1,9 % del nivel de Tcm en el grupo de control de referencia) (Figuras 7A-C y 8A-B). La influencia de la presencia continuada de IL-21 en expansion celular, aunque conduce claramente a mayor aumento promedio (135 ± 47 % de los valores hallados en el grupo de control de referencia) fue menos uniforme, conduciendo en dos de tres experimentos a una expansion ligeramente reducida (95 % y 81 % de los valores de referencia respectivamente), mientras que en el tercer experimento, mostraba una expansion drasticamente potenciada (228 %), lo que indica que la adicion de IL-21 en las fases tanto de sensibilizacion como de expansion podna ser deseable (Figuras 8A-B).
Composicion de las terceras celulas estimulantes
Los resultados descritos anteriormente muestran que la adicion secuencial de IL-21, IL-7 e IL-15 debe estar acompanada de estimulacion alogenica por CD maduras derivadas de monocitos para la induccion exitosa de fenotipo de Tcm y para expansion celular robusta.
Para simplificar el procedimiento, se llevo a cabo un experimento para evaluar si la estimulacion alogenica esencial podna suministrarse por PBMC irradiadas en lugar de CD maduras derivadas de monocitos que requiere una preparacion de 4 dfas.
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Como puede verse en la Tabla 2 a continuacion, a los 7 dfas de cultivo, la eficacia de induccion de fenotipo Tcm por PBMC, a diferencia de CD maduras derivadas de monocitos (CDm-dm), las celulas estimulantes fueron muy similares, cuando las celulas T CD8 sin tratamiento previo purificadas (92 % frente a 92 %, respectivamente) as^ como cuando las celulas T CD8 no separadas actuaron como celulas sensibles (77 % frente a 80 %). Sin embargo, las celulas estimulantes PBMC no fueron capaces de inducir el mismo nivel de expansion de Tcm en comparacion con CD usando celulas T CD8 sin tratamiento previo (6,75 frente a 20,5, respectivamente) o celulas T CD8 no separadas (1,8 frente a 16) como celulas sensibles.
Tabla 2: El papel critico de las CD como estimulantes
- % de Tcm (CD3+CD8+CD62L+CD45RA-)
- Factor de expansion desde el dfa 0 (el dfa 7) Grupo
- 92
- 20,5 Celulas T CD8 sin tratamiento previo ^ (CDm-dm)
- 92
- 6,75 Celulas T CD8 sin tratamiento previo ^ PBMC
- 80
- 16 Celulas T CD8 no separadas ^ (CDm-dm)
- 77
- 1,8 Celulas T CD8 no separadas ^ PBMC
- El cultivo de RLM en el que se estimularon celulas T CD8 sin tratamiento previo o celulas sensibles T CD8 no separadas contra CD maduras derivadas de monocitos (relacion de celulas sensibles/CD 8:1) o PBMC (relacion de celulas sensibles/PBMC 1:1), del mismo donante alogenico, en un medio que contema IL-21 durante 3 dfas. A continuacion, las celulas se cultivaron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 7 sin activacion adicional. El dfa 7 del cultivo, los diferentes grupos se evaluaron con respecto al porcentaje de Tcm usando analisis de FACS y con respecto a numeros de celulas por exclusion con azul de tripano.
Por lo tanto, a diferencia del protocolo de raton en el que los esplenocitos irradiados fueron suficientes para inducir la expansion, en el protocolo humano, las CD maduras derivadas de monocitos alogenicos son cruciales para la buena expansion de celulas Tcm y no pueden reemplazarse por PBMC alogenicas.
Definicidn de la relacidn de celulas sensibles/CD optima para la induccidn de fenotipo Tcm y expansion celular.
Para definir la relacion de celulas sensibles/CD optima, se uso un sistema de RLM, como se ha descrito anteriormente, excepto que se ensayaron diferentes relaciones de celulas sensibles/CD. Como puede verse en las Figuras 9A-B, cuando se usan 4 x 105 celulas sensibles, se obtuvo una adquisicion optima de fenotipo Tcm tras la adicion de 50-100 x 103 CD, mientras que la expansion fue optima a la menor concentracion de CD. Se examinan experimentos adicionales a relaciones de celulas sensibles/CD menores.
Definicion de un protocolo autologo final basado exclusivamente en reactivos de uso en GMP.
Tras el establecimiento de un protocolo autologo satisfactorio para la generacion de Tcm antiterceros, se llevo a cabo un experimento para desarrollar un procedimiento equivalente basandose solamente en reactivos de uso en GMP disponibles actualmente en el mercado para permitir el ensayo de este enfoque en pacientes humanos.
Agotamiento de celulas adherentes en placas de plastico.
Antes de optimizar el proceso de seleccion de celulas T CD8, se llevo a cabo un experimento para obtener un enriquecimiento inicial significativo mediante la retirada de celulas adherentes en plastico presentes en PBMC. Este proceso no solamente aumenta la concentracion de las celulas T CD8+ deseadas sino que tambien es util cuando se procesan PBMC humanas crioconservadas a diferencia de esplenocitos nuevos usados en el modelo de raton. Este experimento revelo que la incubacion durante una noche con suero humano al 10 % e IL-7 permitio que las celulas descongeladas se recuperaran antes de someterse al proceso de enriquecimiento magnetico (datos no mostrados).
Enriquecimiento de celulas T CD8 sin tratamiento previo
A continuacion, la atencion se centro en la adaptacion del enriquecimiento de celulas T CD8 sin tratamiento previo a reactivos de uso clmico usando tan pocos anticuerpos como fuera posible.
Como se muestra en la Figura 10, que representa un experimento tfpico, la poblacion deseada de celulas T CD8 representa el 21 % de las celulas el dfa 0 despues del agotamiento de celulas adheridas, mientras que las otras subpoblaciones “contaminantes” principales incluyen celulas T CD4 (61 %), celulas B (7 %) y celulas NK (7 %). Por lo tanto, las celulas CD4 representan la mayor contaminacion, y se ha mostrado previamente que compiten con celulas T CD8; por lo tanto hubo que retirar estas celulas. De forma similar, fue importante retirar celulas NK que se sabe que se expanden en cultivos de IL-15. Por el contrario, las celulas B tienden a morir en estas condiciones de
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cultivo. Por lo tanto, el agotamiento potencial con perlas magneticas anti-CD4 y anti-CD56 se evaluo inicialmente con y sin agotamiento de celulas B CD 19+.
Ademas, ya que en las PBMC de pacientes con tumores malignos de celulas B, los niveles de celulas T CD8 son menores en comparacion con donantes sanos, se llevo a cabo una evaluacion paralela que examinaba la posibilidad de omitir el enriquecimiento de celulas T CD8 sin tratamiento previo mediante seleccion positiva de celulas CD45RA+, ya que reduce adicionalmente el numero de celulas T CD8 recuperadas.
Por lo tanto, el dfa -1 se agotaron en primer lugar las celulas adherentes de PBMC donantes mediante incubacion durante una noche en placas de cultivo tisular CELLSTAR greiner-bio-one (Greiner Bio-One Ltd., Stonehouse Reino Unido), disenadas espedficamente para retirar celulas mieloides adherentes y el dfa 0 las celulas no adherentes se dividieron en cuatro grupos experimentales, cada uno sometido a un protocolo de clasificacion magnetica diferente. Los dfas 0, 7, 10 y 14 de cultivo, las celulas se evaluaron con respecto a composicion celular y fenotipo de Tcm por analisis de FACS y con respecto a expansion contando celulas vivas basandose en exclusion con azul de tripano.
Como puede verse en la Figura 10, la clasificacion celular magnetica minima usando solamente perlas anti CD4 y anti cD56, redujo el porcentaje de celulas T CD4 y NK del 61 % y el 7 % al 12 % y el 1 %, respectivamente, dando como resultado enriquecimiento de celulas T CD8 del 23 % al 60 %. Sin embargo, este procedimiento se asocio con potenciacion de los niveles de celulas B del 7 % al 24 %. La adicion de anti CD19 al coctel de agotamiento agoto completamente las celulas B, dando como resultado enriquecimiento mejorado de celulas T CD8 (90 %). La adicion de una segunda etapa de enriquecimiento positivo de celulas sin tratamiento previo con anti CD45RA aumento el porcentaje de celulas sin tratamiento previo (CD45RO-CD45RA+, seleccionadas en CD3+CD8+) del 53 % antes de la clasificacion magnetica al 91 % en ambos grupos. Sin embargo, esta etapa no afecto notablemente al nivel final de celulas T CD8, que aumento del 60 % al 66 % cuando se uso anti CD4 y anti CD56, o del 90 % al 94 % cuando la etapa de seleccion negativa tambien incluyo anti CD19.
Despues de la clasificacion celular magnetica, los cuatro grupos de sensibilizaron con celulas dendnticas alogenicas en presencia de IL-21 durante 3 dfas, y a continuacion las celulas se expandieron en un ambiente sin antfgenos hasta el dfa 14, en presencia de IL-21, IL-7, e IL-15. Como grupo de control para celulas no expandidas, las celulas T CD8 sin tratamiento previo enriquecidas por una etapa de agotamiento usando anti CD4, anti CD56 y anti CD19 y una etapa de enriquecimiento positiva usando anti CD45RA, se mantuvieron en un ambiente sin antfgenos en presencia de solamente IL-7 hasta el dfa 14.
Resulta interesante que, aunque el dfa 0 los grupos tratados o no tratados con anti CD19 mostraron niveles notablemente diferentes de celulas T CD8, esta diferencia se anulo tan pronto como el dfa 7 (Figura 11), y tambien cuando se ensayo el dfa 14 (Figura 12), probablemente debido a muerte selectiva de celulas B en el cultivo. De forma similar, la seleccion positiva de celulas CD45RA+ despues de la purificacion de celulas T CD8 inicial solamente contribuyo marginalmente al enriquecimiento final de celulas T CD8+ con un fenotipo Tcm. Por lo tanto, los cuatro grupos mostraron niveles similares de las celulas deseadas con una ventaja menor para los dos grupos tambien enriquecidos con respecto a celulas sin tratamiento previo mediante anti CD45RA.
Este resultado inicial mostrado anteriormente en un experimento tfpico se analizo adicionalmente comparando resultados promedio obtenidos en el grupo de control expuesto a reactivos de aislamiento celular optimos ("CD4- CD56- CD19-, CD45RA+") con los otros grupos en los que se realizo un intento de eliminar el uso de anti CD19 o anti CD45RA.
Por lo tanto, el porcentaje promedio de celulas T CD8 (Figura 13A), y lo que es mas importante, el porcentaje de Tcm (Figura 13B) en todos los grupos experimentales cuando se calculo como un porcentaje del nivel obtenido en el grupo de control optimo fueron muy similares.
Por el contrario, se encontraron diferencias notables en la expresion promedio de cada preparacion celular cuando se ensayaron el dfa 10 de cultivo, que variaba del 65,6 ± 0,5 % al 105,2 ± 6,8 % (Figura 14A). Sin embargo, las diferencias en la capacidad de expansion se contrarrestaron por el rendimiento reducido asociado con la segunda etapa de purificacion (Figura 14B).
Como puede verse en la Figura 14C, que muestra el rendimiento calculado final de Tcm el dfa 10, la adicion de una segunda etapa de enriquecimiento positivo de celulas sin tratamiento previo con anti CD45RA solamente redujo el rendimiento final de celulas Tcm, del 141 % al 123 %, cuando se uso agotamiento inicial con anti CD4 y anti CD56, o del 157 % al 100 %, cuando la etapa de seleccion negativa tambien incluyo anti CD19.
Colectivamente estos resultados sugieren que el protocolo basado en uso mmimo de reactivos para el aislamiento de celulas T CD8, concretamente seleccion negativa con anti CD4 y anti CD56, es satisfactorio para aplicacion clmica en el entorno autologo.
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Ejemplo 2
Preparation a gran escala de Tcm humanos antiterceros en bolsas de plastico usando reactivos de uso en GMP
Para estimular las condiciones anticipadas cuando se usan PBMC propias de los pacientes para la generacion de Tcm autologos, inicialmente se realizaron dos procedimientos de leucoferesis a gran escala, dos de donantes normales y se crioconservaron un gran numero de celulas mononucleares (divididas en varios lotes). Cada lote se uso para un experimento a gran escala. En el primer experimento, se encontraron varios problemas tecnicos incluyendo dificultad en la generacion de CD a partir de las bolsas congeladas de acuerdo con el protocolo de Wurzburg y la obtencion de una nueva IL-15 de uso en GMP para la que la actividad biologica no estaba clara. Estos problemas, que dieron como resultado una expansion de celulas T CD8 muy baja (aproximadamente el triple), se corrigieron en los experimentos posteriores usando el protocolo descrito por la presente para CD (como se ha descrito anteriormente) y usando la concentracion apropiada de IL-15 (es decir 300 U/ml).
Como puede verse en la Figura 15, cuando se generaron PBMC del mismo donante en dos experimentos de gran escala contra dos terceras CD diferentes, se obtuvo una expansion de celulas T CD8 similar que vario de 26,8 a 31,0 veces el dfa 11. Teniendo en cuenta que este dfa las celulas mostraron un crecimiento lineal es probable que pueda obtenerse expansion adicional en puntos temporales posteriores. Sin embargo, este nivel de expansion es satisfactorio ya que permite la administracion potencial de hasta 3 x 107 celulas por Kg de peso corporal. Resulta interesante que, aunque el dfa 0 se descubrio que la preparacion de leucoferesis estaba en gran medida contaminada con monocitos CD14+ y celulas B CD20, estas celulas desaparecen tras el cultivo celular y la composicion celular final el dfa 12 comprendfa celulas T CD8+CD3+ 94 % y 98 % respectivamente (Figuras 16A-B).
Resulta importante que el fenotipo Tcm obtenido en los dos cultivos contra diferentes CD estaba dentro del intervalo de los experimentos a pequena escala aunque se produjo algo de variabilidad (Figuras 17A-B). Por lo tanto, aunque el dfa 5 en ambos experimentos se encontro alto nivel de fenotipo de Tcm (77 % y 71 %, respectivamente), este nivel se redujo mas significativamente en el cultivo contra el 2° donante de CD tras el 9° dfa (65 % frente a 46 %) y el dfa 12 (62 % frente a 35 %). Esta variabilidad que no se observo significativamente en los experimentos a pequena escala podna explicarse en parte por una dificultad relativa para retirar las CD el dfa 5, ya que es menos probable que se adhieran a la bolsa de plastico en comparacion con su adhesion a las placas usadas en los experimentos a pequena escala. Por lo tanto, la mayor presencia y estimulacion con las CD podna conducir a una transicion mas pronunciada de un fenotipo Tcm con respecto a uno Teff.
Ejemplo 3
Potential de GVL de los Tcm humanos antiterceros contra una linea celular establecida
Teniendo en cuenta que en el entorno autologo el uso potencial de Tcm antiterceros es solamente para erradicar celulas tumorales residuales (en el entorno alogenico tambien actua para potenciar el injerto de las celulas de la MO) es importante desarrollar un ensayo sencillo para la capacidad citotoxica ex vivo que podna usarse para control de calidad antes de la infusion del Tcm al paciente. Para este fin, se uso un ensayo independiente de TCR basado en la demostracion por Lask et al. [Lask A et al., J Immunol. (2011) 187(4): 2006-14] de que una lrnea mutada del MHC no reconocible por TCR debido a esta mutacion, aun puede ser destruida por CTL antiterceros mediante su mecanismo de destruccion independiente de TCR. Claramente, si es aplicable tambien para Tcm humanos, dicha modalidad de destruccion podna actuar para distinguir entre la destruccion de Tcm y la mostrada por celulas NK.
Para abordar esta cuestion, se llevo a cabo una reaccion de linfocitos mixtos (RLM) con Tcm antiterceros que se dirigen a lmeas celulares de linfoma de celulas B y leucemia de celulas plasmaticas y el porcentaje de celulas apoptoticas se midio despues de 22 horas. Como puede verse en la Figura 17C, que representa un experimento tfpico, los Tcm mostraron reactividad de GVL notable.
En un experimento diferente, las celulas T CD8 se enriquecieron en primer lugar agotando exhaustivamente celulas no T CD8 (es decir, celulas T CD4+, celulas T y/6, celulas B, celulas Nk, celulas dendnticas, monocitos, granulocitos y celulas eritroides) usando clasificacion con perlas magneticas. Como puede verse en la Figura 18, que representa un experimento tfpico, el porcentaje de celulas NK y NKT contaminantes fue muy bajo (por debajo del 0,1 % para celulas NK y por debajo de 1,9 % para celulas NKT) para los cuatro grupos ensayados.
Las celulas T CD8 altamente purificadas se incubaron despues con dos tipos de celulas: a) lrnea celular mutante H.My C1R HLA-A2 K66A (K66A) para demostrar destruccion independiente de TCR y b) H.My C1R (Neo), una lrnea linfoblastoide de celulas B que carece de antfgenos del HLA A y B en superficie y por lo tanto es insensible a destruccion por Tcm mediante un mecanismo que requiere interaccion entre la molecula CD8 en el Tcm y el dominio a3 en MHC de las celulas de leucemia diana.
Como se muestra en las Figuras 19A-D, los Tcm antiterceros mostraron destruccion notable de las celulas diana mutadas K66A en comparacion con las celulas H.My C1R (Neo) deficientes en MHC-I. Por lo tanto, los Tcm humanos de forma similar a CTL humanos antiterceros pueden destruir celulas tumorales de celulas B mediante un
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mecanismo de destruccion independiente de TCR, a diferencia de destruccion mediada por NK que requiere expresion del MHC en las celulas diana.
Resulta mas importante que, cuando se analizo adicionalmente comparando resultados promedios obtenidos en el grupo de control expuesto a reactivos de aislamiento celular optimos ("CD4- CD56- CD19-, CD45RA+") con los otros grupos en los que se redujo el uso de anti-CD19 o anti CD45RA (Figuras 19A-D), se mostro que el porcentaje de destruccion independiente de TCR de la lmea celular mutante H.My C1R HLA- A2 K66A en todos los grupos experimentales (calculado como un porcentaje del nivel obtenido en el grupo de control optimo) fue muy similar (Figura 20) (P > 0,05 cuando se comparan los tres grupos de ensayo con el grupo de control de referencia).
Colectivamente, estos resultados sugieren que la reactividad de GVL mostrada por celulas aisladas con un uso mmimo de reactivos para el aislamiento de celulas T CD8, no es inferior a la asociada con protocolos de aislamiento mas extensivos.
La destruccion de celulas tumorales de LLC-B autologas por Tcm in vivo se realiza usando un modelo de Hu/SCID previamente empleado para la demostracion de dicha destruccion por LLC-B mediante CTL antiterceros.
Ejemplo 4
Generacion de celulas Tcm humanas alogenicas antiterceros
Inicio de un nuevo enfoque de uso en GMP para minimizar el riesgo de GVHD cuando se usan Tcm humanos alogenicos antiterceros
Como se ha demostrado previamente en un modelo de raton, los Tcm antiterceros podnan ser muy utiles para la induccion de tolerancia en TMO alogenico [Ophir E. et al. Blood. (2010) 115(10): 2095-104]. En este caso, las celulas T CD8+ sin tratamiento previo que se originan del donante de MO alogenico actuan como celulas sensibles y se usan terceras celulas dendnticas (CD) donantes como estimulantes para permitir la generacion de celulas Tcm no reactivas hospedadoras. Para evitar la GVHD, el tercer donante se selecciona para asegurar que ninguno de estos alelos del HLA de clase I se comparte con los alelos del HLA de clase I del hospedador.
No obstante, teniendo en cuenta que los pacientes humanos pueden ser mas propensos a GVHD que ratones endogamicos, la traslacion clmica de este enfoque debe buscarse con precaucion. Podnan requerirse etapas de aloagotamiento adicionales, tales como fotoagotamiento o seleccion de celulas activadas al final del periodo de aloestimulacion antiterceros, para reducir adicionalmente el riesgo de GVHD.
Modificaciones del protocolo humano autologo (para protocolo alogenico)
Como se muestra en las Figuras 21-22, el protocolo para generar Tcm para el entorno alogenico difiere del protocolo para el entorno autologo en dos etapas importantes:
a) Seleccion de celulas CD45RA+ despues del aislamiento de celulas T CD8. Las celulas T de memoria tienen menor umbral de activacion que celulas T sin tratamiento previo que pueden provocar expansion conducida por citocinas no espedfica de la fraccion de celulas T de memoria. Estas celulas pueden incluir clones que reaccionan de forma cruzada con antfgenos hospedadores, aumentando de este modo el riesgo de induccion de GVHD. Para minimizar el efecto provocado por la diferencia del porcentaje de celulas T sin tratamiento previo entre diferentes donantes humanos y para reducir el riesgo de GVHD, se usaron celulas T CD8 T sin tratamiento previo (CD45RA+CD8+) como la fuente para la generacion de celulas Tcm.
b) Retirada de celulas T potencialmente reactivas al hospedador al final del cultivo, mediante agotamiento de celulas T CD8 activadas CD137+.
Extension del periodo de privacion de IL-7 e IL-15
Como se describe para los cultivos autologos (anteriormente en el presente documento), los presentes inventores han observado que celulas T CD8 sin tratamiento previo expuestas a IL-7 e IL-15 proliferan de una manera independiente de antfgeno. Por otro lado, las celulas T CD8 sin tratamiento previo expuestas a IL-21 en ausencia de estimulacion alogenica no proliferaron, y ni siquiera sobrevivieron mas alla del dfa 7 de cultivo. Por lo tanto, el retardo de la adicion de IL-7 e IL-15 del dfa 3 al dfa 7 podna conducir potencialmente a un agotamiento selectivo de clones antihospedador no sensibles a las terceras celulas estimulantes.
Para definir el momento optimo para la adicion de citocina a la vez que el agotamiento de alorreactividad, se estimularon celulas T CD8 sin tratamiento previo con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia o ausencia de IL-21 durante 7 dfas. A continuacion, las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron con IL-7 e IL-15 (Figura 23B), IL-15 e IL-21 (Figura 23C) o IL-15 solamente (Figura 23D) hasta el dfa 13; las poblaciones celulares resultantes se compararon con las celulas T CD8 sin tratamiento previo cultivadas de
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acuerdo con el grupo de control de referencia, se expandieron como se ha descrito para el entorno autologo (incubacion en d (0-3) con IL21 y CD; en d(3-13), adicion de IL7+IL15 (Figura 23A).
Usando la misma secuencia de adicion de citocinas que el grupo de control de referencia pero con diferente calendario, concretamente, la adicion de IL-21 se extendio de 3 dfas a 7 d^as, y se anadieron IL-7 e IL-15 el dfa 7 y no el dfa 3, obstaculizo la expansion de las celulas (Figura 24A) (proliferacion solamente hasta 54 ± 7 % de la mostrada por el grupo de control de referencia). Sin embargo, la induccion de fenotipo de memoria central fue similar (Figura 24B) (99 ± 14,8 % de la mostrada por el grupo de control de referencia).
Como se muestra, la retirada de IL-7 y extension de la adicion de IL-21 al final del cultivo, redujo la expansion de las celulas (Figura 24A) (60 ± 13 % de la proliferacion mostrada por el grupo de control de referencia), asf como redujo la adquisicion de fenotipo de memoria central (82 ± 6,8 % del nivel de Tcm mostrado por el grupo de control de referencia, Figura 24B).
La sensibilizacion de celulas T CD8 sin tratamiento previo usando privacion de citocinas de 7 dfas, seguido de la adicion de solamente IL-15 desde el dfa 7 redujo drasticamente el potencial de expansion de las celulas (solamente 5 ± 1,3 % de proliferacion de la mostrada por el grupo de control de referencia), y tambien redujo la adquisicion del fenotipo de memoria central (Figura 24B) (68 ± 26 % del nivel de Tcm mostrado por el grupo de control de referencia).
El parametro mas cntico, es examina concretamente agotamiento de clones reactivos a hospedador (ensayados con donantes apropiados que son completamente distintos en HLA de clase I de las terceras celulas usadas para estimulacion). Tambien se llevan a cabo experimentos adicionales para optimizar el periodo de privacion de citocinas.
Un enfoque de clasificacidn magnetica de dos estadios para agotamiento de alorreactividad, basandose en el marcador de activacion CD137
Un modo elegante de agotar clones antihospedador basandose en el concepto de terceros puede conseguirse mediante una tecnica de clasificacion magnetica de dos estadios, que comprende las siguientes etapas de seleccion de CD 137:
a. Seleccion positiva de clones espedficos antiterceros al comienzo del cultivo.
b. Agotamiento de clones espedficos antihospedador cerca del final del cultivo.
Recientemente, se ha descrito que CD 137 es un marcador adecuado para activacion espedfica de antfgeno de celulas T CD8+ humanas, ya que CD137 no se expresa en celulas T CD8+ en reposo y su expresion se induce fiablemente despues de 24 horas de estimulacion.
Para evaluar este enfoque, se estimularon celulas T CD8 sin tratamiento previo con terceras CD alogenicas
irradiadas en presencia de IL-21. Despues de 14 horas de activacion, se seleccionaron positivamente celulas
CD137+ por clasificacion magnetica. Se volvieron a estimular celulas CD137+ con terceras CD alogenicas irradiadas en presencia de IL-21 hasta el dfa 3. A continuacion, las celulas se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 10 y se activaron despues con PBMC hospedadoras irradiadas en presencia de IL-7 e IL-15. Despues de 24 horas de activacion, se agotaron las celulas CD137+ por clasificacion magnetica. Las celulas con agotamiento de CD137 se volvieron a sembrar con IL-7 e IL-15 y se cultivaron hasta el dfa 14. En dfas seleccionados, las celulas se evaluaron con respecto a numeros de celulas por exclusion de azul de tripano y el porcentaje de Tcm (CD62L+CD45RO+)
dentro de la poblacion de celulas CD8 T usando analisis de FACs. La frecuencia de celulas alorreactivas
antiterceros y antihospedador se evaluo mediante ensayo de CFSE contra terceras PBMC o PBMC irradiadas del hospedador. Estos resultados se compararon con los obtenidos en el grupo de control estimulado en presencia de IL-21 durante 3 dfas y a continuacion expandido con IL-7 e IL-15 (“grupo de control de referencia”).
Por lo tanto, como puede verse en la Figura 25, aunque inmediatamente despues del enriquecimiento con respecto a celulas T CD8 sin tratamiento previo (dfa 0), solamente el 0,7 % de las celulas T CD8 totales expresaron CD137+, tras activacion contra terceras CD en presencia de IL-21 durante 14 h, el porcentaje de celulas T CD8 que expresaban CD137+ del compartimento de celulas T CD8 totales aumento hasta el 8,3 % a diferencia del 2,5 % en ausencia de estimulacion de CD. La clasificacion magnetica de esta subpoblacion de celulas activadas condujo a un enriquecimiento notable de celulas CD137+ (85 %, respectivamente) y el nivel de celulas T CD8 CD62L+ en el compartimento de celulas T CD8 totales se redujo drasticamente del 84 % al 14 % (datos no mostrados).
Como se muestra en la Tabla 5, posteriormente, esta seleccion positiva se asocio con recuperacion celular reducida. Por lo tanto, el dfa 0, el rendimiento de PBMC con agotamiento de celulas adherentes despues de enriquecimiento con respecto a celulas T CD8 sin tratamiento previo fue del 7,6 % y el dfa 1, despues de la seleccion positiva con respecto a CD137+, el rendimiento se redujo al 0,25 % (3,3 % de 7,6 %). Cuando se evaluo el dfa 7 del cultivo, el grupo de ensayo de celulas T CD8 sometido a la seleccion positiva de celulas CD137+ se asemejo mucho al grupo de control de referencia en el porcentaje de celulas Tcm (67 % frente a 70 %, respectivamente) y esta similitud entre
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los grupos en el porcentaje de Tcm tambien se mantuvo el d^a 10 de cultivo (54 % frente a 52 %, respectivamente) (Figura 26).
Tabla 5: Comparacion de proliferacion y numero de celulas final
- e
- d c b a Grupo
- (7,6) x (61) = 463 %
- 61 7,6 % Control de referencia
- (0,25) x (72) = 18 %
- 72 (3,3 % de 7,6 %) = 0,25 % CD137+ anti terceros y CD137- anti hospedadoras
Las celulas T CD8 sin tratamiento previo se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 durante 3 dfas. Las celulas no recibieron mas activacion en lo sucesivo y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 14 (“grupo de control de referenda”). Como alternativa, las celulas T CD8 sin tratamiento previo se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 5,7:1 en presencia de IL-21. Despues de 14 horas de activacion, las celulas CD137+ se seleccionaron positivamente por clasificacion magnetica. Las celulas CD 137+ se volvieron a estimular despues con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 hasta el dfa 3. A continuacion, las celulas se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 10. El dfa 10, se activaron con PBMC hospedadoras irradiadas en presencia de IL-7 e IL-15 (a una relacion de 1 a 2). Despues de 24 h, las celulas CD 137+ se agotaron por clasificacion magnetica. Las celulas CD137 agotadas se volvieron a sembrar con IL-7 e IL-15 y se cultivaron hasta el dfa 14 (“CD137+ anti terceros y CD137- anti hospedadores”). Los dfas indicados, las celulas se contaron por exclusion de azul de tripano.
a = rendimiento despues del enriquecimiento de celulas T CD8 sin tratamiento previo (representado como porcentaje del numero de partida de celulas adheridas a PBMC).
b = rendimiento despues de la activacion con terceras CD y enriquecimiento de celulas T CD8 CD137+ (representado como porcentaje del numero de partida de celulas adheridas a PBMC). c = factor de expansion del dfa 0 al dfa 13. d = factor de expansion del dfa 0 al dfa 14.
e = numero de celulas final = (rendimiento) x (factor de expansion del dfa 0) (representado como porcentaje del numero de partida de celulas adheridas a PBMC).
Ademas, cuando se evaluo la composicion celular (% de celulas T CD8, % de celulas NK y % de celulas NKT) los dfas 7 y 10 de cultivo, el grupo de ensayo de celulas T CD8 sometido a seleccion positiva de celulas CD137+, se asemejaba mucho al grupo de control de referencia en su composicion celular (Tabla 6, a continuacion).
Tabla 6: El enriquecimiento de celulas T CD8 espedficas antiterceros por seleccion positiva de celulas CD137+ no __________________________cambia drasticamente la composicion celular____________________________
- (NKT 16+) CD3+ CD16+
- (NKT 56+) CD3+ CD56+ (NK16+) CD3- CD16+ (NK56+) CD3- CD56+ (Celulas T CD8) CD3+CD8+ Dfa 7
- 2,6
- 5,6 1,3 2 92,5 Grupo de control de referencia
- 5,2
- 7,8 3,8 3,2 88 CD137+ antiterceros
- (NKT 16+) CD3+ CD16+
- (NKT 56+) CD3+ CD56+ (NK16+) CD3- CD16+ (NK56+) CD3- CD56+ (Celulas T CD8) CD3+CD8+ Dfa 10
- 2,8
- 8,3 3,2 2,1 91,8 Grupo de control de referencia
- 3,6
- 6,3 4 4,1 87 CD137+ antiterceros
- Las celulas T CD8 sin tratamiento previo se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 durante 3 d^as. A continuacion, las celulas no recibieron mas activacion y se expandieron con IL-7 e IL-15 hasta el d^a 10 (“grupo de control de referencia"). Como alternativa, las celulas T cD8 sin tratamiento previo se estimularon con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 5,7:1 en presencia de IL-21. Despues de 14 horas de activacion, las celulas CD137+ se seleccionaron positivamente por clasificacion magnetica. Las celulas CD137+ se estimularon despues con terceras CD alogenicas irradiadas a una relacion de 4:1 en presencia de IL-21 hasta el d^a 3. A continuacion las celulas se expandieron con IL-7 e IL- 15 hasta el d^a 10. Las celulas se evaluaron con respecto a composicion celular por analisis de FACS.
Por otro lado, como se muestra en la Figura 27, el grupo de ensayo de celulas T CD8 sometido a seleccion positiva de celulas CD137+ mostro potencial de expansion superior en comparacion con el grupo de control de referencia en ambos puntos temporales (expansion de 35 frente a 7 veces del dfa 0 al dfa 7, respectivamente y expansion de 1119 frente a 34 veces del dfa 0 al dfa 10, respectivamente). El dfa 10, el grupo de celulas T CD8 sometido a seleccion positiva de celulas CD137+ se dividio en dos grupos de ensayo. En el primer grupo, las celulas continuaron expandiendose con IL-7 e IL-15 hasta el dfa 14 (“CD137+ antiterceros”), mientras que las celulas en el segundo grupo de ensayo se activaron con PBMC hospedadoras irradiadas en presencia de IL-7 e IL-15. Despues de 24 h de
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activacion las celulas CD137+ se agotaron por clasificacion magnetica. Las celulas CD137 agotadas se volvieron a sembrar con IL-7 e IL-15 y se cultivaron hasta el d^a 14 (“CD137+ antiterceros y CD137- antihospedador”).
Cuando se evaluaron el d^a 13, las celulas T CD8 del grupo de ensayo sometidas a seleccion positiva de CD137+ continuaron mostrando potencial de expansion superior en comparacion con el grupo de control de referencia en ambos puntos temporales (expansion de 134 frente a 61 veces, respectivamente). Por el contrario, las celulas T CD8 del grupo de ensayo sometidas tanto a seleccion positiva antiterceros de CD137+ como agotamiento de celulas CD137+ antihospedador, mostraron menor potencial de expansion cuando se evaluaron el dfa 14 (expansion de 72 veces) (Figura 27) lo que indica que la expansion celular entre los dfas 11 y 14 no pudo compensar la perdida de celulas provocada por el agotamiento de celulas T CD137+ alorreactivas espedficas antihospedador.
Como se muestra en la Figura 28, cuando se evaluo la expresion de CD137 el dfa 10, solamente el 0,5 % del compartimento de celulas T CD8 totales en las celulas T cD8 sometidas a seleccion positiva de celulas CD137+ expreso CD137+. Por lo tanto, las celulas T CD8 en este grupo regularon negativamente de forma considerable la expresion de CD137 (del 85 % el dfa 1 a solamente el 0,5 el dfa 10).
Sin embargo, despues de 24 h de activacion con PBMC hospedadoras irradiadas (a una relacion 1 a 2, en favor de las PBMC hospedadoras), el porcentaje de celulas T CD8 que expresaban CD137+ del compartimento de celulas T CD8 totales aumento hasta el 16 %. El agotamiento de estas celulas CD137+ por clasificacion magnetica redujo el porcentaje de celulas T CD8 que expresaban CD137 del compartimento de celulas T CD8 totales, del 16 % al 3 %.
Se realizo analisis final de alorreactividad antihospedador residual el dfa 14, comparando el nivel de celulas que conservaban CFSE tras estimulacion contra PBMC hospedadoras a diferencia de terceras PBMC en presencia de IL-7.
Como se muestra en la Figura 29, el numero de celulas que se divide espedficamente despues de estimulacion con terceras PBMC fue aproximadamente 3 veces mayor en el grupo sometido a la seleccion positiva y negativa basada en CD 137 en comparacion con el grupo de control de referencia (2259 frente a 741 celulas en division, respectivamente). Lo que es mas importante, la retirada de celulas CD 137+ hacia el final del cultivo, evito completamente la proliferacion en repuesta a PBMC hospedadoras, a diferencia del grupo de control de referencia que mostraba proliferacion detectable (134 celulas en division). Resulta interesante que el grupo que experimenta seleccion positiva de celulas activadas contra terceros sin retirada de clones antihospedador al final del cultivo, mostro mayor nivel de celulas reactivas al hospedador en comparacion con el grupo de control, lo que indica reactividad cruzada potencial entre los alotipos del MHC del hospedador y terceras celulas estimulantes (aunque desapareadas deliberadamente por tipificacion de HLA.) Por lo tanto, aunque la importancia de la etapa de agotamiento de antihospedador al final del cultivo esta claramente indicada, se requieren mas estudios para evaluar el papel potencial de la primera seleccion positiva de celulas activadas antiterceros.
Sin embargo, como se muestra en la Tabla 5, anterior, el agotamiento exitoso de clones espedficos antihospedador por la clasificacion magnetica basada en CD 137 de dos estadios, permite en general menor recuperacion de celulas al final del cultivo (18 % frente a 463 %, representado como porcentaje del numero introducido de celulas adherentes a PBMC, respectivamente).
Colectivamente, este experimento preliminar indica que el agotamiento de alorreactividad por clasificacion magnetica de dos estadios, basado en el marcador de activacion CD 137, es factible y podna incorporarse en el presente protocolo generando celulas Tcm alogenicas no reactivas al hospedador. Son atributos prometedores indicados: 1) altos niveles de expresion inducidos por la activacion alogenica tras seleccion positiva se regularon negativamente completamente el dfa 10, lo que permitio otra aloactivacion contra antfgenos del hospedador. 2) La composicion celular y el porcentaje de celulas Tcm no se vio afectado drasticamente por la clasificacion magnetica, basandose en el marcador de activacion CD137. 3) La retirada de celulas CD137+ hacia el final del cultivo, evito completamente la proliferacion en respuesta a PBMC hospedadoras, a diferencia del grupo de control de referencia, que mostro proliferacion detectable (134 celulas en division). Los estudios actuales incluyen: 1) el uso de bloqueo de FcR antes de la etapa de seleccion positiva. 2) Uso de CD hospedadoras en lugar de PBMC para deteccion mas eficaz de celulas reactivas al hospedador al final del cultivo. 3) Adicion de marcadores de activacion mas clmicamente disponibles como CD25 o captura de IFN gamma a la etapa de agotamiento.
Conclusiones
El uso de agotamiento de CD 137 al final de la generacion de Tcm podna proveer un enfoque factible para agotar adicionalmente la alorreactividad de estas celulas.
Se exploran intentos de continuar refinando el uso de agotamiento de CD 137 junto con agotamiento de CD25, ambos de los cuales estan disponibles como reactivos de GMP.
Ademas, se llevan a cabo experimentos para minimizar la reactividad cruzada potencial usando APC artificiales que portan solamente un alelo del HLA-I.
Claims (12)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un metodo para generar una poblacion aislada de celulas que comprende celulas antiterceros que no inducen injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo dichas celulas, celulas inductoras de tolerancia y/o dotadas con actividad antienfermedad, y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues del trasplante, comprendiendo el metodo:(a) tratar celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con un agente capaz de agotar celulas CD4+ y/o cD56+ para obtener celulas T CD8+;(b) poner en contacto dichas celulas CD8+ con un tercer antigeno o terceros antfgenos en presencia de IL-21 durante 12 horas hasta 5 dfas para permitir el enriquecimiento de celulas reactivas a antigeno; y(c) cultivar dichas celulas resultantes de la etapa (b) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin antfgenos durante 5-20 dfas para permitir la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de este modo la poblacion aislada de celulas.
- 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas:agotar celulas adherentes de dichas PBMC antes de la etapa (a); oseleccionar celulas CD45RA+ y/o CD45RO- despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b); ocultivar dichas celulas resultantes de la etapa (a) con un tercer antfgeno o terceros antfgenos en presencia de IL- 21, IL-15 e IL-7 despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b); o seleccionar celulas activadas despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b); oagotar celulas alorreactivas despues de la etapa (b).
- 3. Un metodo para generar una poblacion aislada de celulas, que comprende celulas antiterceros que no inducen injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo dichas celulas, celulas inductoras de tolerancia y/o dotadas con actividad de injerto contra leucemia (GVHD), y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues del trasplante, comprendiendo el metodo:(a) tratar celulas mononucleares de sangre periferica no adherentes (PBMC) con un agente capaz de agotar celulas CD4+ y/o CD56+ para obtener celulas T CD8+;(b) poner en contacto dichas celulas T CD8+ con terceras celulas dendnticas en presencia de IL-21 durante 12 horas hasta 5 dfas para permitir el enriquecimiento de celulas reactivas a antfgeno;(c) cultivar dichas celulas resultantes de la etapa (b) con dichas terceras celulas dendnticas en presencia de IL- 21, IL-15 e IL-7 durante 12 horas a 3 dfas; y(d) cultivar dichas celulas resultantes de la etapa (c) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin antfgenos durante 5-20 dfas para permitir la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de este modo la poblacion aislada de celulas.
- 4. Un metodo para generar una poblacion aislada de celulas que comprende celulas antiterceros que no inducen injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), estando dichas celulas dotadas de actividad antienfermedad, y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de trasplante, comprendiendo el metodo:(a) tratar celulas mononucleares de sangre periferica no adherentes (PBMC) con un agente capaz de agotar celulas CD4+ y/o CD56+ para obtener celulas T CD8+;(b) poner en contacto dichas celulas T CD8+ con celulas dendnticas no singenicas en presencia de IL-21 durante 12 horas hasta 5 dfas para permitir el enriquecimiento de celulas reactivas a antfgeno;(c) cultivar dichas celulas resultantes de la etapa (b) con dichas celulas dendnticas no singenicas en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 durante 12 horas a 3 dfas; y(d) cultivar dichas celulas resultantes de la etapa (c) en presencia de IL-21, IL-15 e IL-7 en un ambiente sin antfgenos durante 5-20 dfas para permitir la proliferacion de celulas que comprenden dicho fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), generando de este modo la poblacion aislada de celulas.
- 5. El metodo de la reivindicacion 3 o 4, que comprende ademas:seleccionar celulas CD45RA+ y/o CD45RO- despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b); oseleccionar celulas activadas despues de la etapa (b) y antes de la etapa (c); oagotar celulas alorreactivas despues de la etapa (d).51015202530354045
- 6. El metodo de la reivindicacion 1, 3 o 4, en el que dichas celulas antiterceros que tienen un fenotipo de memoria central T comprenden una identificacion CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45Ro+, y en el que al menos el 50 % de la poblacion aislada de celulas son celulas CD3+CD8+ de las que al menos el 50 % tienen dicha identificacion.
- 7. Una poblacion aislada de celulas que comprende celulas antiterceros no inductoras de injerto contra hospedador (GVHD) que tienen un fenotipo de linfocito T de memoria central (Tcm), siendo dichas celulas celulas inductoras de tolerancia y/o dotadas con actividad antienfermedad y capaces de dirigirse a los ganglios linfaticos despues de trasplante, en la que dichas celulas antiterceros que tienen un fenotipo de memoria central T comprenden una identificacion CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+; y en la que al menos el 50 % de la poblacion aislada de celulas son celulas CD3+CD8+ de las que al menos el 50 % tienen dicha identificacion, generada de acuerdo con el metodo de las reivindicaciones 1-6.
- 8. Una composicion terapeuticamente eficaz que comprende la poblacion aislada de celulas de la reivindicacion 7, para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesite, en la que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad maligna, una enfermedad vmca y una enfermedad autoinmunitaria.
- 9. Una composicion terapeuticamente eficaz que comprende la poblacion aislada de celulas de la reivindicacion 7, para su uso en el tratamiento de un sujeto que necesite un trasplante celular o tisular o para tratar a un sujeto que necesite un trasplante de celulas hematopoyeticas inmaduras.
- 10. La composicion terapeuticamente eficaz que comprende la poblacion aislada de celulas para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en la que dicho trasplante celular o tisular se selecciona del grupo que consiste en un hngado, un pancreas, un bazo, un rinon, un corazon, un pulmon, una piel, un intestino y un tejido u organo linfoide/hematopoyetico; o en la que dicho trasplante celular o tisular comprende celulas hematopoyeticas inmaduras.
- 11. La composicion terapeuticamente eficaz que comprende la poblacion aislada de celulas para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en la que dicho trasplante celular o tisular comprende un cotrasplante de varios organos;y opcionalmente en la que dicho cotrasplante comprende el trasplante de celulas hematopoyeticas inmaduras y un organo solido;y opcionalmente en la que dichas celulas hematopoyeticas inmaduras y dicho organo solido se obtienen del mismo donante;y opcionalmente en la que dicho trasplante celular o tisular y dicha poblacion aislada de celulas proceden del mismo donante;y opcionalmente en la que dicho trasplante celular o tisular es singenico con el sujeto y dicha poblacion aislada de celulas no es singenica con el sujeto;y opcionalmente en la que dicho trasplante celular o tisular es singenico con el sujeto y dicha poblacion aislada de celulas es singenica con el sujeto.
- 12. La composicion terapeuticamente eficaz que comprende la poblacion aislada de celulas para su uso de acuerdo con la reivindicacion 9, en la que dichas celulas hematopoyeticas inmaduras y dicha poblacion aislada de celulas proceden del mismo donante;y opcionalmente en la que dicho donante no es singenico con el sujeto;y opcionalmente en la que dichas celulas hematopoyeticas inmaduras y dicha poblacion aislada de celulas proceden del sujeto.
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