BR112014005355B1

BR112014005355B1 - Células t de memória central anti-terceiro, métodos de produção e uso das mesmas em transplante e tratamento de doença

Info

Publication number: BR112014005355B1
Application number: BR112014005355-3A
Authority: BR
Inventors: Yair Reisner; Yaki Eidelstein; Eran Ophir; Assaf Lask; Ran Afik; Noga Or-Geva; Esther Bachar-Lustig
Original assignee: Yeda Research An Development Co., Ltd
Priority date: 2011-09-08
Filing date: 2012-09-06
Publication date: 2022-03-29
Also published as: CN103930130B; RU2636503C2; MX351226B; WO2013035099A1; RU2014110897A; JP6196620B2; BR112014005355A2; ES2640813T3; EP2753351A1; EP2753351B1; US20180193384A1; US11324777B2; KR102073901B1; AU2012305931A1; US20230024587A1; KR20140092298A; CN103930130A; NZ622749A; CA2848121C; SG11201400513PA

Abstract

CÉLULAS T DE MEMÓRIA CENTRAL ANTI-TERCEIRO, MÉTODOS DE PRODUÇÃO E USO DAS MESMAS EM TRANSPLANTE E TRATAMENTO DE DOENÇA. Abrange método de geração 5 de uma população isolada de células, compreendendo células anti-terceiros tendoumfenótipo do linfócitoT (Tcm) dernemória central, as células sendo células de indução de tolerância e/ou dotadas de atividade anti-doença e capazes de retornar aos gânglios linfáticos após transplante é divulgado; o método 10 compreende: (a) contatar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) com um antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21 para permitir o enriqijecimento das células reativas ao antígeno; e (b) cultivar as células resultantes da ' etapa (a) na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 em ambiente livre 15 de antígenos para permitir a proliferação de células compreendendo o fenótipo do linfócito T (Tcm) de memória central.

Description

CAMPO DE APLICAÇÃO E ESTADO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção, em algumas aplicações respectivas, refere- se à indução de tolerância e/ou enxerto versus células anti-terceiro reativas de leucemia, compreendendo o fenótipo do linfócito T de memória central e, mais particularmente, mas não exclusivamente, os métodos de geração dos mesmos e o uso dos mesmos em transplante e em tratamento de doença.

[002] O transplante de medula óssea (BM/bone marrow) proporciona um tratamento curativo para muitos pacientes com neoplasias hematológicas e outras doenças hematológicas. No entanto, o enxerto de BM contém células T do doador que reagem aos antígenos (Ags) hospedeiros e causam a doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD| graft-versus-host disease), uma enfermidade sistêmica. No início dos anos 80, o transplante de medula óssea (BMT|bone marrow transplant), sem o efeito prejudicial da GVHD, foi demonstrado no ambiente haploidêntico (três loci HLA não correspondentes), em pacientes com imunodeficiência combinada grave (SCID/severe combined immunodeficiency). O problema da GVHD, que é letal de forma quase uniforme em tal ambiente, foi evitado completamente pela depleção da célula T.

[003] No entanto, em pacientes com leucemia, o resultado clínico da medula óssea depletada de célula T foi desanimador, já que o benefício da prevenção de GVHD foi neutralizado por uma taxa significativamente elevada de rejeição de enxerto. A rejeição demonstrou ser mediada por células T derivadas de hospedeiros resistentes à radioquimioterapia [Reisner et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1986) 83:4012-4015]. Uma forma de superar este problema é realizar BMT após condicionamento supra-letal e inativação funcional de células T hospedeiras, utilizando fármacos imunossupressores. Entretanto, esta estratégia é dificultada por infecções oportunistas devido à baixa reconstituição da imunidade e toxicidades consideráveis dos imunossupressores.

[004] Embora em pacientes com leucemia de alto risco a mortalidade relacionada ao transplante possa ser aceitável, ela seria intolerável se aplicada a pacientes com uma longa expectativa de vida. Portanto, o uso de condicionamento de intensidade reduzida, com ablação imune menos grave, para permitir a colocação do enxerto de BM depletada de célula T (TDBM), o qual está associado ao risco reduzido para GVHD, é garantido. O estabelecimento de quimerismo do tipo do doador, sob tal condicionamento reduzido, representa a meta mais desejável na biologia de transplante, já que é geralmente associado à tolerância durável em direção às células ou tecidos do doador original. Além disso, os níveis assinalados das células hospedeiras imunes, que sobreviveram aos regimes preparatórios leves, representam uma barreira de dificuldade para o enxerto de células do doador.

[005] Uma abordagem para superar a rejeição de TDBM alogênica fez uso de grandes doses de células. Foi primeiro demonstradoem modelos de roedores que uma“megadose” de transplante de TDBM pode superar a rejeição de enxerto mediado por célula T [Lapidot et al., Blood (1989) 73:2025-2032; Bachar-Lustig et al., Nat Med. (1995) 1:1268-1273; Uharek et al., Blood (1992) 79:1612-1621].No entanto, um aumento significativo no inóculo da BM tem dificultado o alcance em humanos. Para superar este problema, o fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF | granulocytes colony stimulating factor), que facilita a mobilização de células- tronco hematopoiéticas (CTHs [hematopoietic stem cells], células CD34+ em humanos) da BM, tem sido utilizado para aumentar o rendimento de CTHscoletadas do sangue e CTHs depletadas de célula Tforamsuplementadas ao TDBM convencional [Aversa et al., N Engl J Med. (1998) 339:1186-1193; Aversa et al., J Clin Oncol. (2005) 23:3447-3454; Reisner and Martelli, Immunol Today (1999) 20:343-347; Handgretinger et al., Bone Marrow Transplant. (2001) 27:777-783].

[006] Os transplantes de “megadose”de CD34 levantaram questões interessantes, por exemplo, como estas células superam a barreira apresentada pelos precursores do linfócitoT- citotóxico (CTL-p | cytotoxic T-lymphocyte precursors).Esta questão foi respondida, em parte, pela descoberta que as células dentro da fração de CD34 são dotadas de atividade de veto potente [Gur et al., Blood (2005) 105:2585-2593; Gur et al., Blood (2002) 99:41744181; Rachamim et al., Transplantation (1998) 65:1386-1393].Outros tipos de células também têm mostrado mediar a atividade de veto, incluindo linfócitos T (por exemplo, CD8+ CTLs), células exterminadoras naturais e células dendríticas.A comparação direta da reatividade de veto de vários tipos de célula revelou que CTLs compreendem o efeito de veto mais forte [Reich- Zeliger et al., J Immunol. (2004) 173:6654-6659].

[007] Uma abordagem desenvolvida para gerar CTLs de veto sem reatividade de GVH foi descrita por Reisner e colegas, na qual os CTLs eram estimulados contra estimuladores de terceirosna ausência de exógenos IL- 2.Esta abordagem se baseou na observação de que somente CTLp ativados eram capazes de sobreviver à privação de IL-2 na cultura primária. Este método foi mostradoin vitroein vivopara depletar a reatividade de GVHde CTLs de veto anti-terceiro[Publicação PCT N°. WO 2001/049243, Bachar- Lustig et al., Blood. 2003;102:1943-1950; Aviner et al., Hum Immunol. (2005) 66:644-652]. A introdução destes CTLs de veto anti-terceiro em um receptor(juntamente com transplante) preveniu a rejeição do enxerto sem indução de GVHD (Publicação PCT N°. WO 2001/049243).

[008] Várias abordagens foram contempladas para transplante de enxerto sem rejeição de enxerto e/ou doença do enxerto contra hospedeiro, algumas estão sumarizadas.

[009] A Publicação PCT N°. WO 2007/023491 divulga o uso de células tolerogênicas para redução ou prevenção de rejeição de enxerto de um enxerto nãosingênico em um indivíduo. As células tolerogênicas divulgadas (por exemplo: células CD4+CD25+) podem ser derivadas de qualquer doador que não seja singênico com ambos, indivíduo e enxerto (células tolerogênicas “de terceiros”).O enxerto (por exemplo: medula óssea) pode ser derivado de qualquer doador de enxerto que seja alogênico ou xenogênico com o indivíduo.

[010] A Publicação PCT N° WO 2002/102971 divulga o uso de células progenitoras hematopoiéticas (HPC hematopoietic progenitorcells) cultivadas, compreendendo a atividade de veto intensificada para induzir a tolerância a um transplante transplantado de um doador a um receptor. As células tolerogênicas divulgadas expressam preferivelmente CD33 e são administradas antes de, de forma concomitante com ou após o transplante (por exemplo: transplante de célula ou órgão).

[011] A Publicação PCT N° WO 2002/043651 divulga o uso de uma população de indução não GVHD de células efetoras da imunidade para tratamento de doença. Para chegar à população de indução não-GVHD de células efetoras da imunidade, uma primeira população de células (por exemplo: linfócitos T) é co-cultivada com uma segunda população de células sendo não singênica com o indivíduo e não singênica com a primeira população de células (por exemplo: linfócitos B infectados por EBV)sob condições que incluem a inanição de IL-2 seguido da suplementação de IL- 2.As células efetoras da imunidade resultantes podem ser usadas para tratar doenças tais como doenças malignas, doenças virais e doenças autoimunes.

[012] A Patente Americana N°. 6.759.035 divulga métodos de inibição de rejeição de enxerto e indução de tolerância de células T em um receptor de transplante de órgão sólido. Os métodos divulgados compreendem a remoção de células mononucleares do sangue periférico (PBMC’s | peripheral blood mononuclear cells) de um doador e receptor, cultivando as células do doador e receptor em conjunto na presença de um composto que induz à atividade supressora da célula T (por exemplo: TGF-β, IL-15 e IL-2), e administrando as células T supressoras ao receptor juntamente com o transplante para impedir que as células T do receptordestruam as células do doador, destemodo induzindo à tolerância e sobrevivência em longo prazo do transplante.

[013] A Patente Norte-Americana n° 6.803.036 divulga métodos para o tratamento de células de doadores para amenizar a doença do enxerto contra o hospedeiro em um paciente receptor.Os métodos divulgados incluem remover PBMC’s de um doador e tratamento das células com uma composição supressiva (p.ex., IL-10, IL-2, IL-4, IL15 e TGF-β) por um tempo suficiente para induzir a tolerância à célula T. As células são, então, introduzidas a um paciente receptor. As células tratadas podem ser adicionadas às células-tronco do doador antes da introdução no paciente.

[014] A Publicação PCT n° WO 2010/049935 divulgou uma população isolada de células compostas por não GVHD induzindo células anti-terceiro, com um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm | central memory T- lymphocyte), as células sendo células indutoras de tolerância e capazes de retornar aos gânglios linfáticos após o transplante.

RESUMO DA INVENÇÃO

[015] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de geração de uma população isolada de células, compreendendo células anti-terceiro, com um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), as células sendo células indutoras de tolerância e/ou dotadas de atividade anti-doença, e capazes de se orientar aos gânglios linfáticos após o transplante, o método compreendendo: (a) contatar células mononucleares sangue periférico (PBMC) com um antígeno de terceiro ou antígenos na presença de IL-21, de forma a permitir o enriquecimento de células reativas antigênicas; e (b) cultivar as células resultantes da etapa (a) na presença de IL-21, IL-15 e IL-7, em um ambiente livre de antígenos, a fim de permitir a proliferação de células que incluem o fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), gerando assim a população isolada de células.

[016] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de geração de uma população isolada das células, compreendendo células anti-terceiro, com um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), as células sendo células indutoras de tolerância e/ou dotadas de atividade de enxerto contra leucemia (GVL | graft-versus leukemia), e capaz de se orientar aos gânglios linfáticos após o transplante, o método compreendendo: (a) tratar de células mononucleares do sangue periférico não aderentes (PBMC) com um agente capaz de depletar células CD4+ e/ou CD56+, de modo a obter células T CD8+; (b) contatar as células T CD8+ com as células dendríticas de terceiros na presença de IL-21 por 12 horas a 5 dias de modo a permitir o enriquecimento de células reativas antigênicas; (c) cultivar as células resultantes da etapa (b) com as células dendríticas de terceiros na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 por 12 horas a 3 dias; e (d) cultivar as células resultantes da etapa (c) na presença de IL-21, IL- 15 e IL-7 em um ambiente livre de antígenos por 5 a 20 dias, de modo a permitir a proliferação de células compreendendo o fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), gerando assim a população isolada de células.

[017] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de geração de uma população isolada de células, compreendendo células anti-terceiro, com um fenótipo do linfócito T de memória central T (Tcm), as células dotadas com atividade anti-doença e capazes de se orientar aos gânglios linfáticos após o transplante, o método compreendendo: (a) tratar de células mononucleares do sangue periférico não aderente (PBMC) com um agente capaz de depletar células CD4+ e/ou CD56+, assim como obter células T CD8+; (b) contatar as células T CD8+ com as células dendríticas de terceiros na presença de IL-21 por 12 horas a 5 dias de modo a permitir o enriquecimento de células reativas antigênicas; (c) cultivar as células resultantes da etapa (b) com as células dendríticas de terceiros na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 por 12 horas a 3 dias; e (d) cultivar as células resultantes da etapa (c) na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 em um ambiente livre de antígenos por 5 a 20 dias, de modo a permitir a proliferação de células compreendendo o fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), gerando assim a população isolada de células.

[018] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido uma população isolada das células, composta por células anti-terceiro, com um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), em que pelo menos 50% da população isolada de células são células CD3+ CD8+, das quais pelo menos 50% compreendem uma assinatura CD3+ CD8+ CD62L+, CD45RA-, CD45RO+, e caracterizado, ainda, pelas células serem células indutoras de tolerância e/ou dotadas de atividade anti-doença e capazes de retornar aos gânglios linfáticos após o transplante.

[019] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma população isolada das células, composta por células anti-terceiro, com um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), as células sendo células indutoras de tolerância e/ou dotadas com atividade anti-doença e capazes de retornar aos gânglios linfáticos após o transplante, gerados de acordo com os métodos presentes.

[020] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade respectiva, caracterizado pela doença ser selecionada do grupo constituído por uma doença maligna, uma doença viral e uma doença autoimune, o método composto por administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da população isolada de células da presente invenção, tratando, assim, o indivíduo.

[021] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de tratamento de um indivíduo em necessidade de um transplante de célula ou tecido, compreendendo o método: (a) transplantar um transplante de célula ou tecido no indivíduo; e (b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da população isolada de células da presente invenção, tratando, desse modo, o indivíduo.

[022] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de tratamento de um indivíduo necessitando de um transplante de células hematopoiéticas imaturas, o método compreendendo: (a) transplantar células hematopoiéticas imaturas ao indivíduo; e (b) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da população isolada de células da presente invenção, tratando, desse modo, o indivíduo.

[023] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, a depleção das células não aderentes das PBMC antes da etapa (a).

[024] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, a depleção das células CD4+ e/ou CD56+ das PBMC antes da etapa (a).

[025] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, selecionar as células CD45RA+ e/ou CD45RO- das PBMC antes da etapa (a).

[026] De acordo com algumas aplicações da invenção, as PBMC compreendem as células T CD8+.

[027] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o cultivo das células resultantes da etapa (a) com um antígeno ou antígenos de terceiro na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 após a etapa (a) e antes da etapa (b).

[028] De acordo com algumas aplicações da invenção, o antígeno ou antígenos de terceiro incluem células dendríticas.

[029] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células dendríticas são células dendríticas irradiadas.

[030] De acordo com algumas aplicações da invenção, o antígeno ou antígenos de terceiro é selecionado do grupo constituído por células de terceiros, um antígeno da célula, um antígeno viral, um antígeno bacteriano, um extrato de proteína, uma proteína purificada e um peptídeo sintético apresentado por células apresentadoras autólogas, células apresentadoras não autólogas ou em veículo artificial ou em células apresentadoras de antígenos artificiais.

[031] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células de terceiros são células estimuladoras selecionadas do grupo constituído por células purificadas de linfócitos do sangue periférico, baço ou gânglios linfáticos, PBLs mobilizados de citocina, células apresentadoras de antígeno expandidas in vitro (APC | antigen-presenting cells), células dendríticas expandidas in vitro e células apresentadoras de antígenos artificiais.

[032] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, selecionar as células CD45RA+ e/ou CD45RO- das PBMC após a etapa (a) e antes da etapa (b).

[033] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células T CD8+ compreendem células T CD8 + naturais.

[034] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células dendríticas compreendem células dendríticas expandidas in vitro.

[035] De acordo com algumas aplicações da invenção, células dendríticas compreendem as células dendríticas irradiadas.

[036] De acordo com algumas aplicações da invenção, o contato na presença de IL-21 é efetuado por 12 horas a 5 dias.

[037] De acordo com algumas aplicações da invenção, o contato na presença de IL-21 é efetuado por 2 a 3 dias.

[038] De acordo com algumas aplicações da invenção, o contato na presença de IL-21 é efetuado por 3 dias.

[039] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, a seleção de células ativadas após a etapa (a) e antes da etapa (b).

[040] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, a seleção de células ativadas após a etapa (b) e antes da etapa (c).

[041] De acordo com algumas aplicações da invenção, a seleção de células ativadas é efetuada pela seleção de células CD137+ e/ou CD25+.

[042] De acordo com algumas aplicações da invenção, a seleção de células ativadas é efetuada de 12 a 72 horas após o contato.

[043] De acordo com algumas aplicações da invenção, o cultivo com o antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 é efetuado de 12 horas a 3 dias.

[044] De acordo com algumas aplicações da invenção, a presença de IL-21, IL-15 e IL-7 no ambiente livre de antígeno é efetuada por 5 a 20 dias.

[045] De acordo com algumas aplicações da invenção, o cultivo na presença de IL-21, IL15 e IL-7 no ambiente livre de antígeno é efetuado por 7 a 11 dias.

[046] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, a depleção de células alorreativas, após a etapa (b).

[047] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, a depleção de células alorreativas após a etapa (d).

[048] De acordo com algumas aplicações da invenção, a depleção das células alorreativas é efetuada pela depleção de células CD137+ e/ou CD25+ após contato com as células compreendendo o fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm) com células apresentadoras de antígeno hospedeiro (APC’s).

[049] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são singênicas em relação a um indivíduo.

[050] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são não singênicas em relação a um indivíduo.

[051] De acordo com algumas aplicações da invenção, as PBMC não singênicas são xenogênicas ou alogênicas em relação a um indivíduo.

[052] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células anti- terceiro com um fenótipo de memória central T, compreendendo uma assinatura CD3+ CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+.

[053] De acordo com algumas aplicações da invenção, pelo menos 50% da população isolada de células são células CD3+ CD8+, das quais pelo menos 50% têm a assinatura.

[054] De acordo com algumas aplicações da invenção, a doença maligna é composta por uma leucemia ou um linfoma.

[055] De acordo com algumas aplicações da invenção, a população isolada de células é singênica com o indivíduo.

[056] De acordo com algumas aplicações da invenção, a população isolada de células é não singênica com o indivíduo.

[057] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, o condicionamento do indivíduo sob condições sub-letais, letais ou supra-letais antes do transplante.

[058] De acordo com algumas aplicações da invenção, o transplante de célula ou tecido é singênico com o indivíduo.

[059] De acordo com algumas aplicações da invenção, o transplante de célula ou tecido é derivado de um doador selecionado do grupo constituído de um doador alogênico HLA idêntico, doador alogênico HLA não idêntico e um doador xenogênico.

[060] De acordo com algumas aplicações da invenção, o transplante de célula ou tecido compreende células hematopoiéticas imaturas.

[061] De acordo com algumas aplicações da invenção, o transplante de célula ou tecido é selecionado do grupo constituído por um fígado, pâncreas, um baço, um rim, um coração, um pulmão, uma pele, um intestino e um tecido linfoide/hematopoiético ou órgão.

[062] De acordo com algumas aplicações da invenção, o transplante de célula ou tecido compreende um co-transplante de vários órgãos.

[063] De acordo com algumas aplicações da invenção, o co-transplante compreende o transplante de células hematopoiéticas imaturas e um órgão sólido.

[064] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células hematopoiéticas imaturas e o órgão sólido são obtidos do mesmo doador.

[065] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células hematopoiéticas imaturas são transplantadas antes, concomitantemente ou após o transplante de órgão sólido.

[066] De acordo com algumas aplicações da invenção, a população isolada de células é administrada antes, concomitantemente ou após o transplante de células ou tecidos.

[067] De acordo com algumas aplicações da invenção, a população isolada de células é singênica com o indivíduo.

[068] De acordo com algumas aplicações da invenção, a população isolada de células é não singênica com o indivíduo.

[069] De acordo com algumas aplicações da invenção, o transplante de células ou tecidos e a população isolada de células são derivados do mesmo doador.

[070] De acordo com algumas aplicações da invenção, o transplante de célula ou tecido é singênico com o indivíduo e a população isolada de células é não singênica com o indivíduo.

[071] De acordo com algumas aplicações da invenção, o transplante de célula ou tecido é singênico com o indivíduo e a população isolada de células é singênica com o indivíduo.

[072] De acordo com algumas aplicações da invenção, a população isolada de células é administrada antes, concomitantemente ou após as células hematopoiéticas imaturas.

[073] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células hematopoiéticas imaturas e a população isolada de células são derivadas do mesmo doador.

[074] De acordo com algumas aplicações da invenção, o doador é não singênico com o indivíduo.

[075] De acordo com algumas aplicações da invenção, as células hematopoiéticas imaturas e a população isolada de células são derivadas do indivíduo.

[076] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, condicionar o indivíduo em condições sub-letais, letais ou supra-letais antes do transplante.

[077] De acordo com algumas aplicações da invenção, o indivíduo é um indivíduo humano.

[078] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado como é comumente entendido por alguém com habilidade comum na técnica ao qual pertence à invenção. Apesar de métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento poderem ser utilizados na prática ou teste de aplicações da invenção, métodos exemplares e/ou materiais estão descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo suas definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[079] Algumas aplicações da invenção são descritas neste documento a título de exemplo somente, tendo como referência os desenhos de acompanhamento. Com referência específica aos desenhos em detalhes, sublinhe-se que os elementos indicados são a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das aplicações da invenção. A este respeito, a descrição tirada com os desenhos torna evidente aos especialistas na técnica como as aplicações da invenção podem ser praticadas. Nos desenhos:

[080] As Figuras 1A-B são diagramas esquemáticos mostrando a configuração alogênica (Figura 1B) e autóloga (Figura A) humana. De nota, as duas definições diferem entre si na origem do doador de medula óssea (BM | bone marrow) (hospedeiro contra alogênico), os respondentes (hospedeiro contra alogênico) e estimuladores (qualquer doador alogênico contra reatividade não cruzada de terceiro com hospedeiro MHC) que estão envolvidos na geração Tcm.

[081] As Figuras 2A-B são diagramas esquemáticos, retratando as configurações singênica (Figura 2A) e alogênica (figura 2B) de um rato. De nota, as duas configurações diferem entre si na origem do doador BM (singênico ou F1 contra alogênicos), os respondentes (singênicos ou F1 contra alogênicos) e estimuladores (alogênico contra de terceiros) que estão envolvidos na geração do Tcm.

[082] As Figuras 3A-B são diagramas esquemáticos mostrando o protocolo humano autólogo para geração de Tcm (Figura 3A) em comparação com o protocolo do rato singênico (Figura 3B).

[083] As Figuras 4A-C retratam a cinética da geração de memória central antiterceiro (“experimentos de controle de referência”). Células T CD8 naturais foram estimuladas com DC de terceiro alogênica irradiada a uma proporção de 4:1 em um meio contendo IL-21 por 3 dias. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas em um meio contendo IL-7 e IL-15 até o dia 12,5. Nos dias 7,5, 10,5 e 12,5, as células foram avaliadas por fenótipos (expressão de marcador de superfície) (Figura 4A) e o percentual de Tcm (CD62L+ CD45RO+) das células T CD8 utilizando análise de FACS (Figura 4B) e por número celular por exclusão com azul de tripan (Figura 4). Para cada ponto de tempo, dados representam uma média ± SE de n experimentos independentes.

[084] As Figuras 5A-C retratam um típico experimento demonstrando o papel de aplicação com DC alogênica. De nota, a IL-21 sozinha ou IL-7 mais IL-15 sem preparação com DC não induz o fenótipo de memória central de células T CD8 naturais e mal suporta a sua expansão. A Figura 5A ilustra as células T CD8 naturais que foram estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiros a uma proporção de 4:1 num meio contendo IL-21 por 3 dias. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 13 (“grupo de controle de referência” = d(0-3) IL21 + DC d(3-13)IL7+IL15); as Figuras 5B-C ilustram as células T CD8 naturais que foram cultivadas com IL-21 (Figura 5B) ou com uma combinação de IL-7 e IL-15 (Figura 5) na ausência de estimulação até o dia 10 ou o dia 13, respectivamente.

[085] As Figuras 6A-B representam o papel de preparar com as DC alogênicas demonstradas pelo impacto relativo médio no nível Tcm e vezes de expansão em relação ao grupo de controle de referência. As células T CD8 naturais foram estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiro a uma proporção de 4:1 em um meio contendo IL-21 por 3 dias. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 13 (“Grupo de controle de referência” = d(0-3) IL21+DC d(3-13)IL7+IL15). Alternativamente, as células T CD8 naturais foram cultivadas com IL-21 ou com combinação de IL-7 e IL-15, na ausência de estimulação até o dia 13.As células foram avaliadas por número celular por exclusão com azul de tripan (Figura 6A) e o percentual de Tcm (CD62L+ CD45RO+) de células T CD8 utilizando análise de FACS (Figura 6B). Para cada ponto de tempo, dados representam uma média ± SE de n experimentos independentes.

[086] As Figuras 7A-C retratam um típico experimento demonstrando o papel da IL-21 nas fases de preparação e expansão da Tcm anti-terceiro. De nota, a remoção de IL-21 desde a fase de preparação reduziu tanto a expansão quanto a indução de Tcm, enquanto a presença de IL-21 em toda a cultura aumentou a indução de Tcm. A Figura 7 ilustra as células T CD8 naturais que foram estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiro a uma proporção de 4:1 num meio contendo IL-21 por 3 dias. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 13 (“grupo de controle de referência” = d(0-3) IL21+DC d(3- 13)IL7+IL15); as Figuras 7B-C ilustram as células T CD8 naturais, que foram estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiro a uma proporção de 4:1 na ausência de IL-21 por 3 dias. Posteriormente as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 13 (Figura 7B) ou estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiro a uma proporção de 4:1 com a presença contínua de IL-21 em ambas as fase de preparação (IL-21 sozinho) e em fase de expansão (juntamente com IL-7 e IL- 15) (Figura 7C).

[087] As Figuras 8A-B retratam o requisito para IL-21 para rendimento ideal de Tcm (média de vários experimentos independentes). Células T CD8 naturais foram tratadas como acima e as culturas foram avaliadas por número celular por exclusão com azul de tripan (Figura 8A) e o percentual de Tcm (CD62L+ CD45RO+) de células T CD8 utilizando análise de FACS (Figura 8B). Os resultados de cada experimento são mostrados separadamente e as linhas indicam resultados médios sobre n experiências.

[088] As Figuras 9A-B retratam a relação de respondente/DC ideal para a indução do fenótipo de Tcm e para expansão robusta. As células T CD8 naturais 4 x 105 foram estimuladas face às DC’s alogênicas irradiadas de terceiro aumentando os número na presença de IL-21 por 3 dias. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL15 até o dia 13 (“grupo de controle de referência” = d(0-3) IL21+100,00 DC d(3-13) IL7+IL15). As culturas foram avaliadas por número celular por exclusão com azul de tripan (Figura 9A) e o percentual de Tcm (CD62L+ CD45RO+) de células T CD8 utilizando análise de FACS (Figura 9B). Os resultados de cada experimento são mostrados separadamente e as linhas indicam resultados médios sobre n experiências.

[089] A Figura 10 retrata uma avaliação do efeito de diferentes reagentes de grau GMP sobre o enriquecimento de CD8+ e células T CD45RA+CD8+ naturais. PBMC doadoras foram depletadas de células aderentes por incubação durante a noite em placas especificamente projetadas para remover células mieloides aderentes (painel superior), e no dia 0, células não aderentes dividiram-se em quatro grupos de teste, cada um sujeito a um protocolo de separação magnética diferente. As células foram avaliadas por composição celular e fenótipo Tcm por análise de FACS. Os resultados na coluna da esquerda (CD45RO e CD45RA) são dependentes das células CD3+CD8+. Os resultados representam uma experiência típica de dois experimentos independentes realizados.

[090] A Figura 11 mostra um experimento típico mostrando o efeito de diferentes reagentes de grau GMP utilizados para isolamento de células T CD8, na proporção de células T CD8+ com um fenótipo de Tcm e contaminação com células NK e NKT, 7 dias após estimulação com DC’s de terceiro. Células desestimuladas mantidas em cultura com IL-7 sozinhas (painel superior) foram utilizadas como referência. Os resultados na coluna da extrema esquerda (CD45RO e CD45RA) e na coluna da extrema direita (CD62L e CD45RO) são dependentes das células CD3+ CD8+.

[091] A Figura 12 mostra um experimento típico mostrando o efeito de diferentes reagentes de grau GMP, utilizados para isolamento de células T CD8, na proporção de células T CD8+ com um fenótipo de Tcm e contaminação com células NK e NKT, 14 dias após estimulação com DC’s de terceiro. Células desestimuladas mantidas em cultura com IL-7 sozinhas (painel superior) foram utilizadas como referência. Os resultados na coluna da extrema esquerda (CD45RO e CD45RA) e na coluna da extrema direita (CD62L e CD45RO) são dependentes das células CD3+ CD8+.

[092] As Figuras 13A-B retratam o efeito de diferentes reagentes de grau GMP utilizados para isolamento de células T CD8 sobre os níveis de células T CD8 com um fenótipo de Tcm após 7 dias de estimulação face à DC’s de terceiro. A porcentagem média de células T CD3+CD8+ NKT- (Figura 13A) e Tcm (Figura 13B) é mostrada como porcentagem dos níveis atingidos no grupo de controle de otimização fazendo uso de todos os 4 reagentes (CD4/CD56/CD19/CD45RA).

[093] As Figuras 14A-C retratam o efeito de diferentes reagentes de grau GMP utilizados para isolamento de células T CD8 sobre o rendimento final de células T CD8 com um fenótipo de Tcm após 10 dias de estimulação face à DC’s de terceiro. A expansão de vezes média do dia 0, no dia 10 (Figura 14A) e o rendimento médio após separação magnética (Figura 14B) são mostrados como porcentagem dos níveis atingidos no grupo de controle de otimização, fazendo uso de todos os quatro reagentes da seleção (CD4/CD56/CD19/CD45RA). O rendimento do Tcm no dia 10 (Figura 14) foi calculado pela multiplicação do rendimento após separação magnética (no dia 0) com a expansão de vezes do dia 0 (no dia 10).

[094] A Figura 15 mostra que mudar a fonte para estimuladores de DC’s alogênicas só teve efeito menor sobre o potencial de expansão das células Tcm. As células T CD8 foram enriquecidas de leucaférese descongelada por depleção de células CD4+ e CD56+ utilizando o sistema CliniMacs. As células T CD8 enriquecidas foram, em seguida, divididas em dois grupos de testes, cada um deles estimulado com diferentes DC’s alogênicas irradiadas de terceiro, na proporção de 6:1 num meio contendo IL- 21 por 3 dias em sacos de cultura. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas em meio contendo IL-7, IL- 15 e IL-21 até dia 11. Nos dias 5, 7, 9 e 11 das células de cultura, os números foram determinados pela exclusão com azul de tripan.

[095] As Figuras 16A-B retratam que mudar a fonte para estimuladores de DC’s alogênicas só teve efeito menor sobre a composição da célula. As células T CD8 foram enriquecidas de leucaférese descongelada por depleção de células CD4+ e CD56+ utilizando o sistema CliniMacs para isolamento em larga escala. As células T CD8 enriquecidas foram, em seguida, divididas em dois grupos de teste, cada um deles estimulado com DC de terceiro alogênica irradiada diferente (Figuras 16A e 16B, respectivamente), na proporção de 6:1 num meio contendo IL21 por 3 dias em sacos de cultura. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas em meio contendo IL-7, IL-15 e IL-21 até dia 11. Nos dias 0, 5, 9 e 12 da cultura, as células foram avaliadas por composição celular pela análise de FACS. Todos os resultados são dependentes da barreira de células vivas e da barreira linfática (7AAD-).

[096] As Figuras 17A-B retratam que mudar a fonte para estimuladores de DC alogênicas só teve efeito menor sobre a composição da célula. As células T CD8 foram enriquecidas de leucaférese descongelada por depleção de células CD4+ e CD56+ utilizando o sistema CliniMacs. As células T CD8 enriquecidas foram, em seguida, divididas em dois grupos de testes, cada um deles estimulado com diferentes DC’s alogênicas irradiadas de terceiros, na proporção de 6:1 num meio contendo IL-21 por 3 dias em sacos de cultura. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas em meio contendo IL-7, IL-15 e IL-21 até o dia 11. Nos dias 0, 5, 9 e 12 da cultura, as células foram avaliadas por composição de fenótipo de Tcm (CD45RO+ CD62L+) pela análise de FACS. Todos os resultados são dependentes da barreira de células vivas e da barreira linfática (7AAD-) e células T CD8 (CD3+ CD8+ CD56- CD16-).

[097] A Figura 17 mostra a porcentagem das células apoptóticas depois de 22 horas de reação linfocitária mista (MLR | mixed lymphocyte reaction) com linfoma de células-B e células de plasma de linhas celulares de leucemia. Daudi pré-rotulado CalceinaAM, H.My2 C1R HLA A2 K66A mutante ou linhas celulares L363 foram incubadas durante 22 horas com ou sem 5 vezes em excesso de Tcm anti-terceiro. Células de Anexina V+ foram determinadas pela FACS. Os dados são mostrados como média± SD de culturas quadriplicadas. Os valores ***p< 0,001 indicam alterações estatisticamente significativas em comparação com amostras cultivadas na ausência de Tcm.

[098] A Figura 18 retrata um experimento típico mostrando o enriquecimento para as células T CD8, no dia 14, antes do ensaio de enxerto contra leucemia (GVL), pela depleção extensiva das células T não CD8 (i.e., células T CD4+, células T y/δ, células B, células NK, células dendríticas, monócitos, granulócitos e células eritróides) utilizando separação da esfera magnética.

[099] As Figuras 19A-D mostram H.My C1R (“Neo”) e linhas celulares de linfoblastos de células B (“K66A”) mutantes transfectantes H.My C1R HLA A2 K66A que foram rotuladas com CalceinaAM, um corante vital que é liberado após a eliminação da célula e então incubado por 22 horas, com ou sem células Tcm anti-terceiro na proporção de 1 a 5 em favor de células Tcm anti-terceiro. Depois de 22 horas, as células foram recuperadas e analisadas para sobrevivência, medindo-se o número de células marcadas de Calceína+ sobreviventes e apoptose de células Anexava+ da população de Calceína+ pela FACS. As Figuras 19A-B e as Figuras 19C-D representam dois experimentos independentes, respectivamente; as Figuras 19A e 19C mostram a eliminação, enquanto as Figuras 19B e 19D mostram apoptose.

[0100] A porcentagem de eliminação das células da linha de linfoblastos B foi calculada pela seguinte fórmula:

[0101] Valores negativos significam que as linhas celulares linfoblastoides de células B proliferaram na presença de Tcm.

[0102] A porcentagem de células da linha linfoblasto B passando por apoptose específica foi calculada pela seguinte fórmula: = (% Calceína+ AnexinaV+ células da linha linfoblasto B no alvéolo avaliado) - (% Calceína+ AnexinaV+ células da linha linfoblasto B no alvéolo de controle).

[0103] A Figura 20 mostra o efeito de diferentes reagentes de grau GMP utilizados para isolamento de células T CD8 em níveis de eliminação de K66A. As linhas celulares transfectantes mutantes H.My C1R HLA A2 K66A foram incubadas por 22 horas, com ou sem células Tcm anti- terceiro na proporção de 1 a 5 em favor das células Tcm anti-terceiro. Depois de 22 horas, as células foram recuperadas e analisadas por sua sobrevivência, medindo-se o número de células marcadas de Calceína+ sobreviventes pela FACS (média de dois experimentos independentes). A porcentagem média de eliminação das células mutantes H.My C1R HLA A2 K66A mostrada como porcentagem dos níveis atingidos pelo grupo de controle de otimização isolado fazendo uso de todos os quatro reagentes (CD4/CD56/CD19/CD45RA).

[0104] As Figuras 21-22 são ilustrações esquemáticas mostrando protocolos para geração do Tcm para transplante autólogo (Figura 21) e alogênico (Figura 22).

[0105] As Figuras 23A-D mostram um típico experimento demonstrando o papel da temporização da adição de citocinas na indução do fenótipo Tcm em células T CD8 estimuladas por DC madura derivada de monócito de terceiro alogênico. A Figura 23A ilustra as células T CD8 naturais que foram estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiro a uma proporção de 4:1 num meio contendo IL-21 por 3 dias. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 13 (“grupo de controle de referência” = d(0-3) IL21+DC d(3-13)IL7+IL15); a Figura 23B ilustra as células T CD8 naturais que foram estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiro a uma proporção de 4:1 na presença de IL-21 por 7 dias. Daí em diante, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 13; a Figura 23 ilustra as células T CD8 que foram estimuladas com irradiados DC alogênica irradiada de terceiros a uma proporção de 4:1 com a presença contínua de IL-21 em ambas as fases de preparação (IL21 sozinha) e em fase de expansão (juntamente com IL-15); a Figura 23D ilustra as células T CD8 que foram estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiro a uma proporção de 4:1 com privação de citocinas durante 7 dias. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-15 sozinho até o dia 13.

[0106] As Figuras 24A-B mostram o papel da temporização da adição de citocinas no modelo humano alogênico; resumo das experiências. As células T CD8 naturais foram estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiro a uma proporção de 4:1 em um meio contendo IL-21 por 3 dias. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 13 (“grupo de controle de referência” = d(0-3) IL21 d(3-13)IL7+IL15). Outros grupos foram tratados conforme indicado sob os gráficos. As culturas foram avaliadas por números celulares por exclusão com azul de tripan (Figura 24A) e a porcentagem de Tcm (CD62L+ CD45RO+) de células T CD8 utilizando análise de FACS (Figura 24B). Para cada ponto de tempo, os dados representam uma média ± SE do número (n) indicado de experimentos independentes.

[0107] A Figura 25 mostra o enriquecimento de células T CD8 anti- terceiro específicas pela seleção positiva das células CD137+. As células T CD8 naturais foram estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiro (na proporção de 5,7:1) na presença de IL-21. Depois de 14 horas de ativação, as células CD137+ foram positivamente selecionadas por separação magnética. A expressão de CD137 em células T CD8 foi avaliada pela FACS.

[0108] A Figura 26 mostra que o enriquecimento de células T CD8 anti- terceiro específicas pela seleção positiva das células CD137+ não reduz a aquisição do fenótipo Tcm. As células T CD8 naturais foram estimuladas com DC alogênica irradiada de terceiro a uma proporção de 4:1 na presença de IL- 21 por 3 dias. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 10 (“Grupo de controle de referência”). Alternativamente, as células T CD8 naturais foram estimuladas com DC’s alogênicas irradiadas de terceiro na proporção de 5,7:1 na presença de IL-21. Depois de 14 horas de ativação, as células CD137+ foram positivamente selecionadas por separação magnética. As células CD137+ foram então reestimuladas com DC de terceiro alogênicas irradiadas a uma proporção de 4:1 na presença de IL-21 até o dia 3. Depois disso, as células foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 10. As células foram avaliadas pela porcentagem de Tcm (CD62L+ CD45RO+) de células T CD8 por análise de FACS.

[0109] A Figura 27 mostra uma comparação da cinética de proliferação. As células T CD8 naturais foram estimuladas com DC’s alogênicas irradiadas de terceiro a uma proporção de 4:1 na presença de IL-21 por 3 dias. As células não receberam nenhuma ativação adicional depois disso e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 14 (“Grupo de controle de referência”). Alternativamente, as células T CD8 naturais foram estimuladas com DC’s alogênicas irradiadas de terceiro na proporção de 5,7:1 na presença de IL-21. Depois de 14 horas de ativação, as células CD137+ foram positivamente selecionadas por separação magnética. As células CD137+ foram então reestimuladas com DC’s alogênicas irradiadas de terceiro em uma proporção de 4:1 na presença de IL-21 até o dia 3. Depois disso, as células foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 10. No dia 10, as células foram divididas em dois grupos de teste. No primeiro grupo as células continuaram a ser expandidas com IL-7 e IL15 até o dia 14 (“Anti-terceiro CD137+”), enquanto as células do segundo grupo de testes foram ativadas com a PBMC de hospedeiro irradiado na presença de IL-7 e IL-15 (na proporção de 1 para 2). Depois de 24 horas, as células CD137+ foram depletadas por separação magnética. As células CD137 depletadas foram recolocadas em um alvéolo com IL-7 e IL-15 e cultivadas até o dia 14 (“CD137+ Anti-terceiro e CD137- Anti-hospedeiro”). Nos dias indicados, as células foram contadas por exclusão com azul de tripan.

[0110] A Figura 28 retrata a depleção dos clones específicos anti- hospedeiro por depleção de células CD137+ após ativação com PBMC de hospedeiro irradiado. No dia 10 da cultura, 9 dias após seleção positiva dos clones específicos anti-terceiro, as células foram ativadas pelo PBMC de hospedeiro irradiado (na proporção de 1:2, em favor da PBMC de hospedeiro) na presença de IL-7 e IL-15. Após 24 h, as células foram depletadas das células CD137+. A expressão de CD137 em células T CD8 foi avaliada por análise de FACS.

[0111] A Figura 29 retrata uma técnica de separação magnética de duas fases, com base em aumentar a CD137 após ativação específica do antígeno de células T CD8 depletar com sucesso os clones anti-hospedeiro e aumenta a porcentagem de células específicas para antígenos de terceiro. As células T CD8 naturais foram estimuladas com DC’s alogênicas irradiadas de terceiros a uma proporção de 4:1 na presença de IL-21 por 3 dias. As células não receberam nenhuma ativação adicional depois disso e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 14 (“Grupo de controle de referência”). Alternativamente, as células T CD8 naturais foram estimuladas com DC’s alogênicas irradiadas de terceiro na proporção de 5,7:1 na presença de IL-21. Depois de 14 horas de ativação, as células CD137+ foram positivamente selecionadas por separação magnética. As células CD137+ foram então reestimuladas com DC’s alogênicas irradiadas de terceiro em uma proporção de 4:1 na presença de IL-21 até o dia 3. Depois disso, as células foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 10. No dia 10, as células foram divididas em dois grupos de teste. No primeiro grupo as células continuaram a ser expandidas com IL-7 e IL15 até o dia 14 (“CD137+ Anti-terceiro”), enquanto as células do segundo grupo de testes foram ativadas com a PBMC de hospedeiro irradiado na presença de IL-7 e IL-15 (na proporção de 1 para 2). Após 24h, as células CD137+ foram depletadas por separação magnética. As células CD137 depletadas foram recolocadas em um alvéolo com IL-7 e IL-15 e cultivadas até o dia 14 (“CD137+ Anti-terceiro e CD137- Anti- hospedeiro”). No dia 14, a alorreatividade antiterceiro e anti-hospedeiro foi avaliada pelo ensaio CFSE face às PBMC’s de terceiro ou de hospedeiro irradiado. Para o ensaio CFSE, respondentes 1 x 106 CFSE+ foram incubados com ou sem estimuladores PBMC 2 x 106 irradiados (20 Gy) por 84h na presença de IL-7. Após 84h, as células foram recuperadas e analisadas por divisão celular, medindo-se o número de células T CD8 de baixa marcação CFSE (CD3 + CD8 + CD56-) pelo FACS. Para obter valores absolutos das células, as amostras foram suspensas em um volume constante e contagens citométricas de fluxo para cada amostra que fosse obtida durante um período de tempo pré-determinado constante. O número de células específicas em divisão = (Número de células em divisão com APC) - (Número da célula em divisão sem APC). Os valores negativos significam que o número de divisão das células em resposta à ativação com PBMC hospedeiro foi ainda menor do que o número de divisão celular sem qualquer ativação.

DESCRIÇÃO DE APLICAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0112] A presente invenção, em algumas de suas aplicações, refere-se à indução de tolerância e/ou enxerto de células anti-terceiro reativas contra leucemia, compreendendo o fenótipo do linfócito T de memória central e, mais particularmente, mas não exclusivamente, os métodos de gerar os mesmos e para a utilização dos mesmos no transplante e no tratamento de doenças.

[0113] Os princípios e o funcionamento da presente invenção podem ser mais bem compreendidos tendo como referência os desenhos e descrições que a acompanha.

[0114] Antes de explicar pelo menos uma aplicação da invenção em detalhes, deve ser entendido que a invenção não é necessariamente limitada em suas aplicações aos detalhes estabelecidos nas descrições seguintes ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticada e realizada de várias maneiras. Também, deve ser entendido que a fraseologia e a terminologia empregadas neste documento têm o propósito de descrição e não devem ser consideradas como uma limitação.

[0115] Reduzindo-se a presente invenção à prática, os inventores presentes revelaram uma população melhorada de células T de memória central (Tcm) anti-terceiro que retornam aos gânglios linfáticos após o transplante de células e induzem tolerância e atividade anti-doença (p.ex., atividade de enxerto contra leucemia (GVL) sem induzir um enxerto contra reação do hospedeiro (GVH)).

[0116] Como mostrado adiante e na seção de Exemplos que segue, os inventores presentes proporcionaram novos métodos de produção de células Tcm para aplicações alogênicas e autólogas. Conforme mostrado nas Figuras 1A e 21, as células Tcm autólogas, que são dotadas de atividade anti-doença (p.ex., atividade antitumoral), foram primeiramente geradas expondo-se as células T CD8+ a estímulos alogênicos (p.ex., células dendríticas) na presença de IL-21 por 3 dias e posteriormente adicionando IL-15 e IL-7 às células com os estímulos antigênicos por mais 1 a 2 dias. Em seguida, as células resultantes foram cultivadas em um ambiente livre de antígenos na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 por 6 a 8 dias adicionais.

[0117] Como retratado nas Figuras 1B e 22, as células Tcm alogênicas, que são células de indução de tolerância e são dotadas de atividade GVL, foram geradas primeiramente pela exposição das células T CD8+ a estímulos de terceiro (p.ex., células dendríticas) na presença de IL-21 por 3 dias. Cerca de 14 horas desde o início da cultura, as células ativadas foram selecionadas pela seleção positiva de CD137+, e essas células foram recolocadas em um alvéolo com IL-21. Posteriormente, IL-15 e IL-7 foram adicionados à cultura de IL-21 com os estímulos antigênicos por mais 1 a 2 dias. Em seguida, as células resultantes foram cultivadas em um ambiente livre de antígenos na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 por 6 a 8 dias adicionais. No final da cultura, as células Tcm foram depletadas das células alorreativas por depleção de células CD137+ após contato das células Tcm com as células apresentadoras antigênicas do tipo hospedeiras (p.ex., células dendríticas).

[0118] As células geradas pelos inventores presentes compreendem mais de 50% de células CD3+ CD8+, das quais mais de 50% são células Tcm, (i.e., compreende uma assinatura CD3+ CD8+ CD62L+, CD45RA-, CD45RO++. Consulte p.ex., o Exemplo 1 da seção dos Exemplos que segue) e compreendem atividade anti-leucêmica independente de TCR (consulte Exemplo 2).

[0119] Tomados em conjunto, estes resultados fundamentaram o uso de células Tcm antiterceiro como células que facilitam o enxerto e para uso no tratamento de doenças em situações em que o transplante alogênico é garantido (p.ex. transplante de células-tronco hematopoiéticas ou em transplante de órgãos sólidos). Além disso, estes resultados substanciam o uso das células Tcm anti-terceiro no tratamento de doenças em situações nas quais o transplante autólogo é necessário, como para malignidades hematológicas.

[0120] Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma população isolada de células compreendendo células anti- terceiro, não indutoras de GVHD, tendo um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), as células sendo células indutoras de tolerância e capazes de retornar aos gânglios linfáticos após o transplante.

[0121] A frase “população isolada de células”, conforme utilizada neste documento, refere-se às células que têm sido isoladas de seu ambiente natural (p.ex., o corpo humano).

[0122] O termo “não indutoras de GVHD”, conforme utilizado neste documento, refere-se a ter reatividade indutora de enxerto contra hospedeiro substancialmente reduzida ou nenhuma reatividade. Assim, as células da presente invenção são geradas para significativamente não causar a doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD), como evidenciado pela sobrevivência, peso e aparência geral do indivíduo transplantado, 100 dias após o transplante.

[0123] Conforme utilizado neste documento, o termo “singênico” refere- se a uma célula ou tecido que são derivados de um indivíduo essencialmente idêntico geneticamente ao indivíduo. Normalmente, mamíferos totalmente puros, clones de mamíferos ou mamíferos gêmeos homozigóticos são singênicos.

[0124] Exemplos de células ou tecidos singênicos incluem células ou tecidos derivados do indivíduo (também conhecido na técnica como “autólogas”), um clone do indivíduo ou um gêmeo homozigótico do indivíduo.

[0125] Conforme utilizado neste documento, o termo “não singênica” refere-se a uma célula ou tecido, derivados de um indivíduo que é alogênico ou xenogênico com os linfócitos do indivíduo.

[0126] Conforme utilizado neste documento, o termo “alogênico” refere- se a uma célula ou tecido, derivados de um doador que é da mesma espécie que o indivíduo, mas que é substancialmente não-clonal com o indivíduo. Normalmente, mamíferos gêmeos não consanguíneos, não zigóticos da mesma espécie são alogênicos uns com os outros.Será apreciado que um doador alogênico possa ser de HLA idêntico ou HLA não idêntico no que diz respeito ao indivíduo.

[0127] Conforme utilizado neste documento, o termo “xenogênico” refere-se a uma célula ou tecido que substancialmente expressa antígenos de uma espécie relativamente diferente da espécie de uma proporção substancial dos linfócitos do indivíduo. Normalmente, mamíferos não consanguíneos de espécies diferentes são xenogênicos uns com os outros.

[0128] A presente invenção prevê que células ou tecidos xenogênicos sejam derivados de uma variedade de espécies, tais como, mas não se limitando a, bovinos (p.ex., vaca), equídeos (p.ex., cavalo), suínos (p.ex., porco), ovídeos (p.ex., cabra, ovelha), felinos (p.ex., Felis domestica), caninos (p.ex., Canis domestica), roedores (p.ex., camundongo, rato, coelho, porco da índia, gerbilo, hamster) ou primatas (p.ex., chimpanzé, macaco Rhesus, macaco, sagui).

[0129] Células ou tecidos de origem xenogênica (p.ex., de origem suína) são preferencialmente obtidos a partir de uma fonte conhecida por ser livre de zoonoses, tais como retrovírus endógenos suínos. Da mesma forma, células ou tecidos derivados de humanos são preferencialmente obtidos de fontes substancialmente isentas de organismos patogênicos.

[0130] A frase “células anti-terceiro”, conforme utilizada neste documento, refere-se a linfócitos (p.ex., linfócitos T), que são direcionados (p.ex., por reconhecimento de célula T) contra um antígeno ou antígenos de terceiro.

[0131] Conforme utilizado neste documento, a frase “antígeno ou antígenos de terceiro” se refere a um antígeno ou antígenos solúveis ou não solúveis (como associados à membrana) que não estão presentes tanto no doador quanto no receptor, como descrito em detalhes.

[0132] Por exemplo, antígenos de terceiros podem ser células de terceiros, antígenos de vírus, como por exemplo, vírus Epstein-Barr (EBV|EpsteinBarr virus) ou citomegalovírus (CMV|cyto-megalo virus) ou antígenos de bactérias, como flagelina.Antígenos virais ou bacterianos podem ser apresentados pelas células (p.ex., linha celular) infectadas com ou, de alguma forma, feita para expressar proteínas viral/bacteriana. Células autólogas ou não-autólogas apresentadoras podem ser utilizadas para apresentar peptídeos sintéticos curtos fundidos ou carregados aos mesmos. Tais peptídeos curtos podem ser peptídeos derivados de virais ou peptídeos que representam qualquer outro antígeno.

[0133] Um software dedicado pode ser utilizado para analisar sequências virais ou outras para identificar peptídeos curtos imunogênicos, isto é, peptídeos apresentáveis no contexto da MHC classe I ou MHC classe II.

[0134] Células de terceiros podem ser alogênicas ou xenogênicas com relação ao destinatário (explicado em mais detalhes adiante).No caso de células alogênicas de terceiros, tais células têm antígenos de HLA diferentes do doador, mas que não são reativos com os antígenos de HLA destinatários, tal que células antiterceiros geradas face a tais células não apresentam reatividade face a um transplante ou antígenos destinatário.

[0135] De acordo com uma aplicação da presente invenção, as células alogênicas ou xenogênicas de terceiros são células estimuladoras selecionadas do grupo constituído por células purificadas de linfócitos do sangue periférico (PBL), baço ou gânglios linfáticos, PBLs mobilizadores de citocina, células apresentadoras de antígenos expandidas in vitro (APC’s), células dendríticas expandidas in vitro (DC) e células apresentadoras de antígenos artificiais.

[0136] A APC artificial da presente invenção pode ser projetada para exibir MHC autóloga com um peptídeo de terceiro ou uma MHC de terceiro sem ser pulsada com um peptídeo exógeno. Assim, de acordo com uma aplicação, a APC artificial compreende células tumorais K562 transferidas com uma MHC de terceiro determinante e uma molécula co-estimuladora [conforme descrito anteriormente, p.ex.: Suhoski MM et al., Mol Ther. (2007) 15(5): 981-8], ou fibroblastos transfectados com a mesma.

[0137] Antígenos de terceiros podem ser apresentados nas superfícies celulares, virais e bacterianas, ou derivados e/ou purificados decorrente das mesmas. Além disso, um antígeno viral ou bacteriano pode ser exibido em uma célula infectada e um antígeno celular pode ser exibido em um veículo artificial, como um lipossoma ou uma célula apresentadora de antígeno artificial (p.ex., linhas celulares leucêmicas ou de fibroblastos transfectadas com o antígeno ou antígenos de terceiros).

[0138] O antígeno de terceiros pode, ainda, incluir um peptídeo sintético apresentado por células apresentadoras autólogas, células apresentadoras não autólogas ou em um veículo artificial e células apresentadoras antigênicas de terceiros.

[0139] Além disso, antígenos de terceiros podem, por exemplo, ser proteínas extraídas ou purificadas de uma variedade de fontes. Um exemplo de uma proteína purificada, que pode servir como um antígeno de terceiros, de acordo com a presente invenção, é ovalbumina.Outros exemplos são previstos.

[0140] Utilizando células, vírus, bactérias, infectados por vírus, bactérias infectadas, peptídeos virais ou células apresentadoras de peptídeos de bactérias como antígenos de terceiros, é particularmente vantajoso, desde que tais antígenos de terceiros incluam umamatriz diversificada de antigênicos determinantes e, diretamente, a formação de células antiterceiro de uma população diversificada, que pode, ainda, servir na reconstituição mais rápida das células T em casos onde tal reconstituição é necessária, p.ex., após o procedimento de irradiação ou quimioterapia letal ou subletal.

[0141] Além disso, quando as células anti-terceiros são direcionadas face a antígenos de terceiros, as células são dotadas com atividade anti- doença. O termo “atividade anti-doença” refere-se à atividade (p.ex. capacidade de eliminação) das células Tcm contra uma célula doente (p.ex., células de câncer, tais como enxerto contra leucemia, atividade GVL). Esta atividade é normalmente devido à eliminação independente de TCR mediada pela ligação de LFA1-e/CAM1 [Arditti et al., Blood (2005) 105(8):3365-71. Epub 2004 Jul 6].

[0142] De acordo com uma aplicação, as células de terceiros incluem células dendríticas.

[0143] De acordo com uma aplicação, as células de terceiros incluem células dendríticas maduras.

[0144] Métodos de geração de células dendríticas de terceiros, que podem ser utilizadas como células estimuladoras para induzir as células Tcm, são bem conhecidos na técnica. Assim, como um exemplo não limitante, as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) podem ser obtidas de um doador de células não singênicas de terceiros [p.ex., no caso das células Tcm serem singênicas, p.ex., autólogas, as células dendríticas (DC) podem ser não singênicas, p.ex., alogênicas, no que diz respeito ao indivíduo; enquanto que se as células Tcm são não singênicas, p.ex., alogênicas, as DC’s são selecionadas de um doador sendo não singênico, p.ex., alogênico, e HLA incompatível, tanto com o indivíduo quanto com as células Tcm].Monócitos podem ser isolados por aderência plástica e cultivados (p.ex., em placas de cultura de células) utilizando o meio celular da DC (p.ex., meio da DC Cellgro) suplementado com soro humano (p.ex., 1% de soro humano), penicilina/estreptomicina e GM-CSF (800 IU/ml) e IL-4 (20 ng/ml) (disponível pela, p.ex., Peprotech, Hamburgo, Alemanha). Após cerca de 48h de cultura, o meio DC pode ser adicionado compreendendo GM-CSF (1600 IU/ml) e IL-4 (20 ng/ml). Cerca de 24h depois, as células não aderentes podem ser capturadas, e grandes células (principalmente DC imaturas) podem ser ressuspensas no meio fresco contendo GMCSF (800 IU/ml), IL-4 (20 ng/ml), LPS (p.ex., da E.coli O55:B5 em 10 ng/ml) e IFNY 100 lU/ml) (disponível pela, p.ex., Peprotech, Hamburgo, Alemanha), incubado durante a noite. No dia seguinte, as células não aderentes podem ser descartadas e as DC’s aderentes podem ser removidas suavemente utilizando, p.ex., PBS/1%HS frio após incubação no gelo por 20 minutos, obtendo assim grandes células consistindo de DC maduras.

[0145] De acordo com uma aplicação, as células de terceiros incluem células dendríticas irradiadas.

[0146] Assim, de acordo com uma aplicação, as DC’s são irradiadas com cerca de 5 a10 Gy, cerca de10 a 20 Gy, cerca de20 a30 Gy, cerca de20 a 40 Gy, cerca de 20 a 50 Gy, cerca de 10 a 50 Gy. De acordo com uma aplicação específica, as DC’s são irradiadas com cerca de 10 a 50 Gy (p.ex. 30 Gy).

[0147] De acordo com algumas aplicações, as células anti-terceiros da presente invenção compreendem um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm).

[0148] A frase “fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm)”, conforme utilizado neste documento refere-se a um subconjunto de células citotóxicas T que seguem para os gânglios linfáticos. As células que possuem o fenótipo Tcm, em humanos, normalmente compreendem uma assinatura CD3+/CD8+ CD62L+ CD45RO+ CD45RA-. Será apreciado que as células Tcm possam expressar todos os marcadores de assinatura em uma única célula ou possam expressar apenas parte dos marcadores de assinatura em uma única célula.

[0149] Será apreciado que, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mesmo 100% da população isolada de células sejam células CD3+ CD8+. De acordo com uma aplicação específica, a população isolada de células compõe cerca de 70 a 90% de células CD3+ CD8+.

[0150] Será apreciado que, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos, 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mesmo 100% das células CD3+ CD8+ tenham assinatura de células Tcm. De acordo com uma aplicação específica, cerca de 30 a 80% das células CD3+ CD8+ têm assinatura da célula Tcm (p.ex., 40 a 50%).

[0151] De acordo com uma aplicação, é fornecida uma população isolada de células, compreendendo células anti-terceiro com um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), caracterizado por, pelo menos 50% da população de células isoladas serem células CD3+ CD8+, das quais pelo menos 50% compreendem uma assinaturaCD3+ CD8+ CD62L+, CD45RA-, CD45RO+, e, ainda, no qual as células são células indutoras de tolerância e/ou dotadas de atividade anti-doença (p.ex., atividade de enxerto contra leucemia (GVL))e capazes de retornar aos gânglios linfáticos após o transplante.

[0152] Conforme mencionado, as células Tcm normalmente retornam aos gânglios linfáticos após o transplante. De acordo com algumas aplicações, as células Tcm anti-terceiro da presente invenção podem retornar a qualquer um dos gânglios linfáticos após o transplante, como por exemplo, os gânglios linfáticos periféricos e gânglios linfáticos mesentéricos. A localização natural dessas células lhes permite exercer seu efeito de tolerância de forma rápida e eficiente.

[0153] Assim, as células anti-terceiro da presente invenção são células indutoras de tolerância.

[0154] A frase “células indutoras de tolerância”, conforme utilizada neste documento, refere-se a células que provocam a diminuição da capacidade de resposta das células do destinatário (p.ex., células T do destinatário) quando entram em contato com as mesmas em comparação com a capacidade de resposta das células do destinatário na ausência de células indutoras de tolerância administrada. Células indutoras de tolerância incluem células de veto (i.e., células T que levam a apoptose de células T em contato com a mesma) como foi descrito anteriormente na Publicação PCT nos WO 2001/049243 e WO 2002/102971.

[0155] De acordo com algumas aplicações, as células Tcm da presente invenção podem ser células não geneticamente modificadas ou células modificadas geneticamente (p.ex., células que têm sido alteradas geneticamente para expressar ou não expressar genes específicos, marcadores ou peptídeos ou para secretar ou não secretar citocinas específicas).Qualquer método conhecido na técnica pode ser implementado na engenharia genética das células, tais como inativação do gene/s relevante ou por inserção de um RNA antisentido interferindo na expressão do polipeptídio (consulte p.ex., WO/2000/039294, que está incorporado neste documento por referência).

[0156] De acordo com algumas aplicações da invenção, é fornecido um método de gerar a população isolada de células, o método compreendendo: (a) contatar as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) com um antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21 a fim de permitir o enriquecimento das células reativas antigênicas; e (b) cultivar as células resultantes da etapa (a) na presença de IL-21, IL-15 e IL-7, em um ambiente livre de antígenos, a fim de permitir a proliferação de células que incluem o fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm).

[0157] As células Tcm anti-terceiro da presente invenção são geralmente geradas pelo contato com células mononucleares do sangue periférico (PBMC) singênicas ou não singênicas com um antígeno ou antígenos de terceiros (como descrito acima) em uma cultura suplementada com IL-21 (em outro caso, uma cultura livre de citocina, i.e., sem a adição de quaisquer citocinas). Este passo é geralmente realizado por cerca de 12 a 24 horas, cerca de 12 a 36 horas, cerca de 12 a 72 horas, cerca de 24 a 48 horas, cerca de 24 a 36 horas, 24 a 72 horas, 48 a 72 horas, 1 a 2 dias, 2 a 3 dias, 1 a 3 dias, 2 a 4 dias, 1 a 5 dias, 2 a 5 dias, 2 a 6 dias, 1 a 7 dias, 5 a 7 dias, 2 a 8 dias, 8 a 10 dias ou 1 a 10 dias e permite o enriquecimento das células reativas antigênicas. De acordo com uma aplicação específica, o contato da PBMC singênica ou não singênica com um antígeno ou antígenos de terceiros (como descrito acima) em uma cultura suplementada com IL-21 (em outro caso, uma cultura livre de citocina) é efetuada por 1 a 5 dias (p.ex. 3 dias. Esta etapa é geralmente realizada na presença de, cerca de 0,001-3000 ng/ml, 0,001-1000 ng/ml, 0,01-1000 ng/ml, 0,1-1000 ng/ml, 1-1000 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 10500 ng/ml, 10-300 ng/ml, 10-100 ng/ml, 100-1000 ng/ml, 1-100 ng/ml, 1-50 ng/ml, 1-30 ng/ml, 10-50 ng/ml, 1030 ng/ml, 10-20 ng/ml, 20-30 ng/ml, 2050 ng/ml, 30-50 ng/ml, 30-100 ng/ml, 1-10 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml-100 ng/ml IL-21. De acordo com uma aplicação específica, a concentração de IL-21 é de 10-50 ng/ml (p.ex., 30 ng/ml).

[0158] De acordo com uma aplicação específica, contatar a PBMC singênica ou não singênica com um antígeno ou antígenos de terceiros é efetuado em uma cultura livre de citocinas (p.ex., suplementada com apenas IL-21), tal condição de cultura permite a sobrevivência e enriquecimento apenas das células que se submetem a estimulação e ativação pelo antígeno ou antígenos de terceiros (i.e., de células reativas de antígenos), conforme estas células secretam citocinas (p.ex. IL-2), que permitem a sua sobrevivência (todas as células restantes morrem sob estas condições de cultura).

[0159] A relação do antígeno ou antígenos de terceiros (p.ex., células dendríticas) de PBMC é tipicamente cerca de 1:2 para cerca de 1:10 tal como cerca de 1:4, cerca de 1:6, cerca de 1:8 ou cerca de 1:10. De acordo com uma aplicação específica, a relação do antígeno ou antígenos de terceiros (p.ex., células dendríticas) de PBMC é de cerca de 1:2 para cerca de 1:8 (p.ex., 1:4).

[0160] Em seguida, as células anti-terceiros são cultivadas na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 em um ambiente livre de antígenos de modo a permitir a proliferação de células compreendendo o fenótipo Tcm. Esta etapa é geralmente conduzida por, cerca de 12 a 24 horas, cerca de 12 a 36 horas, cerca de 12 a 72 horas, 24 a 48 horas, 24 a 36 horas, cerca de 24 a 72 horas, cerca de 48 a 72 horas, 1 a 20 dias, 1 a 15 dias, 1 a 10 dias, 1 a 5 dias, 5 a 20 dias, 5 a 15 dias, 5 a 10 dias, 1 a 2 dias, 2 a 3 dias, 1 a 3 dias, 2 a 4 dias, 2 a 5 dias, 2 a 8 dias, 2 a 10 dias, 4 a 10 dias, 4 a 8 dias, 6 a 8 dias, 8 a 10 dias, 7 a 9 dias, 7 a 11 dias, 7 a 13 dias, 7 a 15 dias, 10 a 12 dias, 10 a 14 dias, 12 a 14 dias, 14 a 16 dias, 14 a 18 dias, 16 a 18 dias ou 18 a 20 dias. De acordo com uma aplicação específica, as células anti-terceiro são cultivadas na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 em um ambiente livre de antígenos por cerca de 7 a 11 dias (p.ex., 8 dias).

[0161] Esta etapa é geralmente conduzida na presença de IL-21 em uma concentração de cerca de 0,001-3000 ng/ml, 0,001-1000 ng/ml, 0,01-1000 ng/ml, 0,11000 ng/ml, 1-1000 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 10-500 ng/ml, 10300 ng/ml, 10-100 ng/ml, 100-1000 ng/ml, 1-100 ng/ml, 1-50 ng/ml, 1-30 ng/ml, 10-50 ng/ml, 10-30 ng/ml, 10-20 ng/ml, 20-30 ng/ml, 20-50 ng/ml, 30-50 ng/ml, 30-100 ng/ml, 1-10 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 1 ng/ml-100 ng/mlIL21.De acordo com uma aplicação específica, a concentração de IL-21 é 10 a 50 ng/ml (p.ex., 30 ng/ml).

[0162] Esta etapa é, ainda, conduzida na presença de IL-15 em uma concentração de cerca de 0,001-3000 ng/ml, 0,001-1000 ng/ml, 0,01-1000 ng/ml, 0,05-1000 ng/ml, 0,1-1000 ng/ml, 0,5-1000 ng/ml, 0,05-500 ng/ml, 0,5-500 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 0,5-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 5100 ng/ml, 1-50 ng/ml, 5-50 ng/ml, 110 ng/ml, 5-10 ng/ml, 1-5 ng/ml, 2-3 ng/ml, 2-5 ng/ml, 2-7 ng/ml, 3-5 ng/ml, 3-7 ng/ml, 4-5 ng/ml, 5-6 ng/ml, 5-7 ng/ml, 1-8 ng/ml, 10-100 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 100-1000 ng/ml.De acordo com uma aplicação específica, a concentração de IL-15 é 1-10 ng/ml (p.ex. 5 ng/ml).

[0163] Esta etapa é, ainda, conduzida na presença de IL-7 em uma concentração de, cerca de 0,001-3000 ng/ml, 0,001-1000 ng/ml, 0,01-1000 ng/ml, 0,05-1000 ng/ml, 0,1-1000 ng/ml, 0,5-1000 ng/ml, 0,05-500 ng/ml, 0,5-500 ng/ml, 0,1-100 ng/ml, 0,1-10 ng/ml, 0,5-100 ng/ml, 1-100 ng/ml, 5100 ng/ml, 1-50 ng/ml, 5-50 ng/ml, 110 ng/ml, 5-10 ng/ml, 1-5 ng/ml, 2-3 ng/ml, 2-5 ng/ml, 2-7 ng/ml, 3-5 ng/ml, 3-7 ng/ml, 4-5 ng/ml, 5-6 ng/ml, 5-7 ng/ml, 1-8 ng/ml, 10-100 ng/ml, 10-1000 ng/ml, 100-1000 ng/ml.De acordo com uma aplicação específica, a concentração de IL-7 é 1-10 ng/ml (5 ng/ml).

[0164] Os presentes inventores têm recolhido através da experimentação laboriosa e rastreio de uma série de critérios que pode ser aproveitado no sentido de melhorar a proliferação de células anti-terceiro compreendendo um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm) desprovido de células reativas de enxerto contra hospedeiro (GVH) e/ou sendo aprimorada para células reativas anti-doença (p.ex., GVL).

[0165] De acordo com uma aplicação, as PBMC’s são depletadas das células não aderentes antes de contatar um antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21.

[0166] De acordo com uma aplicação, as PBMC’s são depletadas das células CD4+ e/ou CD56+ antes de contatar um antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21.

[0167] De acordo com uma aplicação, as PBMC’s são selecionadas para as células CD45RA+ antes de contatar um antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21.

[0168] A depleção de células CD4+ e/ou CD56+ pode ser conduzida utilizando qualquer método conhecido da técnica, tais como pela purificação com base em afinidade (p.ex., como pelo uso de esferas MACS, classificador de FACS e/ou rotulagem ELISA de captura). Tal etapa pode ser benéfica para aumentar a pureza das células CD8+ dentro da cultura (i.e., eliminar outros linfócitos dentro da cultura da célula, p.ex., células T CD4+ ou células NK) ou para aumentar o número de células T CD8+.

[0169] De acordo com uma aplicação, as PBMC’s compreendem as células não aderentes.

[0170] De acordo com uma aplicação, as PBMC’s compreendem as células T CD8+.

[0171] De acordo com uma aplicação, as PBMC’s compreendem as células T CD8+ naturais.

[0172] A seleção de células T CD8+ naturais pode efetuar-se pela seleção de células expressando CD45RA+ e/ou células expressando CD45RO- e pode ser conduzida utilizando qualquer método conhecido da técnica, tal como pela purificação com base em afinidade (p.ex., pelo uso de esferas MACS, classificador de FACS e/ou rotulagem ELISA de captura).

[0173] De acordo com uma aplicação, as PBMC’s compreendem células CD45RA+.

[0174] Uma etapa adicional que pode ser conduzida em conformidade com os ensinamentos presentes inclui o cultivo das células PBMC’s com um antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21, IL15 e IL-7 antes de remover o antígeno ou antígenos de terceiros da cultura celular (i.e., antes de gerar um ambiente livre de antígeno). Esta etapa é geralmente conduzida por cerca de 12 a 24 horas, cerca de 12 a 36 horas, cerca de 12 a 72 horas, 24 a 48 horas, 24 a 36 horas, cerca de 24 a 72 horas, cerca de 48 a 72 horas, 1 a 2 dias, 2 a 3 dias, 1 a 3 dias, 2 a 4, 1 a 5 dias ou 2 a 5 dias e é efetuado nas mesmas doses de IL-21, IL-15 e IL-7 indicadas acima. De acordo com uma aplicação específica, o cultivo das células PBMC’s com um antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 é realizado de 12 horas a 4 dias (p.ex., 1 a 2 dias).

[0175] Além disso, ou alternativamente, um processo adicional de duas etapas que permite a seleção e isolamento de células ativadas pode ser conduzido. Esta etapa de seleção auxilia na remoção das células T reativas de um hospedeiro potencial em situações onde as PBMC’s são não singênicas no que diz respeito ao indivíduo (conforme descrito em mais detalhes abaixo).

[0176] Assim, isolar células ativadas pode ser conduzido em uma abordagem com duas etapas. Na primeira etapa as células ativadas são selecionadas antes do cultivo das células na presença de IL15 e IL-7. Esta primeira fase é geralmente conduzida após o contato inicial da PBMC com um antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21. Este processo de seleção escolhe somente as células que foram ativadas pelo antígeno de terceiro (p.ex., marcadores de ativação expressos conforme descrito abaixo) e geralmente é afetado por cerca de 12 a 24 horas, cerca de 24 a 36 horas, cerca de 12 a 36 horas, cerca de 36 a 48 horas, cerca de 12 a 48 horas, cerca de 48 a 60 horas, cerca de 12 a 60 horas, cerca de 60 a 72 horas, cerca de 12 a 72 horas, cerca de 72 a 84 horas, cerca de 12 a 84 horas, cerca de 84 a 96 horas, cerca de 12 a 96 horas, após o contato inicial da PBMC com um antígeno ou antígenos de terceiros. De acordo com uma aplicação específica, o processo de seleção é efetuado a cerca de 12 a 24 horas (p.ex., 14 horas) após o contato inicial do PBMC com um antígeno ou antígenos de terceiros.

[0177] Isolar células ativadas pode ser efetuado pela purificação com base em afinidade (p.ex., como pelo uso de esferas MACS, classificador de FACS e/ou rotulagem ELISA de captura) e pode ser efetuada para qualquer marcador de ativação, incluindo marcadores de superfície celular, tais como, mas não limitado a, CD69, CD44, CD25, CFSE, CD137 ou marcadores de superfície nãocelulares, tais como, mas não limitado a, IFN-y e IL2.Isolar células ativadas também pode ser efetuado pela purificação com base em morfologia (p.ex., células grandes isolantes) utilizando qualquer método conhecido na técnica (p.ex., FACS). Normalmente, as células ativadas também são selecionadas para expressão de células CD8+.Além disso, qualquer combinação dos métodos acima pode ser utilizada para isolar eficientemente as células ativadas.

[0178] De acordo com uma aplicação da presente invenção, a seleção de células ativadas é efetuada pela seleção de células CD137+ e/ou CD25+.

[0179] A segunda etapa do isolamento de células ativadas é geralmente conduzida no final do cultivo (i.e., após o cultivo em um ambiente livre de antígenos com IL-21, IL-15 e IL-7). Esta etapa depleta as células alorreativas por depleção das células que foram ativadas após contato do fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm) com células apresentadoras de antígenos de hospedeiros irradiados (p.ex., as células dendríticas das APC’s). Como mencionado acima, isolar as células ativadas pode ser efetuado pela purificação com base em afinidade (p.ex., como pelo uso de esferas MACS, classificador de FACS e/ou rotulagem ELISA de captura) e pode ser efetuada para qualquer marcador de ativação, incluindo marcadores de superfície celular, tais como, mas não limitado a, CD69, CD44, CD25, CFSE, CD137 ou marcadores de superfície não celulares, tais como, mas não limitado a, IFN-y e IL-2.

[0180] De acordo com uma aplicação da presente invenção, depletar a camada de células alorreativas é efetuado através da depleção das células CD137+ e/ou células CD25+.

[0181] Seguem-se um número de exemplos não limitantes de protocolos que podem ser utilizados de acordo com algumas aplicações da invenção.

[0182] De acordo com uma aplicação da invenção, é fornecido um método de se gerar uma população isolada de células, compreendendo células antiterceiro tendo um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), as células sendo células indutoras de tolerância e/ou dotadas de atividade anti- doença (p.ex., atividade de enxerto contra leucemia (GVL)) e capaz de retornar aos gânglios linfáticos após o transplante, o método compreendendo: (a) tratar de células mononucleares do sangue periférico não aderente (PBMC) com um agente capaz de depletar células CD4+ e/ou CD56+, assim como obter células T CD8+; (b) contatar as células T CD8+ com as células dendríticas de terceiros na presença de IL-21 por 12 horas a 5 dias de modo a permitir o enriquecimento de células reativas antigênicas; (c) cultivar as células resultantes da etapa (b) com as células dendríticas de terceiros na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 por 12 horas a 3 dias; e (d) cultivar as células resultantes da etapa (c) na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 em um ambiente livre de antígenos por 5 a 20 dias, a fim de permitir a proliferação de células compreendendo o fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm).

[0183] O protocolo descrito acima é normalmente utilizado para transplante não singênico e, portanto, as PBMC utilizadas são tipicamente alogênicas em relação a um indivíduo (p.ex., de um doador alogênico).

[0184] De acordo com uma aplicação da invenção, é fornecido um método de gerar uma população isolada das células, composto por células antiterceiro tendo um fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm), as células sendo dotadas de atividade anti-doença (p.ex., atividade celular antitumoral) e capazes de retornar aos gânglios linfáticos após o transplante, o método compreendendo: (a) tratar células mononucleares do sangue periférico não aderente (PBMC) com um agente capaz de depletar as células CD4+ e/ou CD56+ de modo a obter as células T CD8+; (b) contatar as células T CD8+ com as células dendríticas não singênicas na presença de IL-21 por 12 horas a 5 dias de modo a permitir o enriquecimento de células reativas do antígeno; (c) cultivar as células resultantes da etapa (b) com as células dendríticas não singênicas na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 por 12 horas a 3 dias; e (d) cultivar as células resultantes da etapa (c) na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 em um ambiente livre de antígenos por 5 a 20 dias, de modo a permitir a proliferação de células compreendendo o fenótipo do linfócito T de memória central (Tcm).

[0185] O protocolo descrito acima é normalmente utilizado para transplante singênico e, portanto, as PBMC utilizadas são tipicamente autólogas no que diz respeito a um assunto (p.ex., do sujeito).

[0186] Assim, como mencionado, a PBMC pode ser singênica ou não singênica no que diz respeito um indivíduo.

[0187] De acordo com algumas aplicações da invenção, a PBMC não singênica da presente invenção pode ser alogênica ou xenogênica com relação ao indivíduo (explicado em mais detalhes, adiante).

[0188] A fonte das PBMC’s será determinada em relação à utilização das células (veja mais detalhes adiante) e está bem dentro da capacidade de um especialista na técnica, especialmente à luz da divulgação detalhada, fornecida neste documento.

[0189] O uso de células indutoras de tolerância é especialmente benéfico em situações em que há uma necessidade de se eliminar a rejeição do enxerto e superar a doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD), tais como em transplantes de células ou tecidos alogênicos ou xenogênicos.

[0190] Assim, de acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de tratamento de um indivíduo em necessidade de um transplante de célula ou tecido, o método compreendendo transplantar um transplante de célula ou órgão ao indivíduo e administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da população isolada de células.

[0191] Conforme utilizado neste documento, o termo “tratamento” inclui revogar, inibir substancialmente, retardar ou reverter a progressão de uma condição, melhorar substancialmente sintomas clínicos ou estéticos de uma doença ou prevenir substancialmente o aparecimento de sintomas clínicos ou estéticos de uma doença.

[0192] Conforme utilizado neste documento, o termo “indivíduo” ou “indivíduo em necessidade respectiva” refere-se a um mamífero, de preferência um ser humano, homem ou mulher em qualquer idade que precise de um transplante de células ou tecidos ou sofra de uma doença que possa ser tratada com as células Tcm. Geralmente o indivíduo está em necessidade de um transplante de células ou tecidos (também referido neste documento como destinatário) devido a uma doença ou uma condição patológica ou indesejada, estado, síndrome ou uma anomalia física, morfológica ou fisiológica, que seja passível de tratamento através do transplante de células ou tecidos. Exemplos de tais transtornos são fornecidos mais abaixo.

[0193] Conforme utilizado neste documento, a frase “transplante de células ou tecido” refere-se a uma célula corporal (p.ex., uma única célula ou um grupo de células) ou tecido (p.ex., tecidos/órgãos sólidos ou tecidos moles, que possam ser transplantados no todo ou em parte). Tecidos ou órgãos exemplares que podem ser transplantados, de acordo com os ensinamentos presentes, incluem, mas não estão limitados a, fígado, pâncreas, baço, rins, coração, pulmão, pele, intestino e tecidos linfoides/hematopoiéticos (p.ex., gânglios linfáticos, timo da placa de Peyer ou medula óssea). Células exemplares que podem ser transplantadas, de acordo com os ensinamentos presentes, incluem, mas não estão limitadas a, células hematopoiéticas imaturas, incluindo células-tronco. Além disso, a presente invenção também contempla o transplante de órgãos inteiros, como por exemplo, rim, coração, fígado e pele.

[0194] Dependendo da aplicação, o método pode ser efetuado utilizando uma célula ou um tecido que é singênico ou não singênico com o indivíduo.

[0195] De acordo com uma aplicação da presente invenção, tanto o indivíduo quanto o doador são seres humanos.

[0196] Dependendo das aplicações e das fontes disponíveis, as células ou os tecidos da presente invenção podem ser obtidos de um organismo pré- natal, organismo pós-natal, um adulto ou um doador cadáver. Além disso, dependendo da aplicação necessária as células ou tecidos podem ser naturais ou geneticamente modificados. Tais determinações estão bem dentro da capacidade de alguém de habilidade comum na técnica

[0197] Qualquer método conhecido da técnica pode ser empregado para se obter uma célula ou tecido (p.ex., para transplante).

[0198] Transplantar a célula ou tecido no indivíduo pode ser feito de várias maneiras, dependendo de vários parâmetros, tais como, por exemplo, o tipo de célula ou tecido; o tipo, fase ou gravidade da doença do destinatário (p.ex., falência de órgãos); os parâmetros fisiológicos ou físicos específicos do indivíduo; e/ou o resultado terapêutico desejado.

[0199] Transplantar um transplante de células ou tecido da presente invenção pode ser efetuado transplantando-se o transplante de células ou tecidos em qualquer um dos vários locais anatômicos, dependendo da aplicação. O transplante de células ou tecidos pode ser transplantado em uma local anatômico homotópico (um local anatômico normal para o transplante), ou em um local anatômico ectópico (um local anatômico anormal para o transplante). Dependendo da aplicação, o transplante de células ou tecidos pode ser vantajosamente implantado sob a cápsula renal, ou no rim, a gordura testicular, a subcútis, o omento, a veia porta, o fígado, o baço, a cavidade do coração, o coração, a cavidade torácica, o pulmão, pele, pâncreas ou espaço intra-abdominal.

[0200] Por exemplo, um tecido do fígado, de acordo com os ensinamentos presentes, pode ser transplantado no fígado, na veia porta, na cápsula renal, na subcutânea, no omento, no baço e no espaço abdominal. O transplante de um fígado em várias localizações anatômicas, tais como estas, é comumente praticado na técnica de tratar doenças passíveis de tratamento através de transplante hepático (p.ex., insuficiência hepática). Da mesma forma, o transplante de um tecido pancreático, de acordo com a presente invenção, pode ser vantajosamente efetuado transplantando-se o tecido na veia porta, no fígado, no pâncreas, na gordura testicular, na subcútis, no omento, em uma alça intestinal (a subserosa de uma alça em U do intestino delgado) e/ou a cavidade intra-abdominal. O transplante de tecido pancreático pode ser utilizado para tratar doenças passíveis de tratamento através do transplante de pâncreas (p.ex., diabetes). Da mesma forma, o transplante de tecidos como um rim, um coração, um tecido de pulmão ou a pele pode ser efetuado em qualquer localização anatômica descrita acima para fins de tratamento de destinatários que sofrem de, por exemplo, insuficiência renal, insuficiência cardíaca, insuficiência respiratória ou danos a pele (p.ex., queimaduras).

[0201] O método da presente invenção também pode ser utilizado, por exemplo, para o tratamento de um destinatário que sofre de uma doença que requer transplante de células hematopoiéticas imaturas.

[0202] Neste último caso, células hematopoiéticas imaturas autólogas, alogênicas ou xenogênicas (incluindo as células-tronco) que podem ser derivadas, por exemplo, da medula óssea, sangue periférico mobilizado (por leucaférese, por exemplo), fígado fetal, saco vitelino e/ou sangue do cordão umbilical do doador em que preferencialmente são células hematopoiéticas imaturas CD34+ depletadas de células T, podem ser transplantadas para um destinatário que sofre de uma doença. Tal doença inclui, mas não está limitada a, leucemia, tais como a leucemia linfoblástica aguda (ALL | acute lymphoblastic leukemia), leucemia não linfoblástica aguda (ANLL | acute nonlymphoblastic leukemia), leucemia mielóide aguda (AML | acute myelocytic leukemia) ou leucemia mielóide crônica (LMC | chronic myelocytic leukemia), síndromes de imunodeficiência combinada severa (SCID | severe combined immunodeficiency syndromes), incluindo deaminase da adenosina (ADA | adenosine deaminase), osteopetrose, anemia aplástica, doença de Gaucher, talassemia e outras anormalidades hematopoiéticas congênitas ou geneticamente determinadas.

[0203] Será apreciado que as células hematopoiéticas imaturas autólogas, alogênicas ou xenogênicas da presente invenção possam ser transplantadas para um destinatário utilizando qualquer método conhecido da técnica para o transplante de células, tais como, mas não limitado a, infusão de células (p.ex., I.V.) ou através de uma via intraperitoneal.

[0204] Opcionalmente, ao transplantar um transplante de células ou tecido da presente invenção em um indivíduo tendo um órgão defeituoso, pode ser vantajoso, primeiramente, pelo menos remover parcialmente o órgão falhado do indivíduo de forma a permitir o desenvolvimento ideal do transplante e integração estrutural/funcional respectiva com a anatomia/fisiologia do indivíduo.

[0205] De acordo com uma aplicação, as células hematopoiéticas imaturas e a população isolada de células são derivadas do mesmo doador.

[0206] De acordo com uma aplicação, as células hematopoiéticas imaturas e a população isolada de células são derivadas do mesmo indivíduo.

[0207] O método da presente invenção também prevê co-transplante de vários órgãos (p.ex., tecidos de coração e pulmão), no caso do indivíduo efetivamente poder ser beneficiado por tal procedimento.

[0208] De acordo com uma aplicação, o co-transplante compreende o transplante de células hematopoiéticas imaturas e um tecido/órgão sólido ou um número de tecidos/órgãos sólidos.

[0209] De acordo com uma aplicação, as células hematopoiéticas imaturas e o órgão sólido são obtidos do mesmo doador.

[0210] De acordo com outra aplicação, as células hematopoiéticas imaturas e o órgão/tecido sólido ou órgãos/tecidos são obtidos de doadores diferentes (não singênicos).

[0211] De acordo com uma aplicação, as células hematopoiéticas imaturas são transplantadas antes, concomitantemente ou após o transplante de órgão sólido.

[0212] De acordo com uma aplicação, quimerismo hematopoiético é induzido primeiramente no indivíduo por transplante de células hematopoiéticas imaturas, em conjunto com as células Tcm da presente invenção, levando à tolerância de outros tecidos/órgãos transplantados do mesmo doador.

[0213] De acordo com uma aplicação, as células Tcm da presente invenção são utilizadas per se para redução de rejeição de tecidos/órgãos transplantados do mesmo doador.

[0214] Em outra aplicação, o transplante de células ou tecidos e a população isolada de células são derivados do mesmo doador.

[0215] Em outra aplicação, o transplante de célula ou tecido é singênico com o indivíduo e a população isolada de células é não singênica com o indivíduo.

[0216] Em outra aplicação, o transplante de célula ou tecido é singênico com o indivíduo e a população isolada de células é singênica com o indivíduo.

[0217] Após a transplantação do transplante de células ou tecidos no indivíduo, de acordo com os ensinamentos presentes, é aconselhável, de acordo com a prática médica padrão, monitorar a funcionalidade de crescimento e imunocompatibilidade do órgão, de acordo com qualquer uma das várias técnicas padrão. Por exemplo, a funcionalidade de um transplante de tecido pancreático pode ser monitorada após o transplante por testes de função do pâncreas padrão (p.ex., a análise dos níveis séricos de insulina).Da mesma forma, um transplante de tecido do fígado pode ser monitorado após o transplante por testes de função hepática padrão (p.ex., análise dos níveis séricos de albumina, proteínas totais, ALT, AST e bilirrubina e análise do tempo de coagulação do sangue). O desenvolvimento estrutural das células ou tecido pode ser monitorado através de tomografia computadorizada ou ultrassonografia.

[0218] Dependendo do contexto do transplante, a fim de facilitar o enxerto do transplante de células ou tecidos, o método pode compreender, de maneira mais vantajosa, condicionar o indivíduo sob condições subletais, letais ou supra-letais antes do transplante.

[0219] Conforme utilizado neste documento, os termos “sub-letais”, “letais” e “supraletais”, quando relacionados ao condicionamento dos indivíduos da presente invenção, referem-se aos tratamentos mielotóxicos e/ou linfocitotóxicos que, quando aplicados a uma população representativa de indivíduos, respectivamente, são tipicamente: não letal para essencialmente todos os membros da população; letal para alguns, mas nem todos os membros da população; ou letal para essencialmente todos os membros da população em condições normais de esterilidade.

[0220] De acordo com uma aplicação, a etapa de condicionamento é efetuada por condicionamento do indivíduo sob condições supra-letais, tais como condições mieloablativas.

[0221] De modo alternativo, a etapa de condicionamento pode ser efetuada condicionando-se o indivíduo sob condições letais ou sub-letais, tais como condicionar o indivíduo sob condições mielorredutivas.

[0222] Exemplos de agentes de condicionamento que podem ser utilizados para condicionar o indivíduo incluem, sem limitação, irradiação, agentes farmacológicos e células indutoras de tolerância (conforme descrito neste documento).

[0223] Exemplos de agentes farmacológicos incluem drogas mielotóxicas, drogas linfocitotóxicas e medicamentos imunossupressores.

[0224] Exemplos de drogas mielotóxicas incluem, sem limitação, busulfan, dimetil mileran, melfalano e tiotepa.

[0225] O método pode, de forma mais vantajosa, compreender condicionar o indivíduo com um regime imunossupressor antes, concomitantemente ou após a transplantação do transplante de células ou tecidos.

[0226] Exemplos de tipos adequados de regimes imunossupressores incluem a administração de drogas imunossupressoras, populações de células indutoras de tolerância (como descrito em detalhes adiante), e/ou irradiação imunossupressora.

[0227] Ampla orientação para seleção e administração de regimes imunossupressores adequados para transplante é fornecido na literatura da técnica (por exemplo, referente a: Kirkpatrick CH. e Rowlands DT Jr., 1992. JAMA. 268, 2952; Higgins RM. et al., 1996. Lancet 348, 1208; Suthanthiran M. e Strom TB., 1996. New Engl. J. Med. 331, 365; Midthun DE. et al., 1997. Mayo Clin Proc. 72, 175; Morrison VA. et al., 1994. Am J Med. 97, 14; Hanto DW., 1995. Annu Rev Med. 46, 381; Senderowicz AM. et al., 1997. Ann Intern Med. 126, 882; Vincenti F. et al., 1998. New Engl. J. Med. 338, 161; Dantal J. et al. 1998. Lancet 351, 623).

[0228] Preferencialmente, o regime imunossupressor consiste em administrar pelo menos um agente imunossupressor ao indivíduo.

[0229] Exemplos de agentes imunossupressores incluem, mas não estão limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sais de ouro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximabe (REMICADE), etanercepte, bloqueadores do TNF alfa, um agente biológico que tem como alvo uma citocina inflamatória e drogas antiinflamatórias não esteroides (NSAIDs | Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug).Exemplos de NSAIDs incluem, mas não estão limitados a ácido acetil salicílico, salicilato de magnésio de colina, diflunisal, salicilato de magnésio, salsalato, salicilato de sódio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, paracetamol, ibuprofeno, inibidores Cox-2, tramadol, rapamicina (sirolimus) e análogos de rapamicina(por exemplo, CCI-779, RAD001, AP23573).Esses agentes podem ser administrados individualmente ou em combinação.

[0230] Independentemente do tipo de transplante, para evitar a rejeição do enxerto e a doença do enxerto contra hospedeiro, o método da presente invenção utiliza as novas células Tcm anti-terceiro (como descrito em detalhes neste documento).

[0231] De acordo com o método da presente invenção, estas células Tcm anti-terceiro são administradas tanto concomitantemente, quanto antes ou após a transplantação do transplante de células ou tecidos.

[0232] As células Tcm anti-terceiro podem ser administradas através de um método conhecido na técnica para transplante de células, tal como, mas não limitado a, infusão de células (p.ex., I.V.) ou através de uma via intraperitoneal.

[0233] Sem ser vinculada à teoria, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade de células Tcm anti-terceiro eficientes para tolerância, efeito antitumoral e/ou reconstituição imune sem induzir GVHD. Desde que as células Tcm da presente invenção retornam aos gânglios linfáticos após o transplante, diminuem a quantidade de células (em comparação com a dose de células previamente utilizadas, ver por exemplo WO 2001/049243) pode ser necessária para alcançar o efeito/s benéfico/s das células (p.ex., tolerância, efeito antitumoral e/ou reconstituição imunológica). Será apreciado que níveis mais baixos de drogas imunossupressoras possam ser necessários em conjunto com as células Tcm da presente invenção (tais como a exclusão de rapamicina de protocolo terapêutico).

[0234] A determinação da quantidade terapeuticamente eficaz está dentro da capacidade daqueles especialistas na técnica, especialmente à luz da divulgação detalhada neste documento divulgado.

[0235] Para qualquer preparação utilizada nos métodos da invenção, a quantidade ou a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente de ensaios in vitro e de análise de culturas de células. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma concentração ou titulação desejadas. Tais informações podem ser utilizadas para determinar com mais precisão as doses úteis em humanos.

[0236] Por exemplo, no caso de transplante de tecido, o número de células Tcm anti-terceiro infundido a um destinatário deve ser maior que 1 x 104 /Kg do peso corporal.O número de células Tcmanti-terceiro infundido a um destinatário deve estar tipicamente na faixa de 1 x 103 /Kg do peso corporal a 1 x 104 /Kg do peso corporal, na faixa de 1 x 104 /Kg do peso corporal, na faixa de 1 x 105 /Kg do peso corporal, na faixa de 1 x 104 /Kg do peso corporal a 1 x 106 /Kg do peso corporal, na faixa de 1 x 104 /Kg do peso corporal corporal corporal corporal corporal corporal corporal específica, o número de células Tcm anti-terceiro infundidas a um destinatário deve estar na faixa de 1 x 105 /Kg do peso corporal a 1 x 107 /Kg do peso corporal.

[0237] Assim, as células Tcm anti-terceiros novas da presente invenção podem ser utilizadas como terapia adjuvante para um transplante de célula ou tecido (como descrito acima).Além disso, as células Tcm novas da presente invenção também são dotadas de atividade anti-doença (p.ex., atividade celular antitumoral, conforme descrito em mais detalhes neste documento) e, portanto, podem ser utilizadas per se para tratamento da doença.

[0238] De acordo com uma aplicação específica, a fim de obter uma atividade de enxerto versus células doentes (p.ex., efeito antitumoral como tratamento contra leucemia), células singênicas, bem como as células não singênicas, podem ser utilizadas.

[0239] Assim, o método da presente invenção pode ser aplicado para tratar qualquer doença, tais como, mas não limitado a, uma doença maligna, uma doença associada com o transplante de um enxerto, uma doença infecciosa como uma doença viral ou uma doença bacteriana, doença inflamatória ou doença autoimune.

[0240] Doenças que podem ser tratadas utilizando os métodos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, doenças malignas como a leucemia [p.ex., linfática aguda, linfoblástica aguda, célula pré-B linfoblástica aguda, leucemia de célula T linfoblástica aguda, megacarioblástica aguda, monocítica, mielógena aguda, mielóide aguda, mielóide aguda com eosinofilia, células B, basofílica, mielóide crônica, células B crônicas, eosinofílica, Friend, granulocítica ou mielocítica, células pilosas, linfocítica, megacarioblástica, monocítica, monocítica-macrófago, mieloblástica, mielóide, mielomonocítica, células plasmáticas, célula pré-B, promielocítica, subaguda, células T, neoplasia linfóide, predisposição para malignidade mielóide, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica aguda de células T (T-ALL | acute lymphocytic leukemia) e leucemia linfocítica crônica de células B (B-CLL|B-cell chronic lymphocytic leukemia)], linfoma (p.ex., doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, células B, de Burkitt, célula T cutânea, histiocítica, linfoblástica, célula T, tímico), carcinoma, blastoma e sarcoma; doenças associadas com o transplante de um enxerto (p.ex., rejeição de enxerto, rejeição crônica do enxerto, rejeição de enxerto subaguda, rejeição de enxerto hiperaguda, rejeição aguda do enxerto e doença do enxerto contra hospedeiro); doenças infecciosas, incluindo, mas não limitados a, doenças infecciosas crônicas, doenças infecciosas subagudas, doenças infecciosas agudas, doenças virais (p.ex., EBV, CMV, HIV), doenças bacterianas, doenças por protozoários, doenças parasitárias, doenças fúngicas, doenças do micoplasma e doenças de príon; doenças inflamatórias (p.ex., doenças inflamatórias crônicas e doenças inflamatórias agudas); e doenças autoimunes (p.ex. doenças cardiovasculares, doenças reumatoides, doenças glandulares, doenças gastrointestinais, doenças cutâneas, doenças hepáticas, doenças neurológicas, doenças musculares, doenças nefríticas, doenças relacionadas com a reprodução, doenças do tecido conjuntivo e doenças sistêmicas).

[0241] Assim, o método da presente invenção pode, além disso, ser vantajosamente aplicado ao tratamento de uma doença em um indivíduo enquanto facilitando concomitantemente o enxerto de um transplante de células ou tecidos singênicos com as células Tcm anti-terceiro (p.ex., em situações onde o transplante de células ou tecidos e as células anti-terceiros são derivados do mesmo doador).

[0242] Conforme utilizado neste documento, o termo “cerca de” refere- se a ± 10%.

[0243] Os termos “compreendem”, “composto por”, “inclui”, “incluindo”, “tendo” e seus conjugados significa “incluindo, mas não limitado a”.

[0244] O termo “consistindo de meios”, “incluindo” e “limitado a”.

[0245] O termo “consistindo essencialmente de” significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou partes, mas somente se os ingredientes adicionais, etapas e/ou partes não alteram materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicada.

[0246] Conforme utilizado neste documento, a forma singular “um”, “uma” e “a/o” inclui referências plurais a menos que o contexto claramente dite de outra forma. Por exemplo, o termo “um composto” ou “pelo menos um composto” pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas respectivas.

[0247] Em toda esta aplicação, várias aplicações da presente invenção podem ser apresentadas em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição em formato de intervalo é apenas para conveniência e concisão e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível sobre o escopo da invenção. Nesse sentido, a descrição de um intervalo deve ser considerada para ter divulgado especificamente todos os subintervalos possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro do intervalo. Por exemplo, a descrição de um intervalo como, de 1 a 6 deve ser considerado ter divulgado subintervalos especificamente divulgados como a partir de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro do intervalo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isto se aplica independentemente da amplitude do intervalo.

[0248] Sempre que um intervalo numérico é indicado neste documento, pretende incluir qualquer numeral citado (fracionário ou integral) dentro do intervalo indicado. As frases “variando/variam entre” a primeira indicando número e a segunda indicando o número e “variando/variam de” a primeira indicando o número “para” e a segunda indicando o número, são utilizados neste documento alternadamente e destinam-se a incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os numerais fracionários e integrais intermediários.

[0249] Conforme utilizado neste documento, o termo “método” refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa, incluindo, mas não limitado a, modos, meios, técnicas e procedimentos tanto conhecidos quanto desenvolvidos de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos pelos praticantes de técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[0250] Aprecia-se que certas características da invenção que, para maior clareza, são descritas separadas no contexto das aplicações, também podem ser fornecidas em combinação em uma única aplicação. Por outro lado, várias características da invenção que, por questões de brevidade, são descritas no contexto de uma única aplicação, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou como adequado em qualquer outra aplicação descrita da invenção. Certas características descritas no contexto de várias aplicações não são consideradas características essenciais dessas aplicações, a menos que a aplicação seja inoperante sem esses elementos.

[0251] Várias aplicações e aspectos da presente invenção, como delineadas acima e, como reivindicado na seção de reivindicações abaixo, encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[0252] Agora, é feita referência aos exemplos a seguir, que, juntamente com as descrições acima, ilustram a invenção de uma forma não limitante.

[0253] Geralmente, a nomenclatura utilizada neste documento e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante.Tais técnicas são exaustivamente explicadas na literatura.Consulte, por exemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias, conforme definido nas Patentes Norte-Americanasnos 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são amplamente descritos na literatura científica e de patentes, veja, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas nos 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 879.219; 5.011.771 e 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., e Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) e “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todos os quais são incorporados por referência, como se plenamente estabelecidos neste documento. Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento.Os procedimentos aqui contidos são acreditados de serem bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações contidas neste documento são incorporadas aqui por referência. MATERIAIS GERAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS Células mononucleares de sangue periférico (PBMC)

[0254] As PBMC foram isoladas do sangue inteiro de pacientes e de voluntários saudáveis por centrifugação gradiente de densidade Ficoll. Quando indicado, as células foram divididas por HLA Classe I por métodos serológicos como descrito anteriormente [Manual of Tissue Typing Techniques. Washington DC, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Publicação NIH DHEW 76545, 1976, p 22]. Linhas celulares de tumores

[0255] Foram utilizadas linhas de células transfectantes H.My2 C1R HLA A2 K66A e células transfectantes B H.My2 C1R HLA A2 w.t.

[0256] Foi utilizada C1R, uma linha linfoblastoide de células B carentes em termos de antígenos HLA A e B de superfície, derivada de Hmy.2 B-LCL por irradiação gama, seguida de seleção para anticorpos e complementos monoclonais Classe I conforme descrito anteriormente[Storkus WJ, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 2361-2364].

[0257] Foi utilizada C1r-neo, uma linha de célula transfectada estável criada em 1987 por eletroporação da linha celular C1R com um vetor eucariótico resistente a medicamentos de neomicina modificado, pSP65-Neo (o vetor não carrega uma inserção), como descrito anteriormente [Grumet FC, et al. Hum. Immunol. (1994) 40: 228-234]. Geração de células dendríticas

[0258] Monócitos foram isolados por aderência plástica e cultivados em placas de 6 alvéolos utilizando 3 ml de meio Cellgro DC suplementado com 1% de soro humano e penicilina/estreptomicina, além de GMCSF (800 IU/ml) e IL-4 (20 ng/ml) (Peprotech, Hamburgo, Alemanha). Após 48h de cultura, 1,5 ml do meio foi adicionado (+GM-CSF em 1600 IU/ml e IL4 a 20 ng/ml). 24h depois, células não aderentes foram colhidas, e grandes células (principalmente DC imaturas) foram contadas, ressuspensas no meio fresco contendo GM-CSF 800 IU/ml, IL-4 20 ng/ml, LPS de E. coli O55:B5 a 10 ng/ml (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) e IFNY (Peprotech, 100 lU/ml) e colocada em um alvéolo em aproximadamente 106 DC por alvéolo em 2 ml e incubada durante a noite. No dia seguinte, as células não aderentes foram descartadas e as DC aderentes foram removidas delicadamente utilizando PBS/1% HS frio após incubação no gelo por 20 minutos. Grandes células consistindo de DC maduras foram contadas. As células foram irradiadas com 30 Gy para evitar consequências de algumas NK- potencialmente contaminadora ou células T de memória e, em seguida, foram utilizadas para a estimulação de células T. Isolamento de células-T CD8 naturais de PBMC

[0259] Células T CD8 naturais foram isoladas por seleção negativa inicial utilizando um kit de seleção negativa de CD8 (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Células T CD8+ experimentadas de antígenos foram então depletadas utilizando esferas-CD45RO e na coluna LD. Geração de células T CD8 humanas de memória central antiterceiro

[0260] Células T CD8 naturais foram isoladas e ressuspensas no meio de células T, suplementada com IL-21 (Peprotech, 30 ng/ml). DC’s irradiados foram adicionados a uma taxa de 1:4 DC de célula T com células T 4 x 105por alvéolo de uma placa de 48 alvéolos. Volume total de cada alvéolo foi de 500 μl.

[0261] 72h após o início da cultura, o meio de células T de 500 μl com IL-7 e IL-15 (concentrações finais de 5 ng/ml, Peprotech) foram adicionados e as células foram alimentadas posteriormente a cada 2 a 3 dias como esboços na seção de resultados.

Ensaio GVL

[0262] Linhas celulares de linfoblastos B (“K66A”) mutantes transfectantes H.My C1R (“Neo”) e H.My C1R HLA A2 K66A foram obtidos por centrifugação gradiente de densidade Ficoll e foram rotulados com 0,15 μ g/ml de CalceinaAM (Sondas Moleculares, Inc., Eugene, OR), um corante vital que é liberado após a morte das células, de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, células da linha de linfoblastos rotuladas como Calceína 2 x 105 B foram incubadas com ou sem Tcm anti-terceiro por 22 horas na proporção de 1 a 5 em favor das Tcms anti-terceiro em placas de 24 alvéolos. Antes da co-cultura, as células Tcm anti-terceiro foram enriquecidas por células T CD8+ através de um kit de seleção negativa (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha). Citocinas não exógenas foram adicionadas ao MLR. Células foram recuperadas e analisadas pela sobrevivência, medindo-se o número de células da linha de linfoblastos B marcados como Calceína sobreviventes por FACS. Para a detecção de apoptose por amostras de AnexinaV+ foram incubadas com 5μl AnexinaV-APC (BD) durante 15 minutos à temperatura ambiente.Posteriormente, a AnexinaV desacoplada foi lavada e as amostras foram analisadas por FACS. Para obter valores absolutos das células, as amostras foram suspensas em volume constante e contagens de fluxo citométrico para cada amostra foram obtidas durante um período constante e predeterminado de tempo e foram comparadas com a contagem de fluxo citométrico obtida com volume e números fixos de células de entrada. As taxas de sobrevivência são apresentadas em relação à sobrevivência das células da linha de linfoblastos B sozinha.

[0263] A porcentagem de eliminação das células da linha linfoblasto B foi calculada pela seguinte:

[0264] A porcentagem de células da linha de linfoblasto B passando por apoptose específica foi calculada pela seguinte fórmula: = (% células da linha de linfoblasto B Calceína+AnexinaV+ no alvéolo avaliado) - (% de células da linha de linfoblasto B Calceína+AnexinaV+ no alvéolo de controle).

[0265] Uma abordagem de separação magnética de dois estágios para depleção de alorreatividade, com base no marcador de ativação CD137.

[0266] Células T CD8 naturais foram estimuladas com DC’s alogênicas irradiadas de terceiros na proporção de 6:1 na presença de IL-21 (Peprotech, 30 ng/ml). Depois de 14 horas de ativação, as células CD137+ foram selecionadas positivamente por separação magnética (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha). As células CD137+ foram então reestimuladas com DC’s alogênicas irradiadas de terceiros a uma proporção de 4:1 na presença de IL-21 (Peprotech, 30 ng/ml) até o dia 3. Depois disso, as células foram expandidas com 5 ng/ml IL-7 e 5 ng/ml IL-15 (Peprotech) até o dia 10. No dia 10, as células foram divididas em dois grupos de teste. No primeiro grupo as células continuaram a ser expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 14, enquanto as células do segundo grupo de testes foram ativadas com a PBMC do hospedeiro irradiado na presença de IL-7 e IL-15 (na proporção de 1 para 2). Após 24h, as células CD137+ foram depletadas por separação magnética. As células CD137 depletadas foram recolocadas em um alvéolo com IL-7 e IL- 15 e cultivada até o dia 14 (“Antiterceiro CD137+ e Anti-hospedeiro CD137”). No dia 14, a atividade alorreativa anti-terceiros e anti-hospedeiros foi avaliada pelo ensaio CFSE face às PBMC’s de terceiros ou hospedeiro irradiado. Para o ensaio CFSE, respondentes 1 x 106 CFSE+ foram incubados com ou sem estimuladores de PBMC 2 x 106 irradiados (20 Gy) por 84h na presença de IL-7. Após 84h, as células foram recuperadas e analisadas por divisão celular, medindo-se o número de células T CD8 marcadas com baixa CFSE (CD3+CD8+CD56-) pela FACS. Para obter os valores absolutos das células, as amostras foram suspensas em um volume constante e contagem de fluxo citométrico para cada amostra que foi obtida durante um período predeterminado, constante. O número de células se dividindo específicas = (Número de células se dividindo com APC) - (Número de célula se dividindo sem APC). Os valores negativos significam que o número de células se dividindo em resposta à ativação com a PBMC hospedeira foi ainda menor que o número de células se dividindo sem qualquer ativação.

EXEMPLO 1 Geração e otimização de células de memória central (Tcm) anti-terceiro humanas

[0267] Para traduzir os estudos realizados em ratos, apresentados anteriormente para aplicação clínica, o procedimento foi otimizado para a geração de linfócitos T citotóxicos anti-terceiro (CTLs | cytotoxic T lymphocytes) humanos. Para este fim, foram avaliados parâmetros diferentes, incluindo diferentes reagentes para o isolamento das células respondentes CD8, a composição dos estimuladores e o meio de citocina.

[0268] Potencialmente, como encontrado no modelo do rato anteriormente apresentado, o tratamento com células T de memória central (Tcm) poderia ser valioso no contexto do autólogo [Lask A et al., Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), (2010) 116: 424] ou em transplante de medula óssea alogênica (BMT) [Ophir E et al., Blood. (2010) 115(10): 2095104; Ophir E., 37th encontro anual EBMT, abril 3-6, 2011, Paris, França. Apresentação Oral do Resumo n° 662].

[0269] Na configuração autóloga humana (Figura 1A) a Tcm anti- terceiro pode ser administrada junto com o BMT autólogo. As células T CD8+ do próprio paciente são isoladas e estimuladas face às células dendríticas alogênicas de um doador alogênico.

[0270] Na configuração alogênica humana (Figura 1B), a Tcm anti- terceiro pode ser transplantada junto com as células BM depletadas T alogênicas. As células T CD8+ naturais originárias do doador alogênico BM serve como respondentes e as células dendríticas de terceiro do doador são utilizadas como estimuladoras para habilitar a geração de hospedeiros Tcm não reativos. Para evitar a GVHD, o doador de terceiros é selecionado a fim de garantir que nenhum de seus alelos HLA de Classe I seja compartilhado com os alelos HLA de Classe I do hospedeiro.

[0271] Ainda em ratos e humanos, o protocolo de perspectiva básica compreendeu similarmente o isolamento de células T CD8 seguido de estimulação face às células de terceiros (Figuras 1A-B e 2AB), vários outros parâmetros tiveram que ser modificados no protocolo humano, conforme descrito na Tabela 1, abaixo.

[0272] Considerando que as Tcm autólogas são livres de risco de GVHD, a otimização do protocolo de produção em grande parte concentrouse em atingir expansão efetiva do das células T CD8 com fenótipos de memória central.

[0273] Como pode ser visto na Figura 3A, um novo protocolo foi desenvolvido com base em três etapas principais: a) Seleção de células T CD8 de PBMC; b) Estimulação Face às células dendríticas (DC) alogênicas por 3 dias na presença de IL-21; e c) Expansão em um ambiente livre de antígenos com IL-7, IL-15 e IL-21 por mais 8 dias.

[0274] Assim, neste protocolo recentemente desenvolvido, vários parâmetros diferem dos utilizados com os da geração de Tcm de ratos (Tabela 1 e Figuras 3A-B). As principais diferenças dizem respeito ao tecido de origem para os respondentes e estimuladores (PBMC contra esplenócitos), os estimuladores (células dendríticas contra esplenócitos), bem como a composição de citocina. Tabela 1: Comparação do protocolo humano autólogo contra o protocolo do rato singênico para geração de Tcm

Otimização de um protocolo de grau GMP para a geração de Tcm anti- terceiro humana:

[0275] As tentativas iniciais para desenvolver um protocolo para a geração de Tcm antiterceiro humano foram feitas com base em um estudo recente por Wolfl et al. [Wolfl M et al., Cancer Immunol Immunother (2011) 60(2): 173-186], que descreveu um procedimento para a geração de células T CD8 específicas de antígeno humano com um fenótipo de memória central.

[0276] A presente abordagem baseou-se na estimulação face à DC pulsada antigênica na presença de IL-21 por 3 dias e a subsequente expansão na presença de IL-7 e IL-15 por mais 8 dias.

[0277] Nestas experiências iniciais que resultaram em uma expansão impressionante de Tcm anti-terceiro e posteriormente serviram como referência para otimização adicional, as etapas a seguir foram utilizadas: a) Enriquecimento de células T CD8 de PBMC’s por depleção de células não CD8+ (i.e., células T CD4+, células T y/δ T, células B, células NK, células dendríticas, monócitos, granulócitos e células eritróides); b) Enriquecimento de células naturais por depleção de células ativadas expressando CD45RO; e c) Estimulação de células T CD8 naturais contra as células dendríticas alogênicas na presença de IL-21 por 3 dias, seguido de expansão em um ambiente livre de antígenos com IL-7 e IL-15 por mais 8 dias.

[0278] Os resultados dessas experiências de referência iniciais, mostrados nas figuras 4A-C, permitiram avaliação do papel dos diferentes parâmetros no protocolo, definindo-se o impacto de cada parâmetro no nível da expansão da célula e nível de expressão do fenótipo Tcm (conforme descrito em detalhes abaixo). O papel da preparação com DC’s de terceiros

[0279] Considerando que as Tcm autólogas são livres de risco de GVHD por definição, o primeiro parâmetro avaliado foi o papel da estimulação contra uma DC de terceiros.Esta etapa foi originalmente destinada a reduzir o risco de GVHD no cenário alogênico, pela expansão seletiva de clones anti- terceiros na ausência de estimulação de clones anti-hospedeiros mediando a GVHD.

[0280] Conforme ilustrado nas Figuras 5A-C e B-6A, células T CD8 naturais cultivadas com IL-21, na ausência de estimulação alogênica por células dendríticas, exibiram baixo nível de proliferação (2,7 ± 1,1% dos expostos pelo grupo de controle de referência), representando no dia 7 uma expansão de, aproximadamente, 0,4 vezes a partir do dia 0 (a maioria das células morreram antes do dia 10) e mantendo seu fenótipo virgem (CD45ROCD62L+, morfologia pequena) (nível de Tcm foi de apenas 10% do grupo de controle de referência). Um nível pobre de diferenciação e expansão semelhantes verificou-se quando as células foram mantidas com IL-7 e IL-15, na ausência de estimulação alogênica por células dendríticas; nestas condições, as células mantiveram seu fenótipo virgem (o nível de Tcm foi de apenas 7 ± 1,6% do grupo de controle de referência), embora algumas proliferações foram induzidas (12 ± 3,2% do valor do grupo de controle, que representa no dia 13 uma expansão de, aproximadamente, 6 vezes a partir do dia 0).Assim, o papel das DC’s alogênicas de terceiros foi muito crítico para a indução do fenótipo Tcm e para a expansão da célula robusta. O papel da IL-21 nas fases de preparação e expansão de Tcm anti-terceiro

[0281] Em geral, tanto no rato quanto no humano, os protocolos de expansão das células T convencionais, a fase de expansão é realizada em ambiente livre de antígenos. No entanto, no protocolo do rato, apenas IL-15 foi adicionado (Figura 3B), no protocolo humano descrito por Wolfl et al. (Wolfl et al. 2011, supra), a expansão de células foi realizada na presença de IL-7 e IL15.Além disso, considerando que IL-21 demonstrou ser benéfico se adicionado durante a fase de preparação inicial, o papel da IL-21 foi avaliado neste documento.

[0282] Curiosamente, como mostrado nas Figuras 7A-C e 8A-B, enquanto a preparação das células T CD8 naturais por DC alogênica na presença ou ausência de IL-21 teve apenas efeito menor na composição da célula (dados não mostrados), preparação na ausência de IL-21 dificultado a aquisição do fenótipo Tcm (CD45RO+ CD62L+) (apenas 69 ± 18% do nível Tcm no grupo de controle de referência) e também resultou na proliferação reduzida (76 ± 23% do nível de expansão do grupo de controle de referência) (Figuras 8A-B). Mesmo em um único experimento de quatro, no qual expansão não foi reduzida (140% do grupo controle de referência) o fenótipo Tcm foi de apenas 35% do nível de Tcm no grupo de controle de referência, sugerindo que a preparação na presença de IL-21 é importante para expansão e indução do fenótipo Tcm da população de células T CD8 naturais.

[0283] Curiosamente, a presença contínua do IL-21 tanto na fase de preparação (IL-21 sozinho) quanto na fase de expansão (juntamente com IL-7 e IL-15) melhorou consistentemente a indução de células do fenótipo de memória central (108 ± 1,9% do nível de Tcm no grupo de controle de referência) (Figuras C-7A e 8A-B).O impacto da presença contínua de IL-21 na expansão celular, embora claramente, levando ao aumento médio superior (135 ±47% dos valores encontrados no grupo de controle de referência) foi menos consistente, levando dois dos três experimentos a uma expansão ligeiramente reduzida (95% e 81% dos valores de referência, respectivamente), enquanto no terceiro experimento, exibiu uma expansão dramaticamente melhorada (228%), indicando que adicionar IL-21 em ambas as fases de preparação e expansão pode ser desejável (Figuras 8A-B). Composição das células estimuladoras de terceiros

[0284] Os resultados descritos acima mostram que a adição sequencial de IL-21, IL-7 e IL-15 deve ser acompanhada pela estimulação alogênica por DC madura derivada de monócito para indução bem-sucedida do fenótipo Tcm e para a expansão da célula robusta.

[0285] Para simplificar o procedimento, um experimento foi conduzido avaliando se a estimulação alogênica essencial pôde ser entregue por PBMC’s irradiadas em vez de DC madura derivada de monócito, o que requer uma preparação de 4 dias.

[0286] Como pode ser visto na Tabela 2 abaixo, em 7 dias de cultura, a eficiência da indução do fenótipo Tcm por PBMC, ao contrário de DC madura derivada de monócito (md-mDC | monocyte derived mature DC), os estimuladores foram muito semelhantes, ambos quando as células T CD8 naturais purificadas (92% vs. 92%, respectivamente) e quando as células T CD8 não separadas serviram como respondentes (77% vs. 80%).No entanto, os estimuladores PBMC não foram capazes de produzir o mesmo nível de expansão de Tcm em comparação com DC’s utilizando células-T CD8 naturais (6,75 x 20,5, respectivamente) ou células T CD8 não separadas (1,8 vs. 16) como respondentes. Tabela 2: O papel crítico das DC’s como estimuladores

[0287] A cultura MLR em que as células T CD8 naturais ou respondentes T CD8 não separados foram estimulados face à DC madura derivada demonócito (proporção de 8:1. do respondente/DC) ou PBMC (proporção de 1:1. do respondente/PBMC), do mesmo doador alogênico, num meio contendo IL-21 por 3 dias. Depois disso, as células foram cultivadas com IL-7 e IL-15 até dia 7 sem ativação adicional. No dia 7 da cultura, os diferentes grupos foram avaliados para porcentagem de Tcm utilizando análise de FACS e por números celulares por exclusão com azul de tripan.

[0288] Assim, ao contrário do protocolo do rato em que esplenócitos irradiados foram suficientes para induzir a expansão, no protocolo humano, DC madura derivada de monócito alogênico é crucial para a boa expansão das células Tcm e não podem ser substituído por PBMC alogênica.

[0289] Definindo a relação ideal do DC/respondente para a indução da expansão do fenótipo Tcm e da célula.

[0290] Para definir a relação ideal do respondente/DC, foi utilizado um sistema MLR, conforme descrito acima, exceto que as relações diferentes do respondente/DC foram testadas. Como pode ser visto nas Figuras 9A-B, ao usar respondentes 4 x 105, uma aquisição ótima de fenótipo Tcm foi conseguida mediante a adição de 50-100 x 103 DC, enquanto a expansão foi otimizada para a menor concentração de DC’s. Outras experiências em menores proporções do respondente/DC são examinadas.

[0291] Definindo um protocolo final autólogo com base exclusivamente em reagentes de grau GMP.

[0292] Após a criação de um protocolo autólogo satisfatório para a geração de Tcm antiterceiro, foi realizado um experimento para desenvolver um procedimento equivalente com base unicamente em reagentes de grau GMP, atualmente disponíveis comercialmente, de modo a permitir o teste desta abordagem em pacientes humanos.

[0293] Depleção de células aderentes em placas plásticas.

[0294] Antes de otimizar o processo de seleção de células T CD8, um experimento foi realizado para atingir um enriquecimento inicial significativo pela remoção de células aderentes plásticas presentes em PBMC’s. Este processo não só aumenta a concentração de células T CD8+ desejadas, mas também é útil quando processando PBMC humana crio-preservada em oposição a esplenócitos frescos utilizados no modelo do rato. Esta experiência revelou que incubação durante a noite com 10% de soro humano e IL-7 permitiu às células descongeladas se recuperarem antes de serem submetidas ao processo de enriquecimento magnético (dados não mostrados). Enriquecimento de células T CD8 naturais

[0295] Em seguida, o foco foi em adaptar o enriquecimento das células T CD8 naturais para reagentes de grau clínico utilizando o mínimo de anticorpos possíveis.

[0296] Como mostrado na Figura 10, representando um experimento típico, a população desejada de células T CD8 representa 21% das células no dia 0 após depleção das células aderidas, enquanto as outras principais subpopulações “contaminantes” incluem células T CD4 (61%), células B (7%) e células NK (7%). Assim, as células CD4 representam a maior contaminação e foram mostradas anteriormente para competir com as células T CD8; estas células, portanto, tiveram que ser removidas. Da mesma forma, foi importante remover as células NK que são conhecidas por consumir em culturas de IL-15. Em contraste, as células B tendem a morrer sob essas condições de cultura. Assim, o potencial de depleção com esferas magnéticas antiCD4 e anti-CD56foi avaliado inicialmente com e sem depleção de células B CD19+.

[0297] Além disso, uma vez na PBMC de pacientes com malignidades de células B, os níveis das células T CD8 são mais baixos em comparação com doadores saudáveis, uma avaliação paralela foi realizada examinando a possibilidade de omitir o enriquecimento de células T CD8 naturais por seleção positiva das células CD45RA+, conforme diminui ainda mais o número de células T CD8 recuperadas.

[0298] Assim, no doador do dia 1, as PBMC foram primeiro depletadas das células aderentes por incubação durante a noite em placas de culturas de tecido CELLSTAR greiner-bio-one (Greiner Bio-One Ltd., Stonehouse Reino Unido), projetadas especificamente para remover células mieloides aderentes e no dia 0 as células não aderentes foram divididas em quatro grupos experimentais, cada um sujeito a um protocolo de classificação magnético diferente.Nos dias 0, 7, 10 e 14 da cultura, as células foram avaliadas por composição celular e fenótipo Tcm por análise de FACS e expansão pela contagem de células vivas, com base na exclusão com azul de tripan.

[0299] Como pode ser visto na Figura 10, a separação celular magnética mínima utilizando apenas esferas anti-CD4 e anti-CD56, diminuiu a porcentagem de células T CD4 e NK de 61% e 7% para 12% e 1%, respectivamente, resultando no enriquecimento das células T CD8 de 23% para 60%.No entanto, este procedimento foi associado com a melhoria dos níveis de células B de 7% para 24%. Adicionando anti-CD19 ao coquetel de depleção depletou completamente as células B, resultando em melhor enriquecimento de células T CD8 (90%).Adicionar uma segunda etapa de enriquecimento positivo de células virgem com antiCD45RA aumentou a porcentagem de células naturais (CD45ROCD45RA+, dependente no CD3+ CD8+) de 53%, antes da separação magnética para 91% em ambos os grupos.No entanto, esta etapa não afetou consideravelmente o nível final de células T CD8, que aumentou de 60% para 66% quando utilizando anti-CD4 e anti-CD56, ou de 90% a 94%, quando a etapa de seleção negativa também incluiu anti-CD19.

[0300] Após a separação de célula magnética, todos os quatro grupos foram preparados com células dendríticas alogênicas na presença de IL-21 por 3 dias, e depois disso, as células foram expandidas em um ambiente livre de antígenos até o dia 14, na presença de IL21, IL-7 e IL-15.Como um grupo de controle para células não expandidas, as células T CD8 naturais enriquecidas por uma etapa de depleção utilizando anti-CD4, anti-CD56 e anti-CD19 e uma etapa de enriquecimento positivo utilizando antiCD45RA, foram mantidas em um ambiente livre de antígenos na presença de IL-7 só até o dia 14.

[0301] Curiosamente, enquanto no dia 0, os grupos tratados ou não com anti-CD19 exibiram níveis marcadamente diferentes de células T CD8, essa diferença foi abolida tão cedo quanto o dia 7 (Figura 11) e também, quando testada no dia 14 (Figura 12), provavelmente devido à morte seletiva de células B na cultura. Da modo similar, a seleção positiva das células CD45RA+ após a purificação de célula T CD8 inicial, apenas contribuíram marginalmente para o enriquecimento final de células T CD8+ com um fenótipo Tcm. Assim, todos os quatro grupos mostraram níveis semelhantes de células desejados com uma pequena vantagem para os dois grupos também enriquecidos por antiCD45RA para células naturais.

[0302] Este resultado inicial mostrado acima em um típico experimento foi analisado, ainda, comparando os resultados médios alcançados no grupo de controle exposto aos reagentes de isolamento de célula ideal (“CD4CD56- CD19-, CD45RA+”) para os outros grupos em que foi feita uma tentativa de eliminar o uso de anti-CD19 ou anti-CD45RA.

[0303] Assim, o percentual médio de células T CD8 (Figura 13A) e mais importante, a porcentagem de Tcm (Figura 13B) em todos os grupos experimentais quando calculado como uma porcentagem do nível alcançado no grupo de controlo ideal foram muito similares.

[0304] Em contraste, foram encontradas diferenças marcadas na expansão média de cada preparação de célula quando testadas no dia 10 da cultura, variando de 65,6 ± 0,5% a 105,2 ± 6,8% (Figura 14A). No entanto, as diferenças na capacidade de expansão foram neutralizadas pelo rendimento reduzido associado com a segunda etapa de purificação (Figura 14B).

[0305] Como pode ser visto na Figura 14C, mostrando o rendimento calculado final da Tcm no dia 10, a adição de uma segunda etapa de enriquecimento positivo de células naturais com anti-CD45RA só diminuiu o rendimento final de células de Tcm, de 141% para 123%, quando utilizando depleção inicial com anti-CD4 e anti-CD56, ou de 157% a 100%, quando a etapa de seleção negativa também incluiu anti-CD19.

[0306] Coletivamente, estes resultados sugerem que o protocolo é feito com base no uso mínimo de reagentes para o isolamento de células T CD8, ou seja, a seleção negativa com anti-CD4 e anti-CD56, é satisfatória para a aplicação clínica no cenário autólogo.

EXEMPLO 2 Preparação em grande escala de Tcm anti-terceiro humana em sacos plásticos, utilizando reagentes de grau GMP

[0307] Para simular as condições antecipadas quando utilizando a PBMC do próprio paciente para a geração de Tcm autólogo, inicialmente realizaram-se dois procedimentos de leucaférese em grande escala, de dois doadores normais, e um grande número de células mononucleares foram crio- preservadas (dividido em vários lotes). Cada lote foi utilizado para a experiência em uma grande escala.No primeiro experimento, vários problemas técnicos foram encontrados, incluindo dificuldade na geração de DC’s dos sacos congelados, de acordo com o protocolo de Wurzburg, e origem de um novoIL-15 de grau GMP para o qual a atividade biológica não fosse clara. Estes problemas, que resultaram em uma expansão de célula T CD8 muito pobre (cerca de 3 vezes), foram corrigidos nos experimentos subsequentes utilizando o protocolo descrito atualmente para DC’s (como descrito acima) e utilizando a concentração adequada de IL-15 (i.e., 300 U/ml).

[0308] Como pode ser visto na Figura 15, quando a PBMC de mesmo doador for gerada em dois experimentos em grande escala face a duas DC’s de terceiros diferentes, a expansão de células T CD8 semelhantes foi conseguida variando de 26,8 a 31,0 vezes no dia 11. Considerando que, neste dia, as células exibiram um crescimento linear, é provável que a expansão pudesse ser alcançada em pontos posteriores. No entanto, esse nível de expansão é satisfatório, pois permite administração potencial de até 3 x 107 células por Kg de peso corporal. Curiosamente, enquanto no dia 0 verificou- se que a preparação de leucaférese foi, em grande parte, contaminada com monócitos CD14+ e células B CD20, estas células desapareceram na cultura celular e na composição de célula final no dia 12 composta por células T CD3+ CD8+ 94% e 98% respectivamente (Figura 16A-B)

[0309] Importante, o fenótipo Tcm alcançado nas duas culturas face às diferentes DC’s estavam dentro da faixa dos experimentos em pequena escala, embora alguma variabilidade ocorreu (Figuras 17A-B). Assim, enquanto no dia 5, foi encontrado em ambos os experimentos um alto nível do fenótipo Tcm (77% e 71%, respectivamente), este nível diminuiu mais significativamente na cultura face ao segundo doador DC sobre o 9° dia (65% vs. 46%) e no dia 12 (62% vs. 35%).Esta variabilidade que não foi observada significativamente nas experiências em pequena escala poderia ser explicada, em parte, por uma relativa dificuldade em remover as DC’s no dia 5, como eles são menos propensos a aderir ao saco plástico, em comparação com sua adesão às placas utilizadas nos experimentos em pequena escala. Assim, a presença e a estimulação com as DC’spoderiam levar a uma transição mais pronunciada de uma Tcm para um fenótipo de Teff.

EXEMPLO 3 Potencial GVL da Tcmanti-terceiro humana face a uma linha celular estabelecida

[0310] Considerando que, na configuração autóloga, o potencial uso de Tcm anti-terceiro é exclusivamente para erradicar as células de tumor residual (no cenário alogênico serve também para melhorar o enxerto das células BM) é importante desenvolver um simples ensaio para capacidade citotóxica ex vivo, que pode ser utilizado para controle de qualidade antes da infusão do Tcm no paciente. Para esse fim, um ensaio TCR independente foi utilizado com base na demonstração de Lask et al. [Lask A et al., J Immunol. (2011) 187(4):2006-14] que uma linha mutante MHC não reconhecível pelo TCR devido a essa mutação, ainda pode ser eliminada por CTLs anti-terceiro através de seu mecanismo de eliminação independente da TCR.Claramente, se aplicável também à Tcm humana, tal modalidade de eliminação pode servir para distinguir a eliminação de Tcm daquela exibida por células NK.

[0311] Para resolver esta questão, foi realizada uma reação linfocitária mista (MLR) com Tcm anti-terceiro visando linfoma de células B e linha de célula de leucemia de célula de plasma e a porcentagem das células apoptóticas foi medida após 22 horas. Como pode ser visto na Figura 17C, que representa um experimento típico, a reatividade GVL marcada foi exibida pelo Tcm.

[0312] Em uma experiência diferente, as células T CD8 primeiro foram enriquecidas por extensiva depleção nas células T não CD8 (i.e., células T CD4+, células y/δ T, células B, células NK, células dendríticas, monócitos, granulócitos e células eritróides) utilizando separação de esfera magnética. Como pode ser visto na Figura 18, que representa um experimento típico, a porcentagem de células NK e NKT contaminantes foi muito baixa (abaixo de 0,1% de células NK e abaixo de 1,9% para células NKT) para todos os quatro grupos testados.

[0313] As células T CD8 altamente purificadas foram então incubadas com dois tipos de células: a) linha celular mutante (K66A) H.My C1R HLA- A2 K66A para demonstrar a eliminação independente de TCR e b) H.My C1R

[0314] (Neo), uma linha linfoblastoide de células B carentes em termos de antígenos HLA A e B de superfície e, portanto, insensível à eliminação pelo Tcm, através de um mecanismo que requer interação entre a molécula CD8 sobre a Tcm e o domínio α3 no MHC das células de leucemia alvo.

[0315] Como mostrado nas Figuras 19A-D, a eliminação marcada das células alvo mutantes K66A em comparação com as células MHC-I deficientes H.My C1R(Neo), foi exibida por Tcm anti-terceiro. Assim, Tcm humano, similarmente às CTLs anti-terceiro humanas, pode eliminar as células de tumor de células B através de um mecanismo de eliminação independente do TCR, que em contraste com a eliminação mediada NK que exige expressão de MHC sobre as células alvo.

[0316] O mais importante, quando analisados ainda comparando os resultados médios alcançados no grupo de controle exposto aos reagentes de isolamento de célula (“CD4- CD56- CD19-, CD45RA+”) com os outros grupos em que o uso de anti-CD19 ou anti-CD45RA (Figuras 19A-D) foi reduzido, é mostrado que a porcentagem de eliminação independente de TCR da linha celular mutante H.My C1R HLA-A2 K66A em todos os grupos experimentais (calculados como uma porcentagem do nível alcançado no grupo de controle de otimização) foi muito semelhante (Figura 20) (P>0,05, quando comparando todos os três grupos de teste ao grupo de controle de referência).

[0317] Coletivamente, estes resultados sugerem que a reatividade GVL exibida por células isoladas com uma mínima utilização de reagentes para o isolamento de células T CD8 não é inferior àquela associada com protocolos de isolamento mais extensos.

[0318] A eliminação de células de tumor autólogas B-CLL pela Tcm in vivo são feitas, utilizando um modelo Hu/SCID anteriormente empregado para a demonstração de tal eliminação de B-CLL pelas CTLs antiterceiro. EXEMPLO 4 Geração de células Tcm anti-terceiro humanas alogênicas

[0319] Início de uma nova abordagem de grau GMP para minimizar o risco de GVHD quando utilizando Tcm anti-terceiro humano alogênico

[0320] Como previamente demonstrado em um modelo de rato, a Tcm anti-terceiro pode ser muito útil para a indução de tolerância em BMT alogênico [Ophir E. et al. sangue. (2010) 115 (10): 2095-104]. Neste caso, as células T CD8+ naturais originárias do doador alogênico BM servem como respondentes, e as células dendríticas (DC) do doador de terceiros são utilizadas como estimuladores para habilitar a geração de células Tcm não reativas do hospedeiro. Para evitar a GVHD, o doador de terceiros é selecionado a fim de assegurar que nenhum dos seus alelos HLA de Classe I são compartilhados com os alelos HLA de Classe I do hospedeiro.

[0321] No entanto, considerando que pacientes humanos podem ser mais propensos a GVHD do que ratos cruzados, tradução clínica desta abordagem deve ser perseguida com cautela. Etapas adicionais de alo-depleção, tais como foto-depleção ou seleção de células ativadas no final do período de alo- estimulação anti-terceiros, pode ser necessário a fim de reduzir ainda mais o risco de GVHD.

[0322] Modificações do protocolo humano autólogo (para protocolo alogênico)

[0323] Como mostrado nas Figuras 21 e 22, o protocolo para a geração de Tcm para a configuração alogênica difere do protocolo para a configuração autóloga em duas etapas principais:

[0324] Seleção de células CD45RA+ após o isolamento das células T CD8. As células T de memória têm limiar de ativação inferior às das células T naturais que podem causar expansão guiada por citocina não específica da fração de células T de memória. Estas células podem incluir clones que reagem de forma cruzada com antígenos do hospedeiro, aumentando assim o risco de indução de GVHD. A fim de minimizar o efeito causado pela diferença na porcentagem de células T naturais entre doadores humanos diferentes e para reduzir o risco de GVHD, células T CD8 naturais (CD45RA + CD8 +) foram utilizadas como fonte para a geração de células Tcm.

[0325] Remoção de células T reativas potencialmente hospedeiras no final da cultura, por depleção de células T CD8 ativadas CD137+. Extensão do período de privação de IL-7 e IL-15

[0326] Conforme descrito para as culturas autólogas (acima), os inventores presentes observaram que células T CD8 naturais expostas a IL-7 e IL15 proliferam de forma independente do antígeno. Por outro lado, células T CD8 naturais expostas a IL-21, na ausência de estimulação alogênica, não proliferaram e não sobreviveram sequer além do 7° dia da cultura. Portanto, atrasar a adição de IL-7 e IL-15, do dia 3 ao dia 7 pode potencialmente levar a uma depleção seletiva de clones antihospedeiros não responsivos aos estimuladores de terceiros.

[0327] Para definir o momento ideal para a adição de depleção de alorreatividade de citocina vis-à-vis, as células T CD8 naturais foram estimuladas com DC de terceiros alogênicas irradiados a uma proporção de 4:1 na presença ou ausência de IL-21 por 7 dias.Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL-15 (Figura 23B), IL-15 e IL-21 (Figura 23C) ou IL-15 sozinho (Figura 23D) até o dia 13; as populações de células resultantes foram comparadas às células T CD8 naturais cultivadas de acordo com o grupo de controle de referência, expandido conforme descrito para a configuração autóloga (incubação no d (0-3), com IL21 e DC; na d(3-13), adição de IL7 + IL15 (Figura 23A).

[0328] Utilizando a mesma sequência de adição de citocinas que o grupo de controle de referência, mas com temporização diferente, ou seja, a adição de IL-21 estendeu-se de 3 dias a 7 dias, e IL-7, IL15 foram adicionados no dia 7 e não no dia 3, dificultando a expansão das células (Figura 24A) (proliferação apenas a 54 ± 7% do que expostos pelo grupo de controle de referência).No entanto, a indução do fenótipo de memória central foi semelhante (Figura 24B) (99 ± 14,8% do que expostos pelo grupo de controle de referência).

[0329] Como mostrado, removendo a IL-7 e estendendo a adição de IL- 21 para o fim da cultura, reduziu a expansão das células (Figura 24A) (60 ± 13% da proliferação exibida pelo grupo de controle de referência), bem como a aquisição de fenótipo de diminuição da memória central (82 ± 6,8% do nível Tcm exibido pelo grupo de controle de referência, Figura 24B).

[0330] A preparação de células T CD8 naturais utilizando a privação de citocina de 7 dias, seguida por adição de apenas IL-15, do dia 7, reduziu drasticamente o potencial de expansão das células (apenas 5 ± 1,3% de proliferação do que expostos pelo grupo de controle de referência) e também diminuiu a aquisição do fenótipo de memória central (Figura 24B) (68 ± 26% do nível de Tcm exibido pelo grupo de controle de referência).

[0331] O parâmetro mais crítico, ou seja, a depleção dos clones reativos do hospedeiro (testado com doadores apropriados que são completamente distintos em HLA de Classe I, a partir das células de terceiros, utilizadas para estimulação) é examinado. Outros experimentos para otimizar o período de privação de citocinas também são realizados.

[0332] Uma abordagem de duas etapas da separação magnética para depleção de alorreatividade, com base no marcador de ativação CD137

[0333] Uma maneira elegante para depletar os clones anti-hospedeiros com base no conceito de terceiro pode ser alcançada por uma técnica de separação magnética de duas etapas, que compreende as seguintes etapas de seleção CD137: Seleção positiva de clones específicos de terceiros no início da cultura. Depleção de clones anti-hospedeiros específicos perto do fim da cultura.

[0334] Recentemente, CD137 tem sido descrito como um marcador apropriado para ativação específica do antígeno de células T CD8+ humanas, já que o CD137 não é expresso nas outras células T CD8+ e sua expressão é induzida confiavelmente após 24 horas de estimulação.

[0335] Para avaliar esta abordagem, as células T CD8 naturaisforam estimuladas com DC de terceiros alogênicas irradiadas na presença de IL-21. Depois de 14 horas de ativação, as células CD137+ foram positivamente selecionadas por separação magnética. As células CD137+ foram então reestimuladas com DC de terceiros alogênicas irradiadas na presença de IL-21 até o dia 3. Depois disso, as células foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 10 e em seguida foram ativadas com PBMC de hospedeiro irradiado na presença de IL-7 e IL-15. Após 24 horas da ativação, as células CD137+ foram depletadas por separação magnética. As células CD137 depletadas foram recolocadas em um alvéolo com IL-7 e IL-15 e cultivadas até o dia 14. Em dias selecionados, as células foram avaliadas por números celulares por exclusão com azul de tripan e porcentagem de Tcm (CD62L+ CD45RO+) dentro da população de células T CD8 utilizando análise de FACS. A frequência de células alorreativas anti-terceiro e anti-hospedeiro foi avaliada por ensaio CFSE face às PBMC’s de terceiros ou hospedeiros irradiados. Estes resultados foram comparados com aqueles alcançados no grupo de controle estimulado na presença de IL-21 por 3 dias e posteriormente expandido com IL-7 e IL-15 (“grupo de controle de referência”).

[0336] Assim, como pode ser visto na Figura 25, enquanto imediatamente após o enriquecimento das células T CD8 naturais (dia 0), apenas 0,7% das células T CD8 totais expressaram CD137+, sobre a ativação face a DC de terceiros na presença de IL-21 por 14h, a porcentagem de células T CD8 expressando CD137+ do compartimento das células T CD8 totais aumentou para 8,3% em oposição a 2,5% na ausência de estimulação da DC. A separação magnética desta subpopulação de células ativadas levou ao enriquecimento marcado de células CD137+ (85%, respectivamente) e o nível de células T CD8+ CD62L no compartimento total de células T CD8 diminuiu drasticamente de 84% para 14% (dados não mostrados).

[0337] Como mostrado na Tabela 5, abaixo, esta seleção positiva foi associada com a recuperação da célula reduzida. Assim, no dia 0, o rendimento da PBMC depletada de células aderentes após enriquecimento para as células T CD8 naturais foi de 7,6% e no dia 1, após a seleção positiva para CD137+, o rendimento diminuiu para 0,25% (3,3% de 7,6%). Quando avaliado no dia 7 da cultura, o grupo de teste de células T CD8 sujeitado a seleção positiva das células CD137+ se assemelhava altamente ao grupo de controle de referência na porcentagem de células Tcm (67% vs. 70%, respectivamente), e esta semelhança entre os grupos em porcentagem de Tcm também foi mantida no dia 10 da cultura (54% vs. 52%, respectivamente) (Figura 26). Tabela 5: Comparação de proliferação e número celular final

[0338] Células T CD8 naturais foram estimuladas com DC de terceiros alogênicas irradiadas a uma proporção de 4:1 na presença de IL-21 por 3 dias. As células não receberam nenhuma ativação adicional depois disso e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 14 (“grupo de controle de referência”). Alternativamente, as células T CD8 naturais foram estimuladas com DC de terceiro alogênica irradiadana proporção de 5,7:1 na presença de IL21. Depois de 14 horas de ativação, as células CD137+ foram positivamente selecionadas por separação magnética. As células CD137+ foram então reestimuladas com DC de terceiro alogênica irradiadaem uma proporção de 4:1 na presença de IL-21 até o dia 3. Depois disso, as células foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 10. No dia 10, foram ativadas comPBMC de hospedeiro irradiada na presença de IL-7 e IL-15 (na proporção de 1 para 2). Após 24h, as células CD137+ foram depletadas por separação magnética. As células CD137 depletadas foram recolocadas em um alvéolo com IL-7 e IL-15 e cultivadas até o dia 14 (“CD137+ Anti-terceiro e CD137- Anti-hospedeiro”).Nos dias indicados, as células foram contadas por exclusão com azul de tripan.

[0339] a = Rendimento após enriquecimento de células T CD8 naturais (representado como porcentagem do número de partida de células aderentes PBMC).

[0340] b = Rendimento após ativação com DC’s de terceiros e enriquecimento de células T CD8 CD137+ (representado como a porcentagem do número de partida das células aderentes de PBMC).

[0341] c = Expansão em vezes a partir do dia 0, no dia 13. [0341] d = Expansão em vezes a partir do dia 0, no dia 14.

[0342] e = Número celular final = (Rendimento) x (Expansão em vezes a partir do dia 0) (Representado como a porcentagem do número de partida das células aderentes de PBMC).

[0343] Além disso, quando a composição da célula (% de células T CD8, % de células NK e % de células NKT) foi avaliada nos dias 7 e 10 da cultura, o grupo de teste de células T CD8 submetido à seleção positiva das células CD137+, se assemelhava altamente ao grupo de controle de referência em sua composição celular (Tabela 6, abaixo). Tabela 6: Enriquecimento de células T CD8 anti-terceiro específicas pela seleção positiva das células CD137+ não muda drasticamente a composição celular:

[0344] Células T CD8 naturais foram estimuladas com DC de terceiro alogênica irradiadaa uma proporção de 4:1 na presença de IL-21 por 3 dias. Depois disso, as células não receberam nenhuma ativação adicional e foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 10 (“grupo de controle de referência”). Alternativamente, as células T CD8 naturais foram estimuladas com DC de terceiro alogênica irradiadana proporção de 5,7:1 na presença de IL-21. Depois de 14 horas de ativação, as células CD137+ foram positivamente selecionadas por separação magnética. As células CD137+ foram então reestimuladas com DC de terceiro alogênica irradiadaa uma proporção de 4:1 na presença de IL21 até o dia 3. Depois disso, as células foram expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 10. As células foram avaliadas por composição celular por análise de FACS.

[0345] Por outro lado, como mostrado na Figura 27, o grupo de teste de células T CD8 sujeitado a seleção positiva das células CD137+, exibiu potencial de expansão superior em comparação com o grupo de controle de referência em ambos os pontos de tempo (35 vs. 7 vezes a expansão do dia 0, no dia 7, respectivamente e 119 vs. 34 vezes a expansão a partir dia 0 no dia 10, respectivamente). No dia 10, o grupo de células T CD8 sujeitado a seleção positiva das células CD137+ foi dividido em dois grupos de teste. No primeiro grupo, as células continuaram a ser expandidas com IL-7 e IL-15 até o dia 14 (“CD137+ Anti-terceiro”), enquanto as células no segundo grupo de teste foram ativadas com PBMC de hospedeiro irradiada na presença de IL-7 e IL-15. Após 24h de ativação, as células CD137+ foram depletadas por separação magnética. As células CD137 depletadas foram então recolocadas em um alvéolo com IL-7 e IL-15 e cultivadas até dia 14 (“CD137+ Anti- terceiro e CD137- Anti-hospedeiro”).

[0346] Quando avaliada no dia 13, as células T CD8 do grupo teste submetido à seleção positiva de CD137+ continuaram a exibir potencial de expansão superior em comparação com o grupo de controle de referência em dois pontos (134 vs. 61 vezes a expansão, respectivamente).Em contraste, as células T CD8 do grupo de teste submetido à seleção positiva anti-terceiro de CD137+ e depleção de células CD137+ anti-hospedeiro, exibiu menor potencial de expansão quando avaliada no dia 14 (72 vezes a expansão) (Figura 27) indicando que a expansão da célula entre os dias 11 a 14 não poderia compensar a perda de células causada pela depleção das células T alorreativas específicas anti-hospedeiros CD137+.

[0347] Como mostrado na Figura 28, quando a expressão CD137 foi avaliada no dia 10, apenas 0,5% do total de compartimento de células T CD8 nas células T CD8 sujeitadas à seleção positiva das células CD137+ expressaram CD137+. Assim, as células T CD8 neste grupo diminuíram consideravelmente a expressão de CD137 (de 85% no dia 1 para apenas 0,5 no dia 10).

[0348] No entanto, após 24h de ativação com PBMC de hospedeiro irradiado (na proporção de 1 para 2, a favor da PBMC de hospedeiro), a porcentagem de células T CD8 expressando CD137+ do compartimento de células T CD8 totais aumentou para 16%. A depleção dessas células CD137+ por separação magnética diminuiu a porcentagem de células T CD8 expressando CD137 do compartimento total de células T CD8, de 16% para 3%.

[0349] Uma última análise de alorreatividade anti-hospedeiro residual foi realizada no dia 14, comparando o nível de células de retenção de CFSE com estimulação face à PBMC de hospedeiro por oposição de PBMC de terceiros na presença de IL-7.

[0350] Como mostrado na Figura 29, o número de células se dividindo especificamente após estimulação com PBMC de terceiros foi aproximadamente 3 vezes maior no grupo submetido ao CD137, seleção com base positiva e negativa em relação ao grupo de controle de referência (células divisoras 2259 vs.741, respectivamente). Mais importante ainda, a remoção de células CD137+ no final da cultura, impediu completamente a proliferação em resposta à PBMC de hospedeiro, em contraste com o grupo de controle de referência que exibiu proliferação detectável (134 células divisoras). Curiosamente, o grupo submetidos à seleção positiva das células ativadas face a terceiros sem remoção de clones anti-hospedeiros no final da cultura, exibiu maior nível reativo das células do hospedeiro em relação ao grupo de controle, indicando potencial reatividade cruzada entre os alótipos MHC de hospedeiro e estimuladores de terceiros (embora deliberadamente não correspondido pelo tipo HLA.) Assim, enquanto a importância da etapa de depleção anti-hospedeiro no final da cultura é claramente indicada, mais estudos são necessários para avaliar o papel potencial da primeira seleção positiva das células ativadas anti-terceiro.

[0351] No entanto, como mostrado na Tabela 5, acima, a depleção bem sucedida dos clones específicos anti-terceiro pela separação magnética em duas etapas com base em CD137, proporciona toda a recuperação celular inferior ao final da cultura (18% vs. 463%, representado como porcentagem dos números de entrada de células aderentes PBMC, respectivamente).

[0352] Coletivamente, este experimento preliminar indica que a depleção de alorreatividade pela separação magnética de duas etapas, com base no marcador de ativação CD137, é viável e pode ser incorporada no presente protocolo para gerar células Tcm alogênicas não reativas de hospedeiro. Atributos encorajadores indicados são: 1) os altos níveis de expressão induzidos por ativação alogênica com seleção positiva foram completamente diminuídos no dia 10, permitindo outra aloativação face aos antígenos do hospedeiro. 2) A composição celular e porcentagem de células Tcm não foram drasticamente afetadas pela separação magnética, com base no marcador de ativação CD137 de células. 3) A remoção de células CD137+ no final da cultura, impediu completamente a proliferação em resposta à PBMC de hospedeiro, em contraste com o grupo de controle de referência, que exibiu proliferação detectável (134 células divisoras). Estudos atuais incluem: 1) o uso de bloqueio FcR antes da etapa de seleção positiva. 2) O uso da DC de hospedeiro ao invés de PBMC para detecção mais eficaz das células reativas de hospedeiro no final da cultura. 3) A adição de mais marcadores de ativação disponíveis clinicamente como CD25 ou capturados de gama IFN para a etapa de depleção.

Conclusão:

[0353] O uso de depleção de CD137 no final da geração da Tcm pode permitir uma abordagem viável para depletar ainda mais estas células de alorreatividade.

[0354] As tentativas de continuar refinando o uso de depleção de CD137 em conjunto com depleção de CD25, ambas os quais estão disponíveis como reagentes GMP, são exploradas.

[0355] Além disso, são realizados experimentos para minimizar o potencial de reatividade cruzada utilizando APC artificial, tendo apenas um alelo HLA-I.

[0356] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com aplicações específicas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para aqueles especialistas na técnica. Nesse sentido, pretendem-se abraçar todas essas alternativas, modificações e variações que caem dentro do espírito e o vasto escopo das reivindicações em anexo.

[0357] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta especificação são incorporadas neste documento em sua totalidade pela especificação, da mesma forma como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse especifica e individualmente indicada para ser incorporada neste documento por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como técnica prévia para a presente invenção. Na medida em que os títulos de seção são utilizados, eles não devem ser interpretados como necessariamente limitantes. Legenda das Figuras Figura 1A T1) Ambiente Autólogo Humano T2) Alogênico - Doador T3) Hospedeiro T4) Respondedores - Células CD8+T T5) Estimuladores - Células Dentríticas (30Gy) T6) AutólogoCD8+Tcm T7) Auto - BM Figura 1B T8) Ambiente AutólogoHumano T9) Doador Alogênico T10) Terceiro - Doador T11) Respondedores - Células CD8+T Naturais T12) Estimuladores - Células Dentríticas (30Gy) T13) Alogênico - Tcm anti-terceiro CD8 T14) Hospedeiro T15) Alogênico - BM depletada T Figura 2A T16) Ambiente Singênico de Rato T17) Doador Singênico T18) Alogênico - Doador T19) Respondedores - Esplenócitos T20) Estimuladores - Esplenócitos (20 Gy) T21) Singênico CD8+Tcm T22) Hospedeiro T23) Singênico - BM depletada T Figura 2B T20) Estimuladores - Esplenócitos (20 Gy) T22) Hospedeiro T24) Ambiente Alogênico de Rato T25) DoadorAlogênico T26) Terceiro - Doador T27) Respondedores - Esplenócitos T28) Alogênico - Tcm anti-terceiro CD8+ T29) Alogênico - BM depletada T Figura 3A T30) Protocolo Autólogo Humano para geração de Tcm T31) TPBMCs de Doador Alogênico T32) Dia(-4) T33) Início da diferenciação de monócitos em relação ao DC imaturo (com coquetel de citocina: GM-CSF+IL-4) T34) Dia(-2) T35) Adição de meio com coquetel de citocinaGM-CSF+IL-4 T36) Dia(-1) T37) Adição de coquetel de citocina de Maturação DC: lps+IFNy+GM-CSF+IL-4 T38) Dia(0) T39) Colheita e irradiação de DC maduro T40) PMBCs de Doador Autólogo T41) Células aderidas depletadas (aderência em plástico durante a noite +IL- 7) T42) Depleção de células CD4+ E CD5G+ T43) Co-Cultura+IL-21 T44) Adição de meio comIL-7+ IL-15 + IL-21 sempre no segundo dia. T45) Dias (3-11) Figura 3B T46) Protocolo Singênico de Rato para geração de Tcm T47) Estimuladores - Esplenócitos de Doador Alogênico T48) Respondedores - Esplenócitos de Doador Singênico T49) Esplenócitos Irradiados T50) Co-cultura sob privação de citocina (por 60h) T51) Seleção positiva de células CD8+ T52) Adição de meio com IL-15 a cada dois dias T53) Seleção positiva de células CD62L+ T54) Dia(0) T55) Dia(2.5) T56) Dias(2.5-16) T57) Dia(16) Figura 21 T32) Dia(-4) T34) Dia(-2) T36) Dia(-1) T38) Dia(0) T40) PBMCs de DoadorAutólogo T41) Células aderidas depletadas (aderência em plástico durante a noite + IL- 7) T42) Depleção de células CD4+ e CD5G+ T43) Co-Cultura+IL-21 T44) Adição de meio com IL-7+ IL-15 + IL-21 sempre no segundo dia T45) Dias (3-11) T58) Protocolo Autólogo Humano para geração de Tcm T59) PMBCs de Doador Alogênico T60) Monócitos isolados (por aderência plástica - 3h a 37°C) Início da diferenciação de monócitos em relação ao DC imaturo (com coquetel de citocina: GM-CSF+IL-4) T61) Adição de meio com coquetel de citocina GM-CSF+IL-4 T62) Adição de coquetel de citona de maturação DC: LPS+IFNy+GM+CSF+IL-4 T63) Colheita e irração de DC maduro Figura 22 T32) Dia(-4) T34) Dia(-2) T36) Dia(-1) T38) Dia(0) T41) Células aderidas depletadas (aderência em plástico durante a noite + IL- 7) T43) Co-cultura+IL-21 T44) Adição de meio com IL-7+ IL-15 + IL-21 sempre no segundo dia T45) Dias (3-11) T60) Monócitos isolados (por aderência plástica - 3h a 37°C) Inicio da Diferenciação de monócitos em relação ao DC imaturo (com coquetel de citocina: GM-CSF + IL-4) T61) Adição de meio com coquetel de Citocina GM-CSF + IL-4) T62) Adição de meio com coquetel de citona de maturação DC: LPS+INFy+GM-CSF+IL-4 T63) Colheita e irradiação de DC maduro T64) Protocolo Alogênico Humano para geração de Tcm T65) Estimuladores - PBMCs de DoadorTerceiro T66) Respondedores - PMBCs de DoadorAlogênico T67) Depleção de células CD45RA+

Claims

1. Método de geração de uma população isolada de células, compreendendo células antiterceiros induzidas por não excerto contra hospedeiro (GVHD) tendo um fenótipo do linfócito T (Tcm) de memória central, as referidas células sendo células de indução de tolerância e/ ou dotadas de at iv idade antidoença e capazes de retornar aos gânglios linfáticos após transplante, caracterizado pelo fato de que compreende: a) tratar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) com um agente capaz de depletar células CD4+ e/ou CD56+ de forma a obter células T CD8+; b) contatar ditas células CD8+ com um antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21 por 12 horas a 5 dias para permitir o enriquecimento de células reativas a antígenos; e c) cultivar as referidas células resultantes da etapa (b) na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 em um ambiente livre de antígenos por 5 a 20 dias para permitir a proliferação de células compreendendo o referido fenótipo do linfócito T (Tcm) de memória central, gerando, assim, a população isolada de células.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente: depleção de células aderentes da referida PBMC antes da etapa (a) ou; selecionar células CD45RA+ e/ou CD45RO- após etapa (a) e antes da etapa (b); ou cultivar as referidas células resultantes da etapa (b) com um antígeno ou antígenos de terceiros na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 após a etapa (b) e antes da etapa (c); ou selecionar células ativadas após a etapa (b) e antes da etapa (c); ou depleção de células alorreativas após a etapa (c).

3. Método de geração de uma população isolada de células compreendendo células antiterceiros induzidas por não excerto contra hospedeiro (GVHD) tendo um fenótipo do linfócito T (Tcm) de memória central, as referidas células sendo células de indução de tolerância e/ou dotadas de atividade de enxerto contra leucemia (GVL) e capazes de retornar aos gânglios linfáticos após transplante, caracterizado pelo fato de que compreende: a) tratar as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) não aderentes com um agente capaz de depletar as células CD4+ e/ou CD56+ para obter células T CD8+; b) contatar as referidas células T CD8+ com células dendríticas de terceiros na presença de IL-21 por 12 horas a 5 dias para permitir o enriquecimento de células reativas a antígenos; c) cultivar as referidas células resultantes da etapa (b) com as referidas células dendríticas de terceiros na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 por 12 horas a 3 dias; e d) cultivar as referidas células resultantes da etapa (c) na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 em um ambiente livre de antígenos por 5 a 20 dias para permitir a proliferação de células compreendendo o referido fenótipo do linfócito T (Tcm) de memória central, gerando, assim, a população isolada de células.

4. Método de geração de uma população isolada de células compreendendo células antiterceiros induzidas por não excerto contra hospedeiro (GVHD) tendo o fenótipo do linfócito T (Tcm) de memória central, as referidas células sendo dotadas de atividade antidoença e capazes de retornar aos gânglios linfócitos após implantes, caracterizado pelo fato de compreende: a) tratar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) não aderentes com um agente capaz de depletar células CD4+ e/ ou CD56+ para obter células T CD8+; b) contatar as referidas células T CD8+ com células dendríticas não singênicas na presença de IL-21 por 12 horas a 5 dias para permitir o enriquecimento de células reativas a antígeno; c) cultivar as referidas células resultantes da etapa (b) com células dendríticas não singênicas na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 por 12 horas a 3 dias; e d) cultivar as referidas células resultantes da etapa (c) na presença de IL-21, IL-15 e IL-7 em um ambiente livre de antígenos por 5 a 20 dias para permitir a proliferação de células compreendendo o referido fenótipo do linfócito T (Tcm) de memória central, gerando, assim, a população isolada de células.

5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado por compreender, ainda: selecionar células CD45RA+ e/ ou CD45RO- após etapa (a) e antes da etapa (b); ou selecionar células ativadas após a etapa (b) e antes da etapa (c); ou depleção de células alorreativas após a etapa (d).

6. Método de acordo com a reivindicação 1, 3, ou 4, caracterizado pelo fato de que as células antiterceiros terem um fenótipo T de memória central são caracterizadas por compreenderem uma assinatura CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+ e, em que, pelo menos, 50% da população isolada de células serem células CD3+CD8+, das quais, pelo menos, 50% possuem a referida assinatura.

7. Composição, caracterizada por compreender uma população isolada de células compreendendo células antiterceiros induzidas por não excerto contra hospedeiro (GVHD), tendo um fenótipo do linfócito T (Tcm) de memória central, as referidas células sendo células de indução de tolerância e/ou dotadas de atividade antidoença e capazes de retornar aos gânglios linfáticos após transplante, em que as referidas células antiterceiros tendo um fenótipo T de memória central compreendem uma assinatura CD3+, CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45RO+; e em que pelo menos 50% da população isolada de células são células CD3+ CD8+ das quais pelo menos 50% têm a referida assinatura, geradas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Uso de quantidade terapeuticamente eficaz da composição compreendendo a população isolada de células como definida na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade específica, em que a doença é selecionada a partir do grupo que consiste de uma doença maligna, uma doença viral e uma doença autoimune.

9. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição compreendendo a população isolada de células como definida na reivindicação 7, caracterizado por ser na manufatura de um medicamento para tratamento de um indivíduo em necessidade de um transplante de célula ou tecido ou para tratamento de um indivíduo em necessidade de um transplante de célula hematopoiética imatura.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido transplante de célula ou tecido ser selecionado de um grupo consistindo de um fígado, um pâncreas, um baço, um rim, um coração, um pulmão, uma pele, um intestino e um órgão ou tecido linfoide/hematopoiético ou em que o referido transplante de célula ou tecido compreende células hematopoiéticas imaturas.

11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido transplante de célula ou tecido compreender um cotransplante de vários órgãos e, opcionalmente, em que o referido cotransplante compreende o transplante de células hematopoiéticas imaturas um órgão sólido e, opcionalmente, em que as referidas células hematopoiéticas imaturas e o referido órgão sólido são obtidos do mesmo doador e, opcionalmente, em que o referido transplante de célula ou tecido e a referida população isolada de células são derivadas do mesmo doador e, opcionalmente, em que o referido transplante de célula ou tecido é singênico com o indivíduo e a referida população isolada de células é não singênica com o indivíduo e, opcionalmente, em que o referido transplante de célula ou tecido é singênico com o indivíduo e a referida população isolada de células é singênica com o indivíduo.

12. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por as referidas células hematopoiéticas imaturas e pela referida população isolada de células serem derivadas do mesmo doador e, opcionalmente, em que o referido doador é não singênico com o indivíduo e, opcionalmente, em que as referidas células hematopoiéticas imaturas e a referida população isolada de células são derivadas do mesmo indivíduo.