JPH06209789A - 刺激リンパ球形質転換試験の実施方法 - Google Patents
刺激リンパ球形質転換試験の実施方法Info
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- JPH06209789A JPH06209789A JP5309635A JP30963593A JPH06209789A JP H06209789 A JPH06209789 A JP H06209789A JP 5309635 A JP5309635 A JP 5309635A JP 30963593 A JP30963593 A JP 30963593A JP H06209789 A JPH06209789 A JP H06209789A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】滅菌ヘパリン化サンプルの採取，培養培地への
全血または分離リンパ球の移植，細胞増殖刺激物質を含
有させた培養と対照培養によって構成される刺激リンパ
球形質転換試験において，インキュベーションは２５〜
４５℃の温度で２４〜１９２時間行い，以下の操作：イ
ンキュベーション終了時における遠心分離，赤血球の溶
解溶液中への再懸濁，ＤＮＡ染色，白血球懸濁液の等張
性水溶液による洗浄，得られた白血球懸濁液の遠心分
離，細胞の白血球溶解溶液中へのＤＮＡ特異的蛍光色素
の存在下における再懸濁，フローサイトメトリーを用い
るサンプルの分析の組合せからなることを特徴とする方
法。 【効果】臨床検査室での利用を可能にする簡便で再現性
の高い試験法を提供する。
全血または分離リンパ球の移植，細胞増殖刺激物質を含
有させた培養と対照培養によって構成される刺激リンパ
球形質転換試験において，インキュベーションは２５〜
４５℃の温度で２４〜１９２時間行い，以下の操作：イ
ンキュベーション終了時における遠心分離，赤血球の溶
解溶液中への再懸濁，ＤＮＡ染色，白血球懸濁液の等張
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るサンプルの分析の組合せからなることを特徴とする方
法。 【効果】臨床検査室での利用を可能にする簡便で再現性
の高い試験法を提供する。
Description
【０００１】本発明は，フローサイトメトリーによっ
て，刺激リンパ球形質転換試験（一般に，細胞形質転換
試験と呼ばれる）を実施する方法に関する。この方法
は，その簡便性と可転性により，複雑さと繊細さのため
に主として研究室で用いられている他の慣用方法とは異
なり，臨床的な使用に適している。
て，刺激リンパ球形質転換試験（一般に，細胞形質転換
試験と呼ばれる）を実施する方法に関する。この方法
は，その簡便性と可転性により，複雑さと繊細さのため
に主として研究室で用いられている他の慣用方法とは異
なり，臨床的な使用に適している。
【０００２】リンパ球の活性化または刺激は，よく知ら
れているように，抗原が感作リンパ球と反応した場合に
インビボで規則的に起こる過程のインビトロ相関現象と
いわれる。リンパ球形質転換の語は，１９６０年にＮｏ
ｗｅｌｌによって最初に使われ，その後，Ｈｉｒｓｃｈ
ｏｒｎが，小休止リンパ球がマイトジェン，フィトヘマ
グルチニン（ＰＨＡ）への暴露によりリンパ芽球に形質
転換する場合に起こる形態学的変化を記載するのに使用
している。幼若化とは，特異的マイトジェンおよび抗原
の両者による刺激下でのリンパ球培養において，幼若な
細胞に類似の大きな好ピロニン細胞の形成過程をいう。
リンパ球活性化は，免疫欠損，感染症，自己免疫疾患ま
たは腫瘍の患者の細胞性免疫の評価に一般に使用される
インビトロ技術である。マイトジェンとのインキュベー
ション後には，多くの複雑な生化学的現象が起こる。マ
イトジェンとは多数のリンパ球を刺激する物質であり，
抗原刺激の場合とは異なり，その場合に必要な前感作を
必要としない。生化学的現象としては，膜に関連する初
期現象，たとえばリン脂質合成の増進，２価陽イオンの
透過性の増大，アデニンサイクラーゼの活性化と同時に
細胞内ｃＡＭＰの増加がある。これに続いて直ちに，蛋
白質，ＲＮＡ，そして最終的にＤＮＡの合成が起こる。
この最後の現象，ＤＮＡ合成に続いて細胞分裂が起こ
り，それがリンパ球活性化に関する臨床的に重要な試験
の大部分の根拠である。便利さと習慣から，臨床免疫学
者は，リンパ球活性化のマーカーとして，初期の現象で
あるｃＡＭＰやリン脂質代謝の促進よりも，ＤＮＡ合成
を利用するようになっている。
れているように，抗原が感作リンパ球と反応した場合に
インビボで規則的に起こる過程のインビトロ相関現象と
いわれる。リンパ球形質転換の語は，１９６０年にＮｏ
ｗｅｌｌによって最初に使われ，その後，Ｈｉｒｓｃｈ
ｏｒｎが，小休止リンパ球がマイトジェン，フィトヘマ
グルチニン（ＰＨＡ）への暴露によりリンパ芽球に形質
転換する場合に起こる形態学的変化を記載するのに使用
している。幼若化とは，特異的マイトジェンおよび抗原
の両者による刺激下でのリンパ球培養において，幼若な
細胞に類似の大きな好ピロニン細胞の形成過程をいう。
リンパ球活性化は，免疫欠損，感染症，自己免疫疾患ま
たは腫瘍の患者の細胞性免疫の評価に一般に使用される
インビトロ技術である。マイトジェンとのインキュベー
ション後には，多くの複雑な生化学的現象が起こる。マ
イトジェンとは多数のリンパ球を刺激する物質であり，
抗原刺激の場合とは異なり，その場合に必要な前感作を
必要としない。生化学的現象としては，膜に関連する初
期現象，たとえばリン脂質合成の増進，２価陽イオンの
透過性の増大，アデニンサイクラーゼの活性化と同時に
細胞内ｃＡＭＰの増加がある。これに続いて直ちに，蛋
白質，ＲＮＡ，そして最終的にＤＮＡの合成が起こる。
この最後の現象，ＤＮＡ合成に続いて細胞分裂が起こ
り，それがリンパ球活性化に関する臨床的に重要な試験
の大部分の根拠である。便利さと習慣から，臨床免疫学
者は，リンパ球活性化のマーカーとして，初期の現象で
あるｃＡＭＰやリン脂質代謝の促進よりも，ＤＮＡ合成
を利用するようになっている。
【０００３】リンパ球形質転換は，最初，培養液中に存
在するリンパ芽球の百分率の形態学的試験によって評価
された。しかしながら，この方法は，結果の著しい変動
性と主観性のために，使用されなくなった。ＤＮＡ合成
のもっと正確な評価法として，現在では，合成時にＤＮ
Ａに取り込まれる放射性ヌクレオチド前駆体，トリチウ
ム化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）を用いる培養体のパルス
標識が行われている。取り込まれたトリチウム化チミジ
ンの量は，液体シンチレーション（ガンマーカウンタ
ー）によって測定される。この方法は，現在，大部分の
臨床免疫検査室で採用されている。シンチレーションカ
ウンターは，データを１分間あたりのカウント数（ｃｐ
ｍ）または消光を補正した１分間あたりの壊変（ｄｐ
ｍ）として供給され，これらがリンパ球応答の指標とし
て用いられる。データの表現には，刺激培養におけるｃ
ｐｍを対照培養のｃｐｍで割って，得られた結果は刺激
係数と呼ばれる。
在するリンパ芽球の百分率の形態学的試験によって評価
された。しかしながら，この方法は，結果の著しい変動
性と主観性のために，使用されなくなった。ＤＮＡ合成
のもっと正確な評価法として，現在では，合成時にＤＮ
Ａに取り込まれる放射性ヌクレオチド前駆体，トリチウ
ム化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）を用いる培養体のパルス
標識が行われている。取り込まれたトリチウム化チミジ
ンの量は，液体シンチレーション（ガンマーカウンタ
ー）によって測定される。この方法は，現在，大部分の
臨床免疫検査室で採用されている。シンチレーションカ
ウンターは，データを１分間あたりのカウント数（ｃｐ
ｍ）または消光を補正した１分間あたりの壊変（ｄｐ
ｍ）として供給され，これらがリンパ球応答の指標とし
て用いられる。データの表現には，刺激培養におけるｃ
ｐｍを対照培養のｃｐｍで割って，得られた結果は刺激
係数と呼ばれる。
【０００４】このような感度の高い試験系の結果には，
多くの変動条件が影響することは明らかである。このよ
うな変動条件には，培養液中の細胞数およびそれらの濃
度，培養ウエルの幾何学的形態，培養液への非リンパ細
胞および微生物の混入，マイトジェンの用量，インキュ
ベーション時間，ならびにリンパ球の分離および収穫に
用いられる方法が包含される。実用的かつ臨床的レベル
においては，臨床的に明らかな細胞免疫の欠損は絶対的
なことは稀で，したがってリンパ球活性化の量的な比が
極めて重要であることを考慮すれば，培養の持続時問お
よびマイトジェンの濃度がとくに重要である。これは，
正常対照群の応答を，リンパ球機能に変化がある患者群
の応答と比較する場合にとくにいえる。９６ウエルのプ
レート上での微量培養および半自動収穫系を用いれば，
マイトジェンおよび抗原の両者で刺激された培養体につ
いて，用量−反応および時間−反応カイネティックを決
定することは可能である。リンパ球機能に変化があれ
ば，用量−反応および時間−反応曲線の左方または右方
への移動によって確認できる。これらのシフトは，リン
パ球応答のための至適用量および至適時間を決定する。
このような詳細な分析を行わなければ，リンパ球応答の
部分的または微小な欠陥は検知できない場合が考えられ
る。単一の時間経過でまたは単一の刺激用量を用いて検
討された培養では，極めて不正確なことが多い。データ
の提示に際しての標準化を欠くことによる混乱も起こり
うる。刺激係数は比であり，したがって，マイトジェン
を含まない対照培養（分母として表されるｃｐｍ）に対
する変化からかなりの変動が生じうる。したがって，結
果は刺激培養のｃｐｍおよび刺激係数の両者で示すこと
が好ましい。
多くの変動条件が影響することは明らかである。このよ
うな変動条件には，培養液中の細胞数およびそれらの濃
度，培養ウエルの幾何学的形態，培養液への非リンパ細
胞および微生物の混入，マイトジェンの用量，インキュ
ベーション時間，ならびにリンパ球の分離および収穫に
用いられる方法が包含される。実用的かつ臨床的レベル
においては，臨床的に明らかな細胞免疫の欠損は絶対的
なことは稀で，したがってリンパ球活性化の量的な比が
極めて重要であることを考慮すれば，培養の持続時問お
よびマイトジェンの濃度がとくに重要である。これは，
正常対照群の応答を，リンパ球機能に変化がある患者群
の応答と比較する場合にとくにいえる。９６ウエルのプ
レート上での微量培養および半自動収穫系を用いれば，
マイトジェンおよび抗原の両者で刺激された培養体につ
いて，用量−反応および時間−反応カイネティックを決
定することは可能である。リンパ球機能に変化があれ
ば，用量−反応および時間−反応曲線の左方または右方
への移動によって確認できる。これらのシフトは，リン
パ球応答のための至適用量および至適時間を決定する。
このような詳細な分析を行わなければ，リンパ球応答の
部分的または微小な欠陥は検知できない場合が考えられ
る。単一の時間経過でまたは単一の刺激用量を用いて検
討された培養では，極めて不正確なことが多い。データ
の提示に際しての標準化を欠くことによる混乱も起こり
うる。刺激係数は比であり，したがって，マイトジェン
を含まない対照培養（分母として表されるｃｐｍ）に対
する変化からかなりの変動が生じうる。したがって，結
果は刺激培養のｃｐｍおよび刺激係数の両者で示すこと
が好ましい。
【０００５】最近，リンパ球の増殖の評価のために用意
される培養の微小化が進んでいる。試験管内での１ｍｌ
の培養から，特別の自動細胞捕集操作（ハーベスター）
の出現により事態はプレート上２００μｌの培養にまで
進展した。今日では，リンパ球を懸濁した２０μｌの懸
垂水滴中で培養し，それらをマイトジェン，抗原および
同種白血球で刺激することも可能である。増殖は，放射
標識培養体を単に濾紙のディスク上に配置した容器を用
い，これをついで洗浄し，シンチレーション計測（ブロ
ット）のために処理することで，トリチウム化チミジン
の取り込みによって測定できる。この方法には，１０分
の１の細胞（１０〜４０，０００）の使用および収穫技
術の単純化（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎのシステム）という二
重の利点がある。懸濁した２０μｌの懸垂水滴法は，リ
ンパ球の増殖に認められる各変化の性質を同定するため
に不可欠な多重因子実験の実施の必要性に対して実用的
な解決を与えるものである。懸垂水滴中での２０μｌ培
養はＴｅｒａｓａｋｉプレート中でヒトおよび動物リン
パ球を用いて容易に達成される。より大容量の培養に比
較して，この方法では，培養時のインキュベーター内部
の適当なｐＨおよび完全湿度の維持に莫大な注意を要求
する。当然に，細胞の収穫は極めて簡単である。６０×
２０μｌ培養のプレートの収穫には，ブロットの作成，
洗浄，処理で，２分間を要しない。したがって，この方
法は，多重因子実験を実施するための膨大な実験を可能
にする。この多重因子実験（濃度，時間，細胞数，同種
または異種血清，樹状細胞の添加，同種リンパ球の数
等）を実施できるのは，データの解析に必要な特殊な計
算技術の使用によるものである。
される培養の微小化が進んでいる。試験管内での１ｍｌ
の培養から，特別の自動細胞捕集操作（ハーベスター）
の出現により事態はプレート上２００μｌの培養にまで
進展した。今日では，リンパ球を懸濁した２０μｌの懸
垂水滴中で培養し，それらをマイトジェン，抗原および
同種白血球で刺激することも可能である。増殖は，放射
標識培養体を単に濾紙のディスク上に配置した容器を用
い，これをついで洗浄し，シンチレーション計測（ブロ
ット）のために処理することで，トリチウム化チミジン
の取り込みによって測定できる。この方法には，１０分
の１の細胞（１０〜４０，０００）の使用および収穫技
術の単純化（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎのシステム）という二
重の利点がある。懸濁した２０μｌの懸垂水滴法は，リ
ンパ球の増殖に認められる各変化の性質を同定するため
に不可欠な多重因子実験の実施の必要性に対して実用的
な解決を与えるものである。懸垂水滴中での２０μｌ培
養はＴｅｒａｓａｋｉプレート中でヒトおよび動物リン
パ球を用いて容易に達成される。より大容量の培養に比
較して，この方法では，培養時のインキュベーター内部
の適当なｐＨおよび完全湿度の維持に莫大な注意を要求
する。当然に，細胞の収穫は極めて簡単である。６０×
２０μｌ培養のプレートの収穫には，ブロットの作成，
洗浄，処理で，２分間を要しない。したがって，この方
法は，多重因子実験を実施するための膨大な実験を可能
にする。この多重因子実験（濃度，時間，細胞数，同種
または異種血清，樹状細胞の添加，同種リンパ球の数
等）を実施できるのは，データの解析に必要な特殊な計
算技術の使用によるものである。
【０００６】これらの慣用方法は完全に満足すべきもの
ではないことが明らかにされてきた。それらの実際的応
用は一連の欠点に直面することになったのである。実際
上，培養の微小化，収穫方法の洗練化，専用のソフトウ
ェアの利用が，刺激に対するリンパ球応答の理解をさら
に深めることを可能にしたという事実にもかかわらず，
それらの複雑さと微妙さは，慣用方法を，臨床的使用に
は全く不適当なものとし，研究室のみでの使用に留める
ことになっている。
ではないことが明らかにされてきた。それらの実際的応
用は一連の欠点に直面することになったのである。実際
上，培養の微小化，収穫方法の洗練化，専用のソフトウ
ェアの利用が，刺激に対するリンパ球応答の理解をさら
に深めることを可能にしたという事実にもかかわらず，
それらの複雑さと微妙さは，慣用方法を，臨床的使用に
は全く不適当なものとし，研究室のみでの使用に留める
ことになっている。
【０００７】本発明に従い，刺激リンパ球形質転換試験
をフローサイトメトリーにより実施する方法の採用は，
全く予期に反して，上述のすべての欠点を克服できるこ
と，しかも同時に，以下に詳述するような利点がさらに
得られることも明らかになったのである。
をフローサイトメトリーにより実施する方法の採用は，
全く予期に反して，上述のすべての欠点を克服できるこ
と，しかも同時に，以下に詳述するような利点がさらに
得られることも明らかになったのである。
【０００８】本発明は，滅菌ヘパリン化サンプルの採
取，培養培地への全血または分離リンパ球の移植，一方
には細胞増殖を生じる濃度の刺激物質を含有させる２種
の培養によって構成される滅菌インキュベーター中での
インキュベーションからなる刺激リンパ球形質転換試験
の実施方法において，インキュベーションは２５〜４５
℃の温度で２４〜１９２時間行うこと，および以下の操
作： −インキュベーション終了時における遠心分離， −赤血球の溶解溶液中への再懸濁， −ＤＮＡ染色， −白血球懸濁液の等張性水溶液による洗浄， −得られた白血球懸濁液の遠心分離， −細胞の白血球溶解溶液中へのＤＮＡ特異的蛍光色素の
存在下における再懸濁， −フローサイトメトリーを用いるサンプルの分析， の組合せからなることを特徴とする方法である。
取，培養培地への全血または分離リンパ球の移植，一方
には細胞増殖を生じる濃度の刺激物質を含有させる２種
の培養によって構成される滅菌インキュベーター中での
インキュベーションからなる刺激リンパ球形質転換試験
の実施方法において，インキュベーションは２５〜４５
℃の温度で２４〜１９２時間行うこと，および以下の操
作： −インキュベーション終了時における遠心分離， −赤血球の溶解溶液中への再懸濁， −ＤＮＡ染色， −白血球懸濁液の等張性水溶液による洗浄， −得られた白血球懸濁液の遠心分離， −細胞の白血球溶解溶液中へのＤＮＡ特異的蛍光色素の
存在下における再懸濁， −フローサイトメトリーを用いるサンプルの分析， の組合せからなることを特徴とする方法である。
【０００９】２５〜４５℃の温度での２４〜１９２時間
のインキュベーションはコルク栓を付した条件下に実施
することができる。また，変法として，コルク栓をしな
いで，気体交換を可能にする試薬を含有する培養培地
中，培養液を，湿度および二酸化炭素レベルが調整され
た滅菌インキュベーター中に取って実施することもでき
る。
のインキュベーションはコルク栓を付した条件下に実施
することができる。また，変法として，コルク栓をしな
いで，気体交換を可能にする試薬を含有する培養培地
中，培養液を，湿度および二酸化炭素レベルが調整され
た滅菌インキュベーター中に取って実施することもでき
る。
【００１０】細胞は白血球溶解溶液中に，ＤＮＡ特異的
蛍光色素の存在下，および所望により溶解を至適化する
試薬の存在下に再懸濁することができる。
蛍光色素の存在下，および所望により溶解を至適化する
試薬の存在下に再懸濁することができる。
【００１１】また，細胞は固定溶液中に再懸濁し，つい
で，ＤＮＡ蛍光色素を含有する溶液中で洗浄し，それに
再懸濁することができる。さらに他の方法として，細胞
は，蛍光色素に直接または間接的に接合した，検査すべ
き細胞集団に特異的なモノまたはポリクローナル抗体と
インキュベートし，ついで固定し，ＤＮＡ−特異的蛍光
色素を用いて染色することもできる。
で，ＤＮＡ蛍光色素を含有する溶液中で洗浄し，それに
再懸濁することができる。さらに他の方法として，細胞
は，蛍光色素に直接または間接的に接合した，検査すべ
き細胞集団に特異的なモノまたはポリクローナル抗体と
インキュベートし，ついで固定し，ＤＮＡ−特異的蛍光
色素を用いて染色することもできる。
【００１２】培養培地は１０％熱失活胎児ウシ血清およ
び１％グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０とし，この培
地を各培養あたり３ｍｌの量を使用することができる。
培養培地は新たに調製したものまたは凍結乾燥したもの
とすることができる。
び１％グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０とし，この培
地を各培養あたり３ｍｌの量を使用することができる。
培養培地は新たに調製したものまたは凍結乾燥したもの
とすることができる。
【００１３】刺激物質としては，たとえば，フィトヘマ
グルチニン（ＰＨＡ），コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）お
よびブタ草マイトジェン（ＰＷＭ）からなる群より選ぶ
ことができる。
グルチニン（ＰＨＡ），コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）お
よびブタ草マイトジェン（ＰＷＭ）からなる群より選ぶ
ことができる。
【００１４】赤血球溶解溶液はＮＨ４Ｃｌ８．２８ｇ／
ｌ，ＫＨＣＯ３１ｇ／ｌ，−または四ナトリウムＥＤＴ
Ａ０．０３７ｇ／ｌを含有する再蒸留水から構成するこ
とができる。
ｌ，ＫＨＣＯ３１ｇ／ｌ，−または四ナトリウムＥＤＴ
Ａ０．０３７ｇ／ｌを含有する再蒸留水から構成するこ
とができる。
【００１５】白血球溶解およびＤＮＡ染色溶液は，クエ
ン酸ナトリウム０．１％，界面活性剤”Ｎｏｎｉｄｅｔ
ＮＰ−４０”０．１％，およびヨー化プロピジウム５
０μｇ／ｍｌを含有する再蒸留水から構成することがで
きる。ヨー化プロピジウムの代わりにエチジウムブロミ
ド，ＤＡＰＩおよび類似の性質をもつ物質を用いること
もできる。
ン酸ナトリウム０．１％，界面活性剤”Ｎｏｎｉｄｅｔ
ＮＰ−４０”０．１％，およびヨー化プロピジウム５
０μｇ／ｍｌを含有する再蒸留水から構成することがで
きる。ヨー化プロピジウムの代わりにエチジウムブロミ
ド，ＤＡＰＩおよび類似の性質をもつ物質を用いること
もできる。
【００１６】固定溶液は，エチルアルコール５０％（ｖ
／ｖ）と等張性リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）５０％（ｖ／
ｖ）から構成し，ＤＮＡ染色溶液は等張性リン酸塩緩衝
液（ＰＢＳ）中ヨー化プロピジウム５０μｇ／ｍｌおよ
びリボヌクレアーゼＡｌｍｇ／ｍｌから構成することが
できる。
／ｖ）と等張性リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）５０％（ｖ／
ｖ）から構成し，ＤＮＡ染色溶液は等張性リン酸塩緩衝
液（ＰＢＳ）中ヨー化プロピジウム５０μｇ／ｍｌおよ
びリボヌクレアーゼＡｌｍｇ／ｍｌから構成することが
できる。
【００１７】本発明の方法は，生体から分離したのちの
ヒト体液に適用されるものであって，その体液は同じ生
体に戻されるものではないことに注意すべきである。さ
らに，本発明の方法は，それ自体では必要な処置を決定
することはできない，単なる中間的な結果を与える情報
を得ることを意図したものである。
ヒト体液に適用されるものであって，その体液は同じ生
体に戻されるものではないことに注意すべきである。さ
らに，本発明の方法は，それ自体では必要な処置を決定
することはできない，単なる中間的な結果を与える情報
を得ることを意図したものである。
【００１８】トリチウム化チミジンを用いる旧来の方法
に比較して，本発明の方法はさらに以下の利点を有す
る。 −試薬がはるかに安価である， −最終情報が質的に優れている（本発明の方法は，生物
学的現象に直接関連する結果を与える）， −放射性物質を使用しないことから，環境および作業
場，両者の安全が改良される， −培養液への異物の混入の危険が低い（培養容器を培養
中に開放する必要がない）， −方法は極めて単純で，再現性に富む， −結果は実質的に細胞数に依存しない， −全血培養である， −極めて少量の血液しか必要でない。
に比較して，本発明の方法はさらに以下の利点を有す
る。 −試薬がはるかに安価である， −最終情報が質的に優れている（本発明の方法は，生物
学的現象に直接関連する結果を与える）， −放射性物質を使用しないことから，環境および作業
場，両者の安全が改良される， −培養液への異物の混入の危険が低い（培養容器を培養
中に開放する必要がない）， −方法は極めて単純で，再現性に富む， −結果は実質的に細胞数に依存しない， −全血培養である， −極めて少量の血液しか必要でない。
【００１９】以上，本発明の−般的な性質について述べ
た。本発明の特定の実施態様である以下の実施例は，本
発明の目的，特性，利点および適用方法のさらに明瞭な
理解を可能にするために，さらに指標を提供するもので
ある。
た。本発明の特定の実施態様である以下の実施例は，本
発明の目的，特性，利点および適用方法のさらに明瞭な
理解を可能にするために，さらに指標を提供するもので
ある。
【００２０】実施例 本発明によるマイトジェンおよびフローサイトメトリー
を使用する刺激リンパ球形質転換の臨床的試験を実施す
るための市販キットを以下のようにして製造する。 １）１０％熱失活胎児ウシ血清および１％グルタミンを
含むＲＰＭＩ１６４Ｏ培養培地を含有する，ゴム栓付き
滅菌容器。培養培地は新たに調製しても，凍結乾燥され
ていてもよい。培地の容量は，凍結乾燥されている場合
は再構築して，各培養あたり３ｍｌとする。ゴム栓は針
で穿孔することができる。各試験毎に２個の培養容器が
提供され，その一方には，リンパ球の増殖を生じる濃度
のＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）も含有させる。リン
パ球機能のさらに完全な評価のためには，所望により，
他の市販パッケージに至適濃度のＣｏｎＡ（コンカバリ
ンＡ）およびＰＷＭ（ブタ草マイトジェン）を含有する
さらに２個の容器を付加することも可能である。
を使用する刺激リンパ球形質転換の臨床的試験を実施す
るための市販キットを以下のようにして製造する。 １）１０％熱失活胎児ウシ血清および１％グルタミンを
含むＲＰＭＩ１６４Ｏ培養培地を含有する，ゴム栓付き
滅菌容器。培養培地は新たに調製しても，凍結乾燥され
ていてもよい。培地の容量は，凍結乾燥されている場合
は再構築して，各培養あたり３ｍｌとする。ゴム栓は針
で穿孔することができる。各試験毎に２個の培養容器が
提供され，その一方には，リンパ球の増殖を生じる濃度
のＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）も含有させる。リン
パ球機能のさらに完全な評価のためには，所望により，
他の市販パッケージに至適濃度のＣｏｎＡ（コンカバリ
ンＡ）およびＰＷＭ（ブタ草マイトジェン）を含有する
さらに２個の容器を付加することも可能である。
【００２１】２）各培養あたり５ｍｌ量の赤血球溶解溶
液を得るための粉末または濃厚溶液を含有する容器。使
用される溶液は，ＮＨ４Ｃｌ８．２８ｇ／ｌ，ＫＨＣＯ
３１ｇ／ｌ，−または四ナトリウムＥＤＴＡ ０．０３
７ｇ／ｌを含有する再蒸留水から構成される。
液を得るための粉末または濃厚溶液を含有する容器。使
用される溶液は，ＮＨ４Ｃｌ８．２８ｇ／ｌ，ＫＨＣＯ
３１ｇ／ｌ，−または四ナトリウムＥＤＴＡ ０．０３
７ｇ／ｌを含有する再蒸留水から構成される。
【００２２】３）ＤＮＡ特異的蛍光色素を含有する低張
性白血球溶解溶液を得るための粉末または濃厚溶液を含
有する容器（または，一方は粉末，他方は濃厚溶液を含
有し，互いに混合するための２個の容器）。使用される
溶液は各培養あたり２ｍｌ量であり，クエン酸ナトリウ
ム０．１％，界面活性剤”Ｎｏｎｉｄｅｔ ＮＰ−４
０”０．１％，ヨー化プロピジウム５０μｇ／ｍｌを含
有する再蒸留水から構成される（他の蛍光染料の使用も
可能であり，サイトメーターの光源に応じて提供され
る）。
性白血球溶解溶液を得るための粉末または濃厚溶液を含
有する容器（または，一方は粉末，他方は濃厚溶液を含
有し，互いに混合するための２個の容器）。使用される
溶液は各培養あたり２ｍｌ量であり，クエン酸ナトリウ
ム０．１％，界面活性剤”Ｎｏｎｉｄｅｔ ＮＰ−４
０”０．１％，ヨー化プロピジウム５０μｇ／ｍｌを含
有する再蒸留水から構成される（他の蛍光染料の使用も
可能であり，サイトメーターの光源に応じて提供され
る）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カルロ ルミ イタリア国ローマ アールエム，ビア パ オルッチィデ カルボリ ５
Claims (13)
- 【請求項１】 滅菌ヘパリン化サンプルの採取，培養培
地への全血または分離リンパ球の移植，一方には細胞増
殖を生じる濃度の刺激物質を含有させる２種の培養によ
って構成される滅菌インキュベーター中でのインキュベ
ーションからなる刺激リンパ球形質転換試験の実施方法
において，インキュベーションは２５〜４５℃の温度で
２４〜１９２時間行うこと，および以下の操作： −インキュベーション終了時における遠心分離， −赤血球の溶解溶液中への再懸濁， −ＤＮＡ染色， −白血球懸濁液の等張性水溶液による洗浄， −得られた白血球懸濁液の遠心分離， −細胞の白血球溶解溶液中へのＤＮＡ特異的蛍光色素の
存在下における再懸濁，−フローサイトメトリーを用い
るサンプルの分折， の組合せからなることを特徴とする方法 - 【請求項２】 ２５〜４５℃の温度で２４〜１９２時間
のインキュベーションはコルク栓を付した条件下に実施
する「請求項１」に記載の方法 - 【請求項３】 ２５〜４５℃の温度で２４〜１９２時間
のインキュベーションは，コルク栓をしないで，気体交
換を可能にする試薬を含有する培養培地中，培養液を，
湿度および二酸化炭素レベルが調整された滅菌インキュ
ベーター中に取って実施する「請求項１」に記載の方法 - 【請求項４】 細胞は白血球溶解溶液中に，ＤＮＡ特異
的蛍光色素の存在下および溶解を至適化する試薬の存在
下に再懸濁する「請求項１〜３」に記載の方法 - 【請求項５】 細胞は固定溶液中に再懸濁し，ついで，
ＤＮＡ蛍光色素を含有する溶液中で洗浄し，それに再懸
濁する「請求項１〜３」に記載の方法 - 【請求項６】 細胞は，蛍光色素に直接または間接的に
接合した，検査すべき細胞集団に特異的なモノまたはポ
リクローナル抗体とインキュベートし，ついで固定し，
ＤＮＡ−特異的蛍光色素を用いて染色する「請求項１〜
３」に記載の方法 - 【請求項７】 培養培地は１０％熱失活胎児ウシ血清お
よび１％グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０である「請
求項１〜６」に記載の方法 - 【請求項８】 培養培地は新たに調製したかもしくは凍
結乾燥したものである「請求項７」に記載の方法 - 【請求項９】 刺激物質はフィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ），コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ），ブタ草マイトジェ
ン（ＰＷＭ）およびそれらの混合物からなる群より選ば
れる「請求項１〜８」のいずれかに記載の方法 - 【請求項１０】 赤血球溶解溶液はＮＨ４Ｃｌ８．２８
ｇ／ｌ，ＫＨＣＯ３１ｇ／ｌ，−または四ナトリウムＥ
ＤＴＡ ０．０３７ｇ／ｌを含有する再蒸留水から構成
される「請求項１〜９」のいずれかに記載の方法 - 【請求項１１】 白血球溶解およびＤＮＡ発色溶液はク
エン酸ナトリウム０．１％，界面活性剤”Ｎｏｎｉｄｅ
ｔ ＮＰ−４０”０．１％，およびヨー化プロピジウム
５０μｇ／ｍｌを含有する再蒸留水から構成される「請
求項４」に記載の方法 - 【請求項１２】 固定溶液はエチルアルコール５０％
（ｖ／ｖ） および等張性リン酸緩衝液（ＰＢＳ）５０
％（ｖ／ｖ）から構成され，ＤＮＡ染色溶液は等張性リ
ン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中ヨー化プロピジウム５０μｇ
／ｍｌおよびリボヌクレアーゼＡ１ｍｇ／ｍｌから構成
される「請求項５または６」に記載の方法 - 【請求項１３】 本明細書に記載，例示および請求され
た，フローサイトメトリーを用いる刺激リンパ球形質転
換試験の実施方法
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT92A000803 | 1992-11-05 | ||
| ITRM920803A IT1263256B (it) | 1992-11-05 | 1992-11-05 | Metodologia per la realizzazione di un saggio di laboratorio di trasformazione linfocitaria stimolata in citofluorimetria a flusso. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06209789A true JPH06209789A (ja) | 1994-08-02 |
Family
ID=11401274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5309635A Pending JPH06209789A (ja) | 1992-11-05 | 1993-11-04 | 刺激リンパ球形質転換試験の実施方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0596840A1 (ja) |
| JP (1) | JPH06209789A (ja) |
| CN (1) | CN1087948A (ja) |
| AU (1) | AU5048393A (ja) |
| IT (1) | IT1263256B (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU1533099A (en) * | 1998-08-25 | 2000-03-14 | Immune Response Corporation, The | Methods for evaluating immune function |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0294216A3 (en) * | 1987-06-05 | 1990-05-30 | Interferon Sciences, Inc. | A functional assay for t-lymphocytes |
-
1992
- 1992-11-05 IT ITRM920803A patent/IT1263256B/it active IP Right Grant
-
1993
- 1993-10-26 EP EP93830426A patent/EP0596840A1/en not_active Withdrawn
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