PT603107E - Processo para a quantificacao simultanea numa unica medicao dos principais tipos de linfocitos humanos e dos seus subconjuntos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

•'PROCESSO PARA A QUANTIFICAÇÃO SIMULTÂNEA, NUMA ÚNICA MEDIÇÃO, DOS PRINCIPAIS TIPOS DE LINFÓCITOS HUMANOS E DOS SEUS SUBCONJUNTOS"

Embora não exclusivamente, esta invenção está principalmente relacionada com um processo para a quantificação simultânea dos principais tipos de linfócitos humanos (células T, B e NK) e das suas subconjuntos (CD3+/CD4+, CD3+/CD8+, etc) até um total de 12 subpopulações linfóides por meio de uma única medição rápida, de baixo custo, eficiente, sensível e específica, capaz de ser analisada num citómetro de fluxo equipado com um único laser para investigação ou diagnóstico, prognóstico e fins terapêuticos.

Os linfócitos são as células responsáveis pela imunovigilância, assim como pela especificidade da defesa imunitária de seres humanos. A realização da determinação do fenótipo imunulógico das subpopulações linfóides, combinando o uso de anticorpos monoclonais e citometria de fluxo, fornece medidas objectivas e sensíveis tanto da distribuição das subpopulações linfóides como da sua intensidade de positividade para um determinado antigénio.

Ambos os tipos de informação rapidamente atraíram a atenção de profissionais de diferentes áreas da Medicina, tais como Biologia Celular, Imunologia e Hematologia, pois a medição dos diferentes derivados linfóides provou ser de elevado valor diagnóstico e prognóstico em diferentes condições patológicas.

De todas estas aplicações, uma cuja utilidade deve ser referida é a enumeração de subconjuntos CD4+ de células T em indivíduos que possuem anticorpos no soro contra o Vírus da Imunodeficência Humano (HIV), responsável pela Síndroma da 2

Imunodeficiência Adquirida (SIDA). Esta medida representa presentemente um dos critérios de prognóstico mais importantes que devem ser tidos em conta quando se analisa o progresso destes pacientes. A relevância clínica deste tipo de medições contribuiu em grande medida para o facto de, nos últimos anos, ter existido um enorme aumento na necessidade de processos de controlo de qualidade apropriados quando se analisam subpopulações de linfóides por citometria de fluxo, com o objectivo de eliminar artefactos técnicos que podem levar a resultados errados.

Como resultado destes estudos relacionados com a estandardização das medições das subconjuntos linfóides utilizando citometria de fluxo, vários grupos de investigação, associações científicas e instituições públicas publicaram documentos com recomendações e directrizes para serem cumpridas quando se realiza o fenotipificação imunológica dos linfócitos humanos por de citometria de fluxo. Estes documentos reconhecem a necessidade de identificação sistemática de: 1) a proporção e pureza dos linfócitos analisados, ou seja, a proporção de linfócitos não incluídos na análise, assim como a proporção dos casos analisados que correspondem a linfócitos; e 2) o número total de células T, Be NK, assim como de subconjuntos CD3+/CD4+ e CD3+/CD8+ de células T. Isto significa que um tem de ser painel mínimo de anticorpos monoclonais utilizado o que, por sua vez, significa que um grande número de medições tem que ser realizada por amostra.

Como exemplo, em 1982, o CDC (Center for Disease Control, EUA), recomendou a utilização de cinco medições diferentes combinando dois anticorpos monoclonais com diferentes fluorocromos para a enumeração das células T CD4+ em pacientes VHI+, para se atingir os dois objectivos mencionados anteriormente: 1) CD45/CD14 para o estudo da pureza e da proporção de linfócitos; 2) CD3/CD19 para a identificação do número total de linfócitos T (CD3+/CD19-) e o número total de linfócitos B (CD3-/CD19+); β ¥ Ê Lí

A 3) CD3/CD56 para a caracterização de células NK (CD56+/CD3-); 4) CD3/CD4 para a identificação de células T CD3+/CD4+, que estão relacionadas com as funções de ajuda/indução dentro do sistema imunitário; 5) CD3/CD8 para a identificação de células T CD3+/CD8+, que estão associadas com as funções imunológicas supressoras/citotóxicas.

Além disso, EP-A-0 219 309 revela um método de identificação de subpopulações das células do sangue que consiste em utilizar um anticorpo monoclonal específico para cada subpopulação, conjugado com um ou dois fluorocromos. Os diferentes anticorpos são distinguíveis por marcação dos anticorpos com diferentes quantidades de um ou de ambos os fluorocromos. Num exemplo ilustrativo, 7 subpopulações são identificadas utilizando 9 anticorpos monoclonais diferentes e dois fluorocromos (ver exemplo 8).

Até agora, não foi descrito qualquer processo que permita uma análise directa e simultânea do número total de populações T, B, NK, CD3+/CD4+ e CD3+/CD8+ numa única medição, eliminando a necessidade de realizar mais de cinco medições diferentes utilizando dez anticorpos monoclonais em combinações de duplo manchamento.

Desta forma, um dos objectivos desta invenção é propor uma solução para o estudo simultâneo, numa única medição, de 12 subconjuntos linfóides, incluindo todos os linfócitos T, B, NK, CD3+/CD4+ e CD3+/CD8+. Outro objectivo da invenção é a avaliação simultânea de contaminação por não linfócitos presentes nos elementos analisados. O processo desta invenção consiste na utilização de uma mistura de cinco anticorpos monoclonais conjugados com três fluorocromos diferentes: CD 19 e CD8 conjugados com fluorocromo (FL1), por exemplo isotiocianato de fluoresceína (FITC); CD3 e CD56 e/ou CD 16 conjugado com outro fluorocromo (FL2), como ficoeritrina (PE); e CD4 conjugados com um terceiro fluorocromo (FL3), como PerCP™ (proteína clorofila peridinina) tm ou TriColor™ (tandem ficoeritina/cianina 5 fluorocromo).

Assim, o método reenvidicado na presente invenção distingue-se de EP-A-0 219 309 pela utilização de apenas cinco anticorpos, que permitem identificar mais de cinco subpopulações diferentes. Além disso, os anticorpos são marcados com apenas um de três fluorocromos, enquanto no método de EP-A-0 219 309 têm de ser utilizados dois fluorocromos em quantidades que variam de forma a que cada anticorpo utilizado possa ser distinguido dos outros. A preparação das amostras, o manchamento das células com anticorpos monoclonais, a selecção dos linfócitos, assim como a calibração e o ajustamento do citometro de fluxo são realizados de acordo com métodos vastamente descritos e recomendados para a realização da imunofenotipificação de subpopulações linfóides.

Para a análise dos resultados e para a quantificação exacta de cada subpopulação, podem ser utilizados diferentes programas de software, dos quais o PAINT-A-GATEN PLUS tm foi especialmente útil. Na análise, tanto a negatividade/positividade como a intensidade de positividade para cada anticorpo monoclonal são tomadas em conta.

Uma explicação do processo para a análise dos resultados obtidos a partir das medições realizadas com o citómetro de fluxo é descrita em seguida.

Linfócitos B são a única população em grande números dos linfócitos FL1+ (CD 19+ ou CD8+) que não expressam as CD3 e CD56 (e/ou CD 16) (FL2), sendo assim, os únicos linfócitos FL1+/FL2 - quando se considera o espaço bidimensional FL1/FL2.

Adicionalmente, nas células T, B e NK, o antigénio CD 19 é específico para os linfóciots B, estando presente em todas estas células que, por sua vez, são CD8-.

Consequentemente, podemos postular que as células FL1+/FL2- correspondem ao número total de células B. A separação entre células T (FL2+ porque são CD3+) e células NK (FL2+ porque são CD56+ (e/ou CD16®) /CD3-) é claramente estabelecida quando é considerada a intensidade da fluorescência/célula do FL2. Tal deve-se ao facto de a intensidade da fluorescência de CD3 em linfócitos ser constantemente diferente da fluorescência de CD56 (e/ou CD 16) em células NK quando o mesmo fluorocromo é utilizado para a detecção de ambos os antigénios por citometria de fluxo, não havendo sobreposição entre estas duas populações linfóides no eixo, que neste caso reflete a quantidade de FL2.

Assim, quando FL1/FL2 é exclusivamente considerado o espaço bidimensional, são medidos os totais de células B (CD 19+ /CD3- /CD56- e/ou CD 16'), T (CD3+ /CD 19-/CD56 e/ou CD 16® + ou -) e NK (CD56+ (e/ou CD 16®) /CD3- /CD19-).

Além disso, permite-nos determinar a pureza dos linfócitos analisados, visto que a soma total das células CD19+, CD3+ e CD56+ (e/ou CD16") /CD3- representa o número total de linfócitos presentes na amostra analisada e assim os elementos CD 19-/CD3- /CD56- e/ou CD 16' são células não linfóides ou casuais. A formação da mancha com CD8-FL1 permite que outras subpopulações de células T e NK sejam identificadas: 1) linfócitos T CD3+ /CD8+; 2)linfócitos T CD3+ /CD8-; 3) células NK CD56+ (e/ou CD16+)/CD3-/CD8+; e 4) células NK CD56+ (e/ou CD16+) /CD3-/CD8-.

Além disso, em relação aos linfócitos T CD3+ /CD8+, as células T que expressam CD8 a baixa intensidade podem ser identificadas e separadas daquelas que exibem intensa expressão de CD 8. A formação da mancha com CD4 conjugada com um terceiro fluorocromo (FL3) permite a identificação do subconjunto de linfócitos T CD3+/CD4+ e a possível presença ou ausência na amostra de células CD3- /CD4+, que não têm o antigénio CD 19; as últimas células correspondem a contaminação por monócitos.

Finalmente, quando as reactividades para CD3, CD8 e CD4 são simultaneamente tidas em conta, outras duas subpopulações de células T são identificadas: 1) linfócitos T CD3+ /CD4- /CD8-; e 2) linfócitos T CD3+ /CD4+ /CD8+. A invenção pode ser utilizada tanto para amostras .normais como para amostras patológicas, para todas as finalidades em que é requerida, a análise de populações linfóides particularmente para fins de investigação, diagnóstico e prognóstico, assim como para avaliação terapêutica.

Como se pode concluir do que anteriormente foi explicado, os fluorocromos utilizados em FL1, FL2 e FL3 podem ser modificados. Além disso, comprende-se que esta invenção inclui variações que omitem uma terceira fluorescência, tais como as combinações CD19-FL1 /CD8-FL1CD3-FL2 CD56 (e/ou CD16) -FL2 e CD19-FL1 /CD4-FL1 /CD3-FL2 /CD56 (e/ou CD 16) -FL2.

Entre outras vantagens, com esta invenção obtém-se uma importante diminuição do tempo, dos custos e da variabilidade da análise das subpopulações linfóides.

Adicionalmente, deve ser tido em consideração que a sua capacidade de realizar esta combinação quíntupla fornece informações detalhadas sobre um total de 12 subpopulações linfóides, sendo este facto de grande interesse para que se determine sistematicamente a distribuição dos subconjuntos linfóides e o seu possível papel em diferentes condições patológicas. Além disso, permite a quantificação directa dos elementos não linfódes que estão presentes na análise. A invenção será ilustrada por meio do exemplo seguinte, que não é limitativo das suas possibilidades: EXEMPLO 1. Material e métodos.

Sangue periférico (SP) foi obtido de dez voluntários saudáveis na presença de EDTA líquido (K3) por punção venosa e mantido à temperatura ambiente até ser processado. A análise das subpopulações linfóides do SP foi realizada dentro de cinco horas, utilizando-se um sangue totalmente lisado e a técnica de imunofluorescência directa medidas por citometria.de fluxo. 2. Preparação da amostra.

Seis tubos de ensaio contendo 100 μΐ de SP e diferentes combinações de anticorpos monoclonais directamente conjugados obtidos de Becton/Dickinson (San José, CA, USA) foram preparadas por cada uma das amostras.

As especificidades das combinações dos anticorpos monoclonais utilizados foram as seguintes: 1) Hle-FICT (CD45)/LeuM3-PE (CD14)/Leu4-PerCDP (CD3); 2) Leu4-FITC (CD3)/Leu3a-PE (CD4); 3) Leu4-FITC (CD3)/Leu2a-PE (CD8); 4) Leu4-FITC (CD3)/Leul 2-PE (CD 19); 5) Leu4-FITC (CD3)/Leu 19-PE (CD56);

6) Leul2-FITC (CD19)/Leu2a-FITC (CD8)/Leu4-PE (CD3)/Leul9-PE (CD5 6)/Leu3 a-PerCP (CD4). O último tubo de ensaio foi denominado o tubo painel.

Para cada uma das amostras, foi utilizado como controlo negativo um tubo de ensaio contendo imunoglobulinas de rato com o mesmo isotipo de forma a estabelecer os cursores para a positividade.

Os tubos foram submetidos a agitação rotativa lenta e incubados à temperatura ambiente no escuro durante 10-15 minutos. Imediatamente após este período de incubação, foi adicionado a cada tubo 2ml de solução de lise FACS (Becton/Dickinson), seguida de 4-5 segundos de agitação. Depois, as células foram incubadas durante mais 8

10 minutos no escuro (temperatura ambiente). Seguidamente, as amostras foram centrifugadas a 300 g durante 5 minutos (4°C). O sobrenadante foi aspirado e o sedimento celular foi ressuspendido por agitação circular vigorosa (1-2 segundos). Depois, foi adicionado a cada tubo 1 ml de solução salina em tampão fosfato (PBS), contendo 1 g de albumina bovina (Sigma Chemicals, St Louis, MO, USA). Outra centrifugação foi então realizada (300 g, 5 minutos), sendo as células finalmente ressuspendidas em 0,5 ml de PBS, contendo 1 g de albumina bovina e armazenadas a 4°C até serem analisadas no citómetro de fluxo. 3.-Aquisição e análise de dados

Foram realizadas medições no citómetro de fluxo FACScan (Becton/Dickinson) equipado com um laser de iões árgon sintonizado 488 nm e 15m watt. O aparelho foi calibrado com esferas CALIBRITE (Becton/Dickinson) e linfócitos PB manchados em três tubos diferentes para: 1) CD3 (Leu4-PerCP) 2) CD4 (Leu3a-FITC)/CD8 (Leu2a-PE) 3) CD4 (Leu3a-FITC)/CD8 (Leu2a-PE=/CD3 (Leu4 proteína clorofila peridinina- )

Relativamente à calibração diária, uma separação idêntica foi obtida entre os picos de fluorescência das subpopulações linfóides positiva e negativa para FL1 (CD4-FITC), FL2 (CD8-PE positivo forte) e FL3 (CD3- proteína clorofila peridinina), sendo a variabilidade em todos os casos inferior a 1,5%. A análise foi realizada com o programa da software PAINT-A-GATE Plus, (Becton/Dickinson) utilizando a sua capacidade de transformação log de dispersão lateral (SSC) de forma a obter uma melhor separação entre as populações celulares identificadas por SSC/FSC (dispersão lateral/dispersão dianteira). A fim de estabelecer a porta ("gate") de linfócitos FSC/SSC ideal, o tubo de ensaio CD45-FITC/CD14-PE (LeucoGATE) foi utilizado de acordo com as directrizes previamente estabelecidas. 9

Em todos os casos, foram calculadas a percentagem de células CD45 negativas, CD 14 positivas e CD45-dim positivas, dentro da porta de linfócitos FSC/SSC assim como a percentagem de linfócitos não incluídos na porta. A percentagem de células positivas para cada antigénio foi calculada a partir da porta de linfócitos FSC/SSC seleccionada, sendo a soma das percentagens das células CD3+, CD 19+ e CD3-/CD56+ considerada como 100% dos linfócitos. A comparação das variáveis individuais foi realizada por meio da análise da variância (ANOVA) a um nível de significância de 5%. O teste de Fisher LSD foi utilizado para realizar as comparações entre dois grupos. Os coeficientes de correlação de Pearson foram calculados para a relação entre os resultados obtidos com o tubo PANEL e os resultados obtidos com os outros tubos ensaio para %CD3+,%CD19+, %CD3-/%CD56+, %CD3+/CD4+ e %CD3+/%CD8+.

Lisboa, i ft 1111 2000

Claims (6)

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Λ iL# REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a realização simultânea da quantificação, numa única medição, de 12 subpopulações linfóides B, T e NK, incluindo, entre outros, o número total de células B, T e NK, assim como subpopulações de células T CD3+/CD4+ e CD3+/CD8+, e a determinação da contaminação das células analisadas por monócitos e outros elementos não linfóides caracterizado pelo facto de inclui os passos: a) incubação da amostra com uma mistura de anticorpos monoclonais CD3, CD4, CD8, CD 19 e CD56 conjugados com três fluorocromos diferentes, sendo cada anticorpo monoclonal conjugado com um único fluorocromo; b) medição das três diferentes emissões fluorescentes por citometria de fluxo; e c) análise dos resultados obtidos, utilizando análise multiparamétrica para determinar a presença/ausência e a intensidade de fluorescência em cada célula de um determinado fluorocromo.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, no passo a), serem utilizadas amostras normais ou patológicas obtidas “in vivo” ou obtidas depois de ser guardadas ou tratadas “in vitro”.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, poder utilizar qualquer tipo de fluorocromo assim como qualquer tipo de anticorpo monoclonal dentro de cada agrupamento de diferenciação (AD).

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de anticorpos monoclonais CD8 e CD 19 serem conjugados com um fluorocromo (FL1); CD3 e CD56 serem conjugados com outro fluorocromo (FL2); e CD4 ser conjugado com um terceiro fluorocromo (FL3).

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o fluorocromo FL1 ser isotiocianato de fluoresceína; o fluorocromo FL2 picoeritrina e o fluorocromo FL3 ser proteína de clorofila Peridinina ou o tandem focoeritrina/cianina 5 fluorocromo.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a mancha para a identificação das células NK poder também ser obtida adicionando anticorpo monoclonal CD 16 com um fluorocromo idêntico ao de CD3 e CD56, ou por simples substituição de CD56 por CD16. Lisboa,

Dr. Américo da Silva Carvalho Agente Oíleid H j Prcprkdda Industrial R. Casíiiho, 201-5' E -1070 051 LISBOA Telefs. 213851339 - 2138546)3