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Die
Erfindung betrifft Triphenylphosphonium-Derivate sowie ihre Verwendung
zur gezielten Anreicherung und Freisetzung von Substanzen in Mitochondrien,
insbesondere um biologisch bzw. pharmakologisch wirksame Substanzen
in die Mitochondrien einzubringen sowie dort zur Entfaltung ihrer
Wirkung definiert anzureichern.
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Anwendung
finden diese Derivate beispielsweise bei der Induktion der Apoptose
in Krebszellen (Chemotherapie), zur Steigerung der mitochondrialen
Aktivität (z. B. oxidative Phosphorylierung) und damit
zur Verzögerung altersassoziierter Erkrankungen, wie z.
B. Diabetes mellitus Typ 2.
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Der
Prozess des Alterns ist im gesamten Tierreich mit einem Verfall
physiologischer Funktionen begleitet. Der Verlust von körperlicher
Ausdauer, Fitness sowie Regenerationsfähigkeit lässt
sich praktisch in allen Tierspezies feststellen und ist vermutlich
auf die Beeinträchtigung des mitochondrialen Energiestoffwechsels
zurückzuführen.
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Allgemeine
Alterungsprozesse, aber auch spezifische altersassoziierte Erkrankungen,
wie Krebs, Diabetes mellitus Typ 2, Übergewicht/Adipositas
sowie neurodegenerative Erkrankungen, stehen im engen Zusammenhang
mit einer verminderten Mitochondrienaktivität.
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Mitochondrien
sind faden- bis kugelförmige Zellorganellen. Sie bestehen
aus einer äußeren Hüllmembran und einer
inneren Membran. Ihre wichtigste Funktion ist Energiegewinnung durch
oxidative Phosphorylierung bei der Zellatmung. Mitochondrien kommen
verteilt im Cytosol (Zellplasma) einer eukaryotischen Zelle vor.
Ihre Größe beträgt etwa 0,5 μm
bis 10 μm in der Länge. Besonders viele Mitochondrien
finden sich in Zellen, die viel Energie verbrauchen (z. B. Muskelzellen,
Nervenzellen, Sinneszellen, Eizellen).
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Seit
Jahrzehnten kennt man aus Untersuchungen an verschiedenen Tierspezies
den Zusammenhang einer erhöhten Lebenserwartung mit einer
Kalorierestriktion (calorie restriction, CR). Als Ursache dieser
Lebensverlängerung vermutet man eine Reduktion von reaktiven
Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS).
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Diese
entstehen in der Atmungskette am Komplex I und III durch die so
genannten „electron leaks", Elektronen, die sich mit Sauerstoff
zu Radikalen verbinden. Sie können u. a. die mitochondriale
DNA schädigen und somit einen weiteren Verlust der Mitochondrienaktivität
verursachen. Die Kalorierestriktion, so die Hypothese, vermindert
die Atmungsketten-Aktivität durch den Mangel an Substrat
und führt so zu einer Verminderung von reaktiven Sauerstoffspezies.
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Andere
Modelle zeigen hingegen, dass eine Kalorierestriktion zu einer Aktivierung
der Mitochondrien führt. Dies kann durch hormonelle Faktoren,
durch so genannte „uncoupling" Proteine, bzw. durch eine
gesteigerte Aktivität und Effektivität der Atmungskette-Enzymkomplexe
verursacht werden. In diesem Fall geht man von einer Reduktion der
reaktiven Sauerstoffspezies aus.
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In
diesen gegensätzlichen Hypothesen stehen in beiden Fällen
neben der Atmungskette und dem Krebs-Zyklus alternative Wege zur
zellulären Energieproduktion im Zentrum der aktuellen Forschung.
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Als
Konsequenz wird zur Verminderung von reaktiven Sauerstoffspezies
vor allem die Einnahme von Antioxidantien empfohlen. Antioxidantien
wurden in einer Vielzahl von prospektiven Studien mit den oben genannten
Krankheiten assoziiert, positive Resultate waren jedoch die Ausnahme
(Halliwell, B.: Lancet 355, 2000, 1179–1180)
und neuere Analysen zeigen sogar eine Reduktion der Lebenserwartung
durch den übermäßigen Konsum von Antioxidantien
und Supplementen (Bjelakovic, JAMA 297, 2007, 842–57).
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Aus
pharmazeutischer Sicht bieten die Mitochondrien ein interessantes
Ziel für Medikamente. Mitochondrien führen eine
Vielzahl physiologischer Prozesse durch. Sie produzieren Adenosintriphosphat
(ATP), regulieren den intrazellulären Ca2+-Haushalt
und leiten den programmierten Zelltod (Apoptose) ein. Mitochondrien
benutzen ca. 90 % des aufgenommenen Sauerstoffs zur oxidativen Phosphorylierung
(OXPHOS) bzw. ATP-Synthese.
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Hierbei
werden Elektronen zum Sauerstoff transportiert. Dieser Elektronentransport
generiert einen Protonengradient, die treibende Kraft für
die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) aus Adenosindiphosphat
(ADP). So entsteht eine negative Potentialdifferenz von 150–180
mV in der inneren Membran, das so genannte mitochondriale Membranpotential.
Hieraus folgt, dass im Besonderen lipophile Kationen in der Lage sind,
sich im Inneren der Mitochondrien anzureichern.
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Die
Bemühungen, biologisch wirksame Substanzen wie z. B. Antioxidantien,
DNA oder Proteine in Mitochondrien einzuschleusen, werden unter
dem Begriff der mitochondrialen Medizin, bzw. des mitochondrialen Targeting
zusammengefasst (Weissig, V.: Expert Opin Drug Deliv 2,
2005, 89–102 oder Sheu, S. S., Nauduri, D. and Anders,
M. W.: Biochim Biophys Acta 1762, 2006, 256–265).
Hierbei wurden natürliche Antioxidantien kovalent an einen
positiv geladenen Triphenylphosphonium(TPP)-Rest gebunden. Neben
Vitamin E (MitoVit E) (Smith, R. A., Porteous, C. M., Coulter,
C. V. and Murphy, M. P.: Eur J Biochem 263, 1999, 709–716)
und einem Ubiquinonderivat (MitoQ) (Kelso, G. F., Porteous,
C. M., Coulter, C. V., Hughes, G., Porteous, W. K., Ledgerwood,
E. C., Smith, R. A., and Murphy, M. P.: J Biol Chem 276, 2001, 4588–4596)
wurden auch nichtnatürliche Antioxidantien an den TPP-Tag
gebunden, wie z. B. Ebselen (MitoPeroxidase) (Filipovska,
A., Kelso, G. F., Brown, S. E., Beer, S. M., Smith, R. A., and Murphy,
M. P.: J Biol Chem 280, 2005, 24113–24126), ein Glutathion-Peroxidase-Mimetikum
oder der Spin-Trap MitoPBN (Murphy, M. P., Echtay, K. S.,
Blaikie, F. H., Asin-Cayuela, J., Cocheme, H. M., Green, K., Buckingham,
J. A., Taylor, E. R., Hurrell, F., Hughes, G., Miwa, S., Cooper,
C. E., Svistunenko, D. A., Smith, R. A. and Brand, M. D.: J Biol
Chem 278, 2003, 48534-48545), vgl. auch 1.
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Es
konnte eine bis zu 1000fache Anreicherung dieser Verbindungen in
den Mitochondrien erzielt werden.
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In
all den genannten Studien wurde die aktive Verbindung kovalent und
damit dauerhaft an den Triphenylphosphonium-Tag (TPP-Tag) gebunden,
was zur Folge hat, dass die Verbindungen als Antioxidanz bzw. Kofaktor
wirken, jedoch nicht oder nur teilweise in ihrer natürlichen
Umgebung, wie zum Beispiel im Intermembranraum (James, A.
M., Cocheme, H. M., Smith, R. A., and Murphy, M. P.: J Biol Chem
280, 2005, 21295–21312). Daneben ist der Transport
mitochondrialer Stoffwechselprodukte streng reguliert, und eine
Anreicherung dieser Moleküle in den Mitochondrien ist kaum
möglich, ohne den Gesamtorganismus zu belasten.
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Darüber
hinaus ist bekannt, dass bestimmte pharmakologisch interessante
Wirkstoffe durch die äußere Hüllmembran
in Mitochondrien diffundieren und auf diese Weise dort aufgenommen
werden können (Galluzzi L. et al.: Oncogene 25,
2006, 4812–4830).
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Von
gravierendem Nachteil ist, dass alle diese Diffusionsprozesse "ungerichtet"
verlaufen und sowohl bezüglich der Einbringung der Wirkstoffe
als auch deren Freisetzung in den Mitochondrien so gut wie nicht
beeinflusst werden können und somit nicht steuerbar sind.
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Der
Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, Substanzen, insbesondere
pharmakologische Wirkstoffe, in weit größerer
Vielfalt definiert in Mitochondrien zu akkumulieren und dort gezielt
sowie mit hoher Spezifität und Effektivität, wie
auch ohne störende Nebeneffekte dieser Wirkstoffe, freizusetzen.
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Erfindungsgemäß werden
zur gezielten Anreicherung und Freisetzung von Substanzen in Mitochondrien
Triphenylphosphonium-Derivate gemäß der allgemeinen
Formel I
vorgeschlagen,
wobei
P = Phosphonium-Ion
n (1, 2, 3, ...) = Laufzahl
der Methylengruppe
R
1 = O-X
R
2 = CO-Y
R
3 =
NH-X
X = Säurefunktion und
Y = Alkohol, Amin,
Thiol
sind.
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Solche
Derivate sind beispielweise Triphenylphosphonium-Ester der Formel
II
oder der
Formel III
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Die
genannten Triphenylphosphonium-Derivate erlauben es, gebundene biologisch
aktive Substanzen in die Mitochondrien einzuschleusen und über
eine Aldehyd-Dehydrogenase-2(ALDH-2)-vermittelte Spaltung wieder
freizusetzen. Unter biologisch aktiven Substanzen werden Nährstoffe,
Antioxidantien, Protein-Agonisten und Protein-Antagonisten verstanden.
Die Nährstoffe werden unterteilt in die endogenen Metabolite
des mitochondrialen Stoffwechsels wie z. B. Verbindungen des Krebs-Zyklus
(alpha-Ketosäuren, Dikarbonsäuren) sowie in exogene
Verbindungen, die nicht ohne Transportsystem in die Mitochondrien
eindringen können, wie z. B. Oxalat und Palmitat.
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Mitochondrien
werden im Körper als Hauptquelle der reaktiven Sauerstoffspezies
(ROS) angesehen, daher scheint es sinnvoll, Radikalfänger
bzw. Antioxidantien dort gezielt anzureichern. Antioxidantien, wie
z. B. Tocopherole oder Liponsäure, können in den
Mitochondrien endogen nicht akkumuliert werden und sollen über
das hier beschriebene Transportsystem in die Mitochondrien gelangen.
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Triphenylphosphonium-Derivate
gemäß der allgemeinen Formel I sind somit in der
Lage, beliebige Moleküle in die Mitochondrien einzuschleusen.
Die Verbindungen können insbesondere Vorteile für
folgende Indikation bieten:
- a) Verwendung bei
genetischen Defekten im mitochondrialen Stoffwechsel:
Mitochondriopathien
zeichnen sich dadurch aus, dass es meist zu genetischen Defekten
in mitochondrialen Enzymen kommt, die zur Energiegewinnung essentiell
sind. Üblicherweise akkumulieren die Stoffwechselprodukte
Laktat oder Pyruvat im Plasma, was zu Azidosen fuhrt. Gleichzeitig
fehlen Stoffwechselprodukte, die durch den Mangel bzw. durch verminderte
Aktivität von Enzymen nicht produziert werden. Mit den
erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verbindungen können
diese Stoffwechselprodukte aufgefüllt werden, was die Bereitstellung
von Energie über die Mitochondrien gewährleisten
kann.
- b) Verwendung zur metabolischen Aktivierung der Mitochondrien:
Kofaktoren
dienen zur Aufrechterhaltung der mitochondrialen Enzymaktivität.
Hierzu zählen Thiamin, alpha-Liponsäure, Q10,
Vitamin E und andere. Der Transport dieser Verbindungen ist jedoch
streng reguliert, bzw. die Synthese erfolgt direkt in den Mitochondrein
(alpha-Liponsäure, Q10). Der Einsatz der Triphenyiphosphonium-Derivate
gemäß der allgemeinen Formel I kann den Mangel
an diesen Faktoren beheben und damit die volle Funktion dieser Enzyme
gewährleisten. Zu diesen Enzymen gehören unter
anderen die Pyruvatdehydrogenase (alpha-Liponsäure und
Thiamin), das 2-Ketoglutaratdehydrogenasesystem (alpha-Liponsäure)
sowie die Enzyme der Atmungskette (Q10).
- c) Verwendung zur Induktion der Apoptose von Krebszellen:
Der
programmierte Zelltod (Apoptose) hat oftmals seinen Ursprung in
den Mitochondrien. Der Organismus kann so kranke oder mutierte Zellen
eliminieren. In Krebszellen hingegen ist dieser Mechanismus unterbunden,
so dass es zu einer gesteigerten Proliferation und letztendlich
zu einem manifesten Tumor kommt. Durch den Einsatz der besagten
Verbindungen können Apoptose induzierende Chemotherapeutika
in die Mitochondrien eingeschleust werden und über die
Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies die Zelle in den Zelltod
treiben. Durch die Kopplung an den Triphenylphosphonium-Anker ist
es möglich, Chemotherapeutika in einer deutlich verminderten
Konzentration zu verabreichen und den Organismus dadurch weniger
zu stressen.
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Die
Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert werden.
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In
der Zeichnung zeigen:
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1: Dünnschichtchromatographische
Aufnahme der Inkubation von Mitochondrien mit einem Triphenylphosphonium-Ester
der Formel II bei unterschiedlichen Inkubationszeiten (vgl. Ausführungsbeispiel
3)
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2: Dünnschichtchromatographische
Aufnahme der Inkubation von Mitochondrien mit einem Triphenylphosphonium-Ester
der Formel II sowie Benomyl bei unterschiedlichen Inkubationszeiten
(vgl. ebenfalls Ausführungsbeispiel 3)
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Ausführungsbeispiel 1:
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Herstellung
von Triphenylphosphonium-Ester der Formel II
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Der
Triphenylphosphonium-Ester wird nach folgendem allgemeinen Reaktionsschema
A hergestellt: Reaktionsschema
A
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Verbindungen
der allgemeinen Formel V, in welcher X jeweils unabhängig
voneinander Chlor oder Brom ist, sind kommerziell erhältlich
(n = 1, X = Chlor) oder werden gemäß Schritt 1.
des vorstehenden Reaktionsschemas A (siehe auch Schmidt,
U. et al.: Angew. Chem. 96, 1984, 310-311) aus der Verbindung
der Allgemeinen Formel IV mit vorzugsweise einem Äquivalent
eines zyklischen Ethers (z. B. Oxetan; n = 2, Tetrahydrofuran; n
= 3) umgesetzt, um das Phosphoniumsalz zu erhalten. Die Reaktion
wird in einem aromatischen Lösungsmittel, wie z. B. Toluol,
Xylol oder Benzol, vorzugsweise Toluol (bei einer Temperatur zwischen
ca. 80°C und ca. 140°C), durchgeführt.
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In
einem zweiten Schritt des Reaktionsschemas A wird die Verbindung
der Formel V bei Raumtemperatur in einem polaren aprotischen Lösungsmittel,
wie z. B. Acetonitril (CH3CN), Dimthylsulfoxid (DMSO) oder N,N-Dimethylformamid
(DMF), gelöst, mit Carbonsäure versetzt und in
Gegenwart von 1,5 Äquivalenten einer Base, wie beispielsweise
Triethylamin, Diisopropyl-ethylamin (DIPEA) oder Dimethyl-aminopyridin
(DMAP), vorzugsweise DMAP und 1,2 Äquivalenten eines Kondensationsreagenz,
wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid
(DIC), 18 bis 24 Stunden gerührt.
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Der
Ausdruck "Carbonsäure", wie er hier verwendet wird, bezeichnet
eine natürlich oder nichtnatürlich vorkommende
aliphatische oder aromatische organische Säure, wie z.
B. alpha-Liponsäure, Palmitinsäure, 5-Aminolävulinsäure,
Lonidamine, Triiodthyronin, Thyroxin, Benzoesäure, Acetylsalicylsäure
und andere.
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Ausführungsbeispiel 2:
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Herstellung
von Triphenylphosphonium-Ester der Formel III
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Der
Triphenylphosphonium-Ester wird nach folgendem allgemeinen Reaktionsschema
B hergestellt: Reaktionsschema
B
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Eine
Verbindung der allgemeinen Formel VIII, in welcher X jeweils unabhängig
voneinander Chlor oder Brom ist, wird in einem ersten Schritt aus
einer Verbindung der allgemeinen Formel VII mit vorzugsweise einem Äquivalent
einer omega-bromierten Carbonsäure (z. B. 3-Bromopropionsäure;
n = 1,4-Bromobuttersäure; n = 2) umgesetzt, um das Phosphoniumsalz
zu erhalten (siehe auch
JP
2002338587 ). Die Reaktion wird in einem aromatischen Lösungsmittel,
wie z. B. Toluol, Xylol oder Benzol, vorzugsweise Toluol (bei einer
Temperatur zwischen ca. 80°C und ca. 140°C), durchgeführt.
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In
einem zweiten Schritt des Reaktionsschemas B wird die Verbindung
der Formel VIII bei Raumtemperatur in einem polaren aprotischen
Lösungsmittel, wie z. B. Acetonitril (CH3CN), Dimthylsulfoxid
(DMSO) oder N,N-Dimethylformamid (DMF), gelöst, mit Alkohol (Thiol/Amin)
versetzt und in Gegenwart von 1,5 Äquivalenten einer Base,
wie z. B. Triethylamin, Diisopropyl-ethylamin (DIPEA) oder Dimethyl-aminopyridin (DMAP),
vorzugsweise DMAP und 1,2 Äquivalenten eines Kondensationsreagenz,
wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diisopropylcarbodiimid
(DIC), 18 bis 24 Stunden gerührt.
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Der
Ausdruck "Alkohol (Thiol/Amin)", wie er hier verwendet wird, bezeichnet
natürlich oder nichtnatürlich vorkommende aliphatische
oder aromatische organische Alkohole, Thiole oder Amine, wie beispielsweise alpha-Tocopherol,
Tocotrienol, und andere.
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Ausführungsbeispiel 3:
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Gezielte
Freisetzung von biologisch aktiven Substanzen mittels mitochondrialer
Enzymsysteme am Beispiel des Triphenylphosphonium-Esters der Formel
II
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Zur
Demonstration der Wirkungsweise wurden Mitochondrien isoliert, indem
frische Schweineleber klein geschnitten und in einem 15 ml Dounce-Potter
zerkleinert wurde. Nachdem die Stücke homogenisiert worden
sind, wurde 10 min. zentrifugiert, und der Überstand verworfen.
Das Pellet (Mitochondrien-Fraktion) wurde mit 5 ml (2 × 2.5
ml) Puffer suspendiert, aliquotiert und für die Versuche
verwendet.
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Der
Triphenylphosphonium-Ester gemäß Formel II wurde
als Stocklösungen (ca. 10 mM) vorzugsweise in Dimethylsulfoxid
(DMSO) gelöst. In je einem 1 ml Probengefäß wurden
200 μl Succrose Puffer vorgelegt und je 10 μl
isolierte Mitochondrien hinzugegeben. 10 μl der Stocklösung
wurden dazu pipettiert und im Thermoschüttler bei 37 C
für 1, 5, 10, 15, 20, 30 und 60 Minuten inkubiert.
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Nach
der entsprechenden Zeit wurden jeweils 90 μl CH3Cl/MeOH dazugeben, 30 Sekunden geschüttelt
und 1 Minute bei 10 000 U/min zentrifugiert. Die obere Phase wurde
abpipettiert und verworfen. Ein Aliquot der organischen Phase ist
auf eine Dünnschichtfolie aufgetüpfelt und mit
CH3Cl/MeOH entwickelt. Die Folie wurde getrocknet
und mit Jod-Dampf angefärbt sowie digital gespeichert.
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1 zeigt als dünnschichtchromatographische
Aufnahme die Umsetzung des Substrats (Verbindung der Formel II)
durch mitochondriale Enzyme. Die Inkubation der Mitochondrien mit
dem Triphenylphosphonium-Ester der Formel II ist zu unterschiedlichen
Zeiten (in Minuten) dargestellt (K1 = Positiv-Kontrolle, K2 = Negativ-Kontrolle,
-OH = Triphenylphosphoniumbutanol mit organischer Phase). Nach 60
Minuten ist das Substrat vollständig umgesetzt.
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Der
Ursprung der mitochondrialen Esteraseaktivität konnte durch
die Wiederholung des Versuchs mit gleichzeitiger Inkubation mit
Benomyl (10 μM) geklärt werden. Benomyl ist ein
selektiver Inhibitor der ALDH-2.
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2 zeigt diese Inkubation (und vergleichsweise
zu 1) ebenfalls als dünnschichtchromatographische
Aufnahme wiederum in Darstellung zu unterschiedlichen Zeiten (K1
= Positiv-Kontrolle, K2 = Negativ-Kontrolle, -OH = Triphenylphosphoniumbutanol
mit organischer Phase).
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Aus 2 ist ersichtlich, dass hier der Triphenylphosphonium-Ester
der Formel II nicht umgesetzt wurde, was in diesem Fall auf eine
Inhibierung des Enzyms schließen lässt.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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