DE60121804T2

DE60121804T2 - Pharmazeutische zusammensetzung eines biguanin (metformin) und arginin

Info

Publication number: DE60121804T2
Application number: DE60121804T
Authority: DE
Inventors: Jean-Robert Rapin; Dominique Halbitte
Original assignee: Dospharma
Current assignee: Inopharm Maromme Fr
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2001-12-31
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2022-01-01
Also published as: CY1105736T1; US20070265349A1; ES2271103T3; PT1349578E; ATE333901T1; CA2435484A1; JP4477301B2; JP2004517105A; US7265156B2; FR2818906A1; DE60121804D1; DK1349578T3; ZA200207761B; FR2818906B1; US20040097399A1; WO2002053090A3; NZ527206A; WO2002053090A2; EP1349578B1; EP1349578A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine medizinische Kombination aus zwei Wirkstoffen, die zusammengenommen eine komplementäre und/oder synergistische Wirkung haben, wobei diese für die Behandlung von Diabetes und insbesondere Diabetes vom Typ 2 vorgesehen ist.
Der Begriff „komplementäre Wirkung" soll die pharmakologische Wirkung von zwei unterschiedlichen Verbindungen bezeichnen, die erlauben, dass sie auf die gleiche Pathologie über zwei entsprechend unterschiedliche pharmakologische Mechanismen wirken, beispielsweise die kombinierte Verwendung von zwei antidiabetischen Mitteln wie beispielsweise ein Biguanin und ein Sulfonylharnstoff.
Der Begriff „synergistische Wirkung" soll die pharmakologische Wirkung von zwei Verbindungen bezeichnen, die darin besteht, die Wirkung von wenigstens einer der Verbindungen zu potenzieren, beispielsweise die Potenzierung der Wirkung eines Biguanins oder Biguanids (in englischer Sprache), durch die Wirkung eines Transporters, wie er im Folgenden in der Erfindung beschrieben und vorgeschlagen ist.
Es ist bekannt, dass Metformin in der Form des Hydrochlorids das Medikament der ersten Wahl bei der Behandlung von Hyperglykämien und nicht-insulinabhängigem Diabetes ist. Dieses Metforminhydrochlorid wird alleine oder in Kombination mit einem Sulfonylharnstoff, einem alpha-Amylase-Inhibitor oder einem Glitazon verwendet.
Metforminhydrochlorid ist bei Ratten bei einer Dosis von 50 mg/kg in den herkömmlichen nicht-insulinabhängigen Diabetesmodellen, beispielsweise dem Streptozotozinmodell und dem Fruktosemodell wirksam.
Es weist eine niedrige Bioverfügbarkeit (60%) auf und sein Durchtritt in den Darm erfolgt bevorzugterweise auf der Ebene des Jejunums und des Ileums. Diese niedrige Bioverfügbarkeit erklärt die störende Nebenwirkung von Metformin, nämlich Diarrhöe.
Metformin ist ein sehr basisches Biguanin, das bei Darm-pH-Werten vollständig ionisiert ist. Sein Durchtritt umfasst daher ein physiologisches Transportersystem, das den bevorzugten Durchtritt erklärt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Nebenwirkungen von Metformin zu verringern und seine Bioverfügbarkeit zu erhöhen, indem auf dieses physiologische Transportersystem eingewirkt wird.
Überraschenderweise hat die vorliegende Erfindung gezeigt, dass, wenn mit Metformin verbunden, Arginin, das eine strukturelle Ähnlichkeit mit Biguanin aufweist und insbesondere mit einem N-Dimethylbiguanin, tatsächlich diese Rolle eines Transporters für Metformin aufweist. Unter den Transportern ist Arginin infolge seiner strukturellen Ähnlichkeit mit Metformin bevorzugt. Genauer aktiviert Arginin selbst seinen eigenen Übergang in den Darm (siehe 3). Zusätzlich ist Arginin der Vorläufer für die Synthese des Nitrosoradikals, NO, das als einer der potentesten Vasodilatoren sowohl bei Venen als auch Arterien und für seine hämodynamischen und hämorheologischen Eigenschaften bekannt ist. Diese für Arginin charakteristische Wirkung könnte für die Sekundärpathologien bei die Entwicklung von Diabetes vorteilhaft sein, nämlich Makroangiopathien, Mikroangiopathien, Neuropathien, Nephropathien und Retinitis von Diabetikern.
Gemäß dem Dokument „Marfella R. et al., Metformin improves hemodynamic and rheological responses to L-arginine in NIDDM patients, Diabetes care, 1996 Sept. 19(9) 934–9" ist ein Experiment beim Menschen außerhalb eines klinischen oder therapeutischen Protokolls beschrieben, das in der intravenösen Verabreichung (unter Infusion) einer Gesamtmenge von 30 g Arginin über 30 Min. besteht, was erheblich ist und bei der üblichen Therapie nicht erreicht werden kann.
Gemäß diesem Dokument ist gezeigt worden, dass die gleichzeitige Verabreichung von Metformin die hämodynamische und hämorheologische Wirkung von Arginin potenziert. Umgekehrt werden jedoch die therapeutischen Wirkungen, die spezifisch für Metformin sind, insbesondere die anti-hyperglykämischen Wirkungen, durch das Arginin nicht modifiziert. Diabetes Care, Band 19, S. 934–939 (Sept. 1996) zeigt die potenzierende Wirkung des mit Arginin co-verabreichten Metformins bei diabetischen Patienten. WO-9929314 offenbart Metforminsalze mit Hilfe von Fumar- oder Bernsteinsäure für die Behandlung von Diabetes.
Somit haben die gemäß der Erfindung bei experimentellen Diabetesmodellen erhaltenen Ergebnisse gezeigt, dass aktive Verbindungen von Metformin, die in ihrer Struktur einen Argininrest enthalten, in der Lage waren, die Bioverfügbarkeit des Metformins in unerwarteter Weise zu erhöhen, indem seine Wirkungen gegen Hyperglykämie potenziert wurden, die das Hauptsymptom von Diabetes ist.
Alle bei der Behandlung von Diabetes derzeit verwendeten oder in der Entwicklung befindlichen Biguanine zeigen die oben angeführten Nebenwirkungen und Bioverfügbarkeitsprobleme.
FR 2696740 zeigt das Metforminderivat N-Dimethyl-N'-diacetyltartroylbiguanin-Hydrochlorid.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine medizinische Zusammensetzung für die Behandlung von Diabetes, insbesondere Diabetes vom Typ 2, die ein Biguanin, insbesondere ein N-Dimethylbiguanin, als ein erstes Medikament, und einen Transporter für dieses Biguanin, als ein zweites Medikament, kombiniert, wobei die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine aktive Verbindung mit der allgemeinen Formel A'---V'---C' ist, die in der Lage ist, mindestens das Biguanin durch In-vivo-Spaltung der entsprechenden Bindung zwischen A' und V' wieder herzustellen, wobei:

– V eine biogene Transportmittelverbindung mit der allgemeinen Formel X-R-Y ist, wobei
– R eine aliphatische, zyklische oder alizyklische, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette aus 2 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die optional mit C1- bis C5-Alkylgruppen und/oder Hydroxylgruppen substituiert ist,
– X und Y jeweils eine freie Säure-, Amin- oder Alkoholfunktion ist,
– A das Biguanin und C das Arginin ist, wobei A eine chemische Funktion umfasst, die komplementär ist zur Funktion X, die in der Lage ist, mit der letzteren zu reagieren, um eine in vivo spaltbare ionische A'---V'- oder kovalente A'-V'-Bindung zu ergeben.

C ist mit der biogenen Transportmittelverbindung V unter Verwendung einer Acylierungsreaktion verbunden. Die Erfindung betrifft auch eine aktive Verbindung, wie sie oben definiert ist, wobei das Biguanin A das Metformin ist.
Die Erfindung betrifft auch eine aktive Verbindung, wie sie im Folgenden definiert ist, wobei A das Metformin ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Metformin mit der biogenen Transportmittelverbindung verbunden ist durch Salzbildung der terminalen primären Aminfunktion des Metformins.
Die Erfindung betrifft auch eine aktive Verbindung, wie sie oben definiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass V ausgewählt ist aus der Gruppe von Dicarbonsäuren bestehend aus Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Korksäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Äpfelsäure, Isatinsäure und Phthalsäure, und bevorzugterweise Bernsteinsäure ist.
Die Erfindung betrifft im gleichen Maße eine aktive Verbindung der Formel III
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Verbindung, wie oben definiert, als Medikament.
Sie betrifft insbesondere die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel A'---V'---C', wie oben definiert, als Medikament.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer aktiven Verbindung gemäß der Erfindung umfassend die folgenden Schritte:

a) eine Kondensationsreaktion und/oder Salzbildung der biogenen Transportmittelverbindung V mit dem Biguanin A,
b) die Kondensationsreaktion des Produktes der Reaktion gemäß (a) mit Arginin C oder a') Kondensationsreaktion der biogenen Transportmittelverbindung V mit Arginin C b') Kondensationsreaktion und/oder Salzbildung der kondensierten biogenen Transportmittelverbindung, die aus der Reaktion gemäß (a') mit dem Biguanin A erhalten ist.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die wenigstens eine Verbindung gemäß der Erfindung zusammen mit einem oder mehreren Vehikeln, Verdünnungsmitteln, Bindemitteln oder Adjuvanzien enthält, die kompatibel und pharmazeutisch akzeptabel sind.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung wie oben definiert, die eine tägliche Dosierung beim Menschen, die zwischen 0,2 g und 1 g der aktiven Verbindung umfasst, in einer oder mehreren Dosen anzupassen erlaubt.
Bei der anti-diabetischen oder anti-hyperglykämischen Indikation kann eine medizinische Zusammensetzung (oder ein therapeutischer Behandlungs-„Kit") der Erfindung und insbesondere eine aktive Verbindung mit der Formel A'---V'---C', wie oben definiert, mit einem anderen anti-hyperglykämischen Agens verbunden sein, wie beispielsweise einem Sulfonylharnstoff.
Unter „Biguanin" (oder „Biguanid") versteht man insbesondere N-Dimethylbiguanine, substituiert oder nicht-substituiert, und beispielsweise Metformin, aber auch andere pharmazeutische Verbindungen, beispielsweise Buformin und Fenformin.
Bevorzugterweise ist das Biguanin Metformin.
Unter „gleichzeitiger Verabreichung" versteht man die Verabreichung zweier Wirkstoffe bei einer einzelnen Einnahme, wobei verstanden wird, dass die gleichzeitige Verabreichung die Freisetzung der zwei Wirkstoffe im Organismus gleichzeitig oder sequenziell erlaubt.
Unter „biogen" versteht man eine chemische Verbindung natürlichen oder nicht-natürlichen Ursprungs und/oder eine metabolisierbar und/oder biologisch abbaubare und/oder beim Menschen oder Tier bei einer physioloischen Dosis atoxische Verbindung.
Unter „Transporter" versteht man ein Molekül oder eine Substanz, die den Übergang eines anderen Moleküls über eine Barriere erlaubt, entweder unter Ausbildung einer Bindung oder unter Ausbildung keiner Bindung, durch Aktivierung des Transportsystems, beispielsweise durch Proteininduktion, Aktivierung der Sauerstoff-abhängigen ATPase-Systeme oder durch Substanzaustausch.
Insbesondere versteht man unter Transporter hierin ein jegliches Molekül oder eine jegliche Verbindung, die erlaubt, dass der Durchtritt eines Biguanins, wie beispielsweise Metformin, potenziert und deshalb der Transport in das Jejunum erleichtert wird.
Für die Implementierung einer medizinischen Kombination wie oben definiert können verschiedene Verabreichungslösungen ins Auge gefasst werden, wie beispielsweise:

– eine pharmazeutische Formulierung oder Darstellung, die es erlaubt, in einer einzelnen Dosis, das Biguanin und den Transporter zu verabreichen
– oder zwei entsprechend unterschiedliche pharmazeutische Darstellungen, die es ermöglichen, in einer geeigneten Verpackung, gleichzeitig und jeweils eine Dosis Biguanin und eine Dosis des Transporters zu verabreichen. Dies wird bewerkstelligt, indem eine aktive Verbindung mit der allgemeinen Formel A'---V'---C' verwendet wird, die in der Lage ist, wenigstens das Biguanin A durch in-vivo-Spaltung der entsprechenden Bindung zwischen A' und V' wieder herzustellen, wobei
– V eine biogene Transportmittelverbindung mit der allgemeinen Formel X-R-Y ist, wobei
– R eine aliphatische, zyklische oder alizyklische, gesättigte oder nicht-gesättigte und optional mit C1- bis C5-Alkylgruppen und/oder Hydroxylgruppen substituierte Kohlenwasserstoffkette mit zwei bis 10 Kohlenstoffatomen ist,
– X und Y jeweils eine freie Säure-, Amin- oder Alkoholgruppe ist, A das Biguanin und C das Arginin ist, A eine chemische Funktion umfasst, die komplementär zur Funktion X ist, die in der Lage ist, mit letzterer zu reagieren, um eine in vivo spaltbare ionische A'---V'- oder kovalente A'-V'-Bindung zu ergeben, C mit der biogenen Transportmittelverbindung V durch eine Acylierungsreaktion verbunden ist.

Man versteht hierin unter „in-vivo-Spaltung" alle Formen von chemischer Hydrolyse, die in vivo beobachtet werden können, beispielsweise Säurehydrolyse und die enzymatischen Hydrolysen, beispielsweise durch Amidasen oder Esterasen.
Unter „komplementärer chemischer Funktion" versteht man eine jegliche chemisch Funktion, die in der Lage ist, mit einer freien oder terminalen Funktion der biogenen Verbindung zu reagieren. Beispielsweise muss V eine Funktion umfassen, die mit A (Biguanin) reagiert, und eine Funktion, die mit C (Arginin) reagiert. Somit ist, wenn A und C jeweils eine Säurefunktion tragen, V ein Diamin, ein Dialkohol oder ein Alkoholamin, um entsprechend ein Amid, einen Ester oder ein Salz auszubilden. Somit ist, wenn A und C jeweils eine Aminfunktion tragen, V eine Dicarbonsäure, um Amid oder ein Salz auszubilden. Wenn A und C jeweils eine Alkoholfunktion tragen, ist V eine Dicarbonsäure, um einen Diester auszubilden. Mit diesem Prinzip sind alle Zusammensetzungen möglich. Entsprechend ist, wenn A eine Säurefunktion und C eine Alkoholfunktion aufweist, V beispielsweise ein Alkoholamin, um mit der Säurefunktion von A zu reagieren, um ein Amid, einen Ester oder ein Salz zu ergeben, und um mit der Alkoholfunktion von C zu reagieren, um einen Ester zu ergeben.
Unter „kovalenten Bindungen" versteht man hierin chemische Bindungen, die in der Lage sind, durch sogenannte komplementäre chemische Funktionen zwischen der biogenen Transportmittelverbindung V und den Wirkstoffen A (Biguanin) und C (Arginin) ausgebildet zu werden.
Unter „ionischen Bindungen" versteht man hierin Bindungen durch elektrostatische Kraft, die ausgebildet werden können durch sogenannte komplementäre chemische Funktionen zwischen der biogenen Transportmittelverbindung V und den Wirkstoffen A (Biguanin) und C Arginin, somit Bindungen von der Art von Säuresalzen, von Aminsalzen, von Alkoholaten und Säure/Base, wobei dies unabhängig von dem molaren Anteil ist, der zwischen der Verbindung V und dem Wirkstoff A oder C existiert, der einem durch die besagten ionischen Bindungen ausgebildeten Komplex angehört.
Unter „in vivo spaltbarer Bindung" versteht man eine jegliche Bindung, die die Freisetzung oder Wiederherstellung der Wirkstoffe A Biguanin und C (Arginin) und der biogenen Transportmittelverbindung V, in vivo, durch Spalten der ionischen oder kovalenten Bindungen zwischen den komplementären chemischen Funktionen von A und V erlaubt.
Die spaltbaren kovalenten Bindungen werden durch die Wirkung der in dem in-vivo-Medium der Freisetzungsstelle vorhandenen Enzyme gespalten. Diese kovalenten Bindungen sind Amidbindungen oder Esterbindungen, die bei dieser Spaltung involvierten Enzyme sind Amidasen, Esterasen und Hydrolasen. Diese Enzyme sind insbesondere im Verdauungstrakt (orale Verabreichung) vorhanden, vorherrschend in der Leber, im Blut und potentiell in den Zielorganen.
Amidasen, die die Bindung -CO-NH- hydrolysieren, finden sich in der Leber, sie sind wenig aktiv; daher wird eine nachhaltige Wirkung mit der Verbindung gemäß der Erfindung erwartet, die eine derartige Bindung trägt. Unter den Amidasen sind einige bekannt; es handelt sich dabei um Endopeptidasen, die die gamma-Amin- oder gamma-Säurebindungen hydrolysieren. Gemäß der Erfindung kann V in der Tat eine gamma-Aminosäure sein, mit einer zweiten Säure- oder Aminfunktion an der Position gamma (beispielsweise im Falle von Glutaminsäure oder Lysin).
Esterasen, die die Bindung -CO-O- hydrolysieren, sind sehr zahlreich in lebenden Organismen. Sie sind jedoch ubiquitär und sehr wenig spezifisch für ein Substrat, daher eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit mit einer schnellen Freisetzung der Bestandteile A (Biguanin), V, C (Arginin) der aktiven Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung. Diejenigen, die für ein Substrat am spezifischsten sind, tragen den Namen dieses Substrates und als solche kann man beispielsweise die Cholinesterasen oder die Procainesterasen erwähnen.
Die Hydrolasen hydrolysieren auch Ester und alle großen Moleküle, die dem Organismus in Form von Lebensmitteln zugeführt werden. Diese Hydrolasen sind zahlreich und auch ubiquitär. Sie werden jedoch gleichwohl für die verwendete biogene Transportmittelverbindung V spezifisch sein.
Als Spaltungsenzyme, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, kann man die proteolytischen Enzyme wie beispielsweise Pepsin, Trypsin, Katalasen, Endo- und Exopeptidasen anführen. In gleichem Maße nützlich sind Amylasen und Osidasen und schließlich Lipasen und Beta-Oxygenasen für den Abbau von Lipiden.
Diese Enzyme sind nur beteiligt, wenn die Struktur der biogenen Transportmittelverbindung eine oder mehrere Bindungen umfasst, die für die Spaltung empfindlich sind. Beispielsweise wirkt die Lipase, wenn die biogene Transportmittelverbindung eine langkettige Dicarbonsäure ist (8 bis 10 Kohlenstoffatome, vergleichbar mit einer Fettsäure) und die Bindung A-V oder V-C durch Kondensation mit einer sekundären Alkoholfunktion von A oder von C erhalten ist.
Die ionischen Bindungen, die gespalten werden können, werden als eine Funktion ihrer Freisetzungsstelle gespalten, beispielsweise dem Darm, der Leber, dem Plasma oder dem Zielorgan, wobei verstanden wird, dass die Säure-, Aminsalze oder Alkoholate im Allgemeinen bei den pH-Werten der Medien lebender Organismen ionisiert vorliegen. Im Allgemeinen liegt der pH zwischen 2 und 8 und beträgt beispielsweise 2 für den Magen und beispielsweise 6 für den Darm.
Es liegt entsprechend eine Ionisierung der aktiven Verbindung der Erfindung als eine Funktion des verwendeten Salzes und eine Dissoziation der aktiven Verbindung vor, wenn die letztere wenigstens eine ionische Bindung umfasst. Das Salz ist ausgewählt als eine Funktion ihrer Dissoziationskonstanten und des pH der in-vivo-Freisetzungsstelle. Beispielsweise wird für eine Dissoziation im Magen ein Salz einer schwachen Säure und einer starken Basen ausgewählt.
Die Auswahl der biogenen Transportmittelverbindung und insbesondere die Auswahl ihrer freien Funktionen X und Y wird gemäß der Natur der freien und komplementären chemischen Funktionen, die in oder auf den Wirkstoffen (Biguanid und Arginin) vorhanden sind, die transportiert werden sollen, d. h. durch kovalente oder ionische Bindung an diese biogene Transportmittelverbindung gebunden werden, aber auch gemäß den ausgewählten Spaltungs- und Freisetzungsstellen vorgenommen. Diese biogene Transportmittelverbindung ist ein Produkt natürlichen oder nicht-natürlichen Ursprungs und/oder metabolisierbar und/oder biologisch abbaubar und/oder atoxisch bei physiologischen Dosen für Menschen oder Tiere. Diese biogene Transportmittelverbindung wird ausgewählt aus biologisch getesteten und beschriebenen Verbindungen, beispielsweise gamma-Aminosäuren, die an der Proteinsynthese beteiligt sind, Dicarbonsäuren, die beim Krebszyklus beteiligt sind, Ethanolamine, die Bestandteile von Zellmembranen sind, die metabolisierbar und atoxisch sind, und in der Lage sind, selbst oder ihre Metabolite in die großen biologischen Lebenszyklen integriert zu werden. Beispielhaft kann man als eine biogene Transportmittelverbindung Bernsteinsäure anführen, die im Krebszyklus gefunden wird, oder Methyl-Bernsteinsäure, die zur Bernsteinsäure abgebaut wird.
Die aufrechterhaltenen Bindungen zwischen der biogenen Transportmittelverbindung und den gemäß der vorliegenden Erfindung kombinierten Wirkstoffen, d. h. Biguanid und Transporter, hängen von den möglichen Metabolismen des Gastrointestinaltraktes und der Leber ab.
Beispielsweise können die Salze im Verdauungstrakt dissoziierbar sein, die Hydrolyse könnte unter Verwendung von gastrointestinal resistenten pharmazeutischen Formulierungen verzögert sein. Die Ester werden im sauren Milieu hydrolysiert oder durch die Esterasen der Darmsäfte hydrolysiert, wobei die Hydrolyse möglicherweise auch unter Verwendung von gastro-resistenten pharmazeutischen Formulierungen verzögert ist. Die Amide werden vermittels der Leberamidasen hydrolysiert, wobei die Kinetik dieser Hydrolysen im Allgemeinen langsam ist.
Verschiedene Tests können durchgeführt werden, um die Zugängigkeit der Bindungen A'---V' und V'---C' für die Spaltung und die entsprechende Freisetzung der Wirkstoffe A (Biguanin) und C (Arginin) in vivo zu evaluieren. Diese Tests bestehen z.B. darin, die Freisetzung der Wirkstoffe in einem Darmsaft zu beobachten oder den Lebermetabolismus an primären Ratten-Hepatozytenkulturen zu studieren. Diese zwei Tests werden im Folgenden beschrieben.
In vitro-Test für die Spaltung in einem Darmsaft.
Man verwendet ein Präparat eines Darmsaftes, der Trypsin, Peptidasen, Lipase, Amylase und alle anderen Enzyme des exokrinen Pankreas enthält. Dieser Test wird zuvor mit Kalibrierungsverbindungen validiert. Eine bekannte Menge (im Größenordnungsbereich von einem Mikrogramm) der Verbindung A'V'C' wird zu einer bekannten Menge Darmsaft gegeben (von dem der Gehalt an Trypsin und Lipase kontrolliert ist). Die Reaktionsmischung wird bei 37°C für eine Stunde gehalten. Diese Zeit ist kompatibel mit dem Übertritt in den Darm. Proben werden alle 15 Min. genommen und die Produkte A und C werden nachgewiesen und ihre Konzentration durch HPLC bestimmt, die mit einem UV-Detektor oder einem Massenspektrometer gekoppelt ist, sofern es nicht möglich ist, UV zu verwenden. Die verwendeten Säulen hängen von der Natur von A und C ab, sind aber infolge der Anwesenheit von freigesetzten Säure-, Amin- oder Alkoholformen im Allgemeinen Ionenaustauschersäulen. Nach Kalibrierung bestimmt man die Gesamtmenge von A (Biguanin) oder von C (Arginin), die innerhalb 1 Std. freigesetzt wird, und die Zwischenpunkte erlauben es, die Dissoziationskonstanten Km und die Geschwindigkeit Vmax der Enzyme für die verwendete aktive Verbindung A'V'C' zu bestimmen. Dieser Test kann mit einer Bestimmung der Freisetzung von A (Biguanin), C (Arginin) und V in dem Darmsaft unter Verwendung genau des gleichen Prinzips gekoppelt sein, wobei aber der Darmsaft durch Magensaft ersetzt ist.
In-vitro-Test an primären Ratten-Hepatozytenkulturen.
Man verwendet eine Primärkultur von Ratten-Hepatozyten, die für Metabolismusstudien nahe an jenen des Menschen sind, in einem HEPES-Medium, zu dem eine bekannte Menge der Verbindung A'V'C' im Größenordnungsbereich von einem Mikrogramm hinzugegeben ist. Die Produkte werden für 6 Stunden in Kontakt belassen und Proben nach 1, 2 und 4 Stunden genommen, von denen der Überstand isoliert wird und die Hepatozyten im Pellet lysiert werden. In diesen Medien werden die Konzentrationen der freigesetzten Wirkstoffe A (Biguanin) und C (Arginin) gemessen. Wie zuvor ist es möglich, Vmax und Km der am Metabolismus beteiligten Enzyme zu bestimmen.
Wenn die Verbindungen der Erfindung nicht über die Zellmembranen treten, kann die gleiche Art von Studie an Rattenleber-Homogenaten durchgeführt werden.
Die mögliche Toxizität der biogenen Transportmittelverbindung steht in Beziehung mit der der aktiven Verbindung (A'V'C') gemäß der Erfindung. Da diese aktive Verbindung zu A (Biguanin), C (Arginin) und V metabolisiert wird und V eine Substanz ist, die per definitionem biologisch ist, muss die Toxizität der Verbindung gemäß der Erfindung vergleichbar sein der Summe der Toxizitäten bei der Verabreichung des Biguanins A und des Arginins C. Zusätzlich kann, wenn die aktive Verbindung zwei Wirkstoffe kombiniert mit einer, unter diesen Bedingungen, zumindest für einen Wirkstoff höheren Wirksamkeit als der des gleichen Wirkstoffes alleine, die Verbindung als weniger toxisch betrachtet werden. Trotzdem wird im Folgenden ein Verfahren zum Vorhersagen der Toxizität, alternativ zu den standardmäßigen in-vivo-Verfahren, vorgeschlagen, um die Toxizität von A und von C und von A'---V'---C' bei gleichen Konzentrationen ausgedrückt als A oder als C zu vergleichen (siehe Toxicologic Emergencies, 6. Ausgabe 1997, Goldfranck et al. Appleton and Lange, Connecticut, USA).
In-vitro-Toxizitätstest
Es wird ein Verfahren zum Kultivieren von primären Hepatozyten über eine Zeitspanne von 96 Stunden verwendet (siehe Biochemical Pharmacology, Bd. 50, 1995, S. 775–780). Die Hepatozyten werden in situ durch Kollagenase-Perfusion isoliert. Sie werden dann in ein Williams-Medium gegeben, das mit fötalem Kälberserum, mit Cortisol und Glutamin supplementiert ist, in einer Menge von 1 Million Zellen pro Napf. Steigende und toxische Konzentrationen von A (Biguanin) und C (Arginin) und von A'---V'---C' werden zu einem jeden Napf hinzugegeben. Proben werden nach 6 Std., 12 Std., 24 Std., 48 Std. und 96 Std. genommen und die Lebensfähigkeit der Zellen durch einen Methylenblautest, durch Albuminexpression, durch Hepatozyten-Apoptose und durch Messen der Aktivität der Zytochrome P450 bestimmt.
Die mittels des Methylenblautests bestimmte Lebensfähigkeit der Zellen ergibt Ergebnisse ähnlich jenen, die mit einer LD₅₀ erhalten werden.
Die durch Albuminexpression erhaltenen Ergebnisse erlauben, die Toleranzgrenzen der Hepatozyten gegenüber einer jeglichen toxischen Substanz in Erfahrung zu bringen (Endtoxizität). In der Tat ist eine der Hauptaufgaben der Hepatozyten die Synthese von Proteinen. Während einer toxischen Wirkung wird die Expression der Albuminsynthese und -freisetzung modifiziert.
Die durch Hepatozyten-Apoptose erhaltenen Ergebnisse erlauben, die Endtoxizität zu bestimmen, da während eines Kontaktes mit einer toxischen Substanz die Zellen ihre Zerstörung programmieren werden, was dem Phänomen der Apoptose entspricht, die durch die anormale DNA gemessen wird.
Die Messung der Aktivität der Zytochrome P450 dokumentiert die Phänomene der Induktion und Inhibierung dieser Enzyme, wie sie oft bei pharmakologisch aktiven Produkten angetroffen wird. Eine Testserie erlaubt, die Aktivität der Isoformen der Zytochrome P450 zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft:

– A ist das Metformin in der oben angeführten allgemeinen Formel, das Metformin ist mit der biogenen Transportmittelverbindung V durch Salzbildung der terminalen primären Aminfunktion des Metformins verbunden
– C ist das Arginin in der oben angeführten allgemeinen Formel, das Arginin ist mit der biogenen Transportmittelverbindung V durch eine Acylierungsreaktion verbunden
– V, in der oben angeführten allgemeinen Formel, ist ausgewählt aus der Gruppe von Dicarbonsäuren, die Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Korksäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Äpfelsäure, Isatinsäure und Phthalsäure umfasst und ist bevorzugterweise Bernsteinsäure.

Die Erfindung betrifft auch, als Medikament, die Verbindung der Formel III.
Die Erfindung betrifft auch eine jegliche pharmazeutische Zusammensetzung, die eine aktive Verbindung wie oben definiert umfasst, in Verbindung mit einem oder mehreren kompatiblen und pharmazeutisch akzeptablen Vehikeln, Verdünnungsmitteln, Bindemitteln oder Adjuvanzien. Bevorzugterweise erlaubt es eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung, eine tägliche Dosierung beim Menschen zwischen 0,2 g und 1 g von einem jeden der Wirkstoffe (Biguanin und Transporter) einzustellen, mit einer oder mehreren Einnahmen. Beispielsweise können gastro-resistente pharmazeutische Formulierungen verwendet werden, um eine Hydrolyse im Magen zu vermeiden.
Bevorzugterweise kann eine aktive Verbindung wie oben definiert am Ende der folgenden Schritte erhalten werden:

– Kondensationsreaktion und/oder Salzbildung der biogenen Transportmittelverbindung (V) mit dem Biguanin A
– Kondensationsreaktion der kondensierten biogenen Verbindung, die mit Arginin C erhalten ist

Herkömmlicherweise sind die Kondensationsreaktionen, die verwendet werden können, Amin-Acylierungsreaktionen und Alkoholveresterungen.

– Wenn wenigstens einer (A oder C) der Wirkstoffe (Biguanin oder Arginin) mit der biogenen Transportmittelverbindung V durch eine Salzbildungsreaktion verbunden ist, wird die Abfolge der Durchführung der Reaktionen bevorzugterweise die Kondensationsreaktion und dann die Salzbildungsreaktion aus Gründen der Stabilität der Salze als Funktion des pHs, wie den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt ist, umfassen.

Wenn A Metformin, C Arginin und V Bernsteinsäure ist, umfasst das Herstellungsverfahren die folgenden Schritte:

– Reaktion des Monochlorid-Monoesters der Bernsteinsäure in Lösung in Äther oder in Benzen mit Arginin in wässriger Lösung in Natriumkarbonat.
– Freisetzung der Metforminbase aus dem Hydrochlorid in konzentriertem Natriumhydroxydmedium und Extraktion mit absolutem Alkohol.
– Ausbildung des Arginin-Hemisuccinimids mit Metformin.

Bevorzugterweise liegen die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung in einer Form vor, die für die orale, parenterale oder intravenöse Verabreichung geeignet ist.
Die Erfindung betrifft spezieller die Verwendung von wenigstens einer aktiven Verbindung, wie oben beschrieben, um Medikamente zu erhalten, die für die Behandlung von Diabetes in all ihren Formen und/oder für die Behandlung von Erkrankungen des Kreislaufsystems, unabhängig davon, ob diese Erkrankungen mit Diabetes verbunden sind, bestimmt sind.
Die vorliegende Erfindung wird nun beispielhaft unter Bezugnahme auf die Kombination von Metformin (Biguanin) und Arginin (Transporter) in einer nämlichen aktiven Verbindung A'V'C' beschrieben, wobei V Bernsteinsäure ist, die, einerseits, kovalent mit einer Aminfunktion des Arginins und andererseits ionisch (Salzbildungsreaktion) mit einer Aminfunktion des Metformins reagiert.
Synthese des Argininhemisuccinimids-Metforminhemisuccinats
a) Erster Schritt: Herstellung des Arginin-Hemisuccinimids.
Argininbase (6 g) wird in 120 ml einer wässrigen Lösung von Natriumkarbonat (N = 10,6 g/100 ml) gelöst. Weiterhin wird Bernsteinsäure-Monochlorid-Monoester in 50 ml Thioether mit einem geringen Überschuss von Bernsteinsäure-Monochlorid-Monoester für eine Reaktion verdünnt, die Mol für Mol bezüglich Arginin ist. Die etherische Lösung wird zu der wässrigen Lösung in 10 Minuten unter kräftigem Rühren bei Raumtemperatur hinzugegeben. Die Reaktionsflüssigkeit wird unter kräftigem Rühren für eine Stunde gehalten, während sie langsam für ein vollständiges Abdestillieren des Äthers aufgeheizt wird. Man verdampft bis zur Trockne und der Rückstand mit einem minimalen Volumen destillierten Wassers (20 ml) aufgenommen und mit verdünnter Salzsäure angesäuert. Durch Konzentrieren (leichtes Erhitzen unter Teilvakuum) werden weiße Kristalle von Argininhemisuccinimid erhalten.
Die Verifizierung des NMR-Spektrums, der Zentesimalanalyse und der Reinheit des Produktes durch Dünnschicht-Chromatographie werden vorgenommen. Insbesondere wird die Anwesenheit des Arginin-Aminosäurerestes verifiziert durch die Ninhydrin-Reaktion und die Gegenwart des freien Carboxyls der Bernsteinsäure durch Titrimetrie bestimmt.
Die Ausbeute ist quantitativ.
b) Zweiter Schritt: Freisetzung der Metforminbase.
10 Gramm von Metformin-Hydrochlorid werden zu 40 ml einer 5 N Natriumhydroxidlösung hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wird für zwei Stunden auf 40°C erhitzt. Nach Verdampfen unter Vakuum bei 40°C wird der viskose Rückstand mit 100 ml absolutem Alkohol aufgenommen. Eine Filtration erlaubt die Beseitigung von Verunreinigungen und ein unlöslicher Rest von Natriumchlorid bleibt. Die Metforminbase liegt in alkoholischer Lösung vor und wird, durch Verdampfung, in der Form eines viskosen Pulvers isoliert. Das NMR-Spektrum bestätigt die Struktur des Metformins. Die Abwesenheit von Chlorid wird mit Silbernitrat verifiziert.
Es sei daran erinnert, dass Metformin, d.h. N,N-Dimethylimidodicarbonimid-Diamid identisch mit der Nummer 5792 im MERCK-Index und unter der Nummer 657-24-9 von Chemical Abstracts charakterisiert ist.
c) Dritter Schritt
Die Metforminbase wird, Mol für Mol, zu einer wässrigen Lösung von Argininhemisuccinimid hinzugegeben. Es wird eine sofortige Auflösung erhalten.
Das Wasser wird vollständig bei 60°C unter Vakuum abdestilliert. Der Rest wird in destilliertem Wasser erneut aufgelöst und kristallisiert während der Konzentrierung unter Vakuum.
Es werden durchscheinende Kristalle, die in Wasser löslich und in organischen Lösungsmitteln unlöslich sind, erhalten. Der Schmelzpunkt beträgt 188–189°C.
Das NMR-Spektrum, die Zentesimalanalyse und die Anwesenheit eines einzelnen Punktes nach Dünnschicht-Chromatographie bestätigen die Struktur und Reinheit des Produktes. Die Gesamtausbeute ist quantitativ.
Nach den obigen Reaktionen ist die Ausbeute nahezu 90%. Die Verluste stammen aus den Reinigungen und Filtrationen.
Die von Arginin, von Metformin und von dem Argininhemisuccinimidsalz mit dem Metformin entwickelten Formen sind in den 1 bis 3 gezeigt.
Spaltungstest:
Dieser Test wird durchgeführt gemäß dem oben beschriebenen in-vitro-Verfahren in einem Darmsaft gemäß dem beschriebenen in-vitro-Toxizitätstest. Man beobachtet eine unmittelbare Freisetzung des Metformins ohne Modifikation des Argininhemisuccinimid-Teils. Ein zweiter Test wird an einer Ratten-Hepatozytenkultur gemäß dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt. Man beobachtet eine langsame Freisetzung von Arginin über 24 Stunden.
Toxizität:
Dieser Test wird durchgeführt gemäß dem oben beschriebenen in-vitro-Toxizitätstest. Die toxische Dosis wird mit dem Metformin bei 10^–2 M beobachtet und sie ist identisch für die aktive Verbindung A'-V'-B', nämlich dem Salz des Argininhemisuccinimids mit dem Metformin.
Verifizierung der pharmakologischen Aktivität der erhaltenen aktiven Verbindung.
Der kinetische und pharmakologische Vorteil der aktiven Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung wird im Folgenden beschrieben unter Verwendung des Argininhemisuccinimid-Metforminhemisuccinats und einer Kombination aus Metformin-Hydrochlorid/Arginin-Hydrochlorid als Beispiel:

a) Eine pharmakokinetische Studie, die in zwei Gruppen mit jeweils 20 Ratten durchgeführt wurde, die, oral, jeweils 50 mg/kg Metformin-Hydrochlorid bzw. 50 mg/kg Argininhemisuccinimid-Metforminhemisuccinat erhielten, erlaubte es, die verschiedenen kinetischen Parameter zu berechnen. Das Argininhemisuccinimid-Metforminhemisuccinat setzt Metformin frei und in den zwei Gruppen werden die Plasmatiter des Metformins bestimmt.

Nach Verabreichung von 50 mg/kg Metformin-Hydrochlorid wird ein Konzentrationsspitzenwert innerhalb von 90 Minuten beobachtet und zu 3,9 μg/ml bestimmt. Die bioverfügbare Fraktion beträgt 60% und die Halbwertszeit beträgt durchschnittlich 2,5 Stunden.
Die Verabreichung von 50 mg/kg Argininhemisuccinimid-Metforminhemisuccinat entspricht etwa 25 mg/kg Metformin-Hydrochlorid, d. h. einer halben Dosis. Die Konzentrationsspitze wird bei 60 Minuten beobachtet und man stellt 2,9 μg/ml Metformin fest. Die bioverfügbare Fraktion beträgt 75% und die Halbwertszeit 2,6 Stunden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Durchtritt des Metformins (Gesamtmenge und Durchtrittsgeschwindigkeit) im Falle des Argininhemisuccinimid-Metforminhemisuccinats verbessert ist.
Vom pharmakologischen Standpunkt aus betrachtet wurde die antidiabetische Aktivität bei zwei Rattenmodellen, die diabetisch gemacht worden waren, studiert.
Das erste Modell bestand darin, die Ratten mit Streptozotozin (50 mg/kg IP) zu behandeln, was eine Verbindung ist, die eine Erhöhung der Glykämie induziert, die in 21 Tagen von 5,5 mM auf 12–14 mM steigt. Die Verabreichung von Metformin (30 mg/kg) verringert diese Hyperglykämie signifikant, die sich im Durchschnitt von 12,11 auf 9,85 mM verringert. Bei der gleichen Dosierung von 30 mg/kg (etwa das Zweifache weniger von der Metforminbase) verringert das Argininhemisuccinimid-Metforminhemisuccinat die Hyperglykämie deutlicher, die von 12,66 auf 7,56 mM fällt. Der Unterschied zwischen den beiden Behandlungen ist trotz der geringeren Metformindosis signifikant.
Das zweite Modell wird hergestellt durch Verabreichung von 10% Fruktose im Trinkwasser der Ratten für drei Wochen. Es entwickelt sich eine Insulinresistenz, gefolgt von einem nicht Insulin-resistenten Diabetes. Es zeigt sich, dass das Argininhemisuccinimid-Metforminhemisuccinat bei einer äquivalenten Dosis an Metforminbase signifikant aktiver ist als das Metformin alleine und die Wirkung schneller ist, wie in Tabelle 1 unten gezeigt.
Tabelle 1:
Die antidiabetische Aktivität wurde ebenfalls an Hamstern getestet, die man durch die Verabreichung von Fruktose für drei Monate diabetisch gemacht hatte. Bei diesem Modell zeigt sich, dass Argininhemisuccinimid-Metforminhemisuccinat bei einer gleichen Dosis von 10 mg/kg/Tag signifikant aktiver ist als Metformin alleine. Für beide Produkte werden nach zweiwöchiger Behandlung die in der folgenden Tabelle 2 dargestellten Ergebnisse erhalten: Tabelle 2:
Glykämie der Kontrolle ohne Fruktose: 91 mg/dl
Eine Studie an der Backentasche des Hamsters zeigt, dass das Argininhemisuccinimid-Metforminhemisuccinat wenigstens die Wirkungen der zwei Wirkstoffe auf die Mikrozirkulation reproduzierte, nämlich die vasodilatorische Wirkung des Arginins und die Wirkung des Metformins auf die Vasomotion.

Claims

Medizinische Zusammensetzung für die Behandlung von Diabetes, insbesondere Typ-2-Diabetes, in der ein Biguanin, insbesondere ein N-Dimethylbiguanin, als erster Arzneistoff und ein Transporter für dieses Biguanin als zweiter Arzneistoff kombiniert sind, – wobei diese Zusammensetzung folgendes umfasst: a) eine therapeutisch wirksame Biguaninmenge b) sowie eine zur Verstärkung der therapeutischen Wirksamkeit des Biguanins gemäß (a) vorbestimmte Transportermenge, – die chemisch für die kontrollierte Freisetzung von zumindest dem Biguanin eingerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Wirkstoff der allgemeinen Formel A'==V'==C' handelt, der zumindest das Biguanin durch In-vivo-Spaltung der entsprechenden Bindung zwischen A' und V' wiederherstellen kann, wobei folgendes gilt: – V ist eine biogene Transportmittelverbindung der allgemeinen Formel X-R-Y, in der – R eine gesättigte oder ungesättigte aliphaltische, cyclische oder alicyclische Kohlenwasserstoffkette mit zwei bis zehn Kohlenstoffatomen bedeutet, die gegebenenfalls durch C1- bis C5-Alkylgruppen und/oder durch Hydroxygruppen substituiert ist, – X und Y sind jeweils eine freie Säure-, Amin- oder Alkoholfunktion, – A ist das Biguanin und C das Arginin, A enthält eine chemisch zu der Funktion X komplementäre Funktion, die mit dieser unter Bildung einer in-vivo-spaltbaren ionischen A'-V'-Bindung oder einer kovalenten A'-V'-Bindung reagieren kann und C ist mit der biogenen Transportmittelverbindung V über eine Acylierungsreaktion gebunden.
Wirkstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass V aus der Reihe der Dicarbonsäuren Oxalsäure, Malonsäure, Bersteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Korksäure, Azelainsäure, Sebacinsäure, Äpfelsäure, Isatinsäure und Phtahalsäure, vorzugsweise Bernsteinsäure, stammt.
Verbindung der Formel III
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Arzneimittel.