PT1349578E - Associação medicinal de uma biguanina (metformina) e arginina. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Associação medicinal de uma biguanina (metformina) e arginina" 0 presente invento refere-se a uma associação medicamentosa, de dois princípios activos, que possuem em conjunto uma acção complementar e/ou sinérgica, para o tratamento de diabetes, em particular diabetes de tipo 2.

Por "acção complementar" entende-se a acção farmacológica de dois compostos diferentes que podem agir sobre a mesma patologia por dois mecanismos farmacológicos respectivamente diferentes, por exemplo, a utilização combinada de dois anti-diabéticos como uma biguanina e uma sulfonilureia.

Por "acção sinérgica" entende-se a acção farmacológica de dois compostos, que consiste em potenciar a acção de pelo menos um dos referidos compostos, por exemplo a potenciação da acção de uma biguanina ou biguanida (em língua inglesa) para a acção de um transportador como se descreve e propõe aqui posteriormente no invento.

Sabe-se que a metformina sob a forma de cloridrato é o medicamento de primeira escolha no tratamento de hiperglicemias e de diabetes não insulino-dependentes. Esse cloridrato de metformina é utilizado sozinho ou em associação quer com uma sulf onilureia, quer com um inibidor de alfa-amilase, quer ainda com uma glitazona. 0 cloridrato de metformina na dose de 50 mg/kg, nos ratinhos, é activo sobre os modelos clássicos de diabetes não insulino-dependente como o modelo estreptozotocina e o modelo de frutose. A sua biodisponibilidade é fraca (60%) e a sua passagem intestinal é preferencialmente ao nível do jejuno e do íleo. Essa fraca biodisponibilidade explica o efeito secundário incómodo da metformina que são as diarreias. A metformina é uma biguanina muito básica e completamente ionizada aos valores de pH intestinais. A sua passagem implica portanto um sistema fisiológico de transporte, o que 2

ΕΡ 1 349 578 /PT explica a passagem preferencial. 0 presente invento tem por objecto reduzir os efeitos secundários e melhorar a biodisponibilidade da metformina activa sobre o sistema fisiológico de transportador.

De modo surpreendente, o presente invento evidenciou que, em associação com a metformina, a arginina possui uma analogia estrutural com uma biguanina, e em particular com uma N-dimetil-biguanina, apresenta efectivamente essa função de transportador relativamente à metformina. De entre os transportadores, prefere-se a arginina devido à sua semelhança de estrutura química com a metformina. Com efeito, a L-arginina (Fig. 3) activa ela mesma a sua própria transferência ao nível intestinal. Depois, a arginina é o precursor da síntese do radical nitroso, NO, que é reconhecido como um dos vasodilatadores mais potentes, tanto ao nível venoso como ao arterial, e por conseguinte pelas suas propriedades hemodinâmicas e hemoreológicas. Essa acção própria da arginina poderá ser benéfica nas patologias secundárias do desenvolvimento de diabetes, a saber as macroangiopatias, as microangiopatias, as neuropatias, as nefropatias e as retinites dos diabéticos.

Em conformidade com o documento "Marfella R. et ai., Metformin improves hemodynamic and rheological responses to L-arginine in NIDDM patients, Diabetes care, 1996 Sep 19(9) 934-9", descreveu-se uma experiência no Homem que, fora de todo o protocolo clínico ou terapêutico, consiste em administrar por via intravenosa (sob perfusão) uma dose total de 30 g de arginina em 30 minutos, o que é demasiado e não exequível em terapêutica corrente.

Em conformidade com o mesmo documento, mostrou-se que a administração conjunta de metformina potência a acção hemodinâmica e hemoreológica da arginina. Mas pelo contrário, os efeitos terapêuticos próprios da metformina, em particular os anti-hiperglicémicos, não são modificados pela arginina. Diabetes Care, vol. 19, pp. 934 - 939 (Setembro 1996), mostra o efeito potenciador da metformina junto com L-arginina nos pacientes diabéticos. Em WO-9929314 divulgam-se os sais de metformina com ácido fumárico ou succínico para o tratamento 3

ΕΡ 1 349 578 /PT de diabetes.

Assim, os resultados obtidos em conformidade com o invento nos modelos experimentais de diabetes demonstraram que os compostos activos de metformina, compreendendo na sua estrutura um resíduo de arginina, são capazes de aumentar a biodisponibilidade da metformina, de modo inesperado, potenciando os efeitos desta contra a hiperglicemia que é a principal manifestação da diabetes.

Todas as biguaninas actualmente utilizadas ou em estudo no tratamento de diabetes, apresentam os efeitos secundários e os problemas de biodisponibilidade aqui anteriormente citados.

Em FR 2696740 apresenta-se o derivado de cloridrato de metformina N-dimetil-N'-diacetiltartroil-biguanida. O presente invento refere-se a um conjunto medicamentoso, para o tratamento de diabetes, em particular de diabetes do tipo 2, que associa uma biguanina, em particular uma N-dimetilbiguanina, na qualidade de primeiro medicamento, e um agente transportador da referida biguanina, na qualidade de segundo medicamento, sendo o referido conjunto caracterizado por ser um composto activo de fórmula geral A'---V'---C', capaz de restituir pelo menos a biguanina, por clivagem ir vivo da ligação correspondente entre A' e V', sendo especificado que: V é um composto biogénico de vectorização, de fórmula geral X-R-Y, na qual * R representa uma cadeia hidrocarbonada de 2 a 10 átomos de carbono, alifática, cíclica, ou alicíclica, saturada ou não, eventualmente substituída pelos grupos alquilo de Ci-C5 e/ou os grupos hidroxilos, * X e Y são cada um uma função livre ácido, amina ou álcool, A é a biguanina e C é a arginina, A compreende uma função química complementar da função X, susceptível de reagir com esta última para originar uma ligação clivável in vivo 4

ΕΡ 1 349 578 /PT A'---V' iónica ou A'-V' covalente. C liga-se ao composto biogénico de vectorização V por uma reacção de acilação. 0 invento refere-se igualmente a um composto activo tal como definido anteriormente, que se caracteriza por a biguanina A ser a metformina. 0 invento refere-se a um composto activo tal como se definiu anteriormente, sendo A a metformina, caracterizado por a metformina estar ligada ao composto biogénico de vectorização, para a salificação da função amina primária terminal da metformina. 0 invento refere-se igualmente a um composto activo tal como se definiu anteriormente, que se caracteriza por V ser seleccionado de entre o conjunto de diácidos constituídos pelos ácidos oxálico, malónico, succínico, glutárico, adípico, pimélico, subérico, azelaico, sebático, málico, isático e ftálico e de preferência succínico.

0 invento refere-se igualmente a um composto activo de fórmula III

HN /

CH 2

CNHCH2CH2CHa.____ NH nh2

! cI

COOH h2c

co ^OH, h2N

CH3 ch3

III 0 invento refere-se também à utilização, na qualidade de medicamento, de um composto como definido anteriormente. 0 invento refere-se mais particularmente à utilização como medicamento de um composto de fórmula geral A'---v'---C' como se definiu anteriormente. 5

ΕΡ 1 349 578 /PT Ο invento refere-se igualmente a um procedimento de preparação de um composto activo conforme o invento, compreendendo os seguintes passos: a) reacção de condensação e/ou salificação do composto biogénico de vectorização V com a biguanina A; b) reacção de condensação do produto de reacção em conformidade com (a) com a arginina C ou a') reacção de condensação do composto biogénico de vectorização V com a arginina C; b') reacção de condensação e/ou salificação do referido composto biogénico condensado obtido na reacção em conformidade com (a') com a biguanina A.

Um outro objecto do invento é uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um composto em conformidade com o invento, em associação com um ou vários veiculos, diluentes, excipientes ou adjuvantes compatíveis e farmaceuticamente aceitáveis.

Um outro objecto em conformidade com o invento é igualmente uma composição farmacêutica tal como se definiu anteriormente, que permite adaptar uma posologia diária no Homem compreendida entre 0,2 g e 1 g do referido composto activo em uma ou várias doses.

Na indicação anti-diabética ou anti-hiperglicémica, um conjunto medicamentoso (ou "kit" de tratamento terapêutico) de acordo com o invento, e em particular um composto activo de fórmula A'---V'---C' como se definiu anteriormente, pode ser associado a um outro agente anti-hiperglicémico tal como uma sulfonilureia.

Por "biguanina" (ou "biguanida") entenda-se em particular as N-dimetilbiguaninas, substituídas ou não, e por exemplo a metformina, mas também outros compostos farmacêuticos, por exemplo a buformina, a fenformina.

Preferencialmente, a biguanina é a metformina.

Por "administração simultânea" entende-se a administração numa só dose de dois princípios activos, entendendo-se que a 6

ΕΡ 1 349 578 /PT administraçao simultânea permite a libertação no organismo dos dois princípios activos de forma simultânea ou sequencial.

Por "biogénico" entende-se um composto químico de origem natural ou não e/ou metabolizável, e/ou biodegradável, e/ou não tóxico relativamente ao Homem ou aos animais, na dose fisiológica.

Por “transportador" entende-se uma molécula ou substância que permite a transferência de uma outra molécula através de uma barreira, quer por formação de uma ligação, quer sem formação de ligação, para a activação do sistema de transporte, por exemplo por indução proteica, activação dos sistemas ATPasicos dependentes de oxigénio, ou por troca de substância.

Mais particularmente, por transportador entende-se aqui toda a molécula ou substância que permite potenciar a passagem de uma biguanina como a metformina, e portanto facilitar o transporte ao nível do jejuno.

Para produzir uma associação medicamentosa tal como se definiu anteriormente, podem ser consideradas diferentes soluções de administração, como por exemplo: - uma formulação ou apresentação galénica permitindo numa única dose de administração, e a biguanina e o transportador ou - duas apresentações galénicas respectivamente diferentes, permitindo num condicionamento adequado administrar ao mesmo tempo e respectivamente, e uma dose de biguanina, e uma dose de transportador; essa produção é efectuada utilizando um composto activo de fórmula geral A'---V'---C', capaz de restituir pelo menos a biguanina A por clivagem in vivo da ligação correspondente entre A' e V', especificando-se que: - V é um composto biogénico de vectorização, de fórmula geral X-R-Y, na qual, * R representa uma cadeia hidrocarbonada de 2 a 10 átomos de carbono, alifática, cíclica, ou alicíclica, saturada ou não, eventualmente substituída pelos grupos alquilo de Ci a C5, e/ou grupos hidroxilo, 7

ΕΡ 1 349 578 /PT * X e Υ são, cada um, uma função livre, ácido, amina, ou álcool. A é a biguanina e C a arginina, A compreende uma função química complementar da função X, susceptível de reagir com esta última para originar uma ligação clivável in vivo, A'---V' iónica ou A'-V' covalente, C liga-se ao composto biogénico de vectorização V por uma reacção de acilação.

Entende-se aqui por "clivagem in vivo" todas as formas de hidrólise química, susceptíveis de serem observadas in vivo por exemplo, hidrólise ácida, e as hidrólises enzimáticas, por exemplo pelas amidases ou pelas as esterases.

Por "função química complementar" entende-se toda a função química capaz de reagir com uma função livre ou terminal do composto biogénico. Por exemplo, V deve comportar uma função que reaja com A (biguanina) e uma função que reaja com C (arginina). Portanto, se A e C comportarem cada um uma função ácido, V será uma diamina, um diálcool ou uma enolamina, de modo a formar respectivamente uma amida, um éster ou um sal. Assim, se A e C comportarem cada um uma função amina, V será um diácido de modo a formar uma amida ou um sal. Se A e C comportarem cada um uma função álcool, V será um diácido de modo a formar um diéster. Com base neste princípio, todas as composições são possíveis. Em consequência, se A comportar uma função ácido e C uma função álcool, V será por exemplo enolamina, para actuar com a função ácido de A para originar uma amida, um éster ou um sal e com a função álcool de C para originar um éster.

Por "ligações covalentes" entende-se aqui as ligações químicas susceptíveis de se formarem por reacção de funções químicas ditas complementares, entre o composto biogénico de vectorização V e os princípios activos A (biguanina) e C (arginina). e os

Por "ligações iónicas" entende-se aqui as ligações por forças electrostáticas, susceptíveis de se formarem por acção das funções químicas ditas complementares, entre o composto biogénico de vectorização V e os princípios activos A (biguanina) e C (arginina), logo as ligações do tipo sais de ácidos, sais de aminas, alcoolatos e ácido/base, 8

ΕΡ 1 349 578 /PT independentemente da proporção molar existente entre o composto V e o principio activo A ou C, pertencentes ao complexo formado pelas ditas ligações iónicas.

Por "ligação clivável in vivo" entende-se toda a ligação que permita a libertação e a restituição dos princípios activos A (biguanina) e C (arginina), e do composto biogénico V de vectorização, in vivo, por ruptura das ligações iónicas ou covalentes entre as funções químicas complementares de A e V.

As ligações covalentes cliváveis sofrem clivagem por acção das enzimas presentes no meio in vivo do local de libertação. Se essas ligações covalentes forem as ligações amida ou as ligações éster, as enzimas implicadas nessa clivagem serão as amidases, as esterases e as hidrolases. Essas enzimas encontram-se presentes particularmente no tubo digestivo (administração oral), de forma preponderante no fígado, sangue, e potencialmente presentes nos órgãos alvo.

As amidases que hidrolisam a ligação -CO-NH- encontram-se ao nível do fígado, estas são pouco activas; resultando um efeito prolongado esperado com o composto em conformidade com o invento portador de uma dessas ligações. De entre essas amidases, algumas são conhecidas, actuam as endopeptidases que hidrolisam as ligações gama-aminas ou gama-ácidos. V pode ser consequentemente, segundo o invento, um ácido gama-amina, com uma segunda função ácido ou amina na posição gama (caso do ácido glutâmico ou da lisina por exemplo).

As esterases que hidrolisam a ligação -C0-0- são muito numerosas no organismo vivo. Estas são, no entanto, ubiquitárias e muito pouco específicas de um substrato, resultando uma grande velocidade de reacção, com uma rápida libertação dos constituintes A (biguanina), V, C (arginina) do composto activo em conformidade com o presente invento. As mais específicas de um substrato usam o nome desse substrato, e para esse fim podem-se citar por exemplo as colinesterases ou as procaina-esterases.

As hidrolases que hidrolisam igualmente os ésteres e todas as moléculas de grande dimensão que chegam ao organismo sob a forma de alimentos. Essas hidrolases são igualmente 9

ΕΡ 1 349 578 /PT numerosas e ubiquitárias. Estas serão contudo específicas do composto biogénico de vectorização V utilizado.

Como enzimas de clivagem úteis para a execução do presente invento, podem-se citar as enzimas proteolíticas como a pepsina, a tripsina, as catalases, as endo- e exo-peptidases. São também úteis as amilases e as osidases, e finalmente as lipases e as beta-oxigenases para a destruição dos lípidos.

Essas enzimas não intervêm senão quando a estrutura do composto biogénico de vectorização compreende uma ou várias ligações que sejam susceptíveis de clivagem. Por exemplo, a lipase actua se o composto biogénico de vectorização for um diácido de cadeia longa (8 a 10 átomos de carbono, o que é comparável a um ácido gordo) , e a ligação A-V ou V-C for obtida por condensação com uma função álcool secundário de A ou de C.

As ligações iónicas cliváveis sofrem clivagem em função do seu local de libertação, por exemplo intestino, fígado, plasma ou órgão alvo, entendendo-se que os sais de ácido, de amina, ou os alcoolatos são geralmente ionizados ao pH do meio dos organismos vivos. Geralmente o pH está compreendido entre 2 e 8, e é por exemplo 2 para o estômago, e de 6 por exemplo para o intestino.

Temos, portanto, uma ionização do composto activo em conformidade com o invento, em função do tipo de sal utilizado, e uma dissociação do referido composto activo, quando o último comporta pelo menos uma ligação iónica. O sal é seleccionado em função da sua constante de dissociação, e do pH do local de libertação in vivo. Por exemplo, para uma dissociação no estômago, selecciona-se um sal de ácido fraco e de uma base forte. A selecção do composto biogénico de vectorização, e especialmente a selecção das suas funções livres X e Y é efectuada de acordo com a natureza das funções químicas, livres e complementares, presentes nos princípios activos ou sobre os princípios activos (biguanina e arginina) destinados a serem vectorizados, ou seja, ligados por ligação covalente 10

ΕΡ 1 349 578 /PT ou iónica a esse composto biogénico de vectorização, mas também de acordo com os locais de clivagem e de libertação seleccionados. Esse composto biogénico de vectorização é um produto de origem natural ou não, e/ou metabolizável e/ou biodegradável e/ou não tóxico relativamente ao Homem ou ao animal, na dose fisiológica. Este composto biogénico de vectorização será seleccionado de entre os compostos biologicamente aceites e descritos, por exemplo os gama-aminoácidos intervenientes na síntese de proteínas, os diácidos intervenientes no ciclo de Krebs, as etanolaminas constituintes das membranas celulares, metabolizáveis e não tóxicas, e susceptíveis de serem integradas, elas próprias ou os seus metabolitos nos grandes ciclos biológicos da vida. Podemos citar, por exemplo, na qualidade de composto biogénico de vectorização, o ácido succínico que encontramos no ciclo de Krebs, ou o ácido metilsuccínico que é biodegradado em ácido succínico.

As ligações retidas entre o composto biogénico de vectorização e os princípios activos associados de acordo com o presente invento, a saber biguanina e transportador, dependem dos metabolismos possíveis ao nível gastrointestinal e hepático.

Por exemplo, os sais são dissociados no tubo digestivo, a hidrólise pode ser retardada pelas formas galénicas gastro-resistentes. Os ésteres são hidrolisados em meio ácido, ou hidrolisados pelas esterases dos sucos gástricos, a hidrólise pode ser igualmente retardada pelas formas galénicas gastro-resistentes. As amidas são hidrolisadas pelas amidases hepáticas, sendo a cinética dessas hidrólises geralmente lenta.

Para avaliar a capacidade para a clivagem in vivo das ligações A'---V' e V'---C' e para a correspondente libertação dos princípios activos A (biguanina) e C (arginina) podem ser realizados diferentes testes. Esses testes consistem, por exemplo, na observação da libertação dos princípios activos no suco intestinal, ou no estudo do metabolismo hepático sobre cultura primária de hepatócito de ratinho. Estes dois testes estão aqui seguidamente descritos. 11

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Teste in vitro de clivagem num suco intestinal

Utiliza-se uma preparação de suco intestinal contendo tripsina, as peptidases, a lipase, a amilase e todas as outras enzimas do pâncreas exócrino. Este teste foi previamente validado com os compostos apresentados. Coloca-se o composto A'V'C em quantidade conhecida (na ordem dos microgramas) em presença de uma quantidade conhecida de suco intestinal (cujos teores em tripsina e lipase são controlados). Mantém-se a mistura reaccional a 37°C durante uma hora. Esse tempo é compatível com o trânsito intestinal. Retiram-se amostras de 15 em 15 minutos, e detectam-se os produtos A e C e mede-se a sua concentração por HPLC acoplado a um detector de UV, ou a um espectrómetro de massa se não for possível utilizar um detector de UV. As colunas utilizadas dependem da natureza de A e de C, mas são geralmente as colunas de permuta iónica, do facto de haver formas ácidas, aminas ou álcoois livres. Após a aferição determina-se a quantidade total de A (biguanina) ou de C (arginina) libertada numa hora, e os pontos intermédios permitem calcular as constantes de dissociação Km e a velocidade Vmax das enzimas para o composto activo A'V'C' utilizado. Este teste pode ser associado com uma determinação da libertação de A (biguanina) , C (arginina) e V no suco gástrico, utilizando exactamente o mesmo princípio mas substituindo o suco intestinal pelo suco gástrico.

Teste in vitro sobre cultura primária de hepatócitos de ratinho

Utiliza-se uma cultura primária de hepatócitos de ratinho, que são próximos aos do Homem, para os estudos de metabolismo num meio HEPES, ao qual se adiciona uma quantidade conhecida de composto A'V'C' da ordem do micrograma. Deixam-se os produtos em contacto durante 6 horas, e retiram-se amostras a 1 hora, 2 horas e 4 horas, nas quais se isolam os sobrenadantes e se efectua a lise dos hepatócitos do resíduo. Nestes meios, medem-se as concentrações dos princípios activos A (biguanina) e C (arginina) libertados. Como anteriormente, é possível o cálculo de Vmax e de Km das enzimas implicadas no metabolismo. 12

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Quando os compostos em conformidade com o invento não atravessam as membranas celulares, pode-se realizar o mesmo tipo de estudo sobre um homogeneizado de figado de ratinho. A eventual toxicidade do composto biogénico de vectorização reporta-se à do composto activo (A'V'Cr) em conformidade com o invento. Como esse composto activo é metabolizado em A (biguanina) , C (arginina) e V, e V é por definição uma substância biológica, a toxicidade do composto em conformidade com o invento deve comparar-se à soma das toxicidades devido à administração da biguanina A e da arginina C. Além disso, quando o composto activo associa dois princípios activos que possuem, nestas condições, pelo menos para um dito princípio activo, uma eficácia superior à do mesmo referido princípio activo isolado, pode-se considerar uma toxicidade menor para o referido composto. Contudo, propõe-se aqui seguidamente um método de prever a toxicidade, alternativo aos métodos padrão in vivo, para comparar a toxicidade de A e de C e de A' V' C' à de concentrações idênticas expressas de A ou de C (ver "Toxicologic Emergencies", Sixth Edition 1997, Goldfranck et al. Appleton and Lange, Connecticut, USA).

Teste de toxicidade in vitro

Efectua-se um método de cultura primária de hepatócitos durante 96 horas (ver Biochemical Pharmacology, vol. 50, 1995, pp. 775-780) . Isolam-se os hepatócitos in situ para uma perfusão de colagenase. Colocam-se, de seguida, num meio de Williams suplementado com soro de vitelo fetal, com cortisol e com glutamina, à razão de 1 milhão de células por poço. Em cada poço adicionam-se as concentrações crescentes e tóxicas de A (biguanina) e de C (arginina) e de A'---V'---C' .

Retiram-se amostras após 6 h, 12 h, 24 h, 48 h e 96 h e determina-se a viabilidade das células por um teste com azul de metileno, para a expressão de albumina, para a apoptose dos hepatócitos, e para a medida da actividade dos citocromos P450. A viabilidade das células pelo teste com azul de metileno originou os resultados semelhantes aos obtidos por uma DL5o. 13

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Os resultados obtidos para a expressão da albumina permitem conhecer os limites de tolerância do hepatócito a toda a substânca tóxica (toxicidade a prazo). Com efeito, um desses papéis principais do hepatócito é o de sintetizar as proteínas. Por ocasião de um efeito tóxico, essa expressão da síntese e da libertação de albumina é alterada.

Os resultados obtidos para a apoptose dos hepatócitos permitem confirmar a toxicidade a prazo, porque por ocasião de um contacto com uma substância tóxica, as células vão programar a sua destruição, isto é o que corresponde ao fenómeno de apoptose que é medido pelo ADN anormal. A medida da actividade dos citocromos P450 documenta os fenómenos de indução e de inibição dessas enzimas, muitas vezes reencontrados com os produtos farmacologicamente activos. Uma série de testes permite determinar a actividade das isoformas dos citocromos P450. 0 presente invento refere-se: sendo A a metformina na fórmula geral anterior, a metformina está ligada ao composto biogénico de vectorização V, por salificação da função amina primária terminal da metformina - C é a arginina na fórmula geral anterior, a arginina liga-se ao composto biogénico de vectorização V por uma reacção de acilação - V, na fórmula geral anterior, é seleccionado num conjunto de diácidos constituídos pelos ácidos oxálico, malónico, succínico, glutárico, adípico, pimélico, subérico, azelaico, sebático, málico, isático e ftálico e de preferência succínico. 0 invento refere-se também, na qualidade de medicamento, ao composto de fórmula III. 0 invento refere-se também a toda a composição farmacêutica que compreende um composto activo tal como se definiu anteriormente, em associação com um ou vários veículos, diluentes, excipientes ou adjuvantes compatíveis e farmaceuticamente aceitáveis. De preferência, uma tal 14

ΕΡ 1 349 578 /PT composição farmacêutica permite adaptar uma posologia diária no Homem, compreendida entre 0,2 g e 1 g de cada principio activo (biguanina e transportador), numa ou em várias doses. Por exemplo, as formas galénicas gastro-resistentes podem ser efectuadas para evitar toda a hidrólise ao nível do estômago.

De preferência, um composto activo tal como se definiu anteriormente pode ser obtido no fim dos seguintes passos: * reacção de condensação e/ou salificação do composto biogénico de vectorização (V) com a biguanina A; * reacção de condensação do referido composto biogénico condensado, obtido, com a arginina C; ou * reacção de condensação do composto biogénico de vectorização V com a arginina C; * reacção de condensação e/ou salificação do referido composto biogénico condensado obtido com a biguanina A.

Tipicamente, as reacções de condensação que podem ser utilizadas são as reacções de acilação das aminas e de esterificação dos álcoois. * Quando um (A ou C) pelo menos dos princípios activos (biguanina ou arginina) se liga ao composto biogénico de vectorização V por uma reacção de salificação, a sequência realizada das reacções compreenderá de preferência a reacção de condensação após a reacção de salificação, por razões de estabilidade dos sais em função do pH, bem conhecidas do especialista na arte.

Quando A é metformina, C é arginina e V é ácido succínico, o procedimento de preparação compreende os seguintes passos: - Reacção do monocloreto do monoéster do ácido succínico em solução num éter ou no benzeno, com arginina em solução aquosa no carbonato de sódio. - Libertação da base metformina a partir do cloridrato em meio sódico concentrado e extracção a partir de álcool 15

ΕΡ 1 349 578 /PT absoluto . - Formação do sal de hemi-succinimida de arginina com a metformina.

De preferência, as composições farmacêuticas em conformidade com o invento estão adaptadas numa forma adequada para a administração por via oral, parentérica ou intravenosa. 0 invento tem mais particularmente como objecto a utilização de pelo menos um composto activo tal como o descrito aqui anteriormente, para a obtenção de medicamentos destinados ao tratamento de diabetes em todas as suas formas e/ou ao tratamento de enfermidades do sistema circulatório, estando essas enfermidades ligadas ou não à diabetes. 0 presente invento é agora descrito a titulo de exemplo, por referência à associação de metformina (biguanina) e arginina (transportador) num mesmo composto activo A'V'C', V é o ácido succinico reagente, de um lado de modo covalente com uma função amina de arginina e do outro lado de modo iónico (reacção de salificação) com uma função amina da metformina. Síntese da hemi-succinimida de arginina - hemi-sucinato de metformina a) Primeiro Passo: Preparação de hemi-succinimida de arginina

Dissolve-se a base arginina (6 g) em 120 ml de uma solução aquosa de carbonato de sódio (N = 10,6 g/lOOml). Para além disso, dissolve-se monocloreto de monoéster succinico em 50 ml de éter sulfúrico, em ligeiro excesso de monocloreto de monoéster succinico para uma reacção mole para mole referida à arginina. Sob agitação vigorosa à temperatura ambiente, adiciona-se a solução em éter à solução aquosa em 10 minutos. Mantém-se o líquido reaccional sob agitação vigorosa durante uma hora, em aquecimento lento para uma destilação completa do éter. Evapora-se até à secura e retoma-se o resíduo para um mínimo de água destilada (20 ml), e acidifica-se pelo ácido clorídrico diluído. Por concentração (aquecimento ligeiro sob vácuo parcial) obtemos os cristais brancos de 16

ΕΡ 1 349 578 /PT hemi-succinimida de arginina.

Efectua-se a verificação do espectro de RMN, a análise centesimal e a pureza do produto por cromatografia em camada fina. Verifica-se que, em particular, a presença do resíduo ácido aminado de arginina pela reacção em ninidrina e a presença de carboxilo livre do ácido succínico por titulação. 0 rendimento é quantitativo. b) Segundo Passo: libertação da base metformina

Adicionam-se 10 gramas de cloridrato de metformina a 40 ml de uma solução de hidróxido de sódio 5N. Aquece-se a mistura de reacção durante duas horas a 40°C. Após evaporação sob vácuo a 40°C, reparte-se o resíduo viscoso por 100 ml de etanol absoluto. Uma filtração permite eliminar as impurezas e fica um resíduo não solúvel de cloreto de sódio. A base metformina está em solução alcoólica e é isolada por evaporação sob a forma de um pulverizado viscoso. O espectro de RMN confirma a estrutura da metformina. A ausência de cloreto é verificada com nitrato de prata.

Recordamos que a metformina, isto é, a diamida N,N-dimetilimidodicarbonimídica, é identificada no índice MERCK sob o número 5792 e está caracterizada sob o número Chemical Abstracts 657-24-9. c) Terceiro passo

Numa solução aquosa de hemi-succinimida de arginina, junta-se, mole a mole, a base metformina. Obtém-se uma dissolução imediata.

Evapora-se completamente a água a 60 °C sob vácuo. Repõe-se o residuo em solução em água destilada e cristaliza então da concentração sob vácuo.

Obtém-se os cristais translúcidos solúveis na água e insolúveis nos solventes orgânicos. O ponto de fusão é de 188-189 °C. 17

ΕΡ 1 349 578 /PT Ο espectro de RMN, a análise centesimal e a presença de uma única mancha após cromatografia em camada fina confirmam a estrutura e a pureza do produto. 0 rendimento total é quantitativo.

No seguimento das reacções anteriores, o rendimento é próximo de 90%. As perdas provêm das purificações e das filtrações.

As fórmulas desenvolvidas de arginina, da metformina, e do sal de hemi-succinimida de arginina com a metformina são fornecidas respectivamente nas Figuras 1 a 3.

Teste de clivagem

Este teste é realizado em conformidade com o método in vitro no suco intestinal, descrito anteriormente segundo o ensaio in vitro de toxicidade descrito. Observa-se uma libertação imediata de metformina sem modificar a porção hemi-succinimida de arginina. Realiza-se um segundo ensaio sobre uma cultura de hepatócitos de ratinhos, em conformidade com o método descrito anteriormente. Observa-se uma libertação lenta de arginina em 24 horas.

Toxicidade

Este teste é realizado em conformidade com o ensaio in vitro de toxicidade descrito anteriormente. Observa-se a dose tóxica com a metformina a 1CT2 M, e esta é idêntica para o composto activo Α'-ν'-Β', a saber o sal de hemi-succinimida de arginina com a metformina.

Verificação da actividade farmacológica do composto activo obtido O interesse cinético e farmacológico do composto activo em conformidade com o presente invento é aqui seguidamente descrito, tomando como exemplo ilustrativo, a hemi-succinimida de arginina - hemi-succinato de metformina, e uma associação cloridrato de metformina/ cloridrato de arginina: a) Um estudo farmacocinético conduzido em dois grupos de 20 ratinhos cada, que receberam por via oral, respectivamente 18

ΕΡ 1 349 578 /PT 50 mg/kg de cloridrato de metformina, e 50 mg/kg de hemi-succinimida de arginina - hemi-succinato de metformina, permitiu calcular os diferentes parâmetros cinéticos. A hemi-succinimida de arginina - hemi-succinato de metformina liberta a metformina e nos dois grupos, são esses os níveis plasmáticos de metformina que são determinados.

Após a administração de 50 mg/kg de cloridrato de metformina, observa-se o pico de concentração aos 90 minutos e verificou-se ser igual a 3,9 pg/ml. A fracção biodisponível é de 60% e o período de meia-vida igual em média a 2,5 horas. A administração de 50 mg/kg de hemi-succinimida de arginina - hemi-succinato de metformina corresponde a cerca de 25 mg/kg de cloridrato de metformina, isto é, a uma semi-dose. Observa-se o pico de concentração aos 60 minutos e verifica-se ser igual a 2,9 yg/ml de metformina. A fracção biodisponível é de 75% e o período de meia-vida de 2,6 horas.

Estes resultados demonstram que a passagem da metformina (quantidade total e velocidade de transferência) é melhor no caso da hemi-succinimida de arginina - hemi-succinato de metformina.

Do ponto de vista farmacológico, a actividade antidiabética foi estudada em dois modelos de ratinhos tornados diabéticos. O primeiro modelo consiste em tratar os ratinhos através da estreptozotocina (50 mg/kg IP), composto que induz um aumento de glicemia que passa de 5,5 mM para 12-14 mM em 21 horas. A administração de metformina (30 mg/kg) diminui significativamente essa hiperglicemia que passa de 12,11 para 9,85 mM em média. Para a mesma posologia de 30 mg/kg (cerca de duas vezes menos de base metformina), a hemi-succinimida de arginina - hemi-sucinato de metformina diminui o aspecto mais importante da hiperglicemia que passa de 12,66 para 7,56 mM. A diferença entre os dois tratamentos é significativa a despeito da dose mais fraca de metformina.

Realiza-se o segundo modelo com a administração de frutose a 10% na água de beber dos ratinhos durante três semanas. Desenvolve-se uma insulino-resistência, seguida de 19

ΕΡ 1 349 578 /PT uma diabetes de tipo não insulino-resistente. A hemi-succinimida de arginina - hemi-succinato de metformina revela-se significativamente mais activa do que a metformina sozinha na dose equivalente de base metformina e a acção é mais rápida como se mostra no Quadro 1 a seguir.

Quadro 1 \ Metformina 30 mg/kg/dia Arginina 30 mg/kg/dia | Hemisuccinimida de arginina -: hemisuccinato de metformina | 70 mg/kg/dia Controlo j (glicemia mM) : 6,94 ± 0,13 6,87 ± 0,14 | 6,84 ± 0,06 21 dias de frutose j (glicemia mM) j 12,52 ± 0,52 13,24 ± 0,62 | 12,14 ± 0,28 4 dias de tratamento ; (glicemia mM) j 13,41 ±0,52 14,37 ± 0,20 \ 10,92 ±0,44 8 dias de tratamento ; (glicemia mM) j 10,83 ± 0,64 12, 56 ± 0,89 | 9,13 ± 0,64 12 dias de tratamento j (glicemia mM) | 9, 78 ± 0,72 11,98 ± 0,71 | 8, 43 ± 0,52 21 dias de tratamento | (glicemia mM) | 9,87 ± 0,68 10,73 ±1,27 | 7, 76 ± 0, 78 A actividade antidiabética foi igualmente verificada nos hamsteres tornados diabéticos por administração durante três meses de frutose. Neste modelo a hemi-succinimida de arginina - hemi-succinato de metformina revelou-se significativamente mais activa do que a metformina sozinha para a dose igual de 10 mg/kg/dia para os dois produtos após duas semanas de tratamento. Obtiveram-se os resultados ilustrados no Quadro 2 que se segue:

Quadro 2 S Frutose + Frutose i : Metformina 3 meses S S 10 mg/kg/dia Frutose + Hemisuccinimida de arginina-hemisuccinato de metformina 10 mg/kg/dia 2 semanas de tratamento (glicemia mg/dl) 143 \ 112 93

Glicemia de controlo sem frutose: 91 mg/dl

Um estudo na cavidade jugal do hamster mostra que o hemi-succinimida de arginina - hemi-succinato de metformina reproduz pelo menos os efeitos dos dois princípios activos 20

ΕΡ 1 349 578 /PT sobre a microcirculaçao, nomeadamente a acçao vasodilatadora da arginina e a acção sobre a vasomoção da metformina.

Lisboa,

Claims (4)

1. ΕΡ 1 349 578 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Combinação medicamentosa para o tratamento de diabetes, em particular diabetes de tipo 2, que associa uma biguanina, em particular uma N-dimetil-biguanina, como primeiro medicamento, e um agente transportador para a referida biguanina como segundo medicamento, compreendendo a referida associação: a) uma quantidade terapeuticamente activa da biguanina, b) e uma quantidade de agente transportador, previamente determinada, para potenciar a actividade terapêutica da biguanina em conformidade com (a) combinados quimicamente para a libertação controlada de pelo menos biguanina, que se caracteriza por ser um composto activo de fórmula geral A'---V'---C', capaz de restituir pelo menos a biguanina por clivagem in vivo da correspondente ligação entre A' e V', sendo especificado que: - V é um composto biogénico de vectorização, de fórmula geral X-R-Y, na qual: * R representa uma cadeia hidrocarbonada de 2 a 10 átomos de carbono, alifática, cíclica ou alicíclica, saturada ou não, opcionalmente substituída com grupos alquilo de Ci a C5 e/ou grupos hidroxilo, * X e Y são, cada um, uma função ácido, amina ou álcool livre, - A é biguanina e C é arginina, A compreende uma função química complementar da função X, capaz de reagir com a última para originar uma ligação A'---V' iónica ou A'---V' covalente que possa sofrer clivagem in vivo, e C liga-se ao composto biogénico de vectorização V por uma reacção de acilação.
2. 2. Composto activo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por V ser seleccionado do conjunto de diácidos que consiste em ácidos oxálico, malónico, succínico, glutárico, adípico, pimélico, subérico, azelaico, sebático, málico, isático e ftálico, e de preferência ácido succínico. ΕΡ 1 349 578 /PT 2/2
3. 3. Composto de fórmula III: QÇ——-HN / Hj.

   CNHCH2CHzCHfr„. ^nh co \ OH. HaN _ NH Lh C NH I C ...... COOHi H ^CH3 ^ CH3 iii
4. 4. Utilização como medicamento de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3. Lisboa,