DE69911755T2

DE69911755T2 - Synthetische endogene cannabinoidanaloge und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE69911755T2
Application number: DE69911755T
Authority: DE
Inventors: Raphael Mechoulam; Esther Fride; Shimon Ben Shabat; Tzviel Sheskin; Aviva Breuer
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2019-03-31
Also published as: AU765670B2; US6531636B1; EP1066235A1; EP1066235B1; WO1999051560A1; CA2326766A1; ES2209417T3; ATE251103T1; IL138690A0; AU3165399A; DE69911755D1

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I), ein Verfahren zu deren Herstellung, pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten und verschiedene Verwendungen der Verbindungen.
Hintergrund der Erfindung
Anandamid und 2-Arachidonylglycerol (2-Ara-Gl) vertreten die zwei Arten endogener Cannabinoid-Bestandteile, die bislang entdeckt wurden [Devane W. A. et al., Science 258: 1946–1949 (1992a); Mechoulam R. et al., Biochem. Pharmacol. 50: 83–90 (1995); Mechoulam R. et al., US-Patent Nr. 5,618,858 (entsprechend IL 103932)]. Diese Verbindungen sowie verwandte Amide und Ester davon verursachen zahlreiche Wirkungen, die therapeutisches Potential besitzen [Mechoulam R. (Hrg.), Cannabinoids as therapeutic agents, CRC Press Coca Raton Florida (1986)). Es ist kürzlich gezeigt worden, daß Anandamid ein endogener Modulator des Blutdrucks sein kann [Wagner J. A, et al., Nature 390: 518–521 (1997)]. Bei Verabreichung an Ratten wurde gezeigt, daß es den Blutdruck senkt [Varga K. et al., Eur. J. Pharmacol. 278: 279–283 (1995)]. Diese Befunde wurden durch die Erfinder bestätigt [siehe Tabelle 3]. Sowohl Anandamid als auch 2-Arachidonylglycerol unterliegen jedoch leichter und schneller enzymatischer Hydrolyse. Dies stellt ein ernsthaftes Hindernis bei ihrer möglichen Verwendung als Arzneimittel dar, unter anderem, weil Substanzen, die für hydrolytische Spaltung anfällig sind, im Gastrointestinaltrakt Veränderungen unterworfen sein können.
Verfahren zum Synthetisieren von Lysophosphatidylethanolamin-Analoga, die die Reninaktivität hemmen, sind offenbart worden [Turcotte J. G. et al., J. Med. Chem., 1975, Vol. 18, Nr. 12].
Die Erfinder haben eine neue Gruppe von verwandten synthetischen Derivaten von 2-Arachidonylglycerol entdeckt, die gegenüber Hydrolyse stabil sind. Es handelt sich um Ether, die von langkettigen Fettalkoholen (insbesondere Arachidonylalkohol) abgeleitet sind. Diese Verbindungen binden an die CB₁-und CB₂-Cannabinoid-Rezeptoren und weisen In-vivo-Wirkungen auf, die vergleichbar sind zu denen von Anandamid und 2-Ara-Gl. Die hier offenbarten Verbindungen reduzieren den intraokulären Druck bei Kaninchen (einem Model für Glaukom), vermindern Schmerzen und Erbrechen, erniedrigen den Blutdruck, weisen entzündungshemmende Eigenschaften auf, besitzen antispastische Wirkungen und können daher bei der Behandlung von Multipler Sklerose nützlich sein. Darüber hinaus ist die Wirkung der neuen Verbindungen verlängert, was bei bestimmten Krankheiten von besonderem Vorteil ist.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung der allgemeinen Formel (I): R1-CH2-O-CHR2R3 (I),wobei R¹-CH₂- einen Alkenyl-Rest repräsentiert, der abgeleitet ist von einem mehrfach ungesättigten Fettalkohol aus 16 bis 28 Kohlenstoffatomen, enthaltend 2 bis 6 Doppelbindungen, wobei die erste Doppelbindung bei Zählung vom freien Ende des Alkenyl-Rests aus an C-3, C-6 oder C-9 positioniert ist; R² ein Wasserstoffatom oder eine Nieder-C₁-C₅-Alkylgruppe repräsentiert; und R³ eine Alkoxyalkyl-Gruppe repräsentiert; oder die CHR²R³-Gruppe eine 2-Glyceryl-Gruppe repräsentiert; wobei die C₁-C₅-Alkyl- und Alkoxyalkyl-Gruppen unabhängig voneinander durch eine oder mehrere Hydroxyl-Gruppen, Amino-Gruppen oder Alkylamino-Gruppen an jedem ihrer Kohlenstoffatome substituiert sein können, wobei jede der Hydroxylgruppen zur Bildung eines Esters weiter substituiert sein kann oder in eine Phosphonat-Gruppe oder Alkylsulfonat-Gruppe umgesetzt sein kann.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt des (a) In-Reaktionbringens einer Verbindung der allgemeinen Formel (II) R1-CH2-OH (II),wobei R¹ wie oben für Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert ist, mit einem Alkylsulfonylhalogenid oder Arylsulfonylhalogenid; (b) In-Reaktion-bringens des in Schritt (a) erhaltenen Produktes entweder mit (i) einem Alkohohl der allgemeinen Formel (III) R2R3CHOH (III),wobei R² und R³ wie oben für Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert sind, in Gegenwart einer Base; oder mit (ii) einem Alkyliden- oder Arylidenglycerin, das mindestens eine freie Hydroxyl-Gruppe aufweist, in Gegenwart einer Base; und optional, wenn das Produkt aus Schritt (a) in Schritt (b) mit einem Glycerinrest in Reaktion gebracht wird, wird das Produkt aus Schritt (b) weiter mit einem sauren Reagenz in Reaktion gebracht, um die Verbindung der allgemeinen Formel (I) zu erhalten.
Des weiteren betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als wirksamen Bestandteil eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung umfaßt und optional darüber hinaus pharmazeutisch annehmbare Träger, Adjuvanzien, Zusatzstoffe, Verdünnungsmittel und Zusatzstoffe umfaßt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung von 2-O-Arachidonylglycerol, das die folgenden Reagenzien und Bedingungen einsetzt (a) Methansulfonylchlorid, Pyridin, Raumtemperatur (RT), 5 Stunden (h); (b) cis-1,3-Benzylidenglycerin, KOH, 3 h; (c) HCl : Methanol (3 : 7) 20 h.
2 zeigt eine schematische Darstellung eines zweiten Weges zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem 2-O-Arachidonylether erhalten werden können, bei dem die folgenden Reagenzien und Bedingungen eingesetzt werden: (a) Methansulfonylchlorid, Pyridin, RT, 5 h; (b) R-OH, KOH, 3 h, wobei R die hier definierte Gruppe -CHR²R³ ist.
3 stellt die kompetetive Hemmung der Bindung von [³H]HU-243 an den Rezeptor CB₁ durch HU-310 ()dar, % Kont. zeigt die % der Kontrolle an.
4 stellt die kompetetive Hemmung der Bindung von [³H] HU-243 an den Rezeptor CB₂ durch HU-310 () dar, % Kont. zeigt die % der Kontrolle an.
5 stellt die Struktur einiger Verbindungen der Formel 2 dar.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Cannabinoide sind in Cannabis sativa vorkommende organische Substanzen mit verschiedenen pharmakologischen Eigenschaften. Endogene Cannabinoide sind in Säugetieren vorkommende Fettsäurederivate, die pharmakologische Eigenschaften ähnlich denen der Pflanzen-Cannabinoide aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft nicht-hydrolysierbare Derivate von endogenen Cannabinoiden.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I): R1-CH2-O-CHR2R3 (2),wobei der Rest R¹-CH₂- einen Alkenyl-Rest repräsentiert, der abgeleitet ist von einem mehrfach ungesättigten Fettalkohol aus 16 bis 28 Kohlenstoffatomen, wobei der Alkenyl-Rest 2 bis 6 Doppelbindungen enthält, und wobei die erste Doppelbindung bei Zählung vom freien Ende des Alkenyl-Rests aus an C-3, C-6 oder C-9 positioniert ist; R² ein Wasserstoffatom oder eine Nieder-C₁-C₅-Alkylgruppe repräsentiert; und R¹ eine Alkoxyalkyl-Gruppe repräsentiert; oder die CHR²R³-Gruppe eine 2-Glyceryl-Gruppe repräsentiert; wobei die C₁-C₅-Alkyl- und Alkoxyalkyl-Gruppen unabhängig voneinander durch eine oder mehrere Hydroxyl-Gruppen, Amino-Gruppen oder Alkylamino-Gruppen an jedem ihrer Kohlenstoffatome substituiert sein können, wobei jede der Hydroxylgruppen zur Bildung eines Esters weiter substituiert sein kann oder in eine Phosphonat- oder Alkylsulfonat-Gruppe umgesetzt sein kann.
Bevorzugt ist der Alkenyl-Rest innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Octadecatrienyl, Eicosapentaenyl, Docosahexaenyl, Eicosatrienyl oder Eicosatetraenyl.
Wie in den folgenden Beispielen offenbart, sind die besonderen Ausführungsformen der Erfindung 2-Dihomo-γlinolenylglycerylether und Arachidonyl-2-isopropoxyethylether, und insbesondere 2-Arachidonylglycerinether (5). Für diese Verbindungen wurde nachgewiesen, daß sie einen therapeutischen Wert aufweisen, da sie in der Lage sind, für eine längere Zeitdauer an den CB₁-und CB₂-Cannabinoid-Rezeptor zu binden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können radiomarkiert sein und in vielen biologischen, klinischen und diagnostischen Verfahren eingesetzt werden. Da die erfindungsgemäßen Derivate die chemische Natur eines Ethers aufweisen, sind sie stabiler als das endogene Cannabinoid 2-Arachidonylglycerol und können die Beobachtung ihres pharmakologischen Profils daher im Vergleich zu den entsprechenden endogenen Verbindungen über eine längere Zeitdauer erlauben.
Nach einem zweiten Aspekt, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I): R1-CH2-O-CHR2R3 (I),wobei R¹-CH₂- einen Alkenyl-Rest repräsentiert, der abgeleitet ist von einem mehrfach ungesättigten Fettalkohol aus 16 bis 28 Kohlenstoffatomen mit 2 bis 6 Doppelbindungen, wobei die erste Doppelbindung vom freien Ende des Alkenyl-Rests aus gezählt an C-3, C-6 oder C-9 positioniert ist; R² ein Wasserstoffatom oder eine Nieder-C₁-C₅-Alkylgruppe repräsentiert; und R3 eine Alkoxyalkyl-Gruppe repräsentiert; oder die CHR²R³-Gruppe eine 2-Glyceryl-Gruppe repräsentiert; wobei die C₁-C₅-Alkyl- und Alkoxyalkyl-Gruppen unabhängig voneinander durch eine oder mehrere Hydroxyl-Gruppen, Amino-Gruppen oder Alkylamino-Gruppen an jedem ihrer Kohlenstoffatome substituiert sein können, wobei jede der Hydroxylgruppen zur Bildung eines Esters weiter substituiert sein kann oder in ein Phosphonat oder ein Alkylsulfonat umgesetzt sein kann, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (a) In-Reaktion-bringen einer Verbindung der allgemeinen Formel (II) R1-CH2-OH (II),wobei R¹ wie oben definiert ist, mit einem Alkylsulfonylhalogenid oder Arylsulfonylhalogenid; (b) In-Reaktion-bringen des in Schritt (a) erhaltenen Produktes entweder mit (i) einem Alkohohl der allgemeinen Formel (III) R²R³CHOH (III),wobei R² und R³ wie oben definiert sind, in Gegenwart einer Base; oder mit (ii) einem Alkyliden- oder Arylidenglycerin, das mindestens eine freie Hydroxyl-Gruppe aufweist, in Gegenwart einer Base; (c) optional, wenn das Produkt aus Schritt (a) in Schritt (b) mit einem Glycerinrest in Reaktion gebracht wird, wird das Produkt aus Schritt (b) weiter mit einem sauren Reagenz in Reaktion gebracht, um die Verbindung der allgemeinen Formel (I) zu erhalten. Die beiden Formen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in 1 und 2 dargestellt.
Das in dem erfindungsgemäßen verfahren verwendete Alkylsulfonylhalogenid ist bevorzugt Methansulfonylchlorid, wohingegen das eingesetzte Arylsulfonylhalogenid bevorzugt Paratoluolsulfonylchlorid ist.
Bei dem erfindungsgemäßen verfahren ist der bevorzugt eingesetzte Alkohol Isoalkoxyalkohol und, weiter bevorzugt, 2-Isopropoxyethanol oder Propanol. Das eingesetzte Arylidenglycerin ist bevorzugt cis-1,3-Benzylidenglycerin.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung werden die Reaktionsschritte in der Gegenwart von KOH als der Base, bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre ausgeführt. Wenn es erforderlich ist, ein saures Reagenz zu verwenden, ist das bevorzugte Reagenz eine Mischung aus HCl und Methanol, bevorzugt in einem Verhältnis von 1 : 7.
Es ist offensichtlich, daß jede durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Verbindung vom Bereich der Erfindung erfaßt wird.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als wirksamen Bestandteil eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) R1-CH2-O-CHR2R3 (I), wobei der Rest R¹-CH₂- einen Alkenyl-Rest repräsentiert, der abgeleitet ist von einem mehrfach ungesättigten Fettalkohol aus 16 bis 28 Kohlenstoffatomen, enthaltend 2 bis 6 Doppelbindungen, wobei die erste Doppelbindung bei Zählung vom freien Ende des Alkenyl-Rests aus an C-3, C-6 oder C-9 positioniert ist; R² ein Wasserstoffatom oder eine Nieder-C₁-C₅-Alkylgruppe repräsentiert; und R³ eine Alkoxyalkyl-Gruppe repräsentiert; oder die CHR²R³-Gruppe eine 2-Glyceryl-Gruppe repräsentiert; wobei die C₁-C₅-Alkyl- und Alkoxyalkyl-Gruppen unabhängig voneinander durch eine oder mehrere Hydroxyl-Gruppen, Amino-Gruppen oder Alkylamino-Gruppen an jedem ihrer Kohlenstoffatome substituiert sein können, wobei jede der Hydroxylgruppen zur Bildung eines Esters weiter substituiert sein kann oder in eine Phosphonat- oder Alkylsulfonat-Gruppe umgesetzt sein kann, wobei die Zusammensetzung ferner annehmbare Träger, Adjuvanzien, Zusatzstoffe, Verdünnungsmittel und/oder Konservierungsstoffe umfassen kann.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann für eine Vielzahl therapeutischer Zwecke verwendet werden, unter anderem als entzündungshemmende, antiasthmatische, analgetische, hypotensive, antiemetische oder antispasmische Zusammensetzungen, als Zusammensetzungen zur Behandlung und/oder Verhinderung von Glaukom oder Migräne, als Zusammensetzungen zur Linderung von Symptomen multipler Sklerose und stimmungsanregende Zusammensetzungen.
Nach einigen besonderen Ausführungsformen der Erfindung umfassen die Zusammensetzungen als wirksamen Bestandteil 2-Arachidonylglycerinether, 2-Dihomo-γlinolenylglycerylether, 2-isopropoxyethylether, eine Kombination derselben oder eine Kombination derselben mit anderen therapeutisch wirksamen Bestandteilen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in Übereinstimmung mit guter medizinischer Praxis verabreicht und dosiert werden, wobei der klinische Zustand des individuellen Patienten, der Ort und die Methode der Verabreichung, der Zeitplan der Verabreichung, Alter, Geschlecht und Körpergewicht des Patienten und andere dem medizinisch Geschulten bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Die pharmazeutisch "wirksame Menge" für die Zwecke der Erfindung wird daher durch solche Überlegungen, wie sie in der Fachwelt bekannt sind, bestimmt. Die Menge muß wirksam sein, um eine Verbesserung herbeizuführen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, erhöhte Überlebensrate oder schnellere Genesung, oder Verbesserung oder Beseitigung von Symptomen und anderer Indikatoren, die als geeignetes Maß vom Fachmann ausgewählt werden, zum Beispiel Entzündung, Hypertonie, Glaukom und andere Funktionsstörungen und Symptome.
Die Dosen können einzelne Dosen oder Mehrfachdosen über eine Dauer von mehreren Tagen sein, Einzeldosen können aber bevorzugt sein.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden und kann, zusätzlich zu dem wirksamen Bestandteil, pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvanzien, Konservierungsstoffe und Vehikel umfassen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können subkutan oder parenteral verabreicht werden, einschließlich intravenöser, intraarterieller, intramuskulärer und intraperitonealer Verabreichung sowie intrathekale Techniken. Implantate der pharmazeutischen Zubereitungen können ebenfalls nützlich sein. Die pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvanzien und Vehikel sowie Implantatträger generell beziehen sich auf inerte, nicht-toxische feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder einkapselnde Materialien, die nicht mit dem erfindungsgemäßen wirksamen Bestandteil reagieren.
Bei der parenteralen Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird es im allgemeinen in einer injizierbaren Dosiereinheitsform (Lösung, Suspension, Emulsion) formuliert. Die zur Injektion geeigneten pharmazeutischen Formulierungen schließen sterile wäßrige Lösungen und sterile Pulver zur Rekonstitution zu sterilen injizierbaren Lösungen ein, Der Träger kann jeder physiologisch annehmbare geeignete Träger sein, zum Beispiel Wasser oder wäßrige Pufferlösungen.
Darüber hinaus können verschiedene Zusatzstoffe, die die Stabilität, Sterilität und/oder Isotonizität der zusammensetzungen verbessern, einschließlich antimikrobieller Konservierungsstoffe, Antioxidantien, Chelatbildnern und Puffern zugesetzt werden. Eine Verhinderung der Aktivität von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antimykotische Mittel, zum Beispiel Parabene, Chlorobutanol, Phenol und Sorbinsäure sichergestellt werden. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, isotonische Agenzien, zum Beispiel Zucker und Natriumchlorid hinzuzufügen. Eine verringerte Absorption der Darreichungsform kann durch Verwendung von Mitteln erreicht werden, die die Absorption verzögern, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine. Nach der vorliegenden Erfindung müßte jedes/jeder verwendete Vehikel, Verdünnungsmittel oder Zusatzstoff mit den Zusammensetzungen kompatibel sein.
Konventionelle Formen wie die Verabreichung der Zusammensetzung als Tablette, Suspension, Lösung, Emulsion, Kapsel, Pulver und Sirups können ebenfalls verwendet werden. Bekannte Techniken, die sie oral oder intravenös zuführen und die biologische Aktivität erhalten sind bevorzugt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen 1 mg bis 100 mg des wirksamen Bestandteils pro Dosiereinheitsform.
Nach noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie vorstehend definiert zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Dessen ungeachtet kann die erfindungsgemäße Verbindung für diagnostische Zwecke, die dem Fachmann gut bekannt sind und hier auch vorstehend kurz beschrieben wurden, eingesetzt werden. Entsprechend wird die Verbindung mit einem geeigneten Markerrest, wie beispielsweise ³H oder ¹³C, markiert sein.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Ansprüche definiert, deren Inhalte als in der Offenbarung der Beschreibung enthalten anzusehen sind.
Die Erfindung wird nun in einer illustrierenden Weise beschrieben und es sollte ersichtlich sein, daß die Terminologie, die hier verwendet wurde, als Mittel zur bloßen Beschreibung und nicht der Limitierung verwendet wird.
Im Lichte der obigen Lehren sind offensichtlich viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich. Es sollte daher verständlich sein, daß die Erfindung innerhalb des Bereichs der Erfindung auf andere Weise als konkret beschrieben ausgeführt werden kann.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Synthese von 2-O-Arachidonylglycerinether (HU-310) (1)
Arachidonylalkohol (0,34 mmol, 100 mg) in trockenem Pyridin (5 ml) wurde auf 0°C gekühlt. Methansulfonylchlorid (0,52 mmol; 40 mg) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre zu der obigen Lösung hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde langsam auf Raumtemperatur gebracht, bei der die Reaktion für 5 Stunden fortgesetzt wurde. Wasser (20 ml) und Ether (20 ml) wurden dann zu der Reaktionsmischung hinzugefügt, wonach die organische Phase abgetrennt, mit 2N Schwefelsäure, dann mit Wasser und dann mit einer 10%igen Kaliumcarbonat-Lösung gewaschen wurde. Die Reaktionsmischung wurde durch Verdampfung der Lösungsmittel getrocknet, um eine das ölige Produkt Arachidonylmethansulfonat (75 mg; Ausbeute 59%) mit folgenden Eigenschaften zu erhalten: ¹H HMR (CDCl₃) δ 5,34–5,41 (m, 8H), 4,23 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,00 (s, 3H), 2,75–2,84 (m, 6H), 2,04–2,12 (m, 4H), 1,65–1,74 (m, 2H), 1,33–1,50 (m, 2H), 1,25–,130 (m, 6H), 0,89 (t, J = 7,2 Hz, 3H). IR (cm^–1): 2900, 2850, 1350, 1170, 940.
Das ölige Produkt, das wie oben beschrieben erhalten wurde (0,22 mmol; 64 mg) wurde zu einer Mischung von cis-1,3-Benzylidenglycerin (0,214 mmol; 39 mg) und Kaliumhydroxid (170 mg) in trockenem Benzol (10 ml) hinzugefügt und wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre zur Reaktion gebracht. Die Mischung wurde dann mit Wasser gewaschen, anschließend mit einer 10% Salzsäurelösung und dann erneut mit Wasser. Die Mischung wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, wonach das Lösungsmittel verdampft wurde und das Produkt eine Säulenchromatographie durchlief, um das ölige Produkt. 2-O-Arachidonyl-1,3-benzylidenglycerin, (26 mg, Ausbeute 33%) zu erhalten. Das erhaltene Produkt wies folgendes auf: ¹H NMR (CDCl₃) δ 7,48–7,52 (m, 2H), 7,33–7,38 (m, 3H), 5,54 (s, 1H), 5,32–5,41 (m, 8H), 4,32 (d, J = 12,6 Hz, 2H), 4,03 (d, J = 14,1 Hz, 2H), 3,55 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,25 (m, 1H), 2,75–2,84 (m, 6H), 2,04–2,18 (m, 4H), 1,60-1,70 (m, 2H), 1,20–1,38 (m, 8H) 0, 88 (t, J = 6,9 Hz, 3H). IR (cm^–1): 2900, 2850, 1450, 1380, 1340, 1150, 1100.
Das oben erhaltene Öl, 2-O-Arachidonyl-1,3-benzylidenglycerin, wurde dann in einer Mischung aus Methanol und konzentrierter Salzsäure (7 : 3, 10 ml) gelöst und unter Stickstoffatmosphäre für 3 h bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht, wonach das Methanol unter vermindertem Druck verdampft wurde und der Säurerest durch azeotrope Destillation mit Benzol entfernt wurde, um das gewünschte Produkt 2-O-Arachidonylglycerinether (hier als HU-310 bezeichnet) in der Form eines gelblichen Öls bereitzustellen. Das Produkt (35 mg, Ausbeute 87%) wies folgendes auf: (1) ¹H NMR (CDCl₃) δ 5,34–5,39 (m, 8H), 3,66–3,79 (m, 4H), 3,58 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,43–3,46 (m, 1H), 2,75–2,84 (m, 6H), 1,99– 2,20 (m, 4H), 1,60–1,70 (m, 2H), 1,20–1,42 (m, 8H), 0,89 (t, J = 6,9 Hz, 3H), IR (cm^–1); 3350, 290, 2850, 1440, 1040. (2) GC-MS (EI) nach Silylierung mit BSTFA zeigte M⁺ bei m/z 508. [M – 15]⁺ bei m/z 493, während erhaltene m/z 405, 383, 272, 219, 150, 129, 103 and 73 betrugen.
Andere Ether wie beispielsweise 2-Dihomo-γ-linolenylglycerylether (hier als HU-314 bezeichnet) und Arachidonyl-2-isopropoxyethylether (hier ebenfalls als HU-313 bezeichnet) wurden hergestellt, indem das Arachidonylmethansulfonat mit einem Alkohol, wie beispielsweise 2-Isopropyloxyethanol bzw. Propanol (2), in Reaktion gebracht wurde. Die Produkte wurden mit guter Ausbeute (60–70%) erhalten.
Beispiel 2 – Biologische Tests und Ergebnisse
Analgesie
Die wie oben beschrieben hergestellten neuen Verbindungen wurden auf ihre Wirksamkeit hinsichtlich einer Reduzierung von Analgesie mit Hilfe des Standard"Hot-plate"-Tests, wie unten kurz beschrieben, untersucht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen (HU-310, HU-313 and HU-314) wurden in einer Detergenz-Mischung (Emulphor : Ethanol : Salzlösung (5 : 5 : 90)) gelöst und durch intravenöse Injektion mit einem Injektionsvolumen von 0,1 ml/10 g Körpergewicht in die Schwanzvene von Mäusen verabreicht. Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß alle drei erfindungsgemäßen Verbindungen wirksame analgetische Mittel sind, wobei HU-310 das wirksamste ist.
TABELLE 1 – Analgesie-Verminderung bei Mäusen
Antiemetische Aktivität
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden nach dem von Feigenbaum et al. [Eur. J. Pharmacol. 169: 159–165 (1989)] beschriebenen Verfahren, bei dem an Erbrechen, verursacht durch ein antineoplastisches Arzneimittel (Cisplatin), leidende Tauben als Modell verwendet wurden, auf ihre Wirksamkeit als antiemetisches Mittel geprüft.
Entsprechend wurde jede Verbindung in Emulphor(Detergenz) : Ethanol : Salzlösung (5 : 5 : 90) gelöst und subkutan an die Tauben verabreicht. Das Injektionsvolumen betrug 1,0 ml/kg Körpergewicht. Die Verminderung von Erbrechen mit 2-O-Arachidonylglycerinether (HU-310) betrug 50% bei Verwendung von 3,0 mg des wirksamen Bestandteils pro kg Körpergewicht. Im Falle von 2-Dihomo-γlinolenylglycerylether (HU-314) und Arachidonyl-2-isopropoxyethylether (HU-313) wurde das Erbrechen ebenfalls vermindert, wenn auch in einem verminderten Umfang.
Antiglaukom-Aktivität
Jede Verbindung wurde darüber hinaus auf ihre Wirksamkeit als Mittel zur Behandlung und/oder Verhinderung von Glaukom untersucht. Entsprechend wurde, wie von Mechoulam R. et al., [Mechoulam R. et al., The Therapeutic Potential of Marihuana, Hrsg. S. Cohen, R. C. Stillman, Plenum Press, N. Y., S. 35–48 (1975)] beschrieben, bei Kaninchen durch Injizieren von δ-Chymotrypsin in das Auge stabiles Glaukom induziert. Als Kontrolle wurde Pilocarpin, ein übliches Antiglaukom-Arzneimittel eingesetzt, welches bei einer Konzentration von 0,01 in wäßriger Lösung eine Verminderung des introkulären Drucks (intraocular Pressure, I.O.P.) zeigte, und eine Verzögerung bei der Wiederherstellung des ursprünglichen chymotrypsininduzierten IOP von 30 Stunden hervorrief.
Jede der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in eine Detergenz-Mischung (Emulphor : Ethanol : Salzlösung (5 : 5 : 90)) gelöst und dann weiter mit Salzlösung verdünnt, um die gewünschten Konzentrationen zu erhalten. Es zeigte sich, daß die Verbindungen bei der Reduzierung des I.O.P. wirksam sind. Bei Verabreichung an das Auge bei einer Konzentration von 0,1% verzögerten sie die Wiederherstellung des ursprünglichen chymotrypsininduzierten IOP für 4–10 Stunden.
Entzündungshemmende Aktivität
Die Wirksamkeit jeder der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde nach der von Calhoun W. et al., [Calhoun W. et al. Agents and Actions 21: 306–309 (1987)] beschriebenen Methode auf ihre Wirksamkeit, als entzündungshemmende Mittel zu agieren, untersucht. Bei dem Verfahren wurde Wasser durch Quecksilber als Verdrängungs-Medium ersetzt. Blutplättchenaktivierungsfaktor (Platelet Activating Factor (PAF)) (1,0 μg) oder Arachidonsäure (1,0 mg), gelöst in 50 μg Salzpuffer enthaltend 5% Ethanol wurden subkutan in die plantare Oberfläche der rechten Hinterpfote von etheranästhesierten weiblichen Mäusen 20–25 g) injiziert. Vor der Behandlung und 15 min nach der PAF-Injektion oder 30 min nach der Arachidonsäureinjektion wurde das Volumen des rechten Fußes bis zur Höhe des lateralen Malleolus durch Wasserverdrängung bestimmt. Für jede Maus wurde die Veränderung im Pfotenvolumen errechnet. Tabelle 2 zeigt die Hemmung von arachidonsäureinduzierter Pfotenschwellung. Die erhaltenen Werte werden als Anstieg im Pfotenvolumen unter Verwendung eines Plethysmometers gemessen. Das Maß des Anschwellens wurde ausgedrückt als Prozentanteil bei arzneimittelbehandelten Mäusen verglichen mit der Hemmung des Pfotenödems bei vehikel(Emulphor-Ethanol : Salzlösung)-behandelten Kontrollen (95% Signifikanz durch ANOVA. N = 5 Mäuse/Gruppe). Kontrolltiere erhielten Erdnußöl (50 μl). Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß sowohl HU-310 als auch HU-313 wirksame entzündungshemmende Mittel sind.
TABELLE 2 – Hemmung von arachidonsäureinduziertem Pfotenödem. ^a,b
Hypertonie
Zur Ermittlung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen als Anti-Hypertoniemittel wurde jede Verbindung in einer Mischung aus Ethanol : Emulphor : Salzlösung (1 : 1 : 18) gelöst und an nicht-anästhesierte Ratten verabreicht, durch die Aorta (zur Injektion) und die Jugular-Vene (zur Messung des Blutdrucks) kanülisiert. Injektion von Salzlösung oder der Auflösungs-Mischung (Ethanol : Emulphor : Salzlösung) zeigte keine Wirkung auf den mittleren Arteriendruck, während HU-310 eine signifikante Wirkung auf den Arteriendruck zeigte. Tabelle 3 zeigt die Wirkung von HU-310 im Vergleich mit Anandamid (ANA) und 2-Ara-GL.
Die folgenden Daten zeigen, daß das endogene Cannabinoid 2-ARA-GL eine moderate, kurzdauernde Hypotonie hervorrief, während HU-310 eine signifikant profundere und länger andauernde Herabsetzung des Blutdrucks induzierte.
TABELLE 3 – Vergleich der hypotensiven Wirkungen von ANA, 2-ARA-GL und HU-310
Bindung der erfindungsgemäßen Verbindungen an die CB₁und CB₂-Cannabinoid-Rezeptoren
Bindung an CB₁
Die Bindung der wirksamen Verbindungen an den CB₁-Rezeptor wurde nach der von Devane et al. [Devane et al., J. Med. Chem. 35: 2065–2069 (1992b)] beschriebenen Methode bestimmt, wie auch die Herstellung der synaptosomalen Membran und des Liganden-Bindungs-Assays. Nach diesem Verfahren wurde die Bindung der erfindungsgemäßen wirksamen Verbindungen bestimmt unter Einsatz von [³H] HU-243, das die markierte Form von 5¹-(1,1-Dimethylheptyl)-7-hexahydrocannabinol darstellt, die ebenfalls von Devane et al [Devane et al. (1992b) ibid.] beschrieben wurde.
Im Prinzip wurden 4 μg des Synaptosomalmembranproteins in 50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl₂ und 1 mM EDTA pH 7.4 homogenisiert, um die Bindungsmischung mit einer Endkonzentration von 60 pM zu erhalten, mit der Ki nach dem von Devane et a1. [Devane et al. (1992) ibid.] beschriebenen Test bestimmt wurde. Der für HU-310 nach dieser Methode erhaltene Ki-Wert betrug 62,3 ± 3,0 IC₅₀. Die Ki-werte wurden nach der folgenden bekannten Gleichung ermittelt: Ki-IC₅₀/(1 + [L]/Kd), wobei IC₅₀ die Konzentration einer Verbindung ist, die eine spezifische Bindung eines Radioliganden um 50% vermindert; [L] ist die Konzentration des im Test verwendeten Radioliganden und Kd ist die Dissoziationskonstante für den Radioliganden (siehe auch 3).
Bindung an CB₂
Die Bindung an CB₂-Rezeptoren von Nierenzellen afrikanischer Grüner Meerkatzen (COS-Zellen) wurde bestimmt durch zunächst vorübergendes Transfizieren der Zellen mit geeigneten Plasmiden, die eine Sequenz enthielten, die CB² kodiert, gebunden an einen Träger (5 μg/100-mm-Platte), unter Anwendung der DEAE-Dextran-Methode [Avidor R. et al. J. Biol. Chem. 271: 21309– 21315 (1996)). Zwei Tage später wurden die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, abgeschabt, niedergeschlagen, und bei –80°C gelagert, wonach der Zell-Niederschlag in 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, und 2.5 mM EDTA, pH 7.4 homogenisiert wurde. Die ligandenhaltige Mischung wurde darüber hinaus mit 10 mM CaCl₂ versetzt, um die Bindungsmischung zu erhalten, in der die Endkonzentration des radiomarkierten Liganden [³H]HU-243 300 pM betrug. Die Bestimmung der Ki-werte wurde dann wie von Rhee et al. [Rhee et al. J. Med. Chem. 40: 3228–3233 (1997)] beschrieben erhalten. Die nach dieser Methode erhaltenen entsprechenden Ki-Werte für HU-310 betrugen 459,4 ± 118,2 (4).
Die Bindung von 2-Arachidonylglycerinether an CB¹ und an CB² ist in 3 bzw. 4 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß HU-310 ein wirksames Substrat für die zwei Cannabinoid-Rezeptoren CB¹ und CB² ist.

Claims

Verbindung der allgemeinen Formel R1-CH2-O-CHR2R3 (I),wobei R¹-CH₂- einen Alkenyl-Rest repräsentiert, der abgeleitet ist von einem mehrfach ungesättigten Fettalkohol aus 16 bis 28 Kohlenstoffatomen, enthaltend 2 bis 6 Doppelbindungen, wobei die erste Doppelbindung bei Zählung vom freien Ende des Alkenyl-Rests aus an C-3, C-6 oder C-9 positioniert ist; R² ein Wasserstoffatom oder eine Nieder-C₁-C₅-Alkylgruppe repräsentiert; und R³ eine Alkoxyalkyl-Gruppe repräsentiert; oder die CHR²R³-Gruppe eine 2-Glyceryl-Gruppe repräsentiert; wobei die C₁-C₅-Alkyl- und Alkoxyalkyl-Gruppen unabhängig voneinander durch eine oder mehrere Hydroxyl-Gruppen, Amino-Gruppen oder Alkylamino-Gruppen an jedem ihrer Kohlenstoffatome substituiert sein können, wobei jede der Hydroxylgruppen zur Bildung eines Esters weiter substituiert sein kann oder in eine Phosphonat-Gruppe oder Alkylsulfonat-Gruppe umgesetzt sein kann.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Alkenyl-Rest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Octadecatrienyl, Eicosapentaenyl, Docosahexaenyl, Eicosatrienyl oder Eicosatetraenyl.
Verbindung nach Anspruch 2, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus 2-Arachidonylglycerinether, 2-Dihomo-γ-linolenylglycerylether und Arachidonyl-2-isopropoxyethylether.
Radiomarkierte Verbindung nach Anspruch 1.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel R¹-CH₂-O-CHR²R³ (I), wobei R¹-CH₂- einen Alkenyl-Rest repräsentiert, der abgeleitet ist von einem mehrfach ungesättigten Fettalkohol aus 16 bis 28 Kohlenstoffatomen mit 2 bis 6 Doppelbindungen, wobei die erste Doppelbindung vom freien Ende des Alkenyl-Rests aus gezählt an C-3, C-6 oder C-9 positioniert ist; R² ein Wasserstoffatom oder eine Nieder-C₁-C₅-Alkylgruppe repräsentiert; und R³ eine Alkoxyalkyl-Gruppe repräsentiert; oder die CHR²R³-Gruppe eine 2-Glyceryl-Gruppe repräsentiert; wobei die C₁-C₅-Alkyl- und Alkoxyalkyl-Gruppen unabhängig voneinander durch eine oder mehrere Hydroxyl-Gruppen, Amino-Gruppen oder Alkylamino-Gruppen an jedem ihrer Kohlenstoffatome substituiert sein können, wobei jede der Hydroxylgruppen zur Bildung eines Esters weiter substituiert sein kann oder in eine Phosphonat-Gruppe oder Alkylsulfonat-Gruppe umgesetzt sein kann, umfassend die Schritte: a) In-Reaktion-bringen einer Verbindung der allgemeinen Formel (II) R1-CH2-OH (II),wobei R¹ wie oben definiert ist, mit einem Alkylsulfonylhalogenid oder Arylsulfonylhalogenid; b) In-Reaktion-bringen des in Schritt (a) erhaltenen Produktes entweder mit (i) einem Alkohohl der allgemeinen Formel (III) R2R3CHOH (III),wobei R² und R³ wie oben definiert sind, in Gegenwart einer Base; oder mit (ii) einem Alkyliden- oder Arylidenglycerin, das mindestens eine freie Hydroxyl-Gruppe aufweist, in Gegenwart einer Base; optional, wenn das Produkt aus Schritt (a) in Schritt (b) mit einem Glycerinrest in Reaktion gebracht wird, wird das Produkt aus Schritt (b) weiter mit einem sauren Reagenz in Reaktion gebracht, um die Verbindung der allgemeinen Formel (I) zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Alkylsulfonylhalogenid Methansulfonylchlorid ist.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Arylsulfonylhalogenid Paratoluolsulfonylchlorid ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Alkohol ein Isoalkoxyalkohol ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Alkohol 2-Isopropoxyethanol ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Reaktion in Gegenwart von KOH durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Arylidenglycerin Cis-1,3-Benzylidenglycerin ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das saure Reagenz eine Mischung aus HCl und Methanol ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Mischung aus HCl und Methanol in einem Verhältnis von 1.7 erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Reaktionsschritte bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend als wirksamen Bestandteil eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), wie in Anspruch 1 oder Anspruch 3 definiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die Zusammensetzung ferner annehmbare Träger, Adjuvanzien, Zusatzstoffe, Verdünnungsmittel und/oder Konservierungsstoffe umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Zusammensetzung eine entzündungshemmende, antiasthmatische, analgetische, hypotensive, antiemetische oder antispasmische Zusammensetzung, eine Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Verhinderung von Glaukom oder Migräne, eine Zusammensetzung zur Linderung von Symptomen multipler Sklerose oder eine stimmungsanregende Zusammensetzung ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15–17, wobei der wirksame Bestandteil ausgewählt ist aus 2-Arachidonylglycerinether, 2-Dihomo-γlinolenylglycerylether und Arachidonyl-2-isopropoxyethylether.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15–18, in Dosiereinheitsform.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei die Dosiereinheitsform 1 mg bis 100 mg des wirksamen Bestandteils umfaßt.
Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Verbindung der allgemeinen Formel (I) nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Diagnose, wobei die Verbindung mit ³H oder ¹³C markiert ist.