JP2006517194A - 骨成長を調節するための方法、組成物および製造物 - Google Patents

Abstract

骨成長および再構築を調節すること、骨疾患を防止すること、および骨細胞のカンナビノイド受容体媒介作用により骨成長または修復を誘導することに適した新規な方法および薬学的組成物が開示される。さらに、骨成長調節剤を同定する方法が開示される。

Description

本発明は、骨の成長および再構築を調節する方法、骨疾患を処置または防止する方法、骨の成長および最大骨量または修復を誘導する方法、骨成長を調節するための薬学的組成物、骨成長調節剤の製造物、ならびに骨成長調節剤を同定する方法に関する。詳細には、本発明では、骨細胞におけるカンナビノイド受容体の発現または活性を調整し、それにより骨成長を調節することが用いられる。

天然に存在するカンナビノイドは、植物由来および内因性の２つのカテゴリーに分けることができる。植物由来のカンナビノイドは、広く知られているΔ^９−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）（これは大麻における向精神性成分である）によって例示される劇的な精神行動的作用を誘発することが知られている。植物由来のカンナビノイドはまた、複雑な心臓血管作用を有することが知られており、その顕著な構成要素の１つが低血圧症である［Ｖｏｌｌｍｅｒ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２６：１８６〜１９８（１９７４）］。内因性のカンナビノイド（エンドカンナビノイド）は、受容体結合部位を植物由来のカンナビノイドと共有し、その神経行動的作用の多くを模倣する脂質様分子の一群である［Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ他、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．、４０２：９５〜１０１（１９９６）］。２つのエンドカンナビノイドが少し詳しく特徴づけられている：アラキドニルエタノールアミド（アナンダミド）［Ｄｅｖａｎｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１９４６〜１９４９（１９９２）；Ｆｅｌｄｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７６５６〜７６６０（１９９３）］および２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）［Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５０：８３〜９０（１９９５）］。

さらなる天然カンナビノイドまたは合成カンナビノイドが下記に記載されている：米国特許第４３７１７２０号、同第５０１３３８７号、同第５０８１１２２号、同第５２９２７３６号、同第５４６１０３４号、同第５６１８９５５号、同第６１６６０６６号および同第６５３１６３６号；国際特許出願公開ＷＯ０１／９７７３、同ＷＯ９７／２９０７９、同ＷＯ９９／０２４９９、同ＷＯ９８／４１５１９および同ＷＯ９４／１２４６６；欧州特許第ＥＰ０５７０９２０号および同第ＥＰ０４４４４５１号；フランス国特許第ＦＲ２７３５７７４号；イスラエル国特許第ＩＬ０１／００５５１号および同第ＩＬ９９／００１８７号；ＧａｏｎｉおよびＭｅｃｈｏｕｌａｍ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、９３、２１７（１９７１）；Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６９、６１１（１９７０）；Ｅｄｅｒｙ他、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９１、４０（１９７１）；Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、９４、７９３０（１９７２）；Ｒ．Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ（編）、“大麻：化学、代謝、薬理学および臨床作用”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９７３、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｒｙ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１７、２８７（１９７４）；Ｈｏｕｒｙ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１８、９５１（１９７５）；Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ他、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、７６、７５（１９７６）；Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２３、１０６８（１９８０）；Ｓｒｅｂｎｉｋ他、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ．、２８８１（１９８４）；Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、１、３１５（１９９０）；Ｄｅｖａｎｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８、１９４６（１９９２）；Ｂｕｒｓｔｅｉｎ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３５、３１３５（１９９２）；Ｈａｎｕｓ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３６、３０３２（１９９３）；Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５０、８３（１９９５）；Ｓｈｅｓｋｉｎ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４０、６５９（１９９７）；Ｒｈｅｅ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４０、３２２８（１９９７）；Ｈａｎｕｓ他、ＰＮＡＳ、９８、３６６２（２００１）。

エンドカンナビノイドは、特異的な受容体に結合し、それにより神経伝達物質およびホルモン調節因子を活性化することによってその作用を発揮する［Ｐｉｏｍｅｌｌｉ他、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、２１：２１８〜２２４（２０００）；Ｐｅｔｗｅｅ，Ｒ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、６：６３５〜６６４（１９９９）；Ｄｅｖａｎｅ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３５：２０６５〜２０６９］。

今日まで、２つのタイプの高親和性のカンナビノイド受容体が分子クローニングによって同定されている：（ｉ）ＣＢ１受容体（これは、ほとんどが脳に存在するが［Ｄｅｖａｎｅ他、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３４：６０５〜６１３（１９８８）；Ｍａｔｓｕｄａ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：５６１〜５６４（１９９０）］、一部の末梢組織にもまた存在する［Ｓｈｉｒｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：３７２６〜３７３１（１９９５）；Ｉｓｈａｃ他、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１１８：２０２３〜２０２８（１９９６）］）、および（ｉｉ）ＣＢ２受容体（これは脾臓内のマクロファージに存在する［Ｍｕｎｒｏ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：６１〜６５（１９９３）］）。他のタイプまたはサブタイプのカンナビノイド受容体が最近報告されており、これらは、ＣＢ１様受容体、ＣＢ２様受容体および非ＣＢ１非ＣＢ２受容体と呼ばれている［Ｈａｎｕｓ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、５４：１６１〜２０２（２００２）］。

内因性カンナビノイドの生理学的役割およびエンドカンナビノイドシグナル伝達の経路は、さかんに行われている研究の対象であり、神経系、心臓血管系、免疫系および生殖系において様々なプロセスに影響を及ぼすことが報告されている［Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３５９：１〜１８（１９９８）；ＡｘｅｌｒｏｄおよびＦｅｌｄｅｒ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２３：５７５〜５８１（１９９８）；Ｗａｇｎｅｒ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、７６：８２４〜８３６（１９９９）；Ｋｌｅｉｎ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１９：３７３〜３８１（１９９８）］。

その結果として、様々なカンナビノイドおよびカンナビノイド受容体リガンドが、様々な医学的障害を処置するための有用な治療剤として使用または記載されている。

例えば、ＴＨＣが、ガン患者またはＡＩＤＳ患者による過度な体重減少を防止するために広範囲に使用されている［Ｍｅｃｈｏｕｌａｍ他、Ｅ．Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３５：１９９〜２４３（１９９８）］。

米国特許第５９３９４２９号には、出血性ショックを含む心臓血管状態を処置するために、また、過度な血管収縮に関連する他の状態、例えば、高血圧、末梢血管疾患、肝硬変、およびある種の形態の狭心症などにおいて、ＣＢ１受容体ならびに他のカンナビノイド受容体のアゴニストを使用することが開示される。さらに、この特許では、マクロファージのエンドトキシン活性化により引き起こされる低血圧を処置するためにＣＢ１および他のカンナビノイド受容体のアンタゴニストを使用することが教示される。

米国特許第６１６６０６６号には、臓器移植患者における組織拒絶を防止するために、また、自己免疫関連疾患を処置するために、ＣＢ２受容体に対して選択的であるカンナビノイドを免疫抑制剤として使用することが開示される。

米国特許出願第０９／７７９１０９号には、呼吸器または非呼吸器での白血球活性化に関連する疾患を処置するためにカンナビノイド受容体調節因子を使用することが開示される。例示的な非呼吸器カンナビノイド受容体媒介の疾患には、移植拒絶、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、狼瘡、移植片対宿主病、Ｔ細胞媒介の過敏性疾患、乾癬、橋本甲状腺炎、ギラン・バレー症候群、ガン、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、および虚血性傷害または再潅流傷害が含まれる。

米国特許出願第１０／０３２１６３号には、内因性カンナビノイド受容体に特異的に結合し、その結果、グルタミン酸誘導による神経毒性から細胞を保護するようにするカンナビノイドアゴニストの活性を増大させる方法が開示される。

なおも、様々なカンナビノイドまたはカンナビノイド受容体リガンドが治療剤としての使用について提案されているが、骨に関係した疾患を処置または防止するためにカンナビノイドを適用することは、先行技術分野では、これまで一度も記載または示唆されていない。

本発明を実施に移しているとき、本発明の発明者らは、驚くべきことに、骨の成長および再構築を調節することにおけるエンドカンナビノイドの主要な役割を発見した。この発見は、例えば、カンナビノイドまたはカンナビノイド受容体リガンドを、骨の疾患および傷害を処置するための治療剤として、そして同様に、骨形成を促進させるための治療剤として使用することが潜在的に有益であることを示している。

骨は、骨芽細胞（これにより、新しい骨が作られる）および破骨細胞（これにより、骨が破壊される）によって媒介される複雑なプロセスでの絶え間ない分解および再合成を受けている。このプロセスは骨再構築と呼ばれている。これらの細胞の活性は非常に多数のサイトカインおよび増殖因子によって調整されており、それらの多くが、現在、同定およびクローン化されている。

極めて多数の状態が、骨形成を促進し、かつ／または骨再吸収を阻害することが必要であることによって特徴づけられる。おそらくは、骨折の場合が最も明らかであり、この場合には、骨の成長を刺激すること、および、骨の修復を急がせ、完全にすることが望まれる。骨形成を高める作用因子はまた、骨内インプラントおよび顔面再建法において有用であり、また、補綴用および治療用の骨インプラントの成長しつつある分野では非常に重要である。他の骨欠損状態には、骨の分節性欠陥、歯周病、転移性骨疾患、溶骨性骨疾患、および、結合組織の修復が有益である状態（例えば、軟骨の欠陥または傷害の治癒または再生など）が含まれる。骨粗鬆症（老人性骨粗鬆症、および閉経後のホルモン状態に関連する骨粗鬆症を含む）の慢性的状態もまた非常に重要である。骨成長が必要であることによって特徴づけられる他の状態には、原発性および二次的な上皮小体機能亢進症、びまん性骨粗鬆症、糖尿病に関係した骨粗鬆症、およびグルココルチコイドに関係した骨粗鬆症が含まれる。

他方で、骨形成を阻害するか、または骨再吸収を促進することが必要であることによって特徴づけられる様々な状態が存在する。これらには、特定の病期段階のパジェット病、芽細胞の転移性骨ガン、ホジキンリンパ腫、退行性硬化症および骨髄炎が含まれる。骨成長の阻害および骨再吸収において効果的であることが知られている薬剤には、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３、グルココルチコイド、オメプラゾール、血清タンパク質フェチュイン、ノギン、コルジンおよびＤＡＮタンパク質、ならびに高濃度のＴＧＦ−βがある。しかしながら、上記薬剤のすべて（特に、グルココルチコイドおよび他のホルモン）は、広範囲の様々な組織に対してその影響を発揮することが知られており、そのため、骨疾患における薬理学的応用のためには適していない。

骨に関係した疾患を処置するための様々な治療剤および治療法が特許刊行物において開示されている。

米国特許第５４６１０３４号には、骨髄移植に備えて骨形成および骨髄を高めるために、再生中の骨髄から同定された骨形成性の成長ポリペプチドが開示される。米国特許第５２８００４０号には、骨粗鬆症の処置において有用であるとして記載される抗エストロゲン性経口避妊化合物の３，４−ジアリールクロマン化合物が開示される。米国特許第６３５２９７３号には、骨成長を高めるために、血清から最初に単離されたＴＧＦ−βスーパーファミリーのサイトカインの骨形態形成ポリペプチドを含有する組換えタンパク質が開示される。米国特許第６４６２０１９号には、プロテアソーム活性を有しないマウスが、大理石骨病として知られている過度な骨形成の状態を発症するという観測結果に基づいて、破骨細胞の活性を阻害し、かつ骨成長を刺激するための、プロテアソーム活性およびプロテアソーム産生の阻害剤が開示される。

国際特許出願公開第９２／１５６１５号には、血清カルシウムレベルの上昇を引き起こす骨障害を処置するために血清カルシウムレベルを低下させるように作用する、ブタ膵臓から得られたタンパク質が開示される。

国際特許出願公開第９２／１４４８１号には、アクチビンおよび骨形態形成タンパク質を含有する、骨成長を誘導するための組成物が開示される。

欧州特許出願第５０４９３８号には、骨疾患の処置においてシステインプロテアーゼを阻害するジペプチドまたはトリペプチドの使用が開示される。

欧州特許出願第４９９２４２号には、骨芽細胞の増殖がそのような組成物により引き起こされるので、骨量の減少を伴う骨疾患において有用であると考えられる骨細胞増殖因子組成物の使用が開示される。

欧州特許出願第４５１８６７号には、カルシウムまたはリン酸に関連する代謝異常（骨粗鬆症など）を処置するための副甲状腺ホルモンペプチドアンタゴニストが開示される。

それにもかかわらず、現在、骨欠陥を管理することに対する薬学的方法はどれも満足すべきものではない。骨折は、依然として、ギブス包帯、ブレース、固定具および他の狭義の機械的手段をもっぱら使用して処置されている。さらに、閉経後の骨粗鬆症に関連するさらなる骨悪化は、一部の個体には欠点を有し得るエストロゲン系薬剤またはビスホスホナート系薬剤で処置されている。

骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）はインビトロおよびインビボでの骨形成の強力な刺激因子であるが、骨の治癒を高めるための治療剤としてのその使用には欠点がある。骨形態形成タンパク質に対する受容体が多くの組織で同定されており、また、ＢＭＰ自身が、特異的な時間的かつ空間的な様式で、非常に様々な組織で発現している。このことは、ＢＭＰが、骨に加えて、多くの組織に対して様々な作用を有し得ることを示唆しており、これにより、全身投与されたときの治療剤としてのその有用性が潜在的に制限される。そのうえ、ＢＭＰはペプチドであるので、注射によって投与されなければならない。これらの欠点は、ＢＭＰを治療剤として開発することに対して厳しい制限を課している。

フッ化物は、骨形成を高める目的のためにもまた提案される一方で、例えば、Ｂｕｒｇｅｎｅｒ他（Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ Ｒｅｓ（１９９５）、１０：１６４〜１７１）により記載されるように、骨芽細胞上の増殖因子受容体のチロシンリン酸化に関係づけられ得る作用様式を有しているが、フッ化物の投与には、骨の石灰化に対する有害な影響のためであるとおそらくは考えられる骨もろさの増大が伴う。

副甲状腺ホルモンは、現在、骨形成を代謝的に高めるための優れた薬剤であると見なされているが、注射により投与されるだけであるので、固有的な問題を有している。

このように、様々な方法（例えば、上記に記載された方法など）が試みられているが、これらの状態を処置するために使用され得る薬剤のレパートリーに加えることが依然として求められている。

従って、これらの状態を処置するために使用され得る、正常なシグナル伝達経路を介して作用する新規な効果的な骨成長調節剤が必要であることが広く認められており、また、そのような骨成長調節剤を得ることは非常に好都合である。従って、本発明は、カンナビノイド受容体を調整することに基づいて骨成長を調節し、また、骨欠陥を処置または防止するための新規な方法、薬学的組成物および製造物を提供する。

本発明の１つの局面によれば、骨成長および／または骨再構築を調節する方法で、少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性を調整し、それにより骨成長および／または骨再構築を調節することを含む方法が提供される。

本発明の別の局面によれば、必要性のある対象において骨疾患を処置または防止する方法で、対象の少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性を調整し、それにより対象において骨疾患を処置または防止することを含む方法が提供される。

本発明のさらに別の局面によれば、必要性のある対象において骨成長および／または骨修復を誘導する方法で、（ａ）骨細胞を単離すること、（ｂ）骨細胞の少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性を調整すること、および（ｃ）工程（ｂ）から得られた骨細胞を対象に投与し、それにより対象において骨成長または骨修復を誘導することを含む方法が提供される。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、対象は脊椎動物である。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、脊椎動物はヒトである。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体の活性化またはリガンド結合を妨げる分子はＳＲ−１４１７６１Ａである。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、対象は、骨粗鬆症、骨折または骨不全症、原発性または二次的な上皮小体機能亢進症、変形性関節炎、歯周病または歯周欠陥、溶骨性骨疾患、形成手術後、整形外科的埋め込み後、および歯科埋め込み後からなる群から選択される状態または疾患に罹患している。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この方法は、骨形成を促進し、かつ／または骨再吸収を阻害することができる少なくとも１つの化合物を対象に投与することをさらに含む。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、少なくとも１つの化合物は、骨形態形成タンパク質、抗再吸収剤、骨形成性因子、軟骨由来形態形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＩＧＦ１、ＦＧＦ、ノギン、骨形成性成長ペプチド、成長ホルモン、エストロゲン系薬剤、ビスホスホナート系薬剤、スタチンおよび分化因子からなる群から選択される。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、対象は、パジェット病、骨芽細胞性骨疾患、芽細胞性転移性骨ガン、転移性骨疾患、ホジキンリンパ腫、退行性硬化症および骨髄炎からなる群から選択される状態または疾患に罹患している。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらになおさらなる特徴によれば、この方法は、骨形成を阻害し、かつ／または骨再吸収を促進することができる少なくとも１つの化合物を対象に投与することをさらに含む。

本発明のさらに別の局面によれば、骨成長および／または骨再構築を調節するための薬学的組成物であって、骨細胞の少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性を調整することができる薬剤と、骨成長および／または骨再構築を調節することができる化合物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物が提供される。

本発明のさらに別の局面によれば、充填用物質と、骨疾患または骨欠陥の処置のために同定されている薬学的組成物の治療効果的な量とを含む製造物が提供され、この場合、薬学的組成物は、少なくとも１つのカンナビノイド受容体の活性または発現を調整することができる薬剤と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの化合物は、骨形態形成タンパク質、抗再吸収剤、骨形成性因子、軟骨由来形態形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＩＧＦ１、ＦＧＦ、ノギン、骨形成性成長ペプチド、成長ホルモン、エストロゲン系薬剤、ビスホスホナート系薬剤、スタチンおよび分化因子からなる群から選択される。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、薬学的組成物は、骨形成を阻害するか、または骨再吸収を促進することができる少なくとも１つの化合物を含む。

本発明のさらなる局面によれば、骨成長調節剤を同定する方法で、多数の分子をスクリーニングし、それにより、少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性を調整することができる、骨成長調節剤である分子を明らかにすることを含む方法が提供される。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この方法は、骨形成速度を変化させる分子の能力を測定すること、および／または骨石灰化周囲を変化させることをさらに含む。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、スクリーニングは、骨細胞を多数の分子にさらし、骨細胞における少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現を測定することによって行われる。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つのカンナビノイド受容体は骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体である。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、カンナビノイド受容体の発現はＲＴ−ＰＣＲによって測定される。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、骨細胞前駆体は、骨形成性細胞、間質細胞または骨再吸収細胞前駆体である。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、調整することはアップレギュレーションすることであり、この場合、発現または活性をアップレギュレーションすることは、薬剤によって、または、（ａ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体の機能的部分を少なくとも発現させるために設計および構築された外因性ポリヌクレオチド配列、（ｂ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードする内因性ＤＮＡまたはｍＲＮＡの発現を増大させる化合物、および（ｃ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体を活性化する分子、からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を対象に投与することによって行われる。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つのカンナビノイド受容体を活性化する分子はカンナビノイドである。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、カンナビノイドは２ＡＧである。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、調整することはダウンレギュレーションすることであり、この場合、発現または活性をダウンレギュレーションすることは、薬剤によって、または、（ａ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体と結合する分子、（ｂ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体を切断する酵素、（ｃ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、（ｄ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡを特異的に切断するＤＮＡザイム、（ｅ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、（ｆ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断するリボザイム、（ｇ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体の結合部分を少なくとも有する非機能的アナログ、および（ｈ）少なくとも１つのカンナビノイド受容体の活性化またはリガンド結合を妨げる分子、からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を対象に投与することによって行われる。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、発現または活性を調整することは、少なくとも１つのカンナビノイド受容体の第１のカンナビノイド受容体をアップレギュレーションし、かつ、少なくとも１つのカンナビノイド受容体の第２のカンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることによって行われる。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つのカンナビノイド受容体は、ＣＢ１受容体、ＣＢ１様受容体、ＣＢ２受容体、ＣＢ２様受容体および非ＣＢ１非ＣＢ２受容体からなる群から選択される。

本発明は、骨成長および骨再構築を調節する方法、骨疾患を処置または防止する方法、骨細胞においてカンナビノイド受容体の発現または活性を調整することにより骨の成長および最大骨量または修復を誘導する方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。具体的には、骨芽細胞（骨形成）および破骨細胞（骨再吸収）の両方の活性に対して作用するカンナビノイド受容体媒介の作用により、様々な骨疾患における新しい防止方法ならびに治療的介入がもたらされる。骨成長および／または骨再構築を調節するための薬学的組成物、カンナビノイド受容体媒介の作用に基づく骨成長調節剤の製造物、およびそのような骨成長調節剤を同定する方法もまた提供される。

別途に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等な方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記に記載される。矛盾する場合には、本特許明細書（定義を含む）が優先する。さらに、材料、方法および例は例示にすぎず、限定することを意図しない。

図面の簡単な記述
本発明を、本明細書中で、例示のみを目的として添付の図面を参照して記載する。ここでは詳細な図面を参照して、示した個々の事項は本発明の好ましい実施形態の例示および例示的考察のみを目的とし、最も有用と考えられるものを示すことおよび本発明の原理および概念的局面の説明が容易に理解されるために示すことを強調する。これに関して、本発明の基本的理解に必要とされる以上により詳細に本発明の構造細部を示すことを意図せず、図面と共に示した説明により、どのようにして本発明のいくつかの形態を実際に実施することができるのかが当業者に明らかとなる。
図１はオスＣＢ１^−／−［ＣＢ１カンナビノイド受容体ノックアウト（欠損）マウス］および野生型コントロール（ＷＴ）の大腿骨の定性的な微小コンピューター断層撮影法（μＣＴ）を例示する。図１Ａおよび図１Ｂは、ＣＢ１^−／−の遠位側の大腿骨骨端中節における小柱骨体積密度の顕著な減少を示す三次元μＣＴ画像（図１Ａ）、ならびに、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱結合性が低下していること（図１Ｂ）を示す。画像は、メジアン小柱骨体積密度値を有する代表的な大腿骨から得られた。
図２はオスＣＢ１^−／−［ＣＢ１カンナビノイド受容体ノックアウト（欠損）マウス］および野生型コントロール（ＷＴ）の大腿骨の微小コンピューター断層撮影法（μＣＴ）の比較形態計測分析を例示する。図２Ａ（上段左）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける皮質厚さの増大が著しいこと（ｐ＝０．０１２）を示し、図２Ｂ（上段右）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける髄質空間体積の減少が著しいこと（ｐ＝０．００３）を示し、図２Ｃ（下段左）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱骨体積の減少が著しいこと（ｐ＝０．０１８）を示し、図２Ｄ（下段中央）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱数減少の減少が著しいこと（ｐ＝０．０００３）を示し、図２Ｅ（下段右）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱結合性の低下が著しいこと（ｐ＝０．０００２）を示す。誤差バーは±標準偏差を示す。
図３はメス野生型コントロール（ＷＴ）との比較で、メスＣＢ１受容体ノックアウト（欠損）マウス（ＣＢ１^−／−）の大腿骨の微小コンピューター断層撮影（μＣＴ）形態計測分析を例示する。誤差バーは±標準偏差を示し、星印は統計学的に有意であることを示す。図３Ａ（上段左）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱骨体積の低下が著しいことを示し、図３Ｂ（上段右）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱結合性の減少が著しくないことを示し、図３Ｃ（下段左）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱数の減少が著しいことを示し、一方、図３Ｄ（下段右）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱間隔の増大が著しいことを示す。
図４はオスＦＡＡＨ^−／−［脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）ノックアウト（欠損）マウス］および野生型コントロール（ＷＴ）の大腿骨のμＣＴ形態計測分析を例示する。誤差バーは±標準偏差を示す。図４Ａ（上段左）は、ＦＡＡＨ^−／−マウスにおける皮質厚さの減少が著しいこと（ｐ＝０．０４９）を示し、図４Ｂ（上段右）は、ＦＡＡＨ^−／−マウスにおける小柱骨体積の減少が著しくないことを示し、一方、図４Ｃ（下段左）は、ＦＡＡＨ^−／−マウスにおける髄質空間体積の増大が著しいことを示す。図４Ｄには、骨皮質厚さ（Ｃｔ．Ｔｈ．）と髄質空間体積（ＭＶ／ＴＶ）との線形回帰分析が示され、これは有意な逆の相関を示している（ｒ＝−０．９８５、ｐ＝０．００５）。
図５は分化途中の骨芽細胞前駆体細胞における、ＣＢ２カンナビノイド受容体、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）、副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲｃ１）および組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のＲＴ−ＰＣＲ発現分析を例示する。ＳＴ２骨髄由来間質前駆体細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析（左パネル）では、ＣＢ２遺伝子の発現が骨形成性培地において５日目もの早くからであることが明らかにされ、その一方で、ＭＣ３Ｔ３Ｅ１頭蓋冠由来骨芽細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析（右パネル）で、ＣＢ２受容体の発現の出現がはるかに後であること（１０日および２０日）が示されることには留意すること。
図６は分化途中の破骨細胞におけるカンナビノイド受容体ＣＢ２および脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）の発現を例示する。図６Ａ（左パネル）は、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬ（破骨細胞分化因子）を含有する破骨細胞分化培地で培養された大腿骨単球の顕微鏡写真である。図６Ｂ（右パネル）は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼに関して染色された分化途中の破骨細胞の顕微鏡写真である。分化した破骨細胞が赤色〜桃赤色で染色されている。図６Ｃ（下段）は、培養された単球および分化した破骨細胞の両方におけるＣＢ２およびＦＡＡＨの陽性の発現を例示するＲＴ−ＰＣＲ分析である。
図７はエンドカンナビノイドの２−アラキドノイルグリセロール（２ＡＧ）で処置されたマウスまたは非処置マウスの定性的分析および組織形態計測分析を例示する。図７Ａ（上段左）には、骨形成速度に対する２ＡＧの著しい正の用量応答作用が示される（ｐ＝０．０４）。図７Ｂ（上段右）には、骨形成部位へのカルセイン染色の取り込みを明らかにする、２ＡＧ処置マウス（２ＡＧ）および非処置マウス（ビヒクル）の代表的な蛍光組織学的画像が示される。２ＡＧ処置マウス（右パネル）では、石灰化前線の密度がより大きくなっていることを示す、蛍光性カルセインの増大した染色密度には留意すること。２ＡＧ処置マウスの骨組織（右側の画像）は、非処置マウスの類似する骨組織（左側の画像）よりも実質的に高密度化しているようである。図７Ｃ（下段左）は、石灰化中の周囲部に対する２ＡＧの類似した著しい正の用量応答作用を示している（ｐ＝０．０１９）。しかしながら、無機付加速度に対する２ＡＧの作用は有意でないことが明らかであった（図７Ｄ、下段右）。

本発明は、骨成長および骨再構築を調節するために、骨疾患を防止するために、また、骨成長または骨修復を誘導するために好適な方法および薬学的組成物に関する。本発明はまた、骨成長調節剤を同定する方法にも関する。本発明の原理または操作は、図面および付随する説明を参照してより良く理解することができる。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、または実施例により例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で行われる。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は説明のためであり、従って、限定であるとして見なされるべきでないことも理解しなければならない。

カンナビノイド受容体はＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーに属する。カンナビノイド受容体は、主としてニューロンＣＢ１受容体と、主として末梢ＣＢ２受容体とに分類される。ＣＢ１受容体の作用は主として中枢神経系に関連しているが、ＣＢ２受容体は、免疫調節および炎症に関係づけられる末梢作用を有すると考えられている。ＣＢ１受容体およびＣＢ２受容体に加えて、最近の薬理学的証拠により、さらなるタイプのカンナビノイド受容体が存在し得ることが示される［例えば、Ｂｒｅｉｖｏｇｅｌ他、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、６０：１５５〜１６３（２００１）；Ｃａｌｉｇｎａｎｏ Ａ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４１９：１９１〜１９８（２００１）；Ｊａｒａｉ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６、１４１３６〜１４１４１（１９９９）；Ｄｉ Ｍａｒｚｏ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、７５：２４３４〜２４４４（２０００）］。

ＣＢ１受容体のアップレギュレーションは伝達物質の放出を阻害し、その一方で、ＣＢ２受容体のアップレギュレーションは単球／マクロファージの活性ならびに炎症性サイトカインの放出を阻害する［Ｈｏｗｌｅｔｔ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．、５４：１６１〜２０２（２００２）］。その結果として、カンナビノイド受容体のリガンドが、これらの受容体のこの記載された機能に関係する様々な疾患または障害を処置するための治療剤として記載されている。

本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、驚くべきことに、そして予想外にも、カンナビノイド受容体が骨細胞において発現し、骨形成、骨再構築および骨成長の調整に関係していることを発見した（下記の実施例の節の実施例１〜４を参照のこと）。

本明細書中で使用される用語「骨成長」は、骨組織の量および一体性の維持または明白な増大を生じさせるすべてのプロセスを含むとして定義される。詳細には、骨成長には、骨再構築、骨形成、石灰化などが含まれる。

骨組織におけるカンナビノイド受容体の発現、骨成長および骨再構築に対するカンナビノイド受容体の調節作用、ならびに、骨疾患を処置するためにカンナビノイド受容体の発現または活性を操作することの潜在的な利益は、これまで先行技術分野では記載または示唆されていない。

従って、本発明の１つの局面によれば、骨成長および骨再構築を調節する方法が提供される。この局面による方法は、１つまたは複数のカンナビノイド受容体の発現または活性を調整することによって行われる。

本発明のカンナビノイド受容体は、好ましくは骨細胞または骨細胞前駆体の受容体である。本明細書中で使用される表現「骨細胞」は、骨格組織細胞、例えば、骨、軟骨、腱、靱帯、骨髄間質および結合組織細胞などを示し、これには、骨再吸収細胞、例えば、骨髄単球由来破骨細胞、マクロファージおよびスカベンジャー細胞などが含まれる。本明細書中で使用される用語「骨細胞前駆体」は、骨細胞分化経路に拘束され得るか、または部分的に拘束され得る細胞（これには、幹細胞および骨再吸収細胞前駆体が含まれる）を示し、しかし、一般には、成熟し、かつ完全に分化した細胞としてのマーカーまたは機能を発現しない。

好ましくは、骨細胞前駆体は、間質細胞もしくは骨形成性細胞、または骨再吸収細胞前駆体である。本明細書中で使用される用語「間質細胞」は、多数回分裂することができる多能性前駆体細胞で、その子孫が、軟骨、骨、腱、靱帯、骨髄間質および結合組織を含む骨格組織を生じさせる多能性前駆体細胞を示す［Ａ．Ｃａｐｌａｎ、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．、９：６４１〜５０（１９９１）を参照のこと］。用語「間質細胞」はまた間葉性細胞を含むことが特筆される。本明細書中で使用される用語「骨形成性細胞」は、骨組織を生じさせる骨芽細胞または前駆体骨芽細胞を示す。

本発明のカンナビノイド受容体は、例えば、ＣＢ１受容体、ＣＢ２受容体、ＣＢ１様受容体、ＣＢ２様受容体または任意の他のタイプのカンナビノイド受容体であり得る［Ｈｏｗｌｅｔｔ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．、５４：１６１〜２０２（２００２）］。

本明細書中で使用される表現「発現または活性を調整する」は、受容体の発現または活性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれか、あるいは、選択された場合には、１つのカンナビノイド受容体の発現または活性のアップレギュレーションおよび別のカンナビノイド受容体の発現または活性のダウンレギュレーションを示す。

本明細書中下記においてさらに記載されるように、カンナビノイド受容体の発現または活性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションは、様々な骨疾患または骨障害を処置するために利用することができる。そのような調整は、当業者に広く知られている様々な薬剤および方法を使用して達成され得る。下記の節には、そのような薬剤の例が、カンナビノイド受容体の活性をアップレギュレーションするために使用され得る薬剤の説明から始まっていくつか示される。

カンナビノイド受容体の活性をアップレギュレーションすることができる薬剤の一例がカンナビノイド分子である。用語「カンナビノイド」は、カンナビノイド受容体の任意の天然アゴニストもしくは合成アゴニスト、またはそのアナログもしくは誘導体を示す。現在知られているカンナビノイドには、例えば、Δ^９−テトラヒドロカンナビノール（Δ^９−ＴＨＣ）、Δ^８−ＴＨＣ、Δ^９−ＴＨＣ−ジメチルヘプチル、１１−ヒドロキシ−Δ^８−ＴＨＣ−ジメチルヘプチル（ＨＵ−２１０）、５’−Ｆ−Δ^８−ＴＨＣ、１１−ＯＨ−カンナビノール、Δ^８−ＴＨＣ−１１−オイック−ジメチルヘプチル酸、１−デオキシ−１１−ＯＨ−Δ^８−ＴＨＣ−ジメチルヘプチル（ＪＷＨ−０５１）、１１−ヒドロキシ−ＴＨＣ類、デスアセチル−Ｌ−ナントラドール、１１−ＯＨ−カンナビノール−ジメチルヘプチル、カンナビノール−ジメチルヘプチル−１１−酸、ＨＵ−３０８、ＨＵ２４３、Ｌ−７５９６３３、Ｌ−７５９６５６、Ｌ−７６８２４２、ＪＷＨ−１３３、ＪＷＨ−１３９、ＪＷＨ−０５１、ＪＷＨ−０１５、ＣＰ５５９４０、ＣＰ４７４９７、ＣＰ５５２４４、Ｒ−（＋）−ＷＩＮ５５２１２、ＡＣＥＡ、ＡＣＰＡ、Ｏ−１８１２、アラキドニルエタノールアミド（アナンダミド）、２−アラキドノイルグリセロール（２ＡＧ）、２−アラキドノイルグリセリルエーテル、およびメタナンダミド、ならびに、それらのアナログまたは誘導体が含まれる。さらなるカンナビノイドが、上記の背景の節で引用された参考文献に記載されている。

受容体の活性をアップレギュレーションする別の方法は、ＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害剤）クラスの抗うつ剤におけるように内因性（または外因性）リガンドの代謝を阻害することによって、または、ｃＡＭＰ依存受容体の活性をメチルキサンチンホスホジエステラーゼ阻害剤によりアップレギュレーションすることによって行われる。例えば、ＦＡＡＨの阻害は、（下記の実施例の節において記載されるように）、カンナビノイド受容体の活性を効果的に増大させることができる。

カンナビノイド受容体の発現をアップレギュレーションすることができる薬剤は、受容体の機能的部分を少なくとも発現させるために設計および構築された外因性のポリヌクレオチド配列であり得る。それによれば、そのような外因性ポリヌクレオチド配列は、骨成長および／または骨再構築を調節することができる、カンナビノイド受容体分子をコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であり得る。

様々なカンナビノイド受容体（ＣＢ１およびＣＢ２）が、ヒト、ラットおよびマウスの供給源からクローン化されている［Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ他、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、５：３８５〜３８８（１９９５）；Ｇｅｒａｒｄ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１８：７１４２（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｎ他、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、２９２：８８６〜８９４（２０００）；Ｓｈｉｒｅ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１３０７：１３２〜１３６（１９９６）；Ｍｕｎｒｏ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：６１〜６５（１９９３）］。従って、ＣＢ１およびＣＢ２の両方に対するコード配列情報を、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ４．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を介して利用可能なＧｅｎＢａｎｋデータベースを含むいくつかのデータベースから入手することができる。

外因性カンナビノイド受容体を哺乳動物細胞において発現させるために、カンナビノイド受容体をコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ＣＢ１受容体ｃＤＮＡ：ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００７７２６；ＣＢ２受容体ｃＤＮＡ：ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００１８４１）が、好ましくは、哺乳動物細胞での発現のために好適な核酸構築物に連結される。そのような核酸構築物は、構成的または誘導可能な様式で細胞内でのポリヌクレオチド配列の転写を行わせるためのプロモーター配列を含む。好適なプロモーターは、例えば、骨特異的な遺伝子発現を行わせることができるヒトオステオカルシン遺伝子プロモーター（例えば、米国特許第５９４８９５１号を参照のこと）、またはヒトコラーゲン１（ＭＭＰ−１）プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０２３３３８）であり得る。本発明の核酸構築物はさらに、さらなるポリヌクレオチド配列、例えば、選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする配列、細菌における複製起点をコードする配列、単一ｍＲＮＡからの数個のタンパク質の翻訳を可能にする配列（ＩＲＥＳ）、哺乳動物発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手できる）、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびにそれらの誘導体など）には一般に含まれる、プロモーター−キメラポリペプチドコード領域および／または配列のゲノム組み込みのための配列などを含むことができる。

カンナビノイド受容体をアップレギュレーションすることができる薬剤はまた、カンナビノイド受容体をコードする内因性ＤＮＡまたはｍＲＮＡの転写および／または翻訳を増大させることができる任意の化合物であり得る。

本明細書中上記で述べられたように、本発明のこの局面による方法はまた、少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性のダウンレギュレーションをもたらす。

カンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることができる薬剤の一例が、カンナビノイド受容体と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントである。好ましくは、抗体は、カンナビノイド受容体の少なくとも１つのエピトープと特異的に結合する。好ましくは、このようなエピトープは細胞外の部分に存在するか、または、最も好ましくは、カンナビノイド受容体のリガンド結合部分に存在する。カンナビノイド受容体の活性をダウンレギュレーションする際に使用される好適な抗カンナビノイド受容体抗体の例には、Ｋａｔｏｎａ他（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９９９、１９：４５４４〜５８）によって記載される、ＣＢ１に対する特異的な抗体がある。

本明細書中で使用される用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原における任意の抗原性決定基を意味する。

エピトープ決定基は、通常、分子の化学的に活性な表面基（例えば、アミノ酸および炭水化物側鎖など）からなり、通常、特異的な三次元の構造的特徴、ならびに特異的な電荷特徴を有する。

本発明において使用される用語「抗体」は、完全な分子ならびにその機能的なフラグメント、例えば、マクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを包含する。これらの機能的な抗体フラグメントは下記のように定義される：（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な分子を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（２）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂフラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（３）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な分子を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（４）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；そして（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である。

ポリクローナルおよびモノクローナル抗体およびそのフラグメントを製造する方法がこの技術においてはよく知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８）を参照のこと：これは参照により本明細書中に組み込まれる）。特に、いくつかのカンナビノイドＣＢ_１およびＣＢ_２特異的な受容体の抗体は開発に成功しており、Ｅｇｅｒｔｏｖａ他、Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ、４２２：１５９−１７１、（２０００）；Ｔｓｏｕ他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、８３：３９３−４１１）、（１９９８）；Ｄａａｋａ他、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、２７６：７７６−７８３、（１９９６）；Ｓｉｎｈａ他、Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、８２：１３−２１、（１９９８）；Ｗａｋｓｍａｎ他、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、２８８：１３５７−１３６６；Ｇａｌｉｅｇｕｅ他、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２３２：５４−６１、（１９９５）；およびＣａｒａｙｏｎ他、Ｂｌｏｏｄ、９２：３６０５−３６１５、（１９９８）に記載されている。

本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質加水分解によって、またはフラグメントをコードするＤＮＡを大腸菌または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現システム）において発現させることによって調製することができる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、抗体をペプシンで酵素切断して、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを得ることによって製造することができる。このフラグメントは、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを製造するために、チオール還元剤、および場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用してさらに切断することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断により、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが直接的に得られる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびにそれらに含まれる参考文献に記載されている（それらの特許は本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）。また、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．、［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、７３：１１９〜１２６、（１９５９）］も参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的な技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。

ＦｖフラグメントはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他、[Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２、（１９７２）]に記載されているように非共有結合性であり得る。あるいは、可変鎖を、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、または、グルタルアルデヒドなどの化学剤によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによりつながれたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子は発現ベクターに導入され、続いて、発現ベクターは大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞により、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一ポリペプチド鎖が合成される。ｓＦｖを製造するための様々な方法が、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５、（１９９１）；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、（１９８８）；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７、（１９９３）；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号（これは本明細書によりその全体が参照により組み込まれる）によって記載されている。

抗体フラグメントの別の形態が、１つだけの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、［Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０、（１９９１）］を参照のこと。

非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）Ｓｕｂ．２または抗体の他の抗原結合性の部分配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望する特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、あるいは取り込まれたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、実質的にはすべての可変ドメインまたは１つ以上の（典型的には２つ）可変ドメインを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部を、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を少なくとも含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。

非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの技術においては広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、輸入残基と呼ばれており、この輸入残基は、典型的には、輸入可変ドメインに由来する。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って本質的には行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全でないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この場合、一部のＣＤＲ残基およびおそらくは一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換される。

ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、その産生は、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含むすべての点に関してヒトにおいて見られる産生と非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および下記の科学的刊行物：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。

カンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることはまた、カンナビノイド受容体を切断する酵素によって行うことができる。

カンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることができる別の薬剤は、小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。ＲＮＡ干渉は二段階プロセスである。最初の段階は開始段階と名付けられており、インプットｄｓＲＮＡが、おそらくは、（直接的に導入されたか、または導入遺伝子もしくはウイルスを介して導入された）ｄｓＲＮＡをＡＴＰに依存する様式でプロセシング（切断）するダイサー（これはＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼの１つである）の作用によって、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に消化される。連続した切断事象により、ＲＮＡは、それぞれが２ヌクレオチドの３’突出を有する１９ｂｐ〜２１ｂｐの二重鎖（ｓｉＲＮＡ）に分解される［ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２：２２５〜２３２（２００２）；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４０９：３６３〜３６６（２００１）］。

エフェクター段階において、ｓｉＲＮＡ二重鎖はヌクレアーゼ複合体に結合して、ＲＮＡ誘導によるサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡ二重鎖のＡＴＰ依存的な巻き戻しが、ＲＩＳＣを活性化させるためには必要である。活性なＲＩＳＣは、その後、塩基対形成相互作用によって相同的な転写物を標的化し、ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡの３’末端から１２ヌクレオチドのフラグメントに切断する［ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２：２２５〜２３２（２００２）；Ｈａｍｍｏｎｄ他（２００１）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．、２：１１０〜１１９（２００１）；Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．、１５：４８５〜９０（２００１）］。この切断機構は未だ解明されていないが、研究では、それぞれのＲＩＳＣが、１個だけのｓｉＲＮＡと、ＲＮａｓｅとを含有することが示されている［ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２：２２５〜２３２（２００２）］。

ＲＮＡｉの効力が顕著であるため、ＲＮＡｉ経路内での増幅段階が示唆されている。増幅は、インプットｄｓＲＮＡをコピーし、これにより、より多くのｓｉＲＮＡを生じさせることによって、または、形成されたｓｉＲＮＡを複製することによって生じ得る。あるいは、またはさらに、増幅はＲＩＳＣの多数回の回転事象によって行われ得る［Ｈａｍｍｏｎｄ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．、２：１１０〜１１９（２００１）；Ｓｈａｒｐ、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．、１５：４８５〜９０（２００１）；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２：２２５〜２３２（２００２）］。ＲＮＡｉに関するさらなる情報について、下記の総説を参照のこと：Ｔｕｓｃｈｌ、ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．、２：２３９〜２４５（２００１）；Ｃｕｌｌｅｎ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３：５９７〜５９９（２００２）；Ｂｒａｎｔｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１５７５：１５〜２５（２００２）］。

本発明とともに使用される好適なＲＮＡｉ分子の合成は下記のように行うことができる。最初に、カンナビノイド受容体のｍＲＮＡ配列が、ＡＡジヌクレオチド配列について、ＡＵＧ開始コドンから下流に走査される。それぞれのＡＡおよびその３’隣接１９ヌクレオチドの存在が、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位はオープンリーディングフレームから選択される。これは、非翻訳領域（ＵＴＲ）には、調節タンパク質結合部位がより多く存在するからである。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体はｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害することができる［Ｔｕｓｃｈｌ、ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．、２：２３９〜２４５］。だが、５’ＵＴＲに向けられたｓｉＲＮＡが細胞ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの約９０％の減少を媒介し、タンパク質レベルを完全になくしたＧＡＰＤＨについて明らかにされたように（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）、非翻訳領域に向けられたｓｉＲＮＡもまた効果的であり得ることが理解される。

次に、潜在的な標的部位が、任意の配列アラインメントソフトウエア（例えば、ＮＣＢＩサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウエアなど）を使用して適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較される。他のコード配列に対して著しい相同性を示す推定される標的部位が選び出される。

適格であると認められた標的配列が、ｓｉＲＮＡ合成のためのテンプレートとして選択される。好ましい配列は、低いＧ／Ｃ含有を含む配列である。これらは、５５％を超えるＧ／Ｃ含有量を有する配列と比較した場合、遺伝子サイレンシングを媒介することにおいてより効果的であることが判明しているからである。数個の標的配列が、好ましくは、評価のために、標的遺伝子の長さに沿って選択される。選択されたｓｉＲＮＡのより良い評価のためには、負のコントロールが好ましくは一緒に使用される。負のコントロールｓｉＲＮＡは、好ましくは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムに対する著しい相同性を有しない。従って、任意の他の遺伝子に対して何らかの著しい相同性を示さないならば、ｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列が好ましくは使用される。

カンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることができる別の薬剤は、カンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖標的配列および二本鎖標的配列の両方を切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドである（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．およびＪｏｙｃｅ，Ｇ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４３：４２６２）。ＤＮＡザイムに対する一般的なモデル（“１０−２３”モデル）が提案されている。“１０−２３”ＤＮＡザイムは、７個〜９個のデオキシリボヌクレオチドからそれぞれがなる２つの基質認識ドメインが両側に隣接する１５デオキシリボヌクレオチドの触媒作用ドメインを有する。このタイプのＤＮＡザイムはその基質ＲＮＡをプリン：ピリミジン接合部において効果的に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９；ＤＮＡザイムの総説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、４：１１９〜２１（２００２）］を参照のこと）。

一本鎖および二本鎖の標的切断部位を認識する操作された合成ＤＮＡザイムの構築および増幅の様々な例が、米国特許第６３２６１７４号（Ｊｏｙｃｅ他）に開示される。ヒトウロキナーゼ受容体に向けられた類似する設計のＤＮＡザイムが、最近、ウロキナーゼ受容体の発現を阻害することが観測され、結腸ガン細胞の転移をインビボで阻害することに成功している（Ｉｔｏｈ他、２０００２、アブストラクト４０９、Ａｎｎ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎ Ｔｈｅｒ、ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。別の適用では、ｂｃｒ−ａｂｌガン遺伝子に対して相補的なＤＮＡザイムが白血病細胞における癌遺伝子の発現を阻害すること、そして、ＣＭＬおよびＡＬＬの場合での自家骨髄移植における再発率を低下させることに成功していた。

カンナビノイド受容体のダウンレギュレーションはまた、カンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを使用することによっても行うことができる。

カンナビノイド受容体を効率的にダウンレギュレーションするために使用され得るアンチセンス分子の設計は、アンチセンス法にとって重要な２つの局面を考慮しながら行わなければならない。第１の局面は、オリゴヌクレオチドを適切な細胞の細胞質の中に送達することであり、一方、第２の局面は、その翻訳を阻害する方法で細胞内において、指定されたｍＲＮＡと特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。

先行技術では、オリゴヌクレオチドを広範囲の様々な細胞タイプに効率的に送達するために使用され得る多数の送達方法が教示されている［例えば、Ｌｕｆｔ、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ、７６：７５〜６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ他、Ｂｌｏｏｄ、９１：８５２〜６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、８：９３５〜４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２３７：５６６〜７１（１９９７）；Ａｏｋｉ他（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２３１：５４０〜５（１９９７）を参照のこと］。特に注目されるのは、骨表面でのＤＮＡの顕微注入を使用する骨膜形質転換のための、Ｅｒｉｋｋｓｏｎによって記載される方法（米国特許第６５２５０３０号）である。

さらに、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造的変化のエネルギー論を説明する熱力学的サイクルに基づいて、その標的ｍＲＮＡに対して最も大きい予測された結合親和性を有するそのような配列を同定するためのアルゴリズムもまた利用することができる［例えば、Ｗａｌｔｏｎ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、６５：１〜９（１９９９）を参照のこと］。

そのようなアルゴリズムは、アンチセンス法を細胞において実施するために使用することに成功している。例えば、Ｗａｌｔｏｎ他によって開発されたアルゴリズムにより、科学者は、ウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）転写物およびマウス腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することに成功することができた。同じ研究グループは、より近年には、３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢならびにラットｇｐ１３０）に対する合理的に選択されたオリゴヌクレオチドの細胞培養物におけるアンチセンス活性が、速度論的ＰＣＲ技術によって評価されたとき、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド化学およびホスホロチオアートオリゴヌクレオチド化学を用いた２つの細胞タイプにおける３つの異なる標的に対する試験を含めて、ほとんどすべての場合において効果的であることが判明したことを報告している。

さらに、インビトロシステムを使用して特異的なオリゴヌクレオチドを設計し、その効率を予測するための方法もまたいくつか発表されていた（Ｍａｔｖｅｅｖａ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：１３７４〜１３７５（１９９８））。

いくつかの臨床試験では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実現可能性および活性が明らかにされている。例えば、ガンを処置するために好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドが成功裏に使用され［Ｈｏｌｍｕｎｄ他、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１：３７２〜８５（１９９９）］、その一方で、ｃ−ｍｙｂ遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる血液学的悪性腫瘍の処置、すなわち、ｐ５３およびＢｃｌ−２が臨床試験に入っており、患者によって許容されることが示されていた［Ｇｅｒｗｉｔｚ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１：２９７〜３０６（１９９９）］。

より近年には、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介による抑制が、マウスモデルにおいてヒトガン細胞の胸膜転移を阻害することが報告されている［Ｕｎｏ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６１：７８５５〜６０（２００１）］。

従って、現在の一致した意見は、上記で記載されたように、アンチセンス技術の分野における最近の発達は、高精度なアンチセンス設計アルゴリズムの作製および広範囲の様々なオリゴヌクレオチド送達システムをもたらしており、このような最近の発達により、当業者は、過度な試行錯誤実験に頼る必要なく、知られている配列の発現をダウンレギュレーションするために好適なアンチセンス法を設計することができ、また実施することができるということである。

カンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることができる別の薬剤は、カンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。様々なリボザイムが、目的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡを切断することによる遺伝子発現の配列特異的な阻害のためにますます使用されつつある［Ｗｅｌｃｈ他、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９：４８６〜９６（１９９８）］。任意の特異的な標的ＲＮＡを切断するためのリボザイムを設計することができることにより、リボザイムは基礎研究および治療的応用の両方で有益なツールになっている。治療領域において、様々なリボザイムが、感染性疾患におけるウイルスＲＮＡ、ガンにおける優勢なガン遺伝子、および遺伝病における特異的な体細胞変異を標的とするために利用されている［Ｗｅｌｃｈ他、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｖｉｒｏｌ．、１０：１６３〜７１（１９９８）］。非常に注目すべきことに、ＨＩＶ患者に対するいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコルが既に第Ｉ相試験に入っている。より近年には、リボザイムが、トランスジェニック動物研究、遺伝子標的の妥当性確認、および経路解明のために使用されている。いくつかのリボザイムが臨床試験の様々な段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験で研究されることになった最初の化学合成されたリボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、血管形成経路における重要な成分であるＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮細胞増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．は、他の企業と同様に、動物モデルにおいて抗血管形成治療の重要性を明らかにしている。ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するために設計されたリボザイム）は、細胞培養アッセイにおいてＣ型肝炎ウイルスＲＮＡを減少させることにおいて効果的であることが見出された（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）。

カンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることができる別の薬剤として、カンナビノイド受容体の結合性部分の非機能的アナログを挙げることができる。例には、（例えば、Ｎ末端部分を有しない）短縮化されたＣＢ１配列またはＣＢ２配列が含まれる。

カンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることができるさらに別の薬剤は、カンナビノイド受容体の活性化またはカンナビノイド受容体におけるリガンド結合を妨げることができる分子である。このような分子は、カンナビノイドアンタゴニストまたはインバースアゴニストであり、例えば、ＳＲ１４１７１６Ａ、ＳＲ１４４５２８、ＡＭ２５１、ＡＭ２８１、ＳＲ１４４５２８、ＬＹ３２０１３５、ＡＭ６３０、ＷＩＮ５６０９８、ＷＩＮ５４４６１、Ｏ−１１８４およびＯ−１２３８などであり得る（Ｈｏｗｌｅｔｔ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．、５４：１６１〜２０２（２００２）を参照のこと）。

カンナビノイド受容体の活性はまた、カンナビノイド受容体の天然リガンド、例えば、アナンダミン、２ＡＧ、または骨細胞においてカンナビノイド受容体と結合することができる任意の他のエンドカンナビノイドなどを特異的に標的化することによってダウンレギュレーションすることができる。

本明細書中上記で述べられているように、カンナビノイド受容体の発現または活性の調整は、１つまたは複数のカンナビノイド受容体のアップレギュレーション、あるいは、１つまたは複数のカンナビノイド受容体のダウンレギュレーション、あるいは、１つの受容体のアップレギュレーションおよび別の受容体のダウンレギュレーションであり得る。後者の事例は、先行技術分野では、カンナビノイド受容体の活性に関連づけられる適用のどれにおいても未だ記載されていないが、下記の実施例の節の実施例４の結果は、そのような事例が、別の未だ知られていないカンナビノイド受容体のアゴニストとしてもまた作用し得るＣＢ１カンナビノイド受容体アンタゴニストＳＲ−１４１７６１Ａを用いて存在することを示唆している。

カンナビノイド受容体の発現または活性の調整は、培養された骨細胞をアップレギュレーション薬剤またはダウンレギュレーション薬剤にさらすことによってエクスビボで行うことができ、あるいは、そのような薬剤を対象に投与することによってインビボで行うことができる。

従って、本発明の別の局面によれば、必要性のある対象において骨成長または骨修復を誘導する方法が提供される。

本明細書中で使用される用語「対象」は、ヒト、ならびに、他の動物種（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、齧歯類など）を示す。

本明細書中で使用される表現「処置または防止する」は、発症するか、もしくは発症することが予想される骨欠陥症状の発症を遅らせること、および／または、そのような症状の重篤度の軽減を示す。これらにはさらに、存在する骨欠陥症状または軟骨欠陥症状を改善すること、さらなる症状を防止すること、症状の根本的な代謝的原因を改善もしくは防止すること、骨再吸収を防止もしくは反転させること、および／または、骨成長を促すことが含まれる。従って、この表現は、有益な結果が、軟骨、骨または骨格の欠陥を有する脊椎動物対象に、あるいはそのような欠陥を発症する可能性を有する脊椎動物対象にもたらされていることを意味する。この表現はさらに、発症するか、もしくは発症することが予想される骨過剰成長症状の発症を遅らせること、および／または、そのような症状の重篤度の軽減を示す。

本発明の方法は、２つの選択可能な方法を使用して行うことができる。第１の方法では、骨細胞が対象または同種ドナーまたは同系ドナーから単離され、これらの骨細胞の１つまたは複数のカンナビノイド受容体の発現または活性が、上記で記載されたように、ダウンレギュレーションまたは好ましくはアップレギュレーションのいずれかに、（または両方に）供される。発現または活性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかが行われると、改変されたカンナビノイド受容体活性を示す細胞が（好ましくは、局所投与によって）対象に投与される。

第２の方法では、薬剤が、（本明細書中下記においてさらに記載される）いくつかの選択可能な投与様式のいずれかによって対象に直接投与される。

上記に記載された方法は、骨に関係づけられる疾患または障害を処置するために利用することができる。例えば、カンナビノイド受容体の発現または活性をアップレギュレーションすることができる薬剤を、骨欠陥に関係づけられる任意の疾患または状態を処置または防止するために、例えば、閉鎖骨折、解放骨折および癒着不能骨折における骨欠陥および骨不全を防止するために；危険性のある若年者において骨量を高めるために；閉鎖骨折および解放骨折を減少させることにおいて最大骨量を高めることによる若年者における予防的処置のために；形成外科において骨治癒を促進させるために；セメント結合していない整形外科後インプラントおよび歯科インプラントの中への骨成長を刺激するために；閉経前の女性において最大骨量を上昇させるために；成長不全を処置するために；原発性または二次的な上皮小体機能亢進症を処置するために；ガンなどの溶骨性骨疾患を処置するために；歯周病および歯周欠陥の処置ならびに他の歯修復プロセスのために；乱れた骨生成のときの骨形成を増大させるために；そして、他の骨格障害、例えば、老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、グルココルチコイド誘導骨粗鬆症またはびまん性骨粗鬆症および関節炎、変形性関節症、または、一方では骨形成を刺激することから、他方では骨再吸収を阻害することから利益を受ける任意の状態などを処置するために使用することができる。本発明の薬剤はまた、骨の先天的または外傷誘導または手術による切除の修復において（例えば、ガン処置のために）、また、美容外科において有用であり得る。さらに、本発明の化合物は、軟骨の欠陥または障害を制限または処置するために使用することができ、従って、創傷治癒または組織修復において有用であり得る。

カンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることができる薬剤、例えば、本明細書中上記に記載された薬剤などは、骨の過剰成長に関係づけられる任意の疾患または状態、例えば、特定の病期段階のパジェット病、骨芽細胞性骨疾患、転移性骨疾患（例えば、乳ガンおよび前立腺ガンなど）、芽細胞性転移性骨ガン、ホジキンリンパ腫、退行性硬化症および骨髄炎などを処置または防止するために使用することができる。

本発明の薬剤は、それ自体が治療において、または薬学的組成物の一部（有効成分）として存在し得る。

本明細書中で使用される「薬学的組成物」は、本明細書中に記載される１つまたは複数の有効成分と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。薬学的組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。

本明細書中下記において、交換可能に使用され得る表現「生理学的に受容可能なキャリア」および表現「薬学的に受容可能なキャリア」は、生物に対する著しい刺激を引き起こさず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントがこれらの表現に含まれる。

本明細書において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の例には、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。

１つまたは複数のカンナビノイド受容体アップレギュレーション薬剤を含む薬学的組成物はまた、骨形成を促進する化合物および／または骨再吸収を阻害する１つまたは複数の化合物、例えば、骨形態形成因子、骨形態形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ノギン、骨形成性成長ペプチド、抗再吸収剤、骨形成性因子、軟骨由来形態形成タンパク質、成長ホルモン、サイトカイン（例えば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、形質転換増殖因子など）、エストロゲン系化合物、ビスホスホナート系化合物、スタチン、カルシトニン、ジヒドロキシビタミンＤ_３を含むことができ、カルシウム調製物がこの目的のためには好ましい。

あるいは、１つまたは複数のカンナビノイド受容体ダウンレギュレーション薬剤を含む薬学的組成物はまた、骨形成を阻害する化合物および／または骨再吸収を促進する１つまたは複数の化合物を含むことができる。

さらに、アップレギュレーション薬剤またはダウンレギュレーション薬剤は、標的化分子を使用して、骨または他の特異的な活性部位に対して標的化することができる。

薬物を配合し、投与するための様々な技術が、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版；これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。

好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜（特に経鼻）送達、腸管送達または非経口送達（筋肉内注射、皮下注射および髄膜内注射、ならびにクモ膜下注射、直接的な心室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を含む）が含まれ得る。

あるいは、薬学的組成物は、全身的な様式ではなく、局所的な様式で、例えば、薬学的組成物を患者の骨組織領域の中に直接注射することによって投与することができる。

本発明の薬学的組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。

従って、本発明に従って使用される薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に受容可能なキャリアを使用して、従来の様式で配合することができる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。

注射の場合、薬学的組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的な塩緩衝液など）において配合することができる。本発明の薬学的組成物のために好適である１つ投与経路が、米国特許第６５２５０３０号（Ｅｒｉｋｋｓｏｎ）に記載されるように、骨膜下注射である。経粘膜投与の場合、透過させられるバリアに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。

経口投与の場合、薬学的組成物は、活性な化合物を、この分野で広く知られている薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に配合することができる。そのようなキャリアは、薬学的組成物を、患者により経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することを可能にする。経口使用される薬理学的組成物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に受容可能なポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。本明細書中で使用される用語「経口投与」は、薬学的化合物を任意の口腔表面（舌、歯ぐき、口蓋または他の口内表面を含む）に投与することを包含する。経口投与のさらなる方法には、口腔表面の組織と適合し得るミスト、スプレー物または懸濁物で薬学的組成物を与えることが含まれる。

糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料を、活性な化合物の量を明らかにするために、または活性な化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。

経口使用され得る薬学的組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべてが、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。

口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。

鼻腔吸入による投与の場合、本発明に従って使用される有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位が、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定され得る。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物および好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。

本明細書中に記載される薬学的組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、そして、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。

非経口投与される薬学的組成物には、水溶性形態での活性な調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物を適切な油性または水系の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。

あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌された、パイロジェンを含まない水溶液）を用いて構成される粉末形態にすることができる。

本発明の薬学的組成物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。

本発明に関連して使用される好適な薬学的組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために好適な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、処置されている対象の障害の症状を防止、軽減もしくは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の量を意味する。

治療効果的な量の決定は、特に、本明細書中に提供されている詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。

本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量はインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量を、所望される濃度または力価を達成するために、動物モデルにおいて、例えば、ネズミＮｅｕモデル［Ｍｕｌｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ、５４、１０５〜１１５（１９８８）］において定めることができる。本発明の方法とともに使用される好適な他のそのような例示的なモデルシステムには、分化途中の破骨細胞（本明細書中下記の実施例３を参照のこと）、および分化途中の培養された骨形成性細胞（本明細書中下記の実施例２を参照のこと）がある。そのような情報は、ヒトおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。

本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、標準的な薬学的手法によって、インビトロで、細胞培養または実験動物において明らかにすることができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、第１章、１頁を参照のこと）。

投薬量および投薬間隔は、例えば、芽細胞転移の場合には腫瘍の進行を遅らせるために十分である有効成分のレベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）に個々に調節することができる。ＭＥＣは、それぞれの組成物について変化し、しかし、インビトロでのデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を測定するために使用することができる。

処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は単回であり得るか、または多数回の投与であり得る。この場合、処置の経過は、数日から、数週間まで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。

投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。

本発明の組成物は、所望する場合には、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことがあり、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーデバイスにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物に対する米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。適合し得る薬学的キャリアで配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、上記においてさらに詳しく記載されているかのように、適応される状態を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。

本明細書中上記で記載された方法の実施、ならびに／または、本明細書中上記に記載されるような薬学的組成物および製造物の製造を容易にするために、本発明はさらに、骨成長および骨再構築の新規な調節剤を同定する方法を提供する。

薬物候補物を同定する方法では、骨細胞の１つのまたは複数のカンナビノイド受容体の発現または活性を調整することができる分子について多数の分子をスクリーニングすることが含まれる。スクリーニングは、培養された骨細胞前駆体（例えば、ネズミの骨髄由来骨形成細胞（ＳＴ２細胞株）または頭蓋冠由来骨芽細胞性細胞（ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞株）など）を試験分子にさらし、その後、カンナビノイド受容体の発現に対する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を、標準的なＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、例えば、下記の実施例の節の実施例２に記載される方法などを使用して行うことによってインビトロで行うことができる。選択された分子は、選択された試験分子を実験動物に投与し、その後、試験動物における骨成長に対するその作用を明らかにすることによって、骨成長調節活性についてインビボでさらに評価することができる。例えば、試験分子は１：１：１８のエタノール：エムルホル（ｅｍｕｌｆｏｒ）：生理的食塩水（ｖ／ｖ／ｖ）ビヒクルに溶解され、下記の実施例の節の実施例４に記載されるなどのプロトコルを使用して、Ｃ３Ｈ（Ｈａｒｌａｎ）マウスに腹腔内注射され得る。試験分子の効力が、処置マウスにおける骨成長速度および／または骨石灰化周を、類似する非処置マウスにおける骨成長パラメーターと比較することによって決定され得る。骨成長パラメーターの著しい刺激または阻害を誘導する分子が、骨成長調節剤としてさらに評価される候補になる。

このように、本発明は、骨疾患を処置または防止する際に使用される新規な方法、組成物および製造物を提供する。本発明は、新しい骨成長を調節する天然の特異的な機構に基づいているので、骨欠陥ならびに骨過剰成長に関係づけられる広範囲の疾患を安全かつ効果的に処置または防止するために適用することができる。

（実施例）
本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、制限を意図しない以下の実施例の実験によって当業者に自明である。さらに、上記の本発明および以下の特許請求の範囲に記載の各々の種々の実施形態および態様は、以下の実施例の実験により支持される。

ここでは、上記説明と共に以下の実施例を参照して、非限定的様式で本発明を例示する。

骨細胞におけるＣＢ１カンナビノイド受容体発現の影響：ＣＢ１の発現は骨成長および骨再構築を調整する
材料および方法
動物：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス［Ｚｉｍｍｅｒ，Ａ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：５７８０〜５７８５（１９９９）］が野生型コントロール（ＷＴ）として使用され、ＣＢ１受容体ノックアウトマウス（ＣＢ１^−／−）（Ｌｅｄｅｎｔ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３：４０１〜４０４（１９９９）］または脂肪酸アミドヒドロラーゼノックアウトマウス（ＦＡＡＨ^−／−）（Ｃｒａｖａｔｔ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、２００１、１９８：９３７１〜７６（２００１））と比較された。

微小コンピューター断層撮影法：１０週齢マウスから得られた大腿骨が、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ他［Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．、１６：１６６５〜１６７３（２００１）］により記載される手法を使用して、定性的および定量的な微小コンピューター断層撮影法（μＣＴ）に供され、分析された。ＷＴマウスはこの週齢でその最大小柱骨量に達するので、大腿骨が１０週齢マウスからサンプリングされた。示された代表的なμＣＴ画像が、メジアン骨体積密度値またはメジアン皮質厚さ値を有するマウスから得られ、従って、代表例であった。示されたデータは、８匹のマウスの繰り返しから得られた平均±標準誤差（ＳＥ）である。

結果
オスのＣＢ１ノックアウト（欠損）（ＣＢ１^−／−）マウスおよび野生型（ＷＴ）マウスにおける二次的な海綿質骨の比較三次元μＣＴ画像が図１Ａおよび図１Ｂに示される。これらの画像は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱網目構造密度の実質的な低下および骨髄空間の実質的な増大を示している。

オスＣＢ１^−／−マウスのμＣＴ形態計測分析が、ＷＴと比較されて、図２Ａ〜図２Ｅにまとめられている。これらの図は、図１Ａおよび図１Ｂに示された結果を裏付けている。すなわち、ＣＢ１^−／−マウスでは、それらと週齢が一致する野生型（ＷＴ）コントロールと比較したとき、著しく大きくなった皮質厚さ［図２Ａ；ｐ＝０．０１２（ｔ検定）］、著しく低下した髄質空間体積［図２Ｂ；ｐ＝０．００３（ｔ検定）］、著しく低下した小柱骨体積密度［図２Ｃ；ＢＶ／ＴＶ＝１１．５±１．７％対１８．８±２．１％（平均±ＳＥ）、ｐ＝０．０１８（ｔ検定）］、著しく低下した小柱数［図２Ｄ；Ｔｂ．Ｎ．＝１．９±０．２ｍ−１対３．０±０．１ｍ−１（平均±ＳＥ）、ｐ＝０．０００３（ｔ検定）］、および著しく低下した小柱結合性［図２Ｅ；下段右グラフ；Ｃｏｎｎ．Ｄ＝２１．６±３．６ｍ−３対４８．５±３．９ｍ−３（平均±ＳＥ）、ｐ＝０．０００２（ｔ検定）］が明らかにされた。

メスＣＢ１^−／−のμＣＴ形態計測分析が、ＷＴと比較されて、図３Ａ〜図３Ｄに例示されている。これらの分析により、メスＣＢ１^−／−において観測された骨幹端変化が、オスＣＢ１^−／−で認められた骨幹端変化と類似していたこと、すなわち、低下した小柱骨体積（図３Ａ）、低下した小柱結合性（図３Ｂ）、低下した小柱数（図３Ｃ）、および増大した小柱間隔（図３Ｄ）を有することが示される。

エンドカンナビノイド分解が損なわれているオスの脂肪酸アミドヒドロラーゼノックアウト（欠損）マウス（ＦＡＡＨ^−／−）のμＣＴ形態計測分析が、ＷＴと比較されて、図４Ａ〜図４Ｄに例示される。これらの図は、ＦＡＡＨ^−／−マウスが、著しく低下した皮質厚さ［図４Ａ、上段左グラフ、ｐ＝０．０４９（ｔ検定）］および著しく大きくなった髄質空間体積［図４Ｂ、左下段グラフ；ｐ＝０．０４９（ｔ検定）］を生じさせたことを示している。ＦＡＡＨ酵素はエンドカンナビノイドを分解することが知られている［Ｃｒａｖａｔｔ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１９８：９３７１〜７６（２００１）］ので、これらの作用は、予想されていたように、ＣＢ１^−／−マウスで観測されたこととは逆のことであった（上記の図４Ｂおよび図４Ｃを参照のこと）。

これらの結果は、ＣＢ１ノックアウト（欠損）マウスが、野生型コントロールと比較されたとき、骨の耐荷力に対する重大な結末が考えられる、小柱の構造的一体性の実質的な破壊を有することを明瞭に示している。ＣＢ１^−／−マウスの体重および神経学的徴候スコアはそのＷＴ同腹子の体重および神経学的徴候スコアとは異なっていないので、ＣＢ１ノックアウト（欠損）マウスのこの骨減少表現型は、損なわれた食物摂取または身体活動に対して二次的でないと考えられる。

従って、これらの結果は、ＣＢ１受容体の発現により、マウスにおける骨成長および骨再構築が調整されること、そして、ＣＢ１の発現または活性を調整することができるカンナビノイドはそれにより骨成長および骨再構築を調節することができることを明瞭に明らかにしている。

分化途中にある培養された骨形成性細胞におけるカンナビノイド受容体の発現
材料および方法
細胞培養：カンナビノイド受容体（Ｃｎｒ）のＣＢ１およびＣＢ２、エンドカンナビノイド分解酵素の脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）、骨芽細胞分化マーカーのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ならびに骨芽細胞分化マーカーの副甲状腺ホルモン受容体Ｉ（ＰＨＴ−Ｒｃ１）の発現が、ネズミ骨髄由来骨形成細胞（ＳＴ２細胞株）および頭蓋冠由来骨芽細胞性細胞（ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞株）において分析された。これらの細胞の骨芽細胞分化が、アスコルビン酸、デキサメタゾンおよびβ−グリセロリン酸を含有する「骨形成性培地」で細胞を成長させることによって誘導された［Ｆｒａｎｋ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８５：７３７〜７４６（２００２）］。

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：ＲＮＡが、インキュベーションの５日後、１０日後、２０日後および３０日後に培養細胞から抽出され、ＲＴ−ＰＣＲによって分析された。ＣＢ１受容体の発現を分析するために使用されたプライマーならびにＲＴ−ＰＣＲの方法論および条件は、本質的にはＮｏｅ他［Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、４３７：２２３〜９（１９９８）］およびＮｏｅ他［Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、４９３：２１５〜２１（２００１）］によって記載される通りであった。ＣＢ２受容体の発現を分析するために使用されたプライマーならびにＲＴ−ＰＣＲの方法論および条件は、本質的にはＬｅｅ他［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４２３：２３５〜４１（２００１）］によって記載される通りであった。骨芽細胞マーカーの組織特異的なアルカリホスファターゼ受容体（ＡＬＰ）の発現を分析するために使用されたプライマーならびにＲＴ−ＰＣＲの方法論および条件は、本質的にはＯｈｋｕｂｏ他［Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１３１：１６６７〜１６７２（２０００）］によって記載される通りであった。副甲状腺ホルモン受容体Ｉ（ＰＴＨ−Ｒｃ１；１２）の発現を分析するために使用されたプライマーならびにＲＴ−ＰＣＲの方法論および条件は、下記のように、本質的にはＫａｔｏ他［Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．、１６：１６２２〜１６３３（２００１）］によって記載される通りであった：ＣＢ１、センス：５’−ＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧ−３’（配列番号１）、アンチセンス：５’−ＡＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＴＡＴＴＧＧＣ−３’（配列番号２）；ＣＢ２、センス：５’−ＡＡＣＧＧＴＧＧＣＴＴＧＧＡＧＴＴＣＡＡＣ−３’（配列番号３）、アンチセンス：５’−ＴＡＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡＡＣＡＧＣＧ−ＧＴＴＡＧ（配列番号４）；ＦＡＡＨ、センス：５’−ＧＣＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号５）、アンチセンス：５’−ＧＡＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＴＧＧＣＴ−３’（配列番号６）；ＡＬＰ（アクセション番号Ｊ０２９８０）、センス：５’−ＧＡＣＡ−ＣＡＡＧＣＡＴＴＣＣＣＡＣＴＡＴ−３’（９６７±９８６）（配列番号７）；アンチセンス：５’−ＡＴＣＡＧ−ＣＡＧＴＡＡＣＣＡＣＡＧＴＣＡ−３’（１３１６±１２９７）（配列番号８）；副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ−Ｒｃ１）、センス：５’−ＣＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＧＴ−３’（配列番号９）；アンチセンス：５’−ＧＣＴＧＣＴＡＣＴＣＣＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＴＴＴ−３’（配列番号１０）。

結果
骨形成性培地を用いた培養での５日後、ＳＴ２間質前駆体細胞およびＭＣ３Ｔ３頭蓋冠由来前骨芽細胞はともに、ＣＢ１カンナビノイド受容体またはＣＢ２カンナビノイド受容体の最小限の発現または非発現を示した。この後には、ＣＢ２のｍＲＮＡ発現の相当高い定常的なレベルへの時間的な増大が 日目まで続いた（図５）。他方で、ＣＢ１のｍＲＮＡの発現は、最も分化した細胞でさえも明らかではなかった（データは示されず）。ＣＢ２の発現パターンは、骨芽細胞分化と一致する、ＦＡＡＨ、ＡＬＰおよびＰＴＨ−Ｒｃ１の時間的発現パターンと類似していた（図５）。

従って、示されるように分化途中の前駆体骨芽細胞におけるカンナビノイド受容体ＣＢ２およびＦＡＡＨの明白な発現により、発達中の骨芽細胞は骨生成の初期においてエンドカンナビノイドのシグナル伝達に対して感受性になっていること、そして、ＣＢ２受容体の発現およびエンドカンナビノイド受容体の活性のこのアップレギュレーションは骨芽細胞分化および骨形成の誘導にとって極めて重要であり得ることが示される。

分化途中の破骨細胞におけるカンナビノイド受容体ＣＢ２およびＦＡＡＨの発現
材料および方法
マウス大腿骨単球が、Ｚｏｕ他（ＦＡＳＥＢ Ｊ、２００２、１６：２７４〜８２）により記載されるように、Ｆｉｃｏｌｌグラジエントで分離され、破骨細胞分化因子のＭ−ＣＦＳおよびＲＡＮＫＬを含有する培地での５日間の培養で成長させられた。培養が終了したとき、培養物を、上記で記載されたようにＲＴ−ＰＣＲによってＣＢ２およびＦＡＡＨの発現について分析し、また、分化した破骨細胞の直接的な観察のために破骨細胞マーカーの酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼに関して染色した。

結果
図６Ａ〜図６Ｃに例示されるように、ＣＢ２およびＦＡＡＨはともに、分化途中の破骨細胞およびその単球前駆体で発現している。単球／マクロファージ細胞（これらは破骨細胞前駆体である）におけるＣＢ２発現はその細胞活性を阻害することが知られている（Ｐａｒｏｌａｒｏ他、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ、１９９９、６５：６３７〜４４）ので、これらの結果から、破骨細胞におけるＣＢ２発現は単球由来の破骨細胞の分化および細胞活性を同様に阻害し得ることが示唆される。従って、エンドカンナビノイドおよび他のカンナビノイド受容体リガンドは、骨芽細胞および破骨細胞の両方の細胞における受容体を活性化することができ、場合により、一方では、破骨細胞の骨再吸収活性を抑制することができ、また、他方では、骨芽細胞の骨成長活性および骨再構築活性を促進することができる。骨形成の刺激ならびに骨再吸収の阻害を効果的に行うことができるそのようなリガンドは、骨障害を処置するための理想的な治療剤を構成すると考えられる。

インビボでの骨形成活性に対するカンナビノイドの作用
材料および方法：
エンドカンナビノイドの２−アラキドノイルグリセロール（２ＡＧ）、およびＣＢ１カンナビノイド受容体アンタゴニストのＮ−（ピペリジン−１−イル）−５−（４−クロロフェニル）−１−（２，４−ジクロロフェニル）−４−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド塩酸塩［ＳＲ−１４１７６１Ａ；Ｐａｎｉｋａｓｈｖｉｌｉ他、Ｎａｔｕｒｅ、４１３：５２７〜５３１（２００１）］を１：１：１８のエタノール：エムルホル：生理的食塩水（ｖ／ｖ／ｖ）ビヒクルに溶解した。各薬剤の種々の投薬量が、毎日、１１週齢のＣ３Ｈ（Ｈａｒｌａｎ）マウスに腹腔内注射された。２ＡＧが、９日間、１日あたり体重１ｋｇについて０ｍｇ（ビヒクルコントロール）、０．５ｍｇ、５ｍｇおよび２０ｍｇで投与され、ＳＲ−１４１７６１Ａが、９日間、１日あたり体重１ｋｇについて１ｍｇおよび１０ｍｇで投与された。

インビボでの骨形成活性を評価するために、マウスには、１５ｍｇ／Ｋｇ体重のカルセインが、屠殺の４日前および１日前（最後の２ＡＧ注射と同じ日）に腹腔内に与えられた。大腿骨が屠殺後直ちに分離され、脱灰することなく、組織学的処理に供された。動的な骨の組織形態計測パラメーターが、Ｐａｒｆｉｔｔ他［Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、２：５９５〜６１０（１９８７）］により記載される手法を使用して、染色されていない長軸方向の正中矢状切片での遠位側骨幹中端（二次的な海綿質骨）において分析された。得られたデータは、処置間の差の有意さを明らかにするために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定によって統計学的に分析された。

結果
エンドカンナビノイド２ＡＧがマウスに対して９日間にわたって５ｍｇ／Ｋｇ／日までで投与された場合、骨形成速度（ＢＦＲ；、全体的な骨芽細胞活性を表すもの）の用量依存的な刺激がもたらされ、その後、プラトー状態になった（図７Ａ）。５ｍｇ／Ｋｇ／日および２０ｍｇ／Ｋｇ／日での２ＡＧで処置されたマウスは、ビヒクルコントロールよりも実質的（４４％まで）かつ有意（ｐ＝０．０４）に大きいＢＦＲを示した。２ＡＧ投与の骨形成作用もまた、そのビヒクル処置コントロールと比較された場合、２ＡＧ（５ｍｇ／Ｋｇ／日）で処置されたマウスから得られた骨の蛍光組織化学画像の比較から明らかである（図７Ｃ）。これは、処置されたマウスの骨組織における蛍光標識されたカルセインの可視的に増大した取り込みにより示される。同様に、２ＡＧが５ｍｇ／Ｋｇ／日までで投与された場合、石灰化中の周囲部（ＭＰ；骨芽細胞数を表すもの）の用量依存的な増大がもたらされ、その後、プラトー状態になった（図７Ｂ）。５ｍｇ／Ｋｇ／日および２０ｍｇ／Ｋｇ／日での２ＡＧの処置もまた、コントロールよりも実質的かつ有意に大きいＭＰをもたらした（ｐ＝０．０１９）。従って、効果的な投薬量の２ＡＧのマウスに対する投与により、骨付加活性および骨形成活性がインビボで実質的に刺激された。

ＣＢ１カンナビノイド受容体アンタゴニストＳＲ−１４１７６１Ａがマウスに対して９日間にわたって１０ｍｇ／Ｋｇ／日までで投与された場合にもまた、ビヒクルコントロールよりも大きい（しかし、統計学的には差がない）ＢＦＲ（骨芽細胞活性）、および、ビヒクルコントロールよりも大きく、かつ統計学的に差のあるＭＰ（骨芽細胞数）がもたらされた（データは示されず）。

これらの結果は、カンナビノイドリガンドの２ＡＧおよびＳＲ−１４１７６１Ａのマウスへの投与により、骨芽細胞数および骨形成速度が実質的に増大し、それにより、骨付加および構造的一体性が処置マウスにおいて効果的に増大したことを明瞭に明らかにしている。

従って、総合的に見た場合、本明細書中上記に記載される結果は、カンナビノイド受容体の発現が骨成長および骨再構築に著しい影響を及ぼすことを明白に示している。さらに、カンナビノイド受容体の発現を調整することができる薬剤を投与することにより、骨形成がインビトロおよびインビボの両方で効果的に調節され得ることが明らかにされる。

本発明のいくつかの特徴は、明確化のために、別個の実施形態に関連して記載されているが、これらはまた、１つの実施形態において組合せで提供されている場合があることが理解される。逆に、本発明の様々な特徴が、簡潔化のために、１つの実施形態に関連して記載されているが、これらはまた、別個に、または任意の好適な部分的組合せで提供されている場合がある。

本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。全ての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が、それぞれの刊行物、特許、および特許出願があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。

オスＣＢ１^−／−［ＣＢ１カンナビノイド受容体ノックアウト（欠損）マウス］および野生型コントロール（ＷＴ）の大腿骨の定性的な微小コンピューター断層撮影法（μＣＴ）を例示する。図１Ａおよび図１Ｂは、ＣＢ１^−／−の遠位側の大腿骨骨端中節における小柱骨体積密度の顕著な減少を示す三次元μＣＴ画像（図１Ａ）、ならびに、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱結合性が低下していること（図１Ｂ）を示す。 オスＣＢ１^−／−［ＣＢ１カンナビノイド受容体ノックアウト（欠損）マウス］および野生型コントロール（ＷＴ）の大腿骨の微小コンピューター断層撮影法（μＣＴ）の比較形態計測分析を例示する。図２Ａ（上段左）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける皮質厚さの増大が著しいこと（ｐ＝０．０１２）を示し、図２Ｂ（上段右）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける髄質空間体積の減少が著しいこと（ｐ＝０．００３）を示し、図２Ｃ（下段左）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱骨体積の減少が著しいこと（ｐ＝０．０１８）を示し、図２Ｄ（下段中央）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱数減少の減少が著しいこと（ｐ＝０．０００３）を示し、図２Ｅ（下段右）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱結合性の低下が著しいこと（ｐ＝０．０００２）を示す。誤差バーは±標準偏差を示す。 メス野生型コントロール（ＷＴ）との比較で、メスＣＢ１受容体ノックアウト（欠損）マウス（ＣＢ１^−／−）の大腿骨の微小コンピューター断層撮影（μＣＴ）形態計測分析を例示する。誤差バーは±標準偏差を示し、星印は統計学的に有意であることを示す。図３Ａ（上段左）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱骨体積の低下が著しいことを示し、図３Ｂ（上段右）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱結合性の減少が著しくないことを示し、図３Ｃ（下段左）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱数の減少が著しいことを示し、一方、図３Ｄ（下段右）は、ＣＢ１^−／−マウスにおける小柱間隔の増大が著しいことを示す。 オスＦＡＡＨ^−／−［脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）ノックアウト（欠損）マウス］および野生型コントロール（ＷＴ）の大腿骨のμＣＴ形態計測分析を例示する。誤差バーは±標準偏差を示す。図４Ａ（上段左）は、ＦＡＡＨ^−／−マウスにおける皮質厚さの減少が著しいこと（ｐ＝０．０４９）を示し、図４Ｂ（上段右）は、ＦＡＡＨ^−／−マウスにおける小柱骨体積の減少が著しくないことを示し、一方、図４Ｃ（下段左）は、ＦＡＡＨ^−／−マウスにおける髄質空間体積の増大が著しいことを示す。図４Ｄには、骨皮質厚さ（Ｃｔ．Ｔｈ．）と髄質空間体積（ＭＶ／ＴＶ）との線形回帰分析が示され、これは有意な逆の相関を示している（ｒ＝−０．９８５、ｐ＝０．００５）。 分化途中の骨芽細胞前駆体細胞における、ＣＢ２カンナビノイド受容体、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）、副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲｃ１）および組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のＲＴ−ＰＣＲ発現分析を例示する。 分化途中の破骨細胞におけるカンナビノイド受容体ＣＢ２および脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）の発現を例示する。図６Ａ（左パネル）は、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬ（破骨細胞分化因子）を含有する破骨細胞分化培地で培養された大腿骨単球の顕微鏡写真である。図６Ｂ（右パネル）は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼに関して染色された分化途中の破骨細胞の顕微鏡写真である。分化した破骨細胞が赤色〜桃赤色で染色されている。図６Ｃ（下段）は、培養された単球および分化した破骨細胞の両方におけるＣＢ２およびＦＡＡＨの陽性の発現を例示するＲＴ−ＰＣＲ分析である。 エンドカンナビノイドの２−アラキドノイルグリセロール（２ＡＧ）で処置されたマウスまたは非処置マウスの定性的分析および組織形態計測分析を例示する。図７Ａ（上段左）には、骨形成速度に対する２ＡＧの著しい正の用量応答作用が示される（ｐ＝０．０４）。図７Ｂ（上段右）には、骨形成部位へのカルセイン染色の取り込みを明らかにする、２ＡＧ処置マウス（２ＡＧ）および非処置マウス（ビヒクル）の代表的な蛍光組織学的画像が示される。２ＡＧ処置マウス（右パネル）では、石灰化前線の密度がより大きくなっていることを示す、蛍光性カルセインの増大した染色密度には留意すること。２ＡＧ処置マウスの骨組織（右側の画像）は、非処置マウスの類似する骨組織（左側の画像）よりも実質的に高密度化しているようである。図７Ｃ（下段左）は、石灰化中の周囲部に対する２ＡＧの類似した著しい正の用量応答作用を示している（ｐ＝０．０１９）。しかしながら、無機付加速度に対する２ＡＧの作用は有意でないことが明らかであった（図７Ｄ、下段右）。

配列番号１〜１０は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。

【配列表】

Claims (74)

1. 骨成長および／または骨再構築を調節する方法であって、少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性を調整し、それにより骨成長および／または骨再構築を調節することを含む方法。
2. 前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体が骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体である請求項１記載の方法。
3. 前記骨細胞前駆体が骨形成性細胞である請求項２記載の方法。
4. 前記骨細胞前駆体が間質細胞である請求項２記載の方法。
5. 前記骨細胞前駆体が骨再吸収細胞前駆体である請求項２記載の方法。
6. 前記調整することがアップレギュレーションすることである請求項１記載の方法。
7. 前記発現または活性を前記アップレギュレーションすることは、
   （ａ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の機能的部分を少なくとも発現させるために設計および構築された外因性ポリヌクレオチド配列、
   （ｂ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードする内因性ＤＮＡまたはｍＲＮＡの発現を増大させる化合物、および
   （ｃ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体を活性化する分子、
   からなる群から選択される薬剤によって行われる請求項６記載の方法。
8. 前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体を活性化する前記分子がカンナビノイドである請求項７記載の方法。
9. 前記カンナビノイドが２ＡＧである請求項８記載の方法。
10. 前記調整することがダウンレギュレーションすることである請求項１記載の方法。
11. 前記発現または活性を前記ダウンレギュレーションすることは、
    （ａ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体と結合する分子、
    （ｂ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体を切断する酵素、
    （ｃ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、
    （ｄ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡを特異的に切断するＤＮＡザイム、
    （ｅ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
    （ｆ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断するリボザイム、
    （ｇ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の結合部分を少なくとも有する非機能的アナログ、および
    （ｈ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の活性化またはリガンド結合を妨げる分子、
    からなる群から選択される薬剤によって行われる請求項１０記載の方法。
12. 前記発現または活性を前記調整することが、前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の第１のカンナビノイド受容体をアップレギュレーションし、かつ、前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の第２のカンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることによって行われる請求項１記載の方法。
13. 前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体は、ＣＢ１受容体、ＣＢ１様受容体、ＣＢ２受容体、ＣＢ２様受容体および非ＣＢ１非ＣＢ２受容体からなる群から選択される請求項１記載の方法。
14. 必要性のある対象において骨疾患を処置または防止する方法であって、対象の少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性を調整し、それにより前記対象において骨疾患を処置または防止することを含む方法。
15. 対象が脊椎動物である請求項１４記載の方法。
16. 前記脊椎動物がヒトである請求項１５記載の方法。
17. 前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体が骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体である請求項１６記載の方法。
18. 前記骨細胞前駆体が骨形成性細胞である請求項１７記載の方法。
19. 前記骨細胞前駆体が間質細胞である請求項１７記載の方法。
20. 前記骨細胞前駆体が骨再吸収細胞前駆体である請求項１７記載の方法。
21. 前記調整することがアップレギュレーションすることである請求項１７記載の方法。
22. 前記発現または活性を前記アップレギュレーションすることは、
    （ａ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体の機能的部分を少なくとも発現させるために設計および構築された外因性ポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体をコードする内因性ＤＮＡまたはｍＲＮＡの発現を増大させる化合物、および
    （ｃ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体を活性化する分子、
    からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を対象に投与することによって行われる請求項２１記載の方法。
23. 前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体を活性化する前記分子がカンナビノイドである請求項２２記載の方法。
24. 前記カンナビノイドが２ＡＧである請求項２２記載の方法。
25. 前記調整することがダウンレギュレーションすることである請求項１７記載の方法。
26. 前記発現または活性を前記ダウンレギュレーションすることは、
    （ａ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体と結合する分子、
    （ｂ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体を切断する酵素、
    （ｃ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、
    （ｄ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡを特異的に切断するＤＮＡザイム、
    （ｅ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
    （ｆ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断するリボザイム、
    （ｇ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体の結合部分を少なくとも有する非機能的アナログ、および
    （ｈ）前記対象の前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体の活性化またはリガンド結合を妨げる分子、
    からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を対象に投与することによって行われる請求項２５記載の方法。
27. 前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体の活性化またはリガンド結合を妨げる前記分子がＳＲ−１４１７６１Ａである請求項２６記載の方法。
28. 前記発現を前記調整することが、前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体の第１のカンナビノイド受容体をアップレギュレーションし、かつ、前記骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体の第２のカンナビノイド受容体をダウンレギュレーションすることによって行われる請求項１７記載の方法。
29. 前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体は、ＣＢ１受容体、ＣＢ１様受容体、ＣＢ２受容体、ＣＢ２様受容体および非ＣＢ１非ＣＢ２受容体からなる群から選択される請求項１４記載の方法。
30. 対象が、骨粗鬆症、骨折または骨不全症、原発性または二次的な上皮小体機能亢進症、変形性関節炎、歯周病または歯周欠陥、溶骨性骨疾患、形成手術後、整形外科的埋め込み後、および歯科埋め込み後からなる群から選択される状態または疾患に罹患している請求項１４記載の方法。
31. 骨形成を促進し、かつ／または骨再吸収を阻害することができる少なくとも１つの化合物を対象に投与することをさらに含む請求項３０記載の方法。
32. 前記少なくとも１つの化合物は、骨形態形成タンパク質、抗再吸収剤、骨形成性因子、軟骨由来形態形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＩＧＦ１、ＦＧＦ、ノギン、骨形成性成長ペプチド、成長ホルモン、エストロゲン系薬剤、ビスホスホナート系薬剤、スタチンおよび分化因子からなる群から選択される請求項３１記載の方法。
33. 対象が、パジェット病、骨芽細胞性骨疾患、芽細胞性転移性骨ガン、転移性骨疾患、ホジキンリンパ腫、退行性硬化症および骨髄炎からなる群から選択される状態または疾患に罹患している請求項１４記載の方法。
34. 骨形成を阻害し、かつ／または骨再吸収を促進することができる少なくとも１つの化合物を前記対象に投与することをさらに含む請求項３３記載の方法。
35. 必要性のある対象において骨成長および／または骨修復を誘導する方法であって、
    （ａ）骨細胞を単離すること、
    （ｂ）前記骨細胞の少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性を調整すること、および
    （ｃ）工程（ｂ）から得られた前記骨細胞を対象に投与し、それにより前記対象において骨成長および／または骨修復を誘導すること、
    を含む方法。
36. 前記骨細胞が骨細胞前駆体である請求項３５記載の方法。
37. 前記骨細胞前駆体が骨形成性細胞である請求項３５記載の方法。
38. 前記骨細胞前駆体が間質細胞である請求項３５記載の方法。
39. 前記骨細胞前駆体が骨再吸収細胞前駆体である請求項３５記載の方法。
40. 前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体は、ＣＢ１受容体、ＣＢ１様受容体、ＣＢ２受容体、ＣＢ２様受容体および非ＣＢ１非ＣＢ２受容体からなる群から選択される請求項３５記載の方法。
41. 前記調整することがアップレギュレーションすることである請求項３５記載の方法。
42. 前記発現または活性を前記アップレギュレーションすることは、
    （ａ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の機能的部分を少なくとも発現させるために設計および構築された外因性ポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードする内因性ＤＮＡまたはｍＲＮＡの発現を増大させる化合物、および
    （ｃ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体を活性化する分子、
    からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に前記骨細胞をさらすことによって行われる請求項４１記載の方法。
43. 前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体を活性化する前記分子がカンナビノイドである請求項４２記載の方法。
44. 前記カンナビノイドが２ＡＧである請求項４３記載の方法。
45. 前記調整することがダウンレギュレーションすることである請求項３５記載の方法。
46. 前記発現または活性を前記ダウンレギュレーションすることは、
    （ａ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体と結合する分子、
    （ｂ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体を切断する酵素、
    （ｃ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、
    （ｄ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡを特異的に切断するＤＮＡザイム、
    （ｅ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
    （ｆ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断するリボザイム、
    （ｇ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の結合部分を少なくとも有する非機能的アナログ、および
    （ｈ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の活性化またはリガンド結合を妨げる分子、
    からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤に前記骨細胞をさらすことによって行われる請求項４５記載の方法。
47. 骨形成を促進し、かつ／または骨再吸収を阻害することができる少なくとも１つの化合物を前記対象に投与する工程をさらに含む請求項３５記載の方法。
48. 前記少なくとも１つの化合物は、骨形態形成タンパク質、抗再吸収剤、骨形成性因子、軟骨由来形態形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＩＧＦ１、ＦＧＦ、ノギン、骨形成性成長ペプチド、成長ホルモン、エストロゲン系薬剤、ビスホスホナート系薬剤、スタチンおよび分化因子からなる群から選択される請求項４７記載の方法。
49. 骨形成を阻害し、かつ／または骨再吸収を促進することができる少なくとも１つの化合物を前記対象に投与する工程をさらに含む請求項３５記載の方法。
50. 骨成長および／または骨再構築を調節するための薬学的組成物であって、骨細胞の少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性を調整することができる薬剤と、骨成長および／または骨再構築を調節することができる化合物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物。
51. 前記カンナビノイド受容体は、ＣＢ１受容体、ＣＢ１様受容体、ＣＢ２受容体、ＣＢ２様受容体および非ＣＢ１非ＣＢ２受容体からなる群から選択される請求項５０記載の薬学的組成物。
52. 前記薬剤は、
    （ａ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の機能的部分を少なくとも発現させるために設計および構築された外因性ポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードする内因性ＤＮＡまたはｍＲＮＡの発現を増大させる化合物、および
    （ｃ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体を活性化する分子、
    からなる群から選択される請求項５０記載の薬学的組成物。
53. 前記薬剤がカンナビノイドである請求項５２記載の薬学的組成物。
54. 前記カンナビノイドが２ＡＧである請求項５２記載の薬学的組成物。
55. 前記薬剤は、
    （ａ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体と結合する分子、
    （ｂ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体を切断する酵素、
    （ｃ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、
    （ｄ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡを特異的に切断するＤＮＡザイム、
    （ｅ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
    （ｆ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断するリボザイム、
    （ｇ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の結合部分を少なくとも有する非機能的アナログ、および
    （ｈ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の活性化またはリガンド結合を妨げる分子、
    からなる群から選択される請求項５０記載の薬学的組成物。
56. 前記化合物は、骨形態形成タンパク質、抗再吸収剤、骨形成性因子、軟骨由来形態形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＩＧＦ１、ＦＧＦ、ノギン、骨形成性成長ペプチド、成長ホルモン、エストロゲン系薬剤、ビスホスホナート系薬剤、スタチンおよび分化因子からなる群から選択される請求項５０記載の薬学的組成物。
57. 充填用物質と、骨疾患または骨欠陥の処置のために同定されている薬学的組成物の治療効果的な量とを含む製造物であって、前記薬学的組成物が、少なくとも１つのカンナビノイド受容体の活性または発現を調整することができる薬剤と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む製造物。
58. 前記カンナビノイド受容体は、ＣＢ１受容体、ＣＢ１様受容体、ＣＢ２受容体、ＣＢ２様受容体および非ＣＢ１非ＣＢ２受容体からなる群から選択される請求項５７記載の製造物。
59. 前記薬剤は、
    （ａ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の機能的部分を少なくとも発現させるために設計および構築された外因性ポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードする内因性ＤＮＡまたはｍＲＮＡの発現を増大させる化合物、および
    （ｃ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体を活性化する分子、
    からなる群から選択される請求項５７記載の製造物。
60. 前記薬剤がカンナビノイドである請求項５７記載の製造物。
61. 前記カンナビノイドが２ＡＧである請求項６０記載の方法。
62. 前記薬剤は、
    （ａ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体と結合する分子、
    （ｂ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体を切断する酵素、
    （ｃ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、
    （ｄ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体のｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡを特異的に切断するＤＮＡザイム、
    （ｅ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
    （ｆ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断するリボザイム、
    （ｇ）前記骨細胞の前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の結合部分を少なくとも有する非機能的アナログ、および
    （ｈ）前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の活性化またはリガンド結合を妨げる分子、
    からなる群から選択される請求項５７記載の製造物。
63. 骨形成を促進するか、または骨再吸収を阻害することができる少なくとも１つの化合物をさらに含む請求項５７記載の製造物。
64. 前記少なくとも１つの化合物は、骨形態形成タンパク質、抗再吸収剤、骨形成性因子、軟骨由来形態形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＩＧＦ１、ＦＧＦ、ノギン、骨形成性成長ペプチド、成長ホルモン、エストロゲン系薬剤、ビスホスホナート系薬剤、スタチンおよび分化因子からなる群から選択される請求項６３記載の製造物。
65. 骨形成を阻害するか、または骨再吸収を促進することができる少なくとも１つの化合物をさらに含む請求項５７記載の製造物。
66. 骨成長調節剤を同定する方法であって、多数の分子をスクリーニングし、それにより、少なくとも１つのカンナビノイド受容体の発現または活性を調整することができる、骨成長調節剤である分子を明らかにすることを含む方法。
67. 骨形成速度を変化させる前記分子の能力を測定すること、および／または骨石灰化周囲を変化させることをさらに含む請求項６６記載の方法。
68. 前記スクリーニングが、前記骨細胞を前記多数の分子にさらし、前記骨細胞における前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体の前記発現を測定することによって行われる請求項６６記載の方法。
69. 前記カンナビノイド受容体は、ＣＢ１受容体、ＣＢ１様受容体、ＣＢ２受容体、ＣＢ２様受容体および非ＣＢ１非ＣＢ２受容体からなる群から選択される請求項６６記載の方法。
70. 前記少なくとも１つのカンナビノイド受容体が骨細胞または骨細胞前駆体のカンナビノイド受容体である請求項６６記載の方法。
71. 前記骨細胞前駆体が骨形成性細胞である請求項７０記載の方法。
72. 前記骨細胞前駆体が間質細胞である請求項７０記載の方法。
73. 前記骨細胞前駆体が骨再吸収細胞前駆体である請求項７０記載の方法。
74. 前記カンナビノイド受容体の前記発現がＲＴ−ＰＣＲによって測定される請求項６６記載の方法。