DE3874568T2 - Fermentation von mikroorganismen mit eisbildungsaktivitaet durch einen temperaturwechsel. - Google Patents

Fermentation von mikroorganismen mit eisbildungsaktivitaet durch einen temperaturwechsel.

Info

Publication number
DE3874568T2
DE3874568T2 DE8888103346T DE3874568T DE3874568T2 DE 3874568 T2 DE3874568 T2 DE 3874568T2 DE 8888103346 T DE8888103346 T DE 8888103346T DE 3874568 T DE3874568 T DE 3874568T DE 3874568 T2 DE3874568 T2 DE 3874568T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
microorganism
fermentation
temperature
microorganisms
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE8888103346T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3874568D1 (de
Inventor
Richard Joseph Eastman Laduca
Jr Eastman Kodak Compa Lawless
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Danisco US Inc
Original Assignee
Genencor International Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genencor International Inc filed Critical Genencor International Inc
Publication of DE3874568D1 publication Critical patent/DE3874568D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3874568T2 publication Critical patent/DE3874568T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/874—Pseudomonas

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fermentation von Mikroorganismen, die eine Eiskristallbildungsaktivität aufweisen.
  • In der U.S. Patentschrift 4 200 228 ist ein Verfahren zur Herstellung von Schnee beschrieben, bei dem Mikroorganismen in Tröpfchen eingeschlossen werden, die in die Luft versprüht werden. Die verwendeten Mikroorganismen sind von dem Typ, der dafür bekannt ist, daß er die Eiskristallbildung fördert. Infolgedessen läßt sich Schnee bei einer Temperatur erzeugen, die viel höher als normalerweise möglich ist. Ein typischer Mikroorganismus, der für dieses Verfahren geeignet ist, ist ein Mikroorganismus vom Typ pseudomonad und insbesondere Pseudomonas syringae.
  • Es ist offensichtlich, daß, wenn dieses Verfahren in beliebigem Maßstab angewandt wird, große Mengen an Mikroorganismen benötigt werden. Weiterhin ist wünschenswert, daß die Mikroorganismen in trockener Form erhalten werden, um ihre Aufbewahrung, Handhabung und den Transport des Materials zu erleichtern.
  • Die Wachstumsbedingungen für Mikroorganismen, die eine Eiskristallbildungsaktivität aufweisen, sind bekannt. Beispielsweise ist aus einer Arbeit von Maki und Willoughby, Bacteria as Biogenic sources of Freezing Nuclei, J. Applied Meteorology 17, 1049-1053 bekannt, daß die Mikroorganismen, wie beispielsweise Pseudomonas syringae in einer Koser-Citratbrühe bei einer Temperatur unterhalb von 20ºC, d. h. bei 5ºC gezüchtet werden.
  • Gemäß einer anderen Literaturstelle werden die Mikroorganismen in einem Trypton-Hefeextrakt-Glycerinmedium gezüchtet, das einen pH-Wert von etwa 7,0 aufweist. (Koxloff, Schofield and Lute, Ice Nucleating Activity of Pseudomonas syringae and Erwinia herbicola, J. Bacter, 153, Seiten 222-231 (1983)). Im Falle dieser Literaturstelle werden die Mikroorganismen nicht in trockener Form gewonnen und die Suspensionen werden direkt auf ihre Aktivität geprüft. Zu bemerken ist, daß die Eiskristallbildungsaktivität in der Suspension nicht stabil ist und über Nacht abnimmt.
  • Werden die bekannten Verfahren zur Erzeugung von großen Mengen an Mikroorganismen angewandt, so wird eine geringere als die gewünschte Eiskristallbildungsaktivität (INA) erhalten. Nicht nur ist die Eiskristallbildungsaktivität der Ausgangssuspension geringer als erwünscht sondern vielmehr geht auch ein großer Teil der Aktivität während der Gefriertrocknung von großen Volumina des Materials verloren. Das Endergebnis ist ein Verfahren, das sich nicht zur Herstellung von kommerziellen Mengen an Mikroorganismen zu vertretbaren Kosten eignet.
  • In der EP-Anmeldung Nr. 87 113 772.5 wird eine Verbesserung des bekannten Verfahrens für die Herstellung von Eiskristalle bildenden Mikroorganismen beschrieben. In diesem Verfahren wird der pH-Wert so eingestellt, daß er zwischen 6,7 und 5,5 liegt. Nähert sich der pH-Wert einem Wert von etwa 6,7, so wird Säure zugesetzt und nähert sich der pH-Wert einem Wert von 5,5, so wird eine Base zugegeben. In dieser Anmeldung werden ferner andere Verbesserungen des Verfahrens zur Fermentation von Eiskristalle bildenden Mikroorganismen beschrieben. Beispielsweise wird ein bevorzugtes Medium beschrieben, das Mannitol als Kohlenstoff-Lieferant aufweist und einen Hefeextrakt als Stickstoff-Lieferanten.
  • Das Verfahren dieser Literaturstelle erzeugt eine akzeptable INA. Beispielsweise liegt der Fermentor INA-Wert, der gemäß Beispiel 1 dieser Literaturstelle erhalten wird, bei 5,0 x 10¹¹ ("Fermentor INA", wie hier definiert, weist die Kristalleinheiten pro Gramm trockener Zellen auf). Die Produktivität war jedoch geringer als erwünscht. Während die Fermentation eine respektable Zelldichte, 18 Gramm pro Liter erreichte, waren hierzu 36 Stunden erforderlich. Infolgedessen betrug die "Fermentor-Produktivität" ebenfalls wie hier definiert lediglich 2,5 x 10¹¹ Kristalle pro L-Stunde.
  • In der EP-A-87 118 942.9 (0 272 669) wird ein Verfahren beschrieben, bei dem bessere Ergebnisse erhalten werden als bei dem Verfahren, das in der EP-A-87 113 772.5 beschrieben wird, wie eben erwähnt wurde. Im Falle des Beispieles 1 wurde der Fermentor-INA-Wert auf 10 x 10¹¹ erhöht, wobei die Fermentor-Produktivität bei 6,59 x 10¹¹ lag. Diese Ergebnisse wurden mit einem Medium erreicht, das einen Zucker als Kohlenstoff-Lieferanten enthielt und ein α-Ketoglutarat oder eine α-Ketoglutarat liefernde Aminosäure.
  • Obgleich beide der beschriebenen Anmeldungen Fermentationsverfahren beschreiben, die eine starke Verbesserung gegenüber denen des Standes der Technik darstellen, sind doch noch weitere Verbesserungen erwünscht. Insbesondere besteht ein Bedürfnis der Verbesserung der Fermentor-Produktivität zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren der Fermentation eines Mikroorganismus dar, der eine Eiskristallbildungsaktivität aufweist und die Stufen der Fermentation des Mikroorganismus in einem Medium und die Gewinnung des Mikroorganismus umfaßt. Das verbesserte Verfahren umfaßt die Stufen:
  • 1) Züchtung des Mikroorganismus bei einer Temperatur von mindestens etwa 29ºC in einem Medium mit einem Stickstoff-Lieferanten, dessen Konzentration:
  • a) ausreichend ist, um eine Zellmasse von mindestens 20 g/L zu liefern, und
  • b) dessen Konzentration geringer als 20 g/L am Ende der Wachstumsphase ist, um die Bildung von Eiskristallbildungsaktivität während der folgenden stationären Phase zu inhibieren und
  • 2) Fortsetzung der Fermentation während der stationären Phase bei einer Temperatur unterhalb von 24ºC.
  • Aus der vorstehenden Diskussion ergibt sich, daß die vorliegende Erfindung zwei wesentliche Merkmale aufweist. Das erste Merkmal betrifft die Konzentration des Stickstoff- Lieferanten in der Wachstumsphase und das zweite Merkmal die Temperaturen während den Wachstums- und stationären Phasen. Diese Merkmale sind erforderlich, um einen hohen INA-Wert bei gleichzeitiger hoher Fermentor-Produktivität zu erreichen. Beispielsweise erreichte die Zelldichte von Beispiel 1 der EP-A-87 118 942.9 (0 272 669), die oben erwähnt wurde, nur einen Wert von 14,5 g/L. Wurde die Nährstoffkonzentration erhöht und die Temperatur erhöht und um das Zellwachstum zu verbessern aufrechterhalten, so wurde der INA-Wert beträchtlich vermindert. Wurde in entsprechender Weise die Temperatur eingestellt (obgleich sich in der Literaturstelle kein Hinweis hierauf findet) ohne geeignete Einstellungen der Nährstoffkonzentration, so ergab sich eine schlechte Produktivität.
  • Die Ausgangskonzentration des Stickstoff-Lieferanten steht in Beziehung zur Temperatur der Fermentation während der Wachstumsphase. Es soll genügend Stickstoff-Lieferant vorliegen, um eine Endzellmasse von mindestens etwa 20 g/L zu erreichen. Es sollte jedoch nicht so viel vorliegen, daß inhibierend wirkende Mengen von Stickstoff-Lieferanten zurückbleiben, nachdem die Wachstumsphase abgeschlossen ist. Die Menge steht in Beziehung zur Temperatur, da, wenn die Temperatur erhöht wird, das Potential für die Zellmasse ebenfalls erhöht wird (bis zu einem Punkt) und die Menge an Stickstoff- Lieferanten muß ebenfalls entsprechend erhöht werden. Wird die optimale Wachstumstemperatur des Mikroorganismus überschritten, so nimmt das Wachstumspotential ab und die Menge an Stickstoff-Lieferanten muß entsprechend vermindert werden.
  • In einer typischen Wachstumsphase mit P. syringae bei 30ºC beträgt die Anfangskonzentration des Stickstoff- Lieferanten etwa 45 g/L (bezogen auf Mononatriumglutamat (MSG)), durch welche eine Zellmasse von etwa 24 g/L zum Ende der Wachstumsphase erzeugt wird. Wenig MSG bleibt zurück. Bei 33ºC wird die optimale wachstumstemperatur dieses Mikro- Organismus überschritten und die Konzentration sollte etwas geringer sein, beispielsweise bei etwa 40 g/L liegen.
  • Die Menge an Stickstoff-Lieferanten, der zum Schluß der Wachstumsphase zurückbleibt, läßt sich nach üblichen Verfahren ermitteln. Das genaue Verfahren, das angewandt wird, hängt von der Natur des Stickstoff-Lieferanten ab. Wird MSG als Lieferant verwendet, so kann dieser im Medium mittels einer HPLC-Methode ermittelt werden, unter Verwendung eines fluoreszierenden OPA-Mercaptoethanolderivates, wie es bekannt ist.
  • Zu erwähnen ist, daß die erwähnten Kriterien normalerweise zu einer Anfangskonzentration fuhren, die etwas höher ist als diejenige, die zuvor angewandt wurde. Bei 30ºC beispielsweise liegt die MSG-Konzentration bei 45 g/L, wodurch eine Zelldichte von 24 g/L erzeugt wird. Zum Vergleich liegt die Anfangskonzentration der L-Glutaminsäure in dem Beispiel der EP-A-87 118 942.9 (0 272 669) bei 20 g/L bei einer Wachstumstemperatur von 24ºC.
  • Gemäß der Erfindung soll die Konzentration des Stickstoff-Lieferanten niedrig genug sein, so daß am Ende der Wachstumsphase eine ungenügende Menge an Stickstoff-Lieferanten verbleibt, um die Formation der Eiskristallbildungsaktivität während der nachfolgenden stationären Phase zu inhibieren. Dies bedeutet, daß, wenn mehr als diese Menge verwendet wird, der INA-Wert um mehr als etwa 60 % abnimmt. Die exakte Menge läßt sich durch einige Experimente ermitteln. Dies bedeutet, daß weniger als 20 g/L zu diesem Zeitpunkt im Fermentationsmedium verbleiben, vorzugsweise weniger als 5 g/L.
  • Bei der Fermentation des vorliegenden Mikroorganismus wie auch im Falle der Fermentation anderer Mikroorganismen tritt eine Phase auf, die als wachstumsphase bezeichnet wird, in der der Mikroorganismus sich schnell vervielfacht. Diese Phase ist auch als die ''log-Phase" oder logarithmische Wachstumsphase bekannt. Während dieser Periode ergibt sich, falls der Logarithmus der optischen Dichte des Wachstumsmediums in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen wird, eine gerade Linie. Am Ende dieser Periode nimmt die Neigung dieser Geraden dramatisch ab, wodurch angezeigt wird, daß sich der Mikroorganismus nicht länger vermehrt, d. h. daß die stationäre Phase erreicht wird. Zwischen diesen beiden Phasen ist ein kurzer Übergang. Im Falle einer typischen Fermentation, die 22 Stunden dauert, kann der Übergang beispielsweise nur eine Stunde dauern. Ist hier die Rede von dem ''Abschluß der Wachstumsphase", so schließt diese jede Zeit vom Ende des Teiles der geraden Linie bis zur kurzen Übergangsperiode ein.
  • Die Temperatur während der wachtsumsphase soll über etwa 29ºC liegen, um ein gutes Wachstum zu fördern. Obgleich bei Durchführungs des Verfahrens der Erfindung höhere Temperaturen angewandt werden können, sind Temperaturen oberhalb etwa 35ºC nicht erforderlich. Im Falle des im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt angewandten Mikroorganismus P. syringae wird das Wachstum bei Temperaturen oberhalb 33ºC vermindert. Sehr hohe Zelldichten lassen sich bei niedrigeren Temperaturen erreichen. Die augenblicklich bevorzugte Temperatur während der Wachstumsphase liegt bei etwa 30ºC.
  • Es wurde gefunden, daß die INA überwiegend während der stationären Phase der Fermentation erzeugt wird. Ferner soll während dieser Phase die Temperatur auf unterhalb 24ºC vermindert werden, damit eine beträchtliche Menge an INA erzeugt wird. obgleich die Temperatur niedriger als 24ºC sein kann, wird eine geringe weitere Verbesserung der INA erreicht, wenn die Temperaturen bei unterhalb etwa 21ºC liegen. Infolgedessen liegt die augenblicklich bevorzugte Temperatur der stationären Phase bei 21ºC.
  • Obgleich jedes übliche Medium zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist doch das aus der EP-A-87 118 924.2 (0 272 609) bekannte Medium das augenblicklich bevorzugte Medium. Das Medium weist zwei wesentliche Komponenten auf, einen Zucker und α-Ketoglutarat oder eine α- Ketoglutarat liefernde Aminosäure.
  • Zu geeigneten Zuckern gehören Glucose (oder rohe Glucose wie Dextrose) Sucrose, Fructose, Erythrose, Mannose, Xylose und Ribose. Handelsübliche Formen dieser Zucker lassen sich in geeigneter Weise verwenden. Zu solchen Formen gehören flüssige Sucrose, Kornsirup von hohem Fructosegehalt sowie Dextrose-Kornsirup. Auch können Mischungen dieser Zucker verwendet werden. Andere Kohlenstoff-Lieferanten können in Kombination mit diesen Zuckern verwendet werden, beispielsweise Mannitol und andere Zuckerderivate.
  • Die andere wesentliche Komponente ist α-Ketoglutarat oder eine α-Ketoglutarat liefernde Aminosäure. Aminosäuren, die α-Ketoglutarat in biologischen Prozessen liefern, sind Arginin, Histinin, Glutamin, Glutaminsäure und Prolin. Auch sind Salze dieser Säuren geeignet, beispielsweise das Mononatriumglutamat (MSG). Eine Diskussion der Erzeugung von α-Ketoglutarat aus diesen Aminosäuren befindet sich in dem Buch Biochemistry, 2. Ausgabe, Lehninger, Worth (1975) Seite 574 und folgende. Auch können Mischungen dieser Verbindungen eingesetzt werden.
  • Das Medium enthält ferner vorzugsweise Phosphate, z.B. Kaliumphosphate. Ein geeigneter Bereich der Ausgangs- Phosphatkonzentration liegt zwischen etwa 0,2 bis 6 g/l, vorzugsweise zwischen 0,6 bis 3 g/L. Im Falle bevorzugter Ausführungsformen wird die Anfangs-Phosphatkonzentration so ausgewählt, daß wenig, z. B. weniger als 1 g/L zum Abschluß der Wachstumsphase hinterbleibt.
  • Das Medium enthält ferner vorzugsweise weitere Komponenten. Es ist bekannt, daß zur Fermentation dieser Mikroorganismen Magnesiumsulfat vorzugsweise verwendet wird. Weiterhin ist wünschenswert, daß das Medium Spurenmengen von Metallen enthält. Besonders nützlich sind Spurenmengen von Eisen und Zink.
  • Zur Verwendung bei einer Fermentation, bei der die Wachstumsphasentemperatur 30ºC beträgt, wird das folgende Medium bevorzugt angewandt:
  • Sucrose 90 g/l
  • MSG 45 g/L
  • Magnesiumsulfat 4 g/L
  • Kaliumphosphat 2,75 g/L
  • Eisensulfat 0,112 g/L
  • Zinksulfat 0,0024 g/L
  • Während der Fermentation ist es wünschenswert, den pH-Wert zu steuern, wie es aus der vorerwähnten EP-Anmeldung Nr. 87 113 772.5 bekannt ist.
  • Jeder Mikroorganismus, der eine Eiskristallbildungsaktivität aufweist, läßt sich nach der vorliegenden Erfindung erzeugen. Zu geeigneten Mikroorganismen gehören Pseudomonads, z. B. P. syringae und P. fluorescens, P. coronafaciens und P. pisi. Zu anderen Mikroorganismen, die sich zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen, gehört Erwina herbicola. Der gegenwärtig bevorzugte Mikroorganismus ist P. syringae ATCC, Nr. 53543, hinterlegt am 23. Sept. 1986 in Übereinstimmung mit dem Budapester Abkommen bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, USA.
  • Der Mikroorganismus, der bei der beschriebenen Fermentation erzeugt wird, läßt sich nach einer Anzahl von Verfahren trocknen. Eine Sprühtrocknung und eine Gefriertrocknung sind typische Beispiele hierfür. Jedes Trocknungsverfahren vermindert dabei die INA in einem bestimmten Ausmaß. Ein bevorzugtes Verfahren, das eine große Menge der INA erhält, die im Fermentor erzeugt worden ist, ist das Verfahren, das in der US-Patentschrift 4 706 463 vom 17. November 1987 beschrieben wird. In diesem Verfahren wird das Medium abgekühlt, konzentriert, in eine cryogene Flüssigkeit unter Bildung von Pellets eingeführt, worauf die Pellets bei einer relativ niedrigen Temperatur gefriergetrocknet werden.
  • In den im folgenden angegebenen Beispielen wurde der INA-Wert nach üblichen Methoden errechnet. Der INA-Wert wurde bestimmt durch Aufbringen einer Vielzahl von Mikroorganismen enthaltenden Wasserströpfchen (10 ul) auf eine mit Paraffin beschichtete Aluminiumfolie. Die Folie wurde bei einer Temperatur von -5ºC gehalten, durch Aufbringen auf ein Bad von konstanter Temperatur. Einzelheiten bezüglich dieses Verfahrens finden sich in der Literatur, beispielsweise in Vali, Quantitative Evaluation of Experimental Results on the Heterogenous Freezing of Supercooled Liquids, J. Atoms, Sci., 28, 402-4009 (1971). Die INA-Werte, die in den Beispielen angegeben werden, stellen die Anzahl von Eiskristallzentren pro Trockengramm Mikroorganismus dar. Für die vorliegenden Zwecke wurde der INA-Wert gemessen unter Verwendung einer Probe, die dem Fermentor ohne Trocknung entnommen wurde. Der Wert wird infolgedessen hier als "Fermentor INA" bezeichnet. Die Einheiten sind Kristalle pro Trockengramm Mikroorganismus. Der INA-Wert kann in mehreren Abständen ermittelt werden, um die optimale INA-Produktion zu ermitteln.
  • Die in der folgenden Tabelle angegebene Fermentor- Produktivität ist definiert als die Fermentor INA mal Zellenmasse dividiert durch die Zeit der Fermentation, beginnend mit einem 10 %igen Saat-Inokulum.
  • Die Einheiten sind Kristalle pro L/Stunde.
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
    • Keimkultur
  • Eine 4,5 ml Probe von Pseudomonas syringae ATCC Nr. 53543 wurde in einen 14 Liter fassenden Fermentor gebracht, der 5 Liter des oben beschriebenen Fermentationsmediums enthielt. Die Temperatur wurde bei 30ºC gehalten. Erreichte der pH-Wert einen Wert von 6,6, so wurden Schwefelsäure zugegeben. Die Fermentation in dem Keimfermentor dauerte 21 Stunden.
    • Beispiele 1-3
  • Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde eine Reihe von Fermentationen durchgeführt.
  • Im Falle einer jeden Fermentation wurde eine 0,5 Liter Probe der Keimkultur in einen anderen 14 Liter fassenden Fermentor übertragen, der 4,5 Liter eines Mediums der gleichen Komponenten enthielt. Sofern nicht anders angegeben ist, war die Konzentration der Komponenten ebenfalls gleich. Die Temperatur wurde während der Fermentation wie in der Tabelle angegeben gesteuert. In der Tabelle ist die erste Temperatur die Temperatur während der Wachstumsphase und die zweite Temperatur ist die Temperatur während der stationären Phase. Ist nur eine Temperatur angegeben, so erfolgte keine Temperaturänderung während der Fermentation. Am Ende der Wachstumsphase wurde eine Probe des Mediums entnommen und auf ihren MSG-Gehalt untersucht. Das Ergebnis ist in der Tabelle unter "Nit. Konz." angegeben. Schwefelsäure wurde zugesetzt, wenn der pH-Wert einen Wert von 6,6 erreichte und Natriumhydroxid wurde zugegeben, wenn der pH-Wert einen Wert von 5,6 erreichte. Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff wurde bei mehr als einer 10 %igen Sättigung gehalten. sämtlich Fermentationen wurden 24 Stunden lang durchgeführt. Falls erforderlich wurde ein Antischaummittel zugegeben, um das Schäumen zu steuern. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Tabelle Nit-Konz. Ferm.INA Zell-Mass. Temp. Ferm.Prod. Beispiele der Erfindung Vergleichsbeispiele NA = nicht verfügbar 1 Phosphat war der begrenzende Nährstoff bei diesem Versuch 2 Anfangs-MSG-Konzentration 25 g/L 3 Beispiel 1 von EP-A-87 113 772.5 (36 Stunden) komplexer Stickstoff-Lieferant 4 Beispiel 1 von EP-A-87 118 942.9 (0 272 669) L-Glutaminsäure

Claims (7)

1. Verfahren zur Fermentation eines Mikroorganismus mit einer Eiskristallbildungsaktivität mit den Stufen der Fermentierung des Mikroorganismus in einem Medium und Gewinnung des Mikroorganismus mit der Verbesserung mit den Stufen:
1) Züchtung des Mikroorganismus bei einer Temperatur von mindestens 29ºC in einem Medium, das einen Stickstoff-Lieferanten enthält, dessen Konzentration:
a) ausreicht, um eine Zellmasse von mindestens 20 g/L zu liefern und die
b) geringer als 20 g/L zum Abschluß der Wachstumsphase ist, um die Bildung der Eiskristallbildungsaktivität während der nachfolgenden stationären Phase zu inhibieren und
2) Fortsetzung der Fermentation während der stationären Phase bei einer Temperatur unterhalb von etwa 24ºC.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Temperatur während der Stufe 2) geringer als 21ºC ist.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Konzentration des Stickstoff-Lieferanten zum Abschluß der Wachstumsphase weniger als 5 g/L beträgt.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Medium einen Zucker und α-Ketoglutarat liefernde Aminosäure enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Medium Sucrose und Mononatriumglutamat enthält.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Mikroorganismus ein Pseudomonad ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Mikroorganismus P. syringae ist.
DE8888103346T 1987-03-05 1988-03-04 Fermentation von mikroorganismen mit eisbildungsaktivitaet durch einen temperaturwechsel. Expired - Fee Related DE3874568T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/021,949 US5153134A (en) 1987-03-05 1987-03-05 Fermentation of microorganisms having ice nucleation activity using a temperature change

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3874568D1 DE3874568D1 (de) 1992-10-22
DE3874568T2 true DE3874568T2 (de) 1993-04-22

Family

ID=21807017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE8888103346T Expired - Fee Related DE3874568T2 (de) 1987-03-05 1988-03-04 Fermentation von mikroorganismen mit eisbildungsaktivitaet durch einen temperaturwechsel.

Country Status (8)

Country Link
US (2) US5153134A (de)
EP (1) EP0281145B1 (de)
JP (1) JPS63291577A (de)
KR (1) KR880011325A (de)
AT (1) ATE80655T1 (de)
AU (1) AU621814B2 (de)
CA (1) CA1292198C (de)
DE (1) DE3874568T2 (de)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1292199C (en) * 1986-12-22 1991-11-19 Shirley Y. Lynn Fermentation of microorganisms having ice nucleating activity using a defined medium
US5223412A (en) * 1991-02-21 1993-06-29 Genencor International, Inc. Cell-free and whole cell ice nucleators and process for their production
EP0628628A4 (de) * 1992-02-24 1995-11-15 Q P Corp Eiskern produzierende bakterien, kultur besagter bakterien, eiskern produzierende substanz die besagtes bakterium enthält und die verwendung besagter substanz.
KR960014623B1 (ko) * 1993-07-27 1996-10-19 주식회사 태평양 신규의 빙핵형성 미생물 변이주 및 이를 이용한 눈 또는 얼음의 제조방법
KR100260335B1 (ko) * 1998-04-09 2000-07-01 박종헌 빙핵활성 미생물 제제의 생산방법

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS49126882A (de) * 1973-04-19 1974-12-04
US4062727A (en) * 1976-04-08 1977-12-13 Louisiana State University Foundation Process for manufacturing high density cell cultures
US4200228A (en) * 1978-09-18 1980-04-29 Woerpel Marvin D Snow making
DE3214953A1 (de) * 1982-04-22 1983-10-27 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Mikrobielle polysaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, dafuer geeignete mikroorganismen und verwendung der polysaccharide
US4464473A (en) * 1982-04-23 1984-08-07 The Regents Of The University Of California Ice nucleating microorganisms
JPS6083581A (ja) * 1983-10-13 1985-05-11 Hideaki Yamada シユ−ドモナス属細菌の培養法
FR2595713B3 (fr) * 1986-03-11 1988-02-26 Socea Balency Sobea Milieu de culture pour bacteries coliformes
US5137815A (en) * 1986-09-23 1992-08-11 Genencor International Production of microorganisms having ice nucleating activity
US4706463A (en) * 1986-09-23 1987-11-17 Eastman Kodak Company Recovery of microorganism having ice nucleating activity
US4784943A (en) * 1987-05-22 1988-11-15 Advanced Genetic Sciences, Inc. Ice nucleation immunoassay
CA1297824C (en) * 1988-03-07 1992-03-24 Carole B. Lindsey Spray drying of microorganisms having ice nucleating activity

Also Published As

Publication number Publication date
EP0281145B1 (de) 1992-09-16
AU1113988A (en) 1988-09-08
EP0281145A3 (en) 1988-11-17
JPS63291577A (ja) 1988-11-29
DE3874568D1 (de) 1992-10-22
KR880011325A (ko) 1988-10-27
CA1292198C (en) 1991-11-19
EP0281145A2 (de) 1988-09-07
US5153134A (en) 1992-10-06
AU621814B2 (en) 1992-03-26
JPH0560352B2 (de) 1993-09-02
ATE80655T1 (de) 1992-10-15
US5413932A (en) 1995-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69821951T2 (de) Bernsteinsäure herstellung und reinigung
EP0144017B1 (de) Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly-D(-)-3-hydroxybuttersäure
EP3623362A1 (de) Nitrifikationsinhibitor enthaltende düngemittelmischung
DE3784611T2 (de) Aureobasidium sp. Mikroorganismen und deren Verwendung beim Verfahren zur Herstellung von erythritol.
DE3784988T2 (de) Methode fuer selektiven zuwachs des anteils der gewoenlichen hauptkomponente des antibiotischen komplexes a/16686.
DE3874568T2 (de) Fermentation von mikroorganismen mit eisbildungsaktivitaet durch einen temperaturwechsel.
DE3486277T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Riboflavin.
EP0149744B1 (de) Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Poly-D(-)-3-hydroxybuttersäure
DE68912395T2 (de) Herstellung von Dicarbonsäuren.
DE3141030C2 (de)
DE69737803T2 (de) Bäckerhefe
EP0829541A2 (de) Osmokontrolliertes Fermentationsverfahren zur Herstellung von Acarbose
DE2157847C3 (de) Verfahren zur Erzeugung von Citronensäure
DE69432240T2 (de) Verfahren zur Herstellung von bakterien Zellen, welche poly-3-hydroxy Buttersäure enthalten
DE2050361A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Zi tronensaure
EP0001122B1 (de) Verfahren zur Herstellung eines Zuckeralkohols
DE3044969C2 (de) Herstellung von Coproporphyrin III
DE2419622A1 (de) Neue mononatriumcitratmonohydratkristalle und verfahren zu ihrer herstellung
DE2212929C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Citronensäure
DE1795721C2 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von Orotidylsäure
DE2345271C2 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure aus Fumarsäure
DE2050982B2 (de) Verfahren zur herstellung von l-aminocyclohexylpenicillin
AT222272B (de) Verfahren zur Gewinnung von Tetracyclin
DE2849393A1 (de) Verfahren zur herstellung von 2,5-diketogluconsaeure
DE2462314B2 (de) Verfahren zur Herstellung von NucleosidO'.S'-cyclophosphaten

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee