KR960014623B1 - 신규의 빙핵형성 미생물 변이주 및 이를 이용한 눈 또는 얼음의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

신규의 빙핵형성 미생물 변이주 및 이를 이용한 눈 또는 얼음의 제조방법
본 발명은 신규의 미생물 변이주 및 이를 이용한 눈 또는 얼음의 개선된 제조방법에 관한 것이다.
좀더 구체적으로, 본 발명은 상온에서 안정하게 빙핵형성 활성을 유지하는 슈도모나스 종의 미생물 변이주를 제조하고, 이를 배양, 회수, 건조 후 현탁시켜 눈 또는 얼음을 제조하는 방법이다.
빙핵형성 미생물을 현탁시켜 분무시킴으로 빙핵형성을 촉진시켜 보다 높은 온도에서 눈을 제조하는 방법은 미국특허 제4,200,228호에 기재되어 있다. 아울러, 이러한 빙핵형성 미생물을 적절한 방법으로 배양하고 회수하여 빙핵형성 활성을 지닌 미생물을 배양하는 방법을 개시하고 있다.
미국특허 제4,706,463호에는 빙핵형성 미생물을 배양하는 방법을 개시하고 있다.
이 방법은 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)를 배양함으로 다량의 균체를 증식시켜 정지기에 이르게 한 후, 정지기로부터 배양온도를 12℃로 낮춤으로 높은 빙핵형성 활성을 수측하는 방법을 제시한다.
미국특허 제4,706,463호에는 높은 빙핵형성 활성을 얻기 위하여 빙핵형성 미생물을 15℃ 이하에서 배양하고, 그 배양액을 15℃ 이하에서 농축한 후 저온의 유체에 분산시켜 급냉시킨 후, 냉동건조함을 특징으로 하는 방법을 제시한다.
미국특허 제4,796,805호에는 빙핵형성 미생물의 현탁액을 제조하여 약 13℃ 이하로 유지시키면서 수원에 공급하여 주입시킴으로 눈과 얼음을 제조하는 방법을 제시하고 있다. 상기 빙핵형성 미생물 현탁액은 21℃에서 24시간 방치하였을 경우 빙핵형성 활성을 완전히 상실함을 보여주고 있다.
이러한 종래의 발명들은 사용된 빙핵형성 미생물이 상온에서 쉽게 빙핵형성 활성을 상실하기 때문에 이를 방지하기 위한 방법들이다.
상기 발명들에 유용한 대표적인 빙핵형성 미생물은 슈도모나드(Pseudomonad), 특히 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae), 바람직하게는 슈도모나스 시린개 ATCC53,543(Pseudomonas syringae ATCC53,543)이다. 이외에도 한국유전공학연구소 부설 유전자은행(KCTC)에 기탁되어 잇는 슈도모나스 시린개 KCTC 1,832(Pseudomonas syringae KCTC 1,832) 및 슈도모나스 시린개 IF03310(Pseudomonas syringae IF03310)등이 빙핵형성 미생물로 사용될 수 있다.
빙핵형성 미생물은 마키등(L.R.Maki etal. Applied Microbiology vol. 28, p456, 1974)에 의해 최초로 발견된 이래 식물체의 잎등에서 분리되어 왔다.
이러한 빙핵형성 미생물은 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 플루르센스(Pseudomonas fluoscens), 슈도모나스 피지(Pseudomonas pisi), 슈도모나스 코로나파시엔스(Pseudomonas coronafaciens), 슈도모나스 비리디프라바(Pseudomonas viridiflava), 어위니아 허비콜라(Erwinia herbicola), 어위니아 유레도보라(Erwinia uredovara), 어위니아 아나나스(Erwinia ananas)와 산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)등이다.
이중에서도 슈도모나스 시린개(Paseudomonas syringae)는 빙핵형성 활성이 높아 산업적으로 많이 이용되고 있다.
그러나 이러한 종래의 미생물들은 상온에서 쉽게 빙핵형성 활성을 잃게 되는 단점이 있어 활성을 유지하기 위하여 전술한 바와 같이 저온에서 배양하며, 저온에서 균체를 회수, 건조시키며, 미생물 현탁액을 저온 유지하는 등의 방법들이 제시되고 있다.
빙핵형성 미생물을 산업적으로 사용하기 위해서는 다량의 균체가 필요로 하며, 이를 배양, 회수, 건조, 수송 및 저장하기 위해서는 공시된 기존의 방법처럼 저온유지를 위한 상당한 경비가 소요되고 공정이 번거로운 단점이 있다.
따라서 본 발명은 상기 종래의 문제를 해결하기 위한 것으로 이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자들은 서리 피해를 입은 식물체의 입들로부터 빙핵형성 활성을 지닌 미생물들을 분리하고, 이들중에서 비교적 높은 온도에서도 빙핵형성 활성을 유지하는 미생물을 분리하였다.
분리된 미생물에 돌연변이를 유발시켜 얻은 변이주 중 1종은 놀랍게도 상온에서도 활성을 유지하며, 상온에서 통상적인 방법에 의해 배양, 회수, 건조하였을 경우에도 활성을 유지하는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 본 발명에서 얻은 미생물 변이주를 사용하여 빙핵형성 미생물을 제조하는 경우 기존의 공시된 방법들에서 제시된 바와는 달리 배양, 균체회수, 건조, 미생물 현탁액 보관에 있어서 저온처리를 하지 않고도 높은 빙핵형성활성이 유지되는 것을 발견하고, 따라서 이 미생물 변이주를 사용하여 빙핵형성 미생물을 제조하는 방법이 매우 경제적이라는 사실에 입각하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
빙핵형성 미생물의 선별
서리 피해를 입은 식물체의 잎을 생리식염수로 세척액을 육즙엑기스 0.3%, 펩톤 0.5%, 글리세롤 2.5%, 한천 1.5%를 포함하는 영양한천 배지에 도포하여 30℃에서 2일간 배양한다.
1차 선별을 위해 배양기를 -4℃의 냉각조상에 10분간 방치한 후 결빙현상을 보이는 군락을 선별한다.
1차 선별된 75종의 빙핵형성 미생물중 빙핵형성 활성이 가장 높은 미생물을 선별하기 위하여 이들 각각을 30℃에서 배양한 수 빙핵형성 활성을 측정 비교한다.
육즙엑기스 0.3%, 펩톤 0.5%, 글리세롤 2.5%를 포함하는 영양액체 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양한다. 배양된 미생물을 수확하여 50mM 인산 완충 용액(pH 7.0)에 분산시켜 빙핵형성 온도를 측정함으로 빙핵형성 활성을 측정한다. 빙핵형성 활성은 발리(Vali, G : J Atmos. Sci, 28,402-409,1971)의 방법에 의해 빙핵 분광계(Freezing uncleus spectrometer, Mitsuwa model K-1, japan)를 사용하여 측정한다. 75종의 미생물중 빙핵형성능이 가장 우수한 균주 1종을 변이주 제조를 위한 모균주로 사용한다.
미생물 동정
모균주의 동정은 크릭(Krieg, N.R : Bergey's manual of systematic bacteriology, vo. 1. 1984)의 방법에 의해 실시한다.
표1. 표2의 결과에 의해 모균주는 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)로 동정되었고 슈도모나스 시린개 SO7( Pseudomonas syringae SO7)로 명명하였다.
이와 같이 선별된 모균주 SO7은 30℃ 배양조건에서도 상당히 높은 빙핵형성 활성을 유지하고 있지만 열에 대한 안전성이 증가된 빙핵형성 미생물을 제조하기 위해 돌연변이를 유발시킨 후 열처리를 하여 빙핵형성 활성도를 측정함으로 열 안전성이 높은 빙핵형성 미생물 변이주를 선발하였다.
돌연변이원으로 자외선을 사용하여 통상의 방법에 의해 시행하였다.
슈도모나스 시린개 SO7(Pseudomonas syringae SO7)을 글리세롤 영양배지에 30℃에서 대수기까지 배양한 후 균체를 수거하여 생리식염수에 현탁시켜 글리세롤 영양한천 배지에 도포하여 균 사멸율이 95%에 이르도록 자외선을 조사한 후, 즉시 30℃의 암소에 옮겨 24시간 배양한다.
형성된 생존 미생물 군락은 멸균된 벨벳을 이용하여 레플리카(Replica)를 만든 후, 30℃에서 24시간 배양한다. 레플리카 -4℃의 냉각조상에 방치하여 가장 짧은 시간에 결빙 현상을 보이는 군락들을 수주 선별한다.
선별된 규주 중 상온에서 빙핵형성 활성이 보존되며 또한 활성이 높은 균주를 선별하기 위해 전술한 바와 같이 빙핵분광계를 사용하여 활성을 비교하였다.
각 균주를 글리세롤 영양배지에 30℃에서 48시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 수거하였다.
이를 생리식염수로 세척한 후 동결건조하였다. 동결건조된 균체를 50mM 인산 완충용액(pH7.0)에 분산하여 40℃, 35℃, 30℃, 25℃, 20℃, 10℃, 4℃, 항온조에 24시간 방치한 후 빙핵 분광계를 사용하여 활성을 측정하였다. 이런 방법에 의해 최종적으로 상온에서 잔류활성도가 높은 변이주 1종을 선별하여 슈도모나스 시린개 SO754(Pseudomonas syringae SO754)로 명명하였으며, 이 균주는 부다페스크조약에 의거 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터(KCCM)에 1993년 7월 19일 KCCM-10039(Pseudomonas syringae SO754 KCCM-10039)로 기탁되었다.
본 발명에서 조제된 미생물 변이주는 적절한 질소원, 탄소원과 무기염류를 지닌 배지에서 적절한 수소이온 농도를 조절하여 배양될 수 있다. 이러한 배지의 조성과 배양 조건은 당 업계에서 조상하는 자와 용이하게 최적화 시킬 수 있다.
종래의 사용되어 온 빙핵형성 미생물은 28℃∼30℃에서 최대의 균체량을 회수할 수 있으나 빙핵형성 활성이 현저하게 감소되기 때문에 21℃ 정도의 낮은 온도에서 배양된다.
그러나, 본 발명에서 제조된 미생물 변이주를 사용하는 경우 25℃∼30℃에서도 높은 빙핵형성 활성을 얻을 수 있다.
실시예 1
슈도모나스 시린개 KCCM-10039를 3리터의 글리세롤 영양배지(육즙엑기스 0.3%, 펩톤 0.5%, 글리세롤 0.5%)에 공기유입량 1.0VVM, pH6.0으로 하며 배양온도를 각기 15℃, 20℃, 25℃, 28℃, 30℃로 하여 24시간 배양하였다.
배양종료후 원심분리하여 세포를 수거하여 50mM 인산완충용액(pH7.0)에 분산시켜 발리(Vail, G.J. : Atmos. Sci, 28, 402-409,1971)의 방법에 의해 빙핵형성 활성을 측정하였다. 빙핵형성 활성은 총 시료의 50%가 동결되는 온도(T50%)를 측정하여 사용하였다. 회수된 총 빙핵형성 활성(T50%)은 배양온도 15℃에서 -2.6℃, 20℃에서 -2.5℃, 25℃에서 -2.8℃, 30℃에서 -30℃였다.
비교실시예 1
슈도모나스 시린개 ATCC53,543을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 행하였다.
회수된 총 빙핵형성 활성(T50%)은 배양온도 15℃에서 -2.7℃, 20℃에서 -2.8℃, 25℃에서 -3.5℃, 28℃에서 -4.2℃, 30℃에서 -4.9℃였다.
실시예 1과 비교실시예 1의 활성 비교표
실시예 2
실시예 1에서 처럼 28℃에서 배양된 슈도모나스 시린개 KCCM-10039 균체를 분무건조기에 의해 건조시켰다.
건조물의 최종온도가 각기 60℃, 50℃, 40, 30℃가 되도록 하여 건조회수된 빙핵형성 활성(T50%)은 60℃에서 -5.2℃, 50℃에서 -4.1℃, 40℃에서 -3.6℃, 30℃에서 -3.1℃였다.
비교실시예 2
비교실시예 1에서 처럼 배양된 슈도모나스 시린개 ATCC 53,543을 사용한 것을 제외하고 실시예 2와 동일하게 행하였다.
건조회수된 빙핵형성 활성(T50%)은 60℃에서, -8.3℃, 50℃에서 -6.7℃, 40℃에서 -5.7℃, 30℃에서 -3.8℃였다.
실시예 2와 비교실시예 2의 활성 비교표
실시예 3
실시예 2에서 건조물 최고온도 40℃에서 건조된 균체를 증류수에 현탁시켜 4℃, 10℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃를 유지하는 항온장치에서 12시간 방치한 후 빙핵형성 활성을 측정하였다.
비교실시예 2에서 건조물 최고온도 40℃에서 건조된 균체를 사용하는 것을 제외하고 실시예 3과 동일한 조건으로 하여 빙핵형성 활성을 측정하였다.
상기 실시예 1,2,3 및 비교실시예 1,2,3에서 알 수 있는 바와 같이, 본원 발명의 미생물 변이주 KCCM-10039가 종래의 미생물 ATCC -53,543 보다 활성이 좋고 특히 25∼40℃에서도 본 발명의 미생물은 활성이 뛰어나기 때문에 상온에서도 빙핵형성이 가능한 장점이 있다.

Claims (2)

  1. 상온에서 안정하게 빙핵형성 활성을 유지하는 신규의 빙핵형성 미생물 슈도모나스 시린개 SO754(KCCM-10039).
  2. 빙핵형성 미생물 슈도모나스 시린개 SO754(KCCM-10039) 를 물에 현탁하고 그 현탁액을 25℃ 이하로 유지하여 수원에 주입함을 특징으로 하는 눈 또는 얼음의 제조방법.
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