KR100492508B1

KR100492508B1 - 토양에서 분리된 내냉성 바실러스 균주

Info

Publication number: KR100492508B1
Application number: KR10-2002-0062169A
Authority: KR
Inventors: 박지용; 배은경
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2005-05-31
Also published as: KR20040033225A

Abstract

본 발명은 토양에서 분리된 내냉성 바실러스 균주 및 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 농작물의 냉해방지제에 관한 것이다. 본 발명의 균주가 생산하는 물질은 어는점이 낮고, 빙핵활성세균이 빙핵을 형성하는 능력을 억제하는 효과를 나타내므로 농작물의 냉해방지제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

토양에서 분리된 내냉성 바실러스 균주{Psychrotolerant Bacillus species isolated from soil}

본 발명은 신규 바실러스 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토양에서 분리된 신규 내냉성 바실러스 균주에 관한 것이다.

내냉성(psychrotolerant) 미생물은 0℃에 근접한 온도에서도 성장할 수 있는 미생물로서, 대개 20℃ 이상의 온도에서 최적의 성장을 나타낸다. 이러한 내냉성 미생물들은 일반적으로 5℃ 이하의 영구적으로 낮은 온도 환경에서 분리된 후 특성이 분석되어 왔다(M.K. Mannisto, J.A. Puhakka, FEMS Microbiol. Ecol., 2002, 1, 1364-1371). 열-저항성(heat-resistant) 내생포자(endospore)를 생산하는 박테리아는 바실라세애(Bacillaceae) 과(family)의 다양한 속(genus)으로 분류되는데, 혐기성이고 내생포자를 형성하는 박테리아를 제외하면 상기 과 중에서 바실러스(Bacillus) 속이 가장 크고 잘 알려져 있다(F.G. Priest, M. Goodfellow and C. Todd., J. General Micorbiol., 1988, 134, 1847-1882). 내냉성 미생물, 특히 바실러스 속의 종들은 종의 특성 및 상기 종으로부터 생산되는 생산물의 구조, 기능 및 특성 등 다양한 분야에서 연구되어 왔으며(Davail, S. et al., J. Biol. Chem., 1994, 269(26), 17448-17453; Narinx E. et al., Protein Engineering, 1997, 10, 1271-1279; Yoko Okubo et al., Biochem. Biophysical Res. Communications, 1999, 256, 333-340; Kumio Yokoigawa et al., J. Catalysis B: Enzymatic, 2001, 12, 27-35), 토양에서 분리된 몇몇 내냉성 바실러스 종들이 현재 보고되어 있다. 이들 중에는 남극권의 토양에서 분리된 바실러스 인솔리투스(Bacillus insolitus)(Larkin J.M. and Stokes, J.L., J. Bacteriol, 1967, 94, 889-895)와 바실러스 맥쿠아리엔시스(Bacillus macquariensis)(Marshall B.J., and Ohye D.F., J. General Microbiol., 1966, 44, 41-46) 및 극지방의 심해침전물로부터 분리되고 생육하는데 있어 염화나트륨(NaCl)을 요구하는 바실러스 마리누스(Bacillus marinus)(Ruger H.J., Fritze D., and Sproer C., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50, 1305-1313) 등이 있다.

본 발명자들은 늦겨울인 3월 초에 강화도의 토양에서 분리된 내냉성 바실러스 종 균주에 대하여 조사하던 중, 유전형 및 표현형 데이터가 종래에 알려진 균주와는 다른 신규한 바실러스 속에 속하는 신규한 미생물을 분리함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 토양에서 분리된 내냉성 바실러스 균주 및 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 농작물의 냉해방지제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토양에서 분리된 내냉성 바실러스 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 내냉성 바실러스 균주를 유효성분으로 함유하는 농작물의 냉해 방지제를 제공한다.

본 발명의 토양에서 분리된 신규한 내냉성 균주는 0.9∼1.0 ㎛의 폭과 2.5∼4.0 ㎛의 길이의 막대기 모양(rod shape)을 하고 있으며, 말단 부위에 계란 형태의 포자를 가지고 있다(도 1 참조).

본 발명에서 분리한 균주는 그람 양성이며, 0 내지 40 ℃의 온도에서 생육이 가능하며, 45℃ 이상의 온도 및 혐기적 환경에서는 성장하지 않는다. 생육 pH는 pH 5 내지 pH 12 이고, 카탈라제(catalase) 활성은 양성이며, 옥시다제(oxidase) 활성은 음성이고, 레시티나제(lecithinase)의 활성이 검출되었다. 아르기틴 디하이드롤레이즈(Arginine dihydrolase)와 인돌 생성능은 음성이다. 구연산(citrate) 및 프로피온산(propionate)과 같은 산을 이용할 수 있고, D-포도당(glucose), D-만니톨(mannitol) 및 D-과당(fructose)과 같은 당을 이용하여 산(acid)을 생산할 수 있으나 L-아라비노즈(arabinose) 또는 D-자일로즈(xylose)로부터는 산을 생산하지 않는다. 또한, 본 발명의 미생물은 젤라틴(gelatin), 카제인(casein) 및 트윈 80을 가수분해할 수 있으나, 전분에 대한 가수분해능은 없다. 또한, 질산(nitrate)을 아질산(nitrite)으로 환원시키지는 않는다(표 1 참조).

본 발명에서 분리한 균주를 구성하고 있는 주요 지방산으로는 C_15:0 anteiso 및 C_15:0 iso를 포함하고 있으며, C_11:0, C_14:0 iso, C_14:0, C_15:0, C_16:1 w7c 알콜, C_16:0 iso, C_16:1 w11c, C_16:0, iso C_17:1 w10c, C_17:0 iso, C_17:0 anteiso와 같은 지방산도 적은 양으로 존재한다. 또한, 가장 함량이 많은 주요 지방산은 C_15:0 anteiso로 함량이 34.49%이다(표 2 참조).

본 발명의 신규한 균주의 16s rDNA 유전자 염기서열을 분석한 후 국외유전자은행(GENBANK)에 등록되어 있는 기존의 균주들에 대한 서열 데이터베이스를 이용하여 상기 유전자 염기서열과 유사한 염기서열을 검색한 결과, 상기 염기서열이 바실러스 속의 종에 존재하는 유전자의 염기서열과 매우 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 그 중에서도 바실러스 심플렉스의 유전자와 가장 서열 유사성이 높았으며(약 99%), 다른 종들과는 낮은 상관관계를 보였다(표 3 참조). 또한, 상기 유전자 DNA의 G+C 함량은 40 ㏖% 임을 확인하였다.

16s rDNA의 전체 염기서열을 분석한 결과 바실러스 심플렉스와 99%의 유사성을 보였기 때문에, DNA-DNA 교잡 실험으로 종간의 유사성을 조사한 결과, DNA/DNA 교잡에서는 상기 서열분석의 결과와는 달리 바실러스 심플렉스와 35%의 유사성을 보였다. 따라서, 웨인 등에 따른 종의 동정에 있어서의 역치값(threshold value)인 70%를 고려할 때(Wayne L.G. et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 1987, 37, 463-464), 토양에서 분리한 본 발명의 균주는 종의 범위에서는 바실러스 심플렉스와 연관되지 않음을 알 수 있다. 상기의 결과로부터, 토양에서 분리된 본 발명의 균주는 바실러스 속에 속하는 신규한 종임을 확인하였으며, 타입으로는 B4로 지정하여 '바실러스 B4'로 명명하고 상기 균주를 2002년 7월 25일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 KCCM 10409).

본 발명의 바실러스 균주는 어는점이 낮은 내냉성 균주이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 바실러스 B4의 배양액 즉, 생산물이 얼음 결정의 성장을 억제시키는 기능을 갖고 있으며(도 2의 A 참조), 대조군인 물은 -15.96℃에서 얼기 시작한 반면 바실러스 B4의 생산물을 처리한 샘플은 -18.37℃에서 얼기 시작함을 확인하였다(도 2의 B 및 표 4 참조).

따라서, 본 발명의 바실러스 균주는 어는점이 -18.37℃로 내냉성 균주이다.

본 발명은 상기 내냉성 바실러스 균주를 유효성분으로 함유하는 농작물의 냉해 방지제를 제공한다.

본 발명의 내냉성 바실러스 균주의 배양여과액은 어는점이 낮고, 부동활성을 가져 농작물의 냉해에 주된 영향을 미치는 빙핵활성세균의 빙핵활성능을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 내냉성 바실러스 균주의 배양여과액을 농작물에 처리하여 농작물의 냉해방지에 효과적으로 이용할 수 있다.

이에, 본 발명의 내냉성 바실러스 균주를 유효성분으로 함유하는 농작물 냉해 방지제를 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 내냉성 균주의 분리

본 발명자들은 강화도에서 수집한 토양 샘플을 0.85%의 염화나트륨 용액에 부유시킨 후, 영양 한천평판배지에 접종시켰다. 상기 토양 샘플을 4℃에서 3 내지 4일 동안 배양시킨 후, 박테리아로부터 형성된 콜로니들을 아가 플레이트에 도말하여 균주로 분리하였다. 상기 과정을 반복하여 단일 콜로니를 분리해 배양한 후 4℃의 영양 배지에서 성장시켰으며, 분리된 균주는 계대 배양을 통하여 활력을 증진시킨 후, 일반세균 배양용 액제배지에 접종하여 4℃에서 배양하면서 내냉성 균주의 증식성을 확인하였다. 분리된 미생물을 장기간 유지시키기 위하여, 세포 부유물을 20%(v/v) 글리세롤을 포함하는 브로스 배지(broth culture)상에서 -40℃에 보관하였다.

<실시예 2> 분리된 균주의 특성 분석

<2-1> 균의 형태 분석 및 그람염색

본 발명자들은 상기에서 분리한 균주의 형태를 분석하기 위해 상기 균주를 영양 한천평판배지에서 30℃, 24시간동안 배양한 후 상기 균을 현미경을 통하여 균의 형태 및 집락의 형태를 관찰하고, 시그마사에서 제조한 그램염색 키트(Sigma Diagnostics, kit HT 90-A)를 사용하여 그램염색 실험을 수행하였다.

그 결과, 본 균주는 그람 양성의 균주로서 세포의 형상은 0.9∼1.0 ㎛의 폭과 2.5∼4.0 ㎛의 길이의 막대형이고, 포자 형성능이 있었다(도 1).

집락의 형태는 원형이고, 불투명한 백색을 띄며, 집락의 질은 점액성이고, 볼록 융기된 형태의 고도를 나타내며, 집락의 가장자리는 둥근형이었다.

<2-2> 균주의 생리학적 성질

본 발명자들은 상기에서 분리한 균주의 온도별 생육여부를 알아보기 위해 0 내지 40℃의 온도조건으로 뉴트리언트 배지에서 균을 배양하여 균의 성장정도를 관찰하였다.

pH별 생육조건을 알아보기 위해 pH 3 내지 5에서는 100 mM 시트레이트(citrate)/100 mM 소듐 시트레이트 버퍼(sodium citrate buffer), pH 6.0 내지 8.0에서는 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄buffer), pH 9.0 내지 10.0에서는 100 mM 소듐 카보네이트 버퍼(NaHCO₃/Na₂CO₃ buffer), pH 11에서는 50 mM 소듐포스페이트(Na₂HPO₄)/100 mM 수산화나트륨(NaOH) 버퍼 및 pH 12 내지 13에서는 100 mM 포타슘 클로라이드/수산화나트륨 버퍼(KCl/NaOH buffer)를 사용하여 이를 함유한 뉴트리언트 배지에서 균의 생육을 관찰하였다.

혐기적 조건에서의 균의 성장을 알아보기 위해 혐기성 아가(anaerobic agar)의 시험관에 균을 시험관의 바닥부분까지 찔러서 접종하고 균의 성장을 관찰하였고, 염에 대한 내성을 알아보기 위해 2 내지 10% 농도의 염화나트륨으로 처리한 뉴트리언트 배지에서 생육정도를 관찰하였다.

카탈라제 활성을 알아보기 위해 3%(v/v) 과산화수소로부터 거품 생산여부를 관찰하여 결정하였고, 옥시다제 활성은 1%(w/v) 테트라메틸-p-페닐렌디아민(tetramethyl-p-phenylenediamine)을 이용하여 결정하였으며 레시티나제 활성은 균을 난황한천배지(0.5% 글루코스, 1% 염화나트륨, 1.5 % 아가, 5% 난황 에멀전, 뉴트리언트 배지)에서 배양하여 난황의 레시틴(lecithin)을 분해하여 집락 주변이 혼탁되는 정도를 관찰하여 판단하였다.

아르기닌 디하이드롤레이즈(Arginie dihydrolase) 활성은 1% 아르기닌을 포함한 박토 디카르복살레이즈 베이스 모엘러 배지(Bacto Decarboxalase Base Moeller)(Difco)에서 배양하면서 실험하였다. 인돌(Indole) 생성능은 SIM 배지(sulfide, Indole, motility)(Difco 사)에 균을 접종하여 배양 한 후 코백 용액(Kovac's reagent)을 첨가하여 인돌 생성능을 관찰하였다.

질산환원능은 질산염(Nitrate) 배지를 사용하였는데, 당 성분이 없는 질산염 배지에서 질산염 또는 아질산염이 환원되면서 가스가 생성되는 것을 관찰하여 질산환원능의 여부를 결정하였다. 당의 이용성은 영양 배지에 당을 제균(0.2 ㎛ microfilter)하여 10 mM 농도로 첨가하여 관찰하였다. 시트레이트와 프로피오네이트의 이용성은 시트레이트와 프로피오네이트 이용 배지를 사면배지(slant)로 제작하여 균을 접종한 후 14일 동안 배양하여 색소의 생성여부를 관찰하여 결정하였다.

보게스-프로스카우어 테스트(Voges-Proskauer test)는 VP 브로스(디포타슘 하이드로젠 포스페이트(Dipotassium hydrogen phosphate; 0.5 %, D(+)-글루코스 0.5 %, 펩톤 0.7%, 염화나트륨 0.7%, Sigma 사)에 균을 접종한 후 배양하여 40% 수산화나트륨을 혼합하고 크레아틴(creatine) 0.5 내지 1 mg을 첨가하여 실온에서 색소가 생성되는 것을 관찰하여 결정하였다.

전분의 분해능은 영양 한천 배지에 0.5% 수용성 전분(soluble starch)을 첨가하여 전분 한천 평판 배지를 제조한 후에 균을 접종하여 30℃에서 3일 배양한 후 95% 에탄올을 평판배지에 붓고 흘려서 15 내지 30분 후에 전분의 상태를 관찰하여 균이 성장한 주위에 클리어존(clear zone)이 생성되는지의 여부로 결정하였다. 카세인의 분해는 영양 한천에 10% 탈지유를 첨가하여 탈지유 한천 배지를 제조한 후에 균을 접종하고 7 일 배양한 후 균이 성장한 주위에 카세인의 상태를 관찰하였다. 젤라틴의 분해는 뉴트리언트 젤라틴(Difco사)배지에 균을 접종하고 28℃에서 배양한 후에 결과를 관찰하였다. 트윈 80 분해능은 나일 블루 설페이트(Nile blue sulfate) 포화용액이 첨가된 트윈 80 3.5 ㎖을 트립틱 소이 한천 배지(tryptic soy agar, TSB agar, Difco 사; pancreatic digest of casein 1.7%, enzymatic digest of soybean meal 0.3%, 글루코스 0.25%, 염화나트륨 0.5%, 디포타슘포스페이트 0.25%, 아가 1.5%) 70 ㎖에 혼합하여 배지를 제조한 후 균을 접종하여 30℃에서 균을 배양한 후 균이 성장한 주위에 파란색 광(blue halo)이 형성되었는지를 관찰하여 양성인지의 여부를 결정하였다.

그 결과, 생육 가능 온도 범위는 0 내지 40℃, 생육 pH 범위는 pH 5 내지 12, 호기성 조건에서 성장, 카탈라제(Catalase) 활성은 양성, 옥시다제(Oxidase) 활성은 음성, 레시티나제(Lecithinase) 활성은 양성, 아르기닌 디하이드롤레이즈(arginie dihydrolase) 활성과 인돌 생성능은 음성이고, 염에 대한 내성은 2 % 내지 8 % 염화나트륨 함유 배지에서 성장 가능하였고, 당을 이용하는데 있어서 글루코스, 만니톨 및 프락토스는 이용하고, 아라비노스 및 자일리톨은 이용하지 않으며, 산을 이용하는데 있어서 프로피온산 및 구연산은 이용하였다. 또한, 카세인, 젤라틴 및 트윈 80을 가수분해할 수 있지만 전분은 가수분해하지 못했고, 질산 환원 능력이 없었으며, 보게스-프로스카우어 테스트 결과 음성을 나타내었다(표 1).

바실러스 균주의 생리학적 성질

막대기 모양	+
포자형성	+
성장온도 4℃10℃30℃40℃45℃	++++-
pH 범위pH 5pH 6pH 7pH 8pH 9 pH 10	++++++
NaCl에서의 성장 2% 5% 8%10%	+++-
옥시다제	-
카탈라제	+
혐기성 성장	-
질산 환원능	-
VP 반응	-
VP 브로쓰에서의 pH	6.8
산의 제조D-포도당L-아라비노즈D-자일로즈D-만니톨D-과당	+--++
포도당으로부터 가스 생산	-
레시티나제	+
아르기닌 디하이드롤레이즈 활성	-
인돌 분해능	-
가수분해전분젤라틴카세인트윈 80	-+++
구연산의 이용프로피온산의 이용	++

<2-3> 균주의 지방산 패턴 분석

본 발명자들은 균주의 지방산 패턴을 분석하기 위해 37℃에서 24시간 동안 트립틱 소이 한천 배지(pancreatic digest of casein 1.7%, enzymatic digest of soybean meal 0.3%, 글루코스 0.25%, 염화나트륨 0.5%, 디포타슘포스페이트 0.25%, 아가 1.5% : Difco 사) 상에서 균주를 배양하였다. 세포막에서 균을 용해시키고 지방산을 추출하여 메틸화시킨 후 지방산 조성을 GC로 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 균주를 구성하는 주요 지방산으로는 C_15:0 anteiso 및 C_15:0 iso를 포함하고 있었으며, C_11:0, C_14:0 iso, C_14:0, C_15:0, C_16:1 w7c 알콜, C_16:0 iso, C_16:1 w11c, C_16:0, iso C_17:1 w10c, C_17:0 iso, C_17:0 anteiso와 같은 지방산도 적은 양으로 존재하였다(표 2).

세포내 FAMA(fatty acid methyl ester, 지방산)의 프로필

지방산		함량(%)
포화지방산	C_14:0	1.92
	C_15:0	1.76
	C_16:0	4.75
	C_17:0	1.5
	C_18:0	0.46
불포화지방산	C_14:1w5c	0.18
	C_16:1w7c 알콜	4.39
	C_16:1w11c	1.58
가지지방산	C_13:0 iso	0.13
	C_13:0 anteiso	0.21
	C_14:0 iso	12.9
	C_15:0 iso	25.41
	C_15:0 anteiso	34.49
	C_15:1 iso	0.39
	C_16:0 iso	7.07
	C_17:0 iso	0.97
	C_17:0 anteiso	0.84
	iso C_17:1 w10c	0.66
	C_18:1 w9c	1.51

<2-4> 균주의 생화학적 분석

본 발명자들은 본 발명에서 분리한 균주의 유전자 서열을 분석하기 위해 DNA 추출 키트(QIAamp DNA mini kit, QIAGEN 사)로 게놈 DNA를 추출하여 정제한 후, 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 사용하여 16S rDNA 유전자를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 pGEM-T Easy 벡터 시스템 Ⅱ(Promega 사)를 이용하여 직접 접합(ligation)시킨 후, DH5α 대장균으로 형질전환을 실시하였다. 형질전환된 클론을 스크리닝한 후, 플라스미드 DNA 정제 키트(QIAprep^? spin mini spin kit, QIAGEN 사)로 플라스미드 DNA를 정제하고, DNA 서열분석기로 서열분석을 하였다.

그 결과, 본 발명의 균주는 서열번호 3으로 기재되는 1,500 뉴클레오타이드 이상 되는 거의 완전한 유전자 서열을 가짐을 확인하였고, 국외유전자은행 (GENBANK)에 등록되어 있는 기존의 균주 들에 대한 서열 데이터베이스를 이용하여 상기 유전자 염기서열과 유사한 염기서열을 검색한 결과, 상기 염기서열이 바실러스 속의 종에 존재하는 유전자의 염기서열과 매우 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. 그 중에서도 바실러스 심플렉스의 유전자와는 약 99%로 가장 서열 유사성이 높았으며, 다른 종들과는 낮은 상관관계를 보였다(표 3).

16s DNA 서열에 기초한 공지된 바실러스 균주와의 서열 유사성

균주의 종류	유사성(%)
바실러스 심플렉스(Bacillus simplex)	1515/1523 (99%)
바실러스 마크로이드(Bacillus macroids)	1462/1473 (99%)
바실러스 사이크로사카로리티쿠스(Bacillus psychrosaccharolyticus)	1418/1450 (97%)
바실러스 마크로카누스(Bacillus maroccanus)	1393/1430 (97%)
바실러스 니아시니(Bacillus niacini)	1468/1528 (96%)
바실러스 플렉서스(Bacillus flexus)	1462/1529 (95%)
바실러스 벤조보반스(Bacillus benzoevovans)	1455/1526 (95%)
바실러스 푸마리올리(Bacillus fumarioli)	1437/1505 (95%)
바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)	1426/1498 (95%)

또한, 상기에서 분리한 DNA를 뉴클레오사이드로 분해시킨 후, 역상 HPLC(Reverse phase HPLC)를 이용하여 유전자의 G+C 함량을 분석한 결과, DNA의 G+C 함량은 40 ㏖% 이었다.

<2-5> 종간 유사성 조사

본 발명자들은 상기에서 16s rDNA의 전체 염기서열을 분석한 결과 바실러스 심플렉스와 99%의 유사성을 보임을 확인하였기 때문에, DNA-DNA 교잡 실험으로 종간의 유사성을 조사하였다. 구체적으로, 캐시온 등의 방법(Cashion P. et al., Anal. Biochem., 1977, 81, 461-466)에 따라 수산화인회석(hydroxyapatite)을 이용한 크로마토그래피로 DNA를 분리하였다. 드 레이 등의 방법(De Ley J. et al., Eur, J. Biochem., 1970, 12, 133-142)에 따라 허스 등의 방법(Huss V.A.R. et al., J. Syst. Appl. Microbiol., 1983, 4, 184-192) 및 에스까라 등의 변형된 방법(Escara J.F. et al., Biopolymers, 1980, 19, 1315-1327)을 적용하여 모델 2527-R 열프로그래머(thermoprogrammer) 및 도형기(plotter)가 장착된 분광광도계(spectrophotometer)(Model 2600, Gilford Instrument Laboratories Inc., Oberlin, Ohio, USA)를 이용하여 DNA-DNA 교잡을 수행하였다. 탈변성율(renaturation rate)은 잔케(Jahnke)에 의한 TRANSFER.BAS 프로그램으로 계산하였다.

그 결과, DNA/DNA 교잡에서는 상기 서열분석의 결과와는 달리 바실러스 심플렉스와 35%의 유사성을 보였다. 따라서, 웨인 등에 따른 종의 동정에 있어서의 역치값(threshold value)인 70%를 고려할 때(Wayne L.G. et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 1987, 37, 463-464), 토양에서 분리된 본 발명의 균주는 종의 범위에서는 바실러스 심플렉스와 연관되지 않음을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 균주는 상기 표 3의 바실러스 심플렉스를 제외한 나머지의 균주와는 생리학적 성질이 상이하므로(표 1), 본 발명의 균주는 바실러스 속에 속하는 신규한 종으로 분류되었으며, 타입으로는 B4를 지정하여 상기 균주를 바실러스 B4로 명명하고 상기 균주를 2002년 7월 25일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KCCM 10409).

<실시예 3> 바실러스 B4의 부동활성

<3-1> 바실러스 B4의 어는점 조사

본 발명자들은 상기 바실러스 B4가 빙핵을 형성하는 능력을 억제하는 효과 즉, 부동활성을 가지는지 확인하기 위해 바실러스 B4의 어는점을 조사하였다. 구체적으로 바실러스 B4를 4℃에서 3일간 배양하여 배양액을 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 배양상등액을 Centriprep YM 10 membrane(Millipore 사)를 이용하여 초여과(ultrafiltration)한 후에 이를 -20℃에서 18시간 동결하여 현미경으로 얼음결정을 관찰하고, 차별 조사 물리열량측정분석(Differential scanning calorimeter, Perkin Elmer 사)를 이용하여 어는점을 측정하였다.

그 결과, 바실러스 B4의 배양 여과액은 얼음 결정의 성장을 억제시키는 기능을 소유하고 있었으며(도 2의 A), 대조군인 물은 -15.96℃에서 얼기 시작한 반면 바실러스 B4의 배양 여과액을 처리한 샘플은 -18.37℃에서 얼기 시작했다(도 2의 B 및 표 4).

차별 조사 물리열량측정분석을 통한 바실러스 B4 생산물의 어는점 조사

화학발열곡선에서의 온도 지점	대조군(물)	바실러스 B4
Tf1(시작 지점)	-15.96	-18.37
Tf2(최고 지점)	-17.22	-19.19
Tf3(소멸 지점)	-21.75	-21.84

<3-2> 바실러스 B4의 부동활성

본 발명자들은 바실러스 B4가 냉해의 발생원인이 되는 슈도모나스 속(Psudomonas), 어위니아 속(Erwinia), 잔토모나스 속(Xanthomonas) 등과 같이 식물체의 잎에 존재하면서 비교적 높은 온도에서 동결이 일어나도록 작용하는 빙핵활성세균들의 특성인 빙핵활성능을 억제하는 기능을 가지고 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 빙핵활성세균들에 의해 생산되어 높은 온도에서 얼게 하는 빙핵활성능을 소유한 빙핵활성단백질이 도입된 대장균 DH5α균주를 30℃에서 18시간 동안 전배양하고 23℃에서 6시간동안 본배양하였다. 상기 배양액을 15000 g에서 원심분리하여 침전된 균체만 취하고 3차 증류수로 세척하고 이를 다시 원심분리하는 과정을 3회 반복한 후 균체만을 취하여 균수가 10⁷내지10⁸개가 되도록 조정하여 3차 증류수에 현탁하였다. 상기 현탁액에 부동활성이 있는 바실러스 B4 균주를 4℃에서 3일간 배양하여 배양액을 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 배양상등액을 Centriprep YM 10 membrane(Millipore 사)를 이용하여 초여과한 샘플을 이용하여 빙핵활성세균에 의한 빙핵활성 정도를 드롭 프리징 방법(drop freezing method)에 의해 분석하였다. 단계별로 희석한 샘플을 알루미늄 블록에 5㎕의 드롭(drop)을 20 드랍씩 떨어뜨린 다음 알루미늄 블록의 온도를 분당 0.2℃씩 0℃에서 -15℃까지 낮추면서 각각의 과냉각된 상태에서 드롭의 수를 계산하였다.

그 결과, 바실러스 B4의 배양여과액을 처리한 샘플이 빙핵활성 세균에 의한 빙핵활성능을 억제함을 확인할 수 있었다(도 3)

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 토양에서 분리된 신규한 내냉성 바실러스 균주의 배양여과액은 어는점이 낮고, 빙핵활성세균이 빙핵을 형성하는 능력을 억제하는 효과를 나타내므로 본 발명의 균주는 농작물의 냉해방지제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 신규한 내냉성 바실러스 균주의 형태를 보여주는 현미경 사진이고,

도 2의 A는 본 발명의 신규한 내냉성 바실러스 균주가 내냉성을 보여주는 것을 100배 확대한 현미경 사진으로, 대조군인 증류수를 얼린 후 얼음 결정의 표면을 관찰한 것(a), 대조군인 증류수를 얼린 후 얼음결정의 성장 끝부분을 관찰한 것(b), 본 발명의 바실러스 B4의 배양 여과액을 얼린 후 얼음결정의 표면을 관찰한 것(c)이고,

도 2의 B는 대조군 및 바실러스 B4의 배양여과액의 어는점을 차별 조사 물리열량측정분석을 통해 실험한 그래프이고,

도 3은 대조군 및 바실러스 B4의 배양여과액을 처리한 빙핵활성 세균의 빙핵능을 빙핵의 수를 세어 부동활성을 측정한 그래프이다.

<110> PARK, Jiyong <120> Psychrotolerant Bacillus species isolated from soil <130> 2p-07-21 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 agaaaggagg tgatccagcc 20 <210> 3 <211> 1598 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 3 cgggaattcg attagaaagg aggtgatcca gccgcacctt ccgatacggc taccttgtta 60 cgacttcacc ccaatcatct gtcccacctt aggcggctgg ctccataaag gttacctcac 120 cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac 180 gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccggcttcat gtaggcgagt 240 tgcagcctac aatccgaact gagaatggct ttatgggatt cgcttacctt cgcaggtttg 300 cagccctttg taccatccat tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga 360 tttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac 420 tgaatgctgg caactaagat caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca 480 cgacacgagc tgacgacaac catgcaccac ctgtcactct gtcccccgaa gggaacgccc 540 tatctctagg gttgtcakag gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat 600 taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcagccttg 660 cggccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg cagcactaaa gggcggaaac 720 cctctaacac ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct aatcctgttt 780 gctccccacg ctttcgcgcc tcagtgtcag ttacagacca gaaagtcgcc ttcgccactg 840 gtgttcctcc aaatctctac gcatttcacc gctacacttg gaattccact ttcctcttct 900 gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccacggttg agccgtgggc tttcacatca 960 gacttaaaga accacctgcg cgcgctttac gcccaataat tccggacaac gcttgccacc 1020 tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca 1080 aggtaccagc agttactctg gtacttgttc ttccctaaca acagaacttt acgacccgaa 1140 ggccttcttc gttcacgcgg cgttgctccg tcagactttc gtccattgcg gaagattccc 1200 tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct 1260 ctcaggtcgg ctacgcatcg tcgccttggt gagccattac ctcaccaact agctaatgcg 1320 ccgcgggccc atctataagt gacagcataa accgtctttc catcttctct catgcgagaa 1380 aagaacgtat ccggtattag ctccggtttc ccgaagttat cccagtctta taggcaggtt 1440 gcccacgtgt tactcacccg tccgccgcta atctcaggga gcaagctccc attgattcgc 1500 tcgacttgca tgtattaggc acgccgccag cgttcgtcct gagccaggat caaactcaat 1560 cactagtgaa ttcgcggccg cctgcaggtc gaccatat 1598

Claims

토양에서 분리된 내냉성 바실러스 속 B4 (Bacillus sp. B4) 균주(수탁번호 : KCCM 10409).
제 1항의 균주를 유효성분으로 함유하는 냉해 방지제.