JPS63291577A - 氷核形成活性をもつ微生物の発酵方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は氷核形成活性（ｉｃｅ　ｎｕｃｌｅａｔｉｎｇ
　ａｃｔｉｖｉｔｙ：ＩＮ＾）をもつ微生物の発酵方法
に関する。

〔従来の技術〕

米国特許第４，２００，２２８号明細書には雪を製造す
る方法が開示されており、この方法によれば空気中に噴
霧される小滴中に微生物が含まれている。

使用されている微生物は氷核形成を促進することが知ら
れている種想のものである。その結果、通常の温度より
可成り高い温度で雪を製造することができる。このプロ
セスに有用な代表的な微生物である。

このプロセスをいがなる規模でも使用しようとすると、
多量の微生物を必要とすることは明白である。更に、微
生物は、その貯蔵、取扱及び運搬輸送を容易にするため
に、乾燥形態で得るのが望ましい。

氷核形成活性をもつ微生物の生長条件は当業界で知られ
ている。例えばＮａｋ　ｉ及びＷｉｌｌｏｕｇｈｂｙの
Ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｓ　１３ｉｏｇｅｎｉｃ　５ｏｕ
ｒｃｅｓ　ｏｆ　ＦｒｅｅｚｉｎｇＮｕｃｌｅｉ、　　
Ｊ、八ｐｐｌｉｅｄ　　Ｍｅｔｅｏｒｏｇｙ　　１７．
　１０４！３−１０５３頁には、シュードモナス・シリ
ンゲのような微生物を２０’Ｃより低い温度、即ち５°
ＣでＫｏｓｅｒクエン酸液体培地（ｃｉＬｒａｔｅ　ｂ
ｒｏｔｈ）で生長させることが記載されている。

別の文献、即ちＫｏｘｌｏｆｆ、　５ｃｈｏｆｉｅｌｄ
及びＬｕｔｅのＩｃｅ　Ｎｕｃｌｅａｔｉｎｇ　Ａｃｔ
ｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎ
Ｈａｅ　ａｎｄ　Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ
、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ。

巧旦、２２２〜２３１頁（１９８３）には、ｐＨが約７
．０のトリプトン−酵母エキス−グリセロール培地上で
微生物を生長させている。εの文献では、微生物は乾燥
状態では回収されておらず、懸濁液の状態で直接、活性
のテストをしている。この氷核形成活性は懸濁液中では
安定でなく、−夜で活性が低下することが認められてい
る。

前記微生物の大量生産に前記した公知の方法を用いた場
合には所望の氷核形成活性のものは得られない。最初の
懸濁液の氷核形成活性が所望の活性より低くなるばかり
でなく、大量の微生物を凍結乾燥する間に活性の大半が
失なわれてしまう。

この結果は、前記方法が商業的な量の微生物を妥当なコ
ストで製造することのできないプロセスであることを示
している。

特願昭６２−２３６４１１号には、氷核形成微生物を製
造するものとして当業界で知られていた方法の改良が記
載されている。この方法ではｐＨを６．７〜５．５にコ
ントロールする。ｐＨが約６．７に近づいた時には酸を
添加し、そしてｐａ＋が５．５に近づいた時には塩基を
添加する。前記の特願昭６２−２３６４１１号には、氷
核形成性微生物の発酵方法についての他の改良も記載さ
れている０例えば、炭素源としてのマンニトールと窒素
源としての酵母抽出物とを含む好ましい培地が記載され
ている。

前記特願昭６２−２３６４１１号に記載の方法で得られ
るＩＮＡは許容できる。例えば、特願昭６２−２３６４
１１号の例１の記載に従って生成される発酵器ＩＮＡは
５．Ｏｘ　１０”である（ここで「発酵器ＩＮＡＪとは
、乾燥細胞１ｇ当りの核の数の単位をもつ）、シかしな
がら、生産性は望ましい水準に達していない。

発酵はかなりの細胞密度１８ｇ／４に達するが、完遂に
は３６時間を必要とした。その結果、「発酵器生産性」
（定義は後述）はわずかに２．５Ｘ１０”核数／ｈｏｕ
ｒでしかなかった。

特願昭６２−３２３０６３号には、前記の特願昭６２−
２３６４１１号記載の方法よりも優れた結果をもたらす
方法が記載されている。その例１では、発酵器ＩＮＡは
ＩＯＸ　１０”に増加したが、発酵器生産性は６．５９
ｘｔＯ”であった。これらの結果は、炭素源としての糖
と、α−ケトグルタレート又はα−ケトグルタレート生
成性アミノ酸とを含む培地を使用することによって達成
された。

〔発明が解決しようとする課題〕

前記の各特願昭の記載は、従来技術の発酵法を大きく改
良した発酵法をもたらしたが、更に改良が求められてい
る。より具体的には、発酵法の経済性を改良するために
は発酵器生成性を改良する必要があった。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、氷核形成活性をもつ微生物を培地において発
酵させる工程とその微生物を回収する工程とを含む、氷
核形成活性をもつ微生物の発酵方法の改良を提供する。

その改良は、 （１）前記の微生物を窒素源含有培地において少なくと
も約２９℃の温度で増殖させる工程、及び（２）前記の
発酵を温度約２４℃以下で定常期の間、続ける工程 を含んでなり、しかも前記の窒素源の濃度が（ａ）少な
くとも２０ｇ／ｌの細胞塊を提供するのに充分であり、
しかも （ｂ）増殖期の終期においては、後の定常期における氷
核形成活性の形成を阻害するには不充分な窒素源しか残
留しないようにするのに充分な程度に低いものであるこ
とを特徴としている。

前記から明らかなとおり、本発明には２つの本質的な特
徴がある。第１は増殖期における窒素源の濃度であり、
そして第２は増殖期及び定常期の間の温度である。これ
らの特徴は、高ＩＮＡを得ると同時に高い発酵層生産性
を提供するためには必要である。例えば、前記の特願昭
６２−３２３０６３号の例１の細胞密度はわずか１４．
５ｇ／ｌであった。仮に、細胞増殖を改良するために栄
養素濃度を増加させ、そして温度を上げて維持すると、
ＩＮＡが激しく低下した。同様に、栄養素濃度を調整せ
ずに、温度を調整したとすると　くこのようにすること
は、前記の特願昭６２−３２３０６３号には示唆されて
いないが）、得られる生産性は劣ったものであった。

窒素源の初期濃度は、増殖期の間の発酵温度に関連する
。少なくとも２０ｇ／ｌの細胞塊を最終的に提供するの
に充分な窒素源が存在する。しかしながら、多くなり過
ぎて、阻害量の窒素源が増殖期の終了後に残留してはな
らない。これらの量は温度と関連がある。なぜなら、温
度が上昇すると、細胞塊の可能性も上昇（ある点まで）
し、そして窒素源も相当に増加させる必要がある。微゛
生物に対する最適増殖温度を超えると、増殖の可能性が
低下し、そして窒素源はそれに従って減少させる一ヒ・
要がある。

３０℃におけるシュードモナス・シリンゲの代表的な増
殖期では、窒素源の初期濃度は約４５ｇ／ｌ〔グルタミ
ン酸モノナトリウム（ＭＳＧ）を基準とする〕であり、
これによって増殖期の終点では細胞塊的２４ｇ／ｌが生
成される。ＭＳＧはほとんど残留しない。３３℃では、
この微生物の最適増殖温度を越えており、濃度を例えば
約４０ｇ／ｌのようにわずかに低下させる。

増殖期の最後に残留する窒素源の量は、通常の方法を用
いて測定することができる。使用する的確な方法は窒素
源の性質に依存する。ＭＳＧが窒素源である場合には、
当業界で知られている０ＰＡ−メルカプトエタノール蛍
光誘導体を用いるＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ法によって、それを
培地中で測定することができる。

前記の基準では、先に使用した濃度よりも若干高い初期
濃度をもたらす点に注意されない。例えば、３０°Ｃに
おいて、ＭＳＧ濃度は４５ｇ／ｌであり、これは細胞密
度２４ｇ／ｌを生成する。これに対して、前記特願昭６
２−３２３０６３号の例１におけるし一グルタミン酸の
初期濃度は、増殖温度２４℃において２０ｇ／ｌであっ
た。

本発明によれば、窒素源は、増殖期の終期においては、
後の定常期における氷核形成活性の形成を阻害するには
不充分な窒素源しか残留しないようにするのに充分な程
度に低いものである。すなわち、これよりも多い量を使
用するとＩＮＡは約６０％以上低下する。実験を数回実
施すれば、正確な量を決定することができる。これは、
この時点で発酵培地中に２０ｇ乙昧満が残留するのが好
ましく、５ｇ／１ｌｉｃ、満残留するのが特に好ましい
ことを意味する。

本発明の微生物及びその他の微生物の発酵においては、
微生物が急速に増加する増殖期と呼ばれる時期がある。

この時期は、当業界において「対数期」又は「対数増殖
期」としても知られている。

この時期に、生長培地の光学密度の対数を時間に対して
プロットすると直線が得られる。この時期の終点におい
て、前記の線の傾斜は劇的に低下する。これは微生物が
もはや増殖しないこと、すなわち定常期に入ったことを
示している。これらの２つの期間の間には短期の遷移状
態がある。例えば、２２時間続く代表的な発酵では、遷
移状態はわずかに１時間だけ続くことがある。本明細書
において「増殖期の終期」とは、前記の直線部分の終り
のあたりから短期の遷移期間のいずれをも含むものとす
る。

良好な増殖を促進するには、増殖期における温度を約２
９℃以上にする。本発明方法では、それよりも高い温度
を使用することができるが、約３５℃よりも高い温度は
必要ない。本発明で使用する好ましい微生物すなわちシ
ュードモナス・シリンゲにおいては、３３℃より高い温
度は増殖を低下させる。それよりも低い温度において非
常に高い細胞密度を得ることができる。増殖期における
現在のところ好ましい温度は約３０°Ｃである。

我々が見出したところによれば、ＩＮＡは発酵の定常期
において主に生成される。更に、この定常期においては
、生成されるＩＮＡの景を有意にするために、温度を２
４°Ｃ以下に下げることが必要である。温度を２４℃よ
りも低くすることができるが、約２１℃よりも低い温度
ではＩＮＡの改良はほとんど観察されない。従って、定
常期における現在のところ好ましい温度は２１℃である
。

本発明を実施する際には任意の通常の培地を用いること
ができるが、前記の特願昭６２−３２３０６３号に記載
の培地が現在のところ好ましい培地である。

この培地は２つの必須成分すなわち糖及びα−ケトグル
タレート又はα−ケトグルタレート生成性アミノ酸から
なる。有用な糖としてはグルコース（又は粗グルコース
例えばデキストロース）、シュークロース、フラクトー
ス、エリスロース、マンノース、キシロース及びリボー
スが含まれる。市販されているこれらの糖源を便利に使
用することができる。これらの糖源としては、液状シュ
ークロース、高フルクトースコーンシロップ及びデキス
トロースコーンシロップが含まれる。これらの糖の混合
物を使用することもできる。これらの糖と組み合せて他
の炭素源例えばマンニト−ル及び他の糖誘導体を使用す
ることができる。

他の必須の成分はα−ケトグルタレート又はα−ケトグ
ルタレート生成性アミノ酸である。生物学的過程でα−
ケトグルタレートを生成するアミノ酸はアルギニン、ヒ
スチジン、グルタミン、グルタミン酸及びプロリンであ
る。これらの酸の塩例えばグルタミン酸モノナトリウム
（ＭＳＧ）も有用である。これらのアミノ酸からα−ケ
トグルタレートを製造することに関する記載は、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ、第２版、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、
ｖ４ｏｒｔｈ（１９７５）　５７４頁以後にある。これ
らの化合物の混合物も使用することができる。

前記の培地が、リン酸塩例えばリン酸カリウムを含有す
ることも好ましい。リン酸塩の有用な初期濃度範囲は、
０，２〜６ｇ／ｌ、好ましくは０．６〜３ｇ／ｌである
。好ましい態様においては、増殖期の終点においてほと
んど残留しない（例えば１ｇ／１未満）ように初期ホス
フェート濃度を選択する。

前記の培地は、好ましくは他の成分を含有する。

前記の微生物の発酵用として当業界で知られているよう
に、硫酸マグネシウムが好ましい。更に、前記の培地が
痕跡量の金属を含有することが望ましい。痕跡量の鉄及
び亜鉛が特に有効である。

増殖期温度が３０℃である発酵に使用するには、以下の
培地が好ましい。

シュークロース　　　　　　　９０ｇ／ＩＭＳＧ　　　
　　　　　　　　　４５ｇ／ｌ硫酸マグネシウム　　　
　　　４ｇ／ｌリン酸カリウム　　　　　　２．７５ｇ
／ｌ硫酸鉄　　　　　　　　　０．１１２ｇ／ｌ硫酸亜
鉛　　　　　　　０．００２４ｇ／１２発酵の間では、
前記特願昭６２−２３６４１１号に記載されているとお
り、ｐｌ＋を制御するのが望ましい。

温度は１９℃〜２５℃が好ましい。

本発明によれば、氷核形成活性をもつ任意の微生物を製
造することができる。適当な微生物としては、Ｐ、シリ
ンゲ５ｒｉｎａｅ）及び凡ニス上土ニル４！　’／　Ｘ
　（ｆ　Ｉｕｏｒｓμ猥σ、Ｐ、コロナファシェンズー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生物を例示
することができる。本発明において使用するのに有用な
他の微生物としては、例えばエルウィナ・ヘルビコラＥ
ｒｕ＋ｉｎａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａを挙げることができ
る。

現在のところ好ましい微生物はＰ、シリンゲ植■植［吐
＾ＴＣＣ階５３，５４３　（ブタベスト条約に従って米
国メリーランド州のロックビルの＾ＴＣＣ（＾ｍｅｒｉ
ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ）に１９８６年９月２３日に寄託〕である。

前記の発酵法で製造される微生物は種々の方法で乾燥さ
せることができる。典型的な例は、スプレー乾燥及び凍
結乾燥である。いずれの乾燥方法もＩＮＡを成る程度低
下させる０発酵話中で生成される大量のＩＮＡを保存す
る成る好ましい方法は、米国特許第４．７０６．４８３
号明細書（１９８７年１１月１７日発行）に記載の方法
である。この方法では、培地を冷却し、濃縮し、そして
超低温液体中に流してベレットを形成し、そしてこれら
のベレットを次に比較的低温で凍結乾燥する。

以下の実施例においては、ＩＮＡは慣用技術を用いて計
算した。ＩＮＡは複数個の微生物を含む水滴（１０μｍ
）をパラフィン被覆アルミ箔上に置き、これを−５°Ｃ
の恒温浴中に入れることによって求めた。この方法の詳
細は、例えば文献Ｖａｌｉ。

（ｌｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　
ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＲｅｓｕｌｔｓ　ｏｎ
　ｔｈｅ　Ｈｅｒｅｒｏｇｅｎｏｕｓ　Ｆｒｅｅｚｉｎ
ｇ　ｏｒＳｕｐｅｒｃｏｏｌｅｄ　Ｌｉｑｕｉｄｓ、　
Ｊ、＾ｔｏｍｓ　Ｓｃｉ、、２８．４０２〜４０９頁（
１９７１年）に記載されている。以下の実施例で報告し
たＩＮＡは、乾燥微生物１ｇ当りの氷核形成部位の数で
ある。本発明の目的に対して、乾燥することなく発酵器
から直接サンプリングしたサンプルを用いてＩＮＡを測
定した。従って、これを「発酵器ＩＮＡＪと称する。そ
の単位は、乾燥微生物１ｇ当りの核の数である。ＩＮＡ
の測定を間隔を置いてしばしば行うことにより、最適の
ＩＮＡ生産を決めることができる。

以下の表に示す発酵器生産性は、発酵器ＩＮＡに細胞塊
を剰じ、１０％種の接種から開始した発酵時間で除した
ものと定義される。単位は！・時間当りの核数である。

〔実施例〕

以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。

種の培養 前記の発酵培地５１を含有する１４１発酵器中に、シュ
ードモナス・シリンゲ（Ｐ、ｓｙｒｉｎｇａｅ）八ＴＣ
Ｃ１１ｈ５３５４３の試料４．５社を装入した。温度を
３０℃に維持した。ｐｌ＋が６．６に近づいた場合には
硫酸を加えた。この種（シード）発酵器中での発酵は２
１時間続けた。

例１〜３ 本発明を説明するために一連の発酵を実施しな。

各発酵において、種培養体の０．５ｆ試料を、同じ成分
の培地４．５１を含有する別の１４１発酵発酵器した。

特に断らない限り、成分の濃度は同じである。温度は、
発酵の間、表に示すようにコントロールした。表中にお
いて、第１の温度は増殖期における温度であり、第２の
温度は定常期における温度である。温度が１つの場合に
は、発酵の間に温度変化がなかったことを示す。培地試
料を増殖期の終点で採取し、ＭＳＧ含量を分析した。結
果を表中で「窒素含量」として示す、ｐＨが６．６にな
ったら硫酸を添加し、ｐＨが５．６になったら水酸化ナ
トリウムを添加した。溶解酸素は１０％飽和より上に維
持した。すべての発酵は２２時間行った。

発泡抑制剤は発泡をコントロールするのに必要な場合に
添加した。結果を以下の表に示す。

り下余白 一表一 例、１　　０．０　　２０　　　　２４　　３０−２１
　　２１．８例、２　１８１　　　７．２６　　　２２
　　３３−２１　　　８．００例、３　　７．３　　　
７．９６　　　２５　　３０−２４　　１１．６比較例 ＣＩ　　１１　　４．５８　１９　２７−２１　３．９
６Ｃ２１４２，１９１５２４−２１１，４９Ｃ３２ＮＡ
　　３．１７　１２　３０−２１　１．９Ｃ４コ　　　
ＮＡ　　　　　　５　　　　　　１Ｂ　　　　　２１　
　　　　　２．５Ｃ５４ＮＡ　　　　　　　　１０　　
　　　　　　　　１４．５　　　　　２４　　　　　　
　　　６．５９Ｃ６ＮＡ　　　　　　　　　　Ｏ，５４
２４３００，６５Ｎ八−利用せず １　この実験ではホスフェートが制御栄養であった。

２　初期ＭＳＧ濃度　２５ｇ／Ｎ ３　特ＪＦ６２−２３６４１１の例１（３６時間）の複
合窒素源４　特ｉｊ７＃２−３２３０６３ノ例１のＬ−
グルタミン酸〔発明の効果〕 本発明は、氷核形成活性の高い生産性を提供するもので
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、氷核形成活性をもつ微生物を培地において発酵させ
   る工程とその微生物を回収する工程とを含む、氷核形成
   活性をもつ微生物の発酵方法において、 （１）前記の微生物を窒素源含有培地において少なくと
   も２９℃の温度で増殖させる工程、及び（２）前記の発
   酵を温度約２４℃以下で定常期の間、続ける工程 を含んでなり、しかも前記の窒素源の濃度が（ａ）少な
   くとも２０ｇ／ｌの細胞塊を提供するのに充分であり、
   しかも （ｂ）増殖期の終期においては、後の定常期における氷
   核形成活性の形成を阻害するには不充分な窒素源しか残
   留しないようにするのに充分な程度に低いものであるこ
   とを特徴とする、氷核形成活性をもつ微生物の発酵方法
   。