Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer schwach alkalischen Protease in kristalliner Form, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Protease erzeugende Aspergillusstämme, vorzugsweise Stämme von Aspergillus melleus, Aspergillus oryzae oder Aspergillus sojae, auf einem flüssigen oder festen Kulturmedium gezüchtet werden, dass eine Lösung der rohen Protease zur Entfernung der neben der Protease vorhandenen Verunreinigungen durch eine Schicht eines Anionenaustauschharzes in der Acetatform, das eine tertiäre Aminogruppe als austauschende Gruppe
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aufweist, gegeben wird, dass dem Eluat zur Ausfällung der Protease ein Lösungsmittel zugesetzt wird und dass die schwach alkalische Protease aus einer Lösung des Niederschlags kristallisiert wird.
Ziel der Erfindung ist ein gewerblich anwendbares Verfahren zur Herstellung kristallisierter Protease, das es gestattet, die Protease in grossem Massstab und mit hoher Ausbeute ohne Verschlechterung der Aktivität durch einfache Entfernung der in der Rohprotease vorhandenen Verunreinigungen herzustellen.
Verschiedene Verfahren, wie beispielsweise Aussalzen, Dialyse, Adsorption, Chromatographie, Elektrophorese, Gelfiltration und Ausfällung mit einem Lösungsmittel oder einem spezifischen Reagens, werden üblicherweise in Kombination miteinander zur Reinigung verschiedener Arten von Enzymen angewendet. Solche Verfahren verursachen jedoch grosse Schwierigkeiten, wenn sie auf gewerblicher Basis zur Herstellung kristallisierter Protease angewendet werden, da sie mühsam sind, die Ausbeute an Protease vermindern und erhebliche Zeit in Anspruch nehmen.
Als Beispiel für die bekannten Verfahren zur Reinigung einer schwach alkalischen Protease wird im folgenden ein Dialyseverfahren beschrieben.
Taka-Diastase, ein Enzym, das durch die Tätigkeit von Aspergillus oryzae erhalten wurde, wird zur Ausfällung von Verunreinigungen mit einer 10 /Oigen Lösung von Calciumacetat versetzt und dann nacheinander mit Aceton und Ammoniumsulfat behandelt, dem Dialyseverfahren unterworfen und endlich mit einer 2%eigen Lösung von Acrinol (oder 2-Äthoxy 6,9-diaminoacridinlactat) behandelt, um weitere Verunreinigungen, wie z. B. eine unerwünschte Protease und Amylase, zu entfernen.
Ein weiteres Beispiel für die bekannten Methoden zur Reinigung einer schwach alkalischen Protease unter Verwendung des Dialyseverfahrens wird im folgenden erläutert.
Taka-Diastase wird mit einer Lösung von Bleichacetat behandelt, mit Ammoniumsulfat ausgefällt und dann dem Dialyseverfahren zur Entfernung des Ammoniumsulfats, einem Acrinol-Fällungsverfahren zur Entfernung von Verunreinigungen, einem Adsorptionsverfahren unter Verwendung von Stärke in 40 /Oigem Alkohol zur Entfernung von Verunreinigungen und Ausfällungsverfahren unter Verwendung von Alkohol und Aceton zur Entfernung von Protease unterworfen.
Ausserdem wurden Verfahren zur Reinigung und Kristallisation zahlreicher Arten von Enzymen vorgeschlagen, wie Adsorption der Enzyme an anorganischen Adsorptionsmaterialien, wie z. B. Bentonit, Kaolin, saure Tonerde und aktive Tonerde, um die Verunreinigungen aus den Enzymen zu entfernen. Sie verwenden verschiedene Arten von Tonen, die Aluminiumsilicat als Hauptbestandteil enthalten und die in ihrer Acidität und Fähigkeit zur Adsorption der eiweissartigen Substanzen variieren. Sie können die Enzyme im sauren Zustand adsorbieren, setzen die adsorbierten Enzyme jedoch im neutralen oder schwach basischen Zustand wieder in Freiheit. Sie können in gepulvertem Zustand und bei chargenweiser Verarbeitung angewendet werden.
Als anorganisches Adsorptionsmaterial kann auch ein Calciumphosphatgel verwendet werden, es hat jedoch nicht die Fähigkeit der selektiven Adsorption des Enzyms und ist nicht wirksam.
Weiterhin wurden Verfahren zur Kristallisation von Pilzprotease durch Adsorption der Protease an organischen Adsorbenzien, wie beispielsweise Ionenaustauschharzen und insbesondere Kationenaustauschharzen, vorgeschlagen. Es ist beispielsweise bekannt, ein Copolymerisat von Methacrylsäure und Divinylbenzol, dass unter dem eingetragenen Warenzeichen Amberlite IRC-50 von Röhm und Haas vertrieben wird und einige Kationenaustauschharze, die vom Science Institute hergestellt werden, für die Reinigung und Kristallisation der alkalischen Protease, die durch Züchtung von Aspergillus sojae Stämmen hergestellt worden ist, zu verwenden.
Solche Methoden, die Kationenaustauschharze verwenden, sind jedoch für die gewerbliche Reinigung von Proteasen im grossen Massstab nicht anwendbar, da sie schwierig durchführbar sind, für die lonenaustauschharze eine grosse Menge Pufferlösung benötigen und für die Behandlung einer grossen Menge an Rohprotease nicht geeignet sind.
Es wurde in diesem Zusammenhang festgestellt, dass die Verwendung eines Anionenaustauschharzes bisher für die Reinigung der Protease nicht vorgeschlagen wurde und dass die Protease auf dem Anionenaustauschharz nicht adsorbiert wird.
Für das erfindungsgemässe Verfahren werden Anionenaustauschharze, die eine tertiäre Aminogruppe in der Acetatform aufweisen, verwendet, beispielsweise eines, das unter Verwendung von Amberlite IRA-93, das eine tertiäre Aminogruppe aufweist, hergestellt worden ist. Solch ein Anionenaustauschharz kann beispielsweise hergestellt werden, indem Styrol und Divinylbenzol zu einem Copolymerisat polymers siert werden, indem dieses Copolymerisat zur Einführung einer Methylenchloridgruppe mit chloriertem Methyläther umgesetzt wird und indem das erhaltene Reaktionsprodukt zur Bildung eines Anionenaustauschharzes, das eine tertiäre Aminogruppe enthält, mit Dimethylamin umgesetzt wird.
Es ist festzustellen, dass die Anionenaustauschharze in der Acetatform die schwach alkalische Protease nicht adsorbieren, dass sie jedoch die zusammen mit dem rohen Enzym vorkommenden Verunreinigungen adsorbieren und dass daher die Rohprotease gereinigt werden kann und dass die kristallisierte schwach alkalische Protease aus der Lösung isoliert werden kann.
Demgemäss liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung und Kristallisation einer rohen schwach alkalischen Protease, die durch Züchtung von Aspergillus-melleus-Stämmen auf einem flüssigen oder festen Kulturmedium gewonnen worden ist. Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass eine Lösung der rohen Protease durch eine Schicht eines Anionenaustauschharzes in der Acetatform gegeben wird, wodurch die neben der Protease vorhandenen Verunreinigungen aus dem ausfliessenden Medium entfernt werden, dass zu dem ausfliessendem Medium zur Ausfällung der Protease ein Lösungsmittel zugegeben wird und dass die schwach alkalische Protease aus einer Lösung des Niederschlags kristallisiert wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren weist zahlreiche Vorteile auf, die darin bestehen, dass die kristallisierte schwach alkalische Protease gewerbsmässig in grossem Massstab hergestellt werden kann, indem eine grosse Menge Rohpro tease verwendet wird, deren Aktivität nicht abgeschwächt wird, da die adsorbierte Protease nicht von dem lonenaustauschharz in Freiheit gesetzt werden muss, andere Verunreinigungen als solche, die durch Lösungsmittelbehandlung entfernt werden können und Enzyme, wie alkalische Phosphatase, saure Protease, Lipase und andere, entfernt werden können und es ausserdem möglich ist, solche technischen Verfahrensschritte, wie Aussalzen, Dialyse, Adsorption, Chromatographie und Ausfällen mit Acrinol, die bei der Durchführung der herkömmlichen Verfahren zur Kristallisation der Enzyme unerlässlich sind, wegzulassen.
Die für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung des Anionenaustauschharzes verwendete Protease enthält eine grosse Menge an schwach alkalischer Protease und kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden.
Ein Aspergillus-melleus-Stamm wird zur Herstellung eine Kleie verwendet, und die Kleie wird in einem Extraktionstank mit Wasser extrahiert, und der Extrakt wird anschliessend unter Verwendung einer Filterpresse gefiltert, um einen klaren Extrakt zu erhalten. Der klare Extrakt wird unter Rühren zum dreifachen Volumen an Äthanol (95 Vol.- /0) gegeben, und die Mischung wird zur Vervollständigung der Ausfällung des Enzyms 4-5 Std. lang stehen gelassen. Die obere klare Schicht des Äthanols wird abgegossen, und das ausgefällte Enzym wird mit Äthanol (95 Vol.-01o) gewaschen. Das Waschen wird 5-6mal wiederholt, und das Äthanol wird unter Verwendung einer Zentrifuge abgetrennt, wobei ein rohres Enzym erhalten wird.
Die rohe Protease wird in Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung wird durch eine Schicht eines Anionenaustauschharzes in der Acetatform gegeben, um die schwach alkalische Protease zu isolieren.
Ein Verfahren zur Messung der Proteaseaktivität wird im folgenden erläutert.
Eine Mutterlösung, die 0,6 % Milchcasein enthält, wurde durch Erwärmen des Milchcaseins in eine 0,1 m Na2H PO4-KH2PO4-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 hergestellt Die 0,1 m Na2HPO4-KH2PO4-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 wurde auch zur Herstellung einer Enzymlösung, die schwach alkalische Protease enthält, verwendet.
5 ml der Mutterlösung wurden 5 Minuten lang in einen auf 37 "C eingestellten Thermostaten gestellt, und dann wurde 1 ml der Enzymlösung zu der Mutterlösung gegeben; die erhaltene Mischung wurde 10 Minuten lang auf 37 "C gehalten, um die Umsetzung zwischen der Protease und dem Milchcasein zu ermöglichen, dann wurde sie zur Ausfällung nicht umgesetzten Proteins mit 5 ml Trichloressigsäurelösung (hergestellt durch Vermischen von 0,11 Mol CCl3COOH, 0,22 Mol CH3COONa und 0,33 Mol CH3COOH mit 1000 ml Wasser) vermischt. Die erhaltene Mischung wurde durch ein Papierfilter filtriert, und 2 ml des Filtrats wurden zu 5 ml 0,55 m Lösung von Natriumcarbonat gegeben.
Dann wurde die erhaltene Mischung mit 1 ml Folins Reagens, das vorher mit Wasser auf das Dreifache seines Volumens verdünnt worden war, vermischt, wodurch eine Farbentwicklung der erhaltenen Mischung erfolgte. Die Dichte der Farbentwicklung wurde durch 30 Minuten langes Erwärmen der erhaltenen Mischung auf 37 OC konstant gemacht, und die Aktivität der schwach alkalischen Protease wurde durch Messen der Lichtabsorption der erhaltenen Mischung bei 660 nm bestimmt.
Die Aktivität wird in Einheiten (PU) angegeben, das ist die Menge an Enzym, die erforderlich ist, Peptid eine Minute zu isolieren, das in Trichloressigsäurelösung löslich ist und 10 um Tyrosin entspricht.
Es ist festzustellen, dass das Anionenaustauschharz in der Acetatform im Vergleich mit einem Anionenaustauschharz in der Sulfat-, Chlorid- oder Phosphatform eine ausgezeichnete Fähigkeit aufweist, die schwach alkalische Protease selektiv nicht zu adsorbieren und dass daher das Anionenaustauschharz in der Acetatform eine hohe Ausbeute an schwach alkalischer Protease ergibt. Die Eigenschaften der oben erwähnten Anionenaustauschharze werden auf folgende Weise miteinander verglichen.
200 ml eines Anionenaustauschharzes vom Hydroxyltyp, das unter dem eingetragenen Warenzeichen Amberlite IRA-93 von Röhm und Haas hergestellt und verkauft wird, werden in je eine der fünf mit den Nummern 1 bis 5 bezeich- neten Säulen der folgenden Tabelle gegeben. Die Säule besteht aus einem Acrylharz und hat einen Durchmesser von 2,04 cm. Durch die Säulen Nr. 1 bis 4 mit Anionenaustauschharz in der Hydroxylform werden 500 ml 0,2 n Essigsäure, 0,2 n Schwefelsäure, 0,2 n Salzsäure und 0,2 n Phosphorsäure mit einer Fliessgeschwindigkeit von 900 ml/Std. gegeben, und dann wird das Anionenaustauschharz mit 4 Litern destilliertem Wasser gewaschen.
Das Anionenaustauschharz in der Hydroxylform, das in die Säule Nr. 5 gegeben ist, wird mit keiner Säure behandelt, sondern mit Wasser gewaschen, daher bleibt das Harz unverändert
Die oben erwähnte Rohprotease wird in Wasser gelöst, und durch jede der 5 Säulen werden mit einer Fliessgeschwindigkeit von 900 mUStd. 2 Liter dieser wässrigen Lösung gegeben. Das ausfliessende Medium aus jeder der 5 Säulen wird auf den Proteasegehalt untersucht. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle I angegeben.
Tabelle I Nr. der Art pH-Wert der Proteasegehalt Säule des Harzes Lösung im Eluat(%) 1 Acetatform 5,1 100 2 Sulfatform 2,5 0 3 Chloridform 4,0 45 4 Phosphatform 2,8 0 5 Hydroxylform 9,8 76
Aus der Tabelle list ersichtlich, dass das Anionenaustauschharz in der Acetattyp ein Eluat liefert, das die Protease in hohem Prozentsatz enthält, und das Eluat wird mit einem Lösungsmittel wie Methanol und Acrinol, behandelt oder dem Ausfällungsverfahren unterworfen, und der Proteaseniederschlag wird in Wasser gelöst, und die kristallisierte Protease wird durch Zugabe eines Lösungsmittels, wie Aceton, zur wässrigen Lösung der Protease isoliert.
Tabelle II
Kennzeichnende Eigenschaften der kristallisierten, schwachalkalischen Protease Spezifische Aktivität 240 pH-Optimum 8,0 Temperatur-Optimum 45 "C pH-Stabilität 3,0-11,2 Hitzestabilität 40-65 "C Druckstabilität 70 % Hydrolyseverhältnis 80 % Isoelektrischer Punkt 6,5 Aktivitätszentrum serine Absorptionsmaximum 280 nm Absorptionsminimum 251 nm Extinktionskoeffizient 11,5 Isosbestischer Punkt 273 nm, 280 nm Sedimentationskoeffizient (So2o,w) 2,98 x 10-s3 sec.
Diffusionskoeffizient (D020.w) 8,75 x 10-7cm2!sec.
Partielles spezifisches Volumen 0,728 Molekulargewicht (Msd) 30 300
In Tabelle II wird die spezifische Aktivität unter Anwendung der Kjeldahl-Methode bestimmt; sie gibt die Aktivität der Protease pro 1 mg Protein an. Das pH-Optimum gibt den pH-Wert der Mutterlösung an, bei dem die Aktivität der Protease ein Maximum hat; die Messungen erfolgen durch Veränderung des pH-Wertes der Mutterlösung durch Zugabe von Britto-Robinson-Pufferlösung. Das Temperaturoptimum gibt die Reaktionstemperatur an, bei der die Protease die grösste Aktivität entwickelt; die Messungen erfolgen, indem die Aktivität der Protease bestimmt wird, wobei lediglich die Reaktionstemperatur verändert wird.
Die pH-Stabilität gibt den pH-Bereich an, in dem die Restaktivität der Protease zu mehr als 90 % beibehalten wird, nachdem die Enzymlösung, die 0,1 % der kristallisierten, schwach alkalischen Protease gelöst in der Britton-Robinson-Pufferlösung bei unterschiedlichen pH-Werten enthält, 30 Minuten lang bei 20 OC stehen gelassen worden ist. Die Hitzestabilität gibt den Temperaturbereich an, in dem die Restaktivität an Protease von 98 % auf 0 vermindert wird, nachdem die wässrige Lösung, die 0,1 /0 der kristallisierten, schwach alkalischen Protease enthält, 30 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen aufbewahrt worden ist.
Die Druckstabilität gibt die Restaktivität an Protease an, die verbleibt, nachdem die wässrige Lösung, die 4 % der kristallisierten, schwach alkalischen Protease enthält, 20 Minuten lang bei 20 "C unter Hochdruck von 9000 Atmosphären aufbewahrt worden ist. Der Extinktionskoeffizient gibt die Absorption der wässrigen Lösung, die 1 % der kristallisierten, schwach alkalischen Protease enthält, bei 280 nm an. Das Hydrolyseverhältnis wird aus den nach der Ninhydrinreaktion mittels den Aminoradikalen bestimmt, die sich aus Milchcasein bei der Durchführung des Verfahrens zur Messung der Aktivität von Protease nach 100 Stunden bei 37 "C unter Verwendung der kristallisierten, schwach alkalischen Protease mit einer Aktivität von 10 PU/ml bilden.
Tabelle III
Einfluss von Metallsalzen auf die Aktivität von Proteasen Salze Konzentration Relative (in Mol) Aktivität Keine (Vergleich) 100 Natriumchlorid 0,01 106 Calciumchlorid 0,01 105 Cobalt(IISchlorid 0,01 96 Nickelsulfat 0,01 92 Zinksulfat 0,01 98 Kupfer(IISsulfat 0,01 96 Eisen(IISsulfat 0,01 91 Manganchlorid 0,01 92 Bleiacetat 0,01 98 Cadmiumchlorid 0,01 96 Quecksilber(IIpchlorid 0,01 3 Silbernitrat 0,01 46
Zur Bestimmung der Proteaseaktivität gemäss Tabelle III wurde die Mutterlösung jeweils hergestellt, indem eine 0,1 m Tris(hydroxymethylaminomethan-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) anstelle der 0,1 m Na2HPO4-KH2PO4-Pufferlösung verwendet wurde.
Die 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-amino- methan-HC1-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) wurde auch zur Herstellung einer Enzymlösung, die 0,01 mg der kristallisierten, schwach alkalischen Protease pro ml Enzymlösung enthielt, verwendet. 5 ml der Mutterlösung wurden mit 1 ml einer wässrigen Lösung, die 0,07 Mol des in Tabelle III angegebenen Metallsalzes enthielt, vermischt, und die erhaltene Mischung wurde 5 Minuten lang bei 37 "C erhitzt und dann wurde 1 ml der Mutterlösung zugesetzt, um die Proteaseaktivität zu bestimmen. Die Proteaseaktivität ist als relative Ak Aktivität angegeben; sie ist im Vergleich zur Proteaseaktivität 100 angegeben; die erhalten wird, wenn 1 ml reines Wasser anstelle von 1 ml der wässrigen Lösung, die 0,07 Mol des jeweiligen Metallsalzes enthält, verwendet wird.
Tabelle IV
Einfluss einiger Inhibitoren auf die
Proteaseaktivität Inhibitoren Konzentration Rest (in Mol) aktivität Kein (Vergleich) 100 Dinatriumäthylendiamintetraessigsäure 0,011 96 Kaliumpermanganat 0,011 98 Jod 0,011 0 Natriumthioglykolat 0,011 103 Natriumthiosulfat 0,011 100 Natriumascorbat 0,011 98 LCystein 0,011 95 Kaliumcyanid 0,011 98 Natrium-pchlormercuri- benzoat 0,0011 97 Natriummonojodacetat 0,011 95 N-Bromsuccinimid 0,011 8 Natriumlaurylsulfat 0,011 96 Kartoffel-Trypsin-lnhibitor 0,1 010 2 Diisopropylfluorophosphat 0,0011 15
Für die Angaben in Tabelle IV wurden Enzymlösungen hergestellt, die 1 % kristallisierte schwach alkalische Protease enthielten,
indem die Protease in einer 0,1 m Tris(hy- droxymethylpaminomethan-HCI-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 aufgelöst wurde. Ausserdem wurden Inhibitorlösungen, die jeweils die in Tabelle IV angegebenen Inhibitoren in Molkonzentrationen enthielten, hergestellt, indem die entsprechenden Inhibitoren in 0,1 m Tris-(hydroxymethyl > aminomethan-HC1-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) gelöst wurden.
Dann wurde 1 ml Enzymlösung zu 9 ml Inhibitorlösung gegeben, und die erhaltene Mischung wurde 10 Minuten bei 20 "C gehalten und dann mit reinem Wasser verdünnt, so dass das 100fache Volumen erhalten wurde. Die Restaktivität der verdünnten Enzymlösung wurde nach der in Punkt V angegebenen Methode zur Messung der Aktivität von Protease bestimmt.
Die Restaktivität der verdünnten Enzymlösung wurde zu 100 angenommen, wenn 9 ml der 0,1 m TrisChydroxymethylS aminomethan-Pufferlösung anstelle der Inhibitorlösung verwendet wurden.
Die kristallisierte schwach alkalische Protease wurde analysiert und es wurde eine Zusammensetzung festgestellt, die unten in Tabelle V als Molverhältnisse der Aminosäuren angegeben ist.
Tabelle V
Zusammensetzung der Schwach alkalischen Protease in Molverhältnissen der Aminosäuren l Asp. r36 Gly. 45 Glu. 18 Ala. 46 Arg. 2 Val. 33 His. 2 Ile. 15 Lys. 5 Leu. 21 Ser. 37 Pro. 9 Thr. 25 Halb-Cys. 0 Tyr. 11 Met. 0 Trp. 2 Amid-NH3 16 Phe. 7
Im folgenden werden an Hand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens näher erläutert. Die in den Beispielen verwendete Roh- protease wurde in gleicher Weise wie oben erwähnt gewonnen.
Beispiel 1
1 kg einer Rohprotease, die eine schwach alkalische Protease enthält und eine Aktivität von 95 000 PU/g hat und die unter dem eingetragenen Warenzeichen Prozym vom Patentinhaber hergestellt und verkauft wird, wurde in 20 Litern Wasser zu der zu reinigenden wässrigen Lösung gelöst.
5 Liter eines schwach basischen Anionenaustauschharzes, das unter dem eingetragenen Warenzeichen Amberlite IRA-93 von Röhm und Haas hergestellt und verkauft wird, wurden in eine Acrylharzsäule von 12 cm Durchmesser und 100 cm Länge gefüllt, und dann wurden 10 Liter einer 0,5 n Essigsäure durch die Säule laufen gelassen, um das Harz in die Acetatform zu überführen; anschliessend wurde das Harz mit 50 Liter Wasser gewaschen, bis die ausfliessende Flüssigkeit einen pH-Wert von mehr als 4,0 aufweist. Die wässrige Lösung der Rohprotease wurde mit einer Fliessgeschwindigkeit von 15 Litern pro Stunde durch die Harzsäule laufen gelassen.
Das erhaltene Eluat wurde mit 45 Litern Äthanol (9501zig) gemischt und zur Ausfällung des Proteaseniederschlags bei -15 "C gehalten; der Niederschlag wurde in 6 Litern Wasser gelöst, die erhaltene wässrige Lösung wurde auf 5 C abgekühlt, und 1,5 Liter Aceton wurden bei -15 "C zugegeben, bis eine leichte Trübung in der wässrigen Lösung auftrat, und die erhaltene Mischung wurde über Nacht bei -15 "C in einem Kühlraum aufbewahrt. Die Kristal lisation der Protease wurde durch langsame Zugabe von Aceton bei -15 "C beendet; die Zugabe des Acetons erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 0,2 Liter pro Tag, bis die Konzentration in der Mischung 30 /0 betrug.
Es wurden 300 g kristallisierte Protease mit einer Aktivität von 222 000 PU/g erhalten, was einer Ausbeute von 70 /0 entspricht. Die Eigenschaften der kristallisierten Protease sind aus den Tabellen I bis V ersichtlich.
Beispiel 2
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde zur Herstellung eines Eluats wiederholt. Dann wurde das Eluat mit Äthanol (9501zig) vermischt, um einen Proteaseniederschlag zu erhalten; anschliessend wurde der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein weisses Pulver mit einer Aktivität von 200 000 PU/g erhalten wurde. 100 g dieses weissen Pulvers wurden in 2 Liter Wasser gelöst, und die wässrige Lösung wurde auf 5 "C abgekühlt, woraufhin Aceton von einer Temperatur von -15 "C zu der wässrigen Lösung gegeben wurde, bis die Konzentration an Aceton 20 Vol.-% betrug; die erhaltene Mischung wurde 3 Tage lang bei 0 "C stehen gelassen. Nach mehreren Stunden begann die Kristallisation der Protease.
In Abständen von ca. 20 Stunden wurde Aceton von -15 "C zu der Mischung gegeben, bis die Gesamtkonzentration des Acetons in der Mischung ca. 30 Vol.-01o betrug.
Es wurden 63 g kristallisierte Protease mit einer Aktivität von 226 000 PU/g erhalten, was einer Ausbeute von 71 % entspricht. Es wurde festgestellt, dass die kristallisierte Protease die gleichen Eigenschaften hat wie die gemäss Beispiel 1 erhaltene.
Beispiel 3
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren zur Herstellung eines Eluats wurde wiederholt. Das Eluat wurde dann zur Ausfällung der Protease mit 95 /0igem Alkohol versetzt, und der Niederschlag wurde unter verminderten Druck getrocknet, wobei ein weisses Pulver mit einer Aktivität von 200 000 PU/g erhalten wurde. 100 g dieses weissen Pulvers wurden in 2 Liter Wasser gelöst, und 300 ml einer 1 /0igen Lösung von Acrinol wurde zu der wässrigen Lösung gegeben, wodurch ein brauner Niederschlag erhalten wurde, der in einer Zentrifuge abgetrennt wurde; dann wurden 1000 ml einer 1 /0igen Lösung von Acrinol zu der überstehenden Lösung gegeben.
Der erhaltene Niederschlag von schöner gelber Farbe wurde abzentrifugiert, und der Niederschlag wurde in einer kleinen Menge (ca. 1 Liter) einer 1 molaren Lösung von Natriumacetat (pH-Wert = 6,0) aufgelöst, und die Lösung wurde mit dem doppelten Volumen an 95 /0igem Äthanol vermischt und bei -15 "C gehalten, um einen weiteren Niederschlag auszufällen, der wiederum abzentrifugiert wurde. Der frische Niederschlag wurde in ca. 1 Liter einer 0,002 molaren Lösung von Calciumacetat aufgelöst und die Lösung wurde mit ca. 250 ml Aceton von -15 "C vermischt. Die Lösung wurde trübe, und die Protease kristallisierte aus.
In Abständen von mehreren Stunden wurden weitere Mengen an Aceton von -15 "C zu der Lösung gegeben, bis die Acetonkonzentration ca. 30 Vol.- /o betrug und die Kristallisation der Protease beendet war.
Es wurden 50 g kristallisierte Protease mit einer Aktivität von 224 000 PUlg erhalten, was einer Ausbeute von 56 /0 entspricht. Es wurde festgestellt, dass die kristallisierte Protease die gleichen Eigenschaften hat wie die in Beispiel 1 erhaltene.
Beispiel 4
2 kg Weizenkleie wurden durch Besprühen mit 1,5 Liter Wasser befeuchtet, und die angefeuchtete Weizenkleie wurde durch 60 Minuten dauerndes Erhitzen auf 123 "C sterilisiert, und die sterilisierte Weizenkleie wurde abgekühlt. Ein Stamm von Aspergillus melleus ATCC 16 889 wurde rein kultiviert, um Saatgut zu erhalten. 10 g des Saatguts wurden mit der sterilisierten Weizenkleie vermischt, und die erhaltene Mischung wurde 120 Stunden lang bei 25 "C gehalten, um Malz zu erhalten. Das Malz wurde bei 40 "C an der Luft getrocknet, bis der Feuchtigkeitsgehalt des Malzes auf 7 % oder weniger reduziert war. Das getrocknete Malz wurde in eine mit einem Mantel versehene Säule aus rostfreiem Stahl von 8 cm Durchmesser und 100 cm Länge gefüllt.
Dann wurde Leitungswasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 100 mllStd. durch die Säule laufen gelassen, indem es am Fuss der Säule eingeleitet wurde, bis 3000 ml ausfliessendes Wasser am Kopf der Säule erhalten wurde, während 20 "C warmes Wasser durch den Mantel geleitet wurde. Es wurde festgestellt, dass das ausfliessende Wasser eine Proteaseaktivi tät von 1250 PU/ml aufwies. Das ausfliessende Wasser wurde mit etwa 100 g gepulvertem Calciumhydroxyd vermischt, und der pH-Wert des ausfliessenden Wassers wurde auf 8,5 eingestellt. Dann wurde das ausfliessende Wasser auf 5 "C abgekühlt und mit 2000 ml Isopropanol (-10 "C) versetzt.
Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, und dann 10 Minuten lang mit 10 000 U/Min. zentrifugiert, wobei eine überstehende klare Flüssigkeit erhalten wurde. 7000 ml Isopropanol von -10 "C wurden mit der überstehenden klaren Flüssigkeit 10 Minuten lang unter Rühren vermischt, und dann wurde die Mischung 10 Minuten lang gerührt und anschliessend 2 Stunden lang zum Absetzenlassen eines rohen Enzyms stehen gelassen. Das rohe Enzym wurde in 1000 ml Wasser zu einer Enzymlösung aufgelöst. Es wurde festgestellt, dass die Enzymlösung eine Proteaseaktivität von 2940 PU/ml aufwies.
500 ml des Anionenaustauschharzes Amberlite IRA-93 mit tertiären Aminogruppen wurden in eine Säule von 4 cm Durchmesser und 100 cm Länge gefüllt. Eine Stunde lang wurden 1500 ml einer 1 n Natriumhydroxydlösung durch das Anionenaustauschharz fliessen gelassen, und dann wurde das Harz mit 10 000 ml Wasser gewaschen. Anschliessend wurden 1000 ml einer 1 n Essigsäurelösung eine Stunde lang durch das Anionenaustauschharz laufen gelassen, um das Anionenaustauschharz in die Acetatform überzuführen. Zum Schluss wurde das Anionenaustauschharz in der Acetatform mit 10 000 ml Wasser gewaschen, bis der pH-Wert der ausfliessenden Flüssigkeit über 4,0 lag.
Jetzt wurde eine Stunde lang 1000 ml der Enzymlösung durch eine Säule, die mit der so erhaltenen Acetatform des Anionenaustauschharzes beschickt war, laufen gelassen, indem die Enzymlösung am Kopf der Säule aufgegeben wurde. Dann wurde reines Wasser durch die Säule laufen gelassen, bis 2000 ml Eluat aufgefangen worden waren. Es wurde festgestellt, dass das Eluat eine Proteaseaktivität von 1210 rot50 PUlml aufwies.
Das Eluat wurde auf 5 "C abgekühlt, und 100 ml des gekühlten Eluats wurden unter Rühren mit 26 ml kaltem Aceton (-10 "C) vermischt, und die Mischung wurde dann etwa 25 Stunden bei 5 "C stehen gelassen, bei 300 mg einer nadelförmigen, kristallinen, schwach alkalischen Protease erhalten wurden. Es wurde festgestellt, dass die schwach alkalische Protease eine Aktivität von 225 000 PU/g aufwies.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung einer schwach alkalischen Pro tease in kristalliner Form, dadurch gekennzeichnet, dass Protease erzeugende Aspergillusstämme auf einem flüssigen oder festen Nährmedium gezüchtet werden, dass eine Lösung der Rohprotease zur Entfernung der neben der Protease vorhandenen Verunreinigungen durch eine Schicht eines Anionenaustauschharzes in der Acetatform, das eine tertiäre Amingruppe als austauschende Gruppe aufweist, gegeben wird, dass dem Eluat zur Ausfällung der Protease ein Lösungsmittel zugesetzt wird und dass die schwach alkalische Protease aus einer Lösung des Niederschlags kristallisiert wird.
PATENTANSPRUCH II
Schwach alkalische Protease in kristalliner Form, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.