Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer schwach alkalischen Protease in kristalliner Form, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Protease erzeugende Aspergillusstämme, vorzugsweise Stämme von Aspergillus melleus, Aspergillus oryzae oder Aspergillus sojae, auf einem flüssigen oder festen Kulturmedium gezüchtet werden, dass eine Lösung der rohen Protease zur Entfernung der neben der Protease vorhandenen Verunreinigungen durch eine Schicht eines Anionenaustauschharzes in der Acetatform, das eine tertiäre Aminogruppe als austauschende Gruppe
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aufweist, gegeben wird, dass dem Eluat zur Ausfällung der Protease ein Lösungsmittel zugesetzt wird und dass die schwach alkalische Protease aus einer Lösung des Niederschlags kristallisiert wird.
Ziel der Erfindung ist ein gewerblich anwendbares Verfahren zur Herstellung kristallisierter Protease, das es gestattet, die Protease in grossem Massstab und mit hoher Ausbeute ohne Verschlechterung der Aktivität durch einfache Entfernung der in der Rohprotease vorhandenen Verunreinigungen herzustellen.
Verschiedene Verfahren, wie beispielsweise Aussalzen, Dialyse, Adsorption, Chromatographie, Elektrophorese, Gelfiltration und Ausfällung mit einem Lösungsmittel oder einem spezifischen Reagens, werden üblicherweise in Kombination miteinander zur Reinigung verschiedener Arten von Enzymen angewendet. Solche Verfahren verursachen jedoch grosse Schwierigkeiten, wenn sie auf gewerblicher Basis zur Herstellung kristallisierter Protease angewendet werden, da sie mühsam sind, die Ausbeute an Protease vermindern und erhebliche Zeit in Anspruch nehmen.
Als Beispiel für die bekannten Verfahren zur Reinigung einer schwach alkalischen Protease wird im folgenden ein Dialyseverfahren beschrieben.
Taka-Diastase, ein Enzym, das durch die Tätigkeit von Aspergillus oryzae erhalten wurde, wird zur Ausfällung von Verunreinigungen mit einer 10 /Oigen Lösung von Calciumacetat versetzt und dann nacheinander mit Aceton und Ammoniumsulfat behandelt, dem Dialyseverfahren unterworfen und endlich mit einer 2%eigen Lösung von Acrinol (oder 2-Äthoxy 6,9-diaminoacridinlactat) behandelt, um weitere Verunreinigungen, wie z. B. eine unerwünschte Protease und Amylase, zu entfernen.
Ein weiteres Beispiel für die bekannten Methoden zur Reinigung einer schwach alkalischen Protease unter Verwendung des Dialyseverfahrens wird im folgenden erläutert.
Taka-Diastase wird mit einer Lösung von Bleichacetat behandelt, mit Ammoniumsulfat ausgefällt und dann dem Dialyseverfahren zur Entfernung des Ammoniumsulfats, einem Acrinol-Fällungsverfahren zur Entfernung von Verunreinigungen, einem Adsorptionsverfahren unter Verwendung von Stärke in 40 /Oigem Alkohol zur Entfernung von Verunreinigungen und Ausfällungsverfahren unter Verwendung von Alkohol und Aceton zur Entfernung von Protease unterworfen.
Ausserdem wurden Verfahren zur Reinigung und Kristallisation zahlreicher Arten von Enzymen vorgeschlagen, wie Adsorption der Enzyme an anorganischen Adsorptionsmaterialien, wie z. B. Bentonit, Kaolin, saure Tonerde und aktive Tonerde, um die Verunreinigungen aus den Enzymen zu entfernen. Sie verwenden verschiedene Arten von Tonen, die Aluminiumsilicat als Hauptbestandteil enthalten und die in ihrer Acidität und Fähigkeit zur Adsorption der eiweissartigen Substanzen variieren. Sie können die Enzyme im sauren Zustand adsorbieren, setzen die adsorbierten Enzyme jedoch im neutralen oder schwach basischen Zustand wieder in Freiheit. Sie können in gepulvertem Zustand und bei chargenweiser Verarbeitung angewendet werden.
Als anorganisches Adsorptionsmaterial kann auch ein Calciumphosphatgel verwendet werden, es hat jedoch nicht die Fähigkeit der selektiven Adsorption des Enzyms und ist nicht wirksam.
Weiterhin wurden Verfahren zur Kristallisation von Pilzprotease durch Adsorption der Protease an organischen Adsorbenzien, wie beispielsweise Ionenaustauschharzen und insbesondere Kationenaustauschharzen, vorgeschlagen. Es ist beispielsweise bekannt, ein Copolymerisat von Methacrylsäure und Divinylbenzol, dass unter dem eingetragenen Warenzeichen Amberlite IRC-50 von Röhm und Haas vertrieben wird und einige Kationenaustauschharze, die vom Science Institute hergestellt werden, für die Reinigung und Kristallisation der alkalischen Protease, die durch Züchtung von Aspergillus sojae Stämmen hergestellt worden ist, zu verwenden.
Solche Methoden, die Kationenaustauschharze verwenden, sind jedoch für die gewerbliche Reinigung von Proteasen im grossen Massstab nicht anwendbar, da sie schwierig durchführbar sind, für die lonenaustauschharze eine grosse Menge Pufferlösung benötigen und für die Behandlung einer grossen Menge an Rohprotease nicht geeignet sind.
Es wurde in diesem Zusammenhang festgestellt, dass die Verwendung eines Anionenaustauschharzes bisher für die Reinigung der Protease nicht vorgeschlagen wurde und dass die Protease auf dem Anionenaustauschharz nicht adsorbiert wird.
Für das erfindungsgemässe Verfahren werden Anionenaustauschharze, die eine tertiäre Aminogruppe in der Acetatform aufweisen, verwendet, beispielsweise eines, das unter Verwendung von Amberlite IRA-93, das eine tertiäre Aminogruppe aufweist, hergestellt worden ist. Solch ein Anionenaustauschharz kann beispielsweise hergestellt werden, indem Styrol und Divinylbenzol zu einem Copolymerisat polymers siert werden, indem dieses Copolymerisat zur Einführung einer Methylenchloridgruppe mit chloriertem Methyläther umgesetzt wird und indem das erhaltene Reaktionsprodukt zur Bildung eines Anionenaustauschharzes, das eine tertiäre Aminogruppe enthält, mit Dimethylamin umgesetzt wird.
Es ist festzustellen, dass die Anionenaustauschharze in der Acetatform die schwach alkalische Protease nicht adsorbieren, dass sie jedoch die zusammen mit dem rohen Enzym vorkommenden Verunreinigungen adsorbieren und dass daher die Rohprotease gereinigt werden kann und dass die kristallisierte schwach alkalische Protease aus der Lösung isoliert werden kann.
Demgemäss liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung und Kristallisation einer rohen schwach alkalischen Protease, die durch Züchtung von Aspergillus-melleus-Stämmen auf einem flüssigen oder festen Kulturmedium gewonnen worden ist. Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass eine Lösung der rohen Protease durch eine Schicht eines Anionenaustauschharzes in der Acetatform gegeben wird, wodurch die neben der Protease vorhandenen Verunreinigungen aus dem ausfliessenden Medium entfernt werden, dass zu dem ausfliessendem Medium zur Ausfällung der Protease ein Lösungsmittel zugegeben wird und dass die schwach alkalische Protease aus einer Lösung des Niederschlags kristallisiert wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren weist zahlreiche Vorteile auf, die darin bestehen, dass die kristallisierte schwach alkalische Protease gewerbsmässig in grossem Massstab hergestellt werden kann, indem eine grosse Menge Rohpro tease verwendet wird, deren Aktivität nicht abgeschwächt wird, da die adsorbierte Protease nicht von dem lonenaustauschharz in Freiheit gesetzt werden muss, andere Verunreinigungen als solche, die durch Lösungsmittelbehandlung entfernt werden können und Enzyme, wie alkalische Phosphatase, saure Protease, Lipase und andere, entfernt werden können und es ausserdem möglich ist, solche technischen Verfahrensschritte, wie Aussalzen, Dialyse, Adsorption, Chromatographie und Ausfällen mit Acrinol, die bei der Durchführung der herkömmlichen Verfahren zur Kristallisation der Enzyme unerlässlich sind, wegzulassen.
Die für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung des Anionenaustauschharzes verwendete Protease enthält eine grosse Menge an schwach alkalischer Protease und kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden.
Ein Aspergillus-melleus-Stamm wird zur Herstellung eine Kleie verwendet, und die Kleie wird in einem Extraktionstank mit Wasser extrahiert, und der Extrakt wird anschliessend unter Verwendung einer Filterpresse gefiltert, um einen klaren Extrakt zu erhalten. Der klare Extrakt wird unter Rühren zum dreifachen Volumen an Äthanol (95 Vol.- /0) gegeben, und die Mischung wird zur Vervollständigung der Ausfällung des Enzyms 4-5 Std. lang stehen gelassen. Die obere klare Schicht des Äthanols wird abgegossen, und das ausgefällte Enzym wird mit Äthanol (95 Vol.-01o) gewaschen. Das Waschen wird 5-6mal wiederholt, und das Äthanol wird unter Verwendung einer Zentrifuge abgetrennt, wobei ein rohres Enzym erhalten wird.
Die rohe Protease wird in Wasser gelöst, und die erhaltene Lösung wird durch eine Schicht eines Anionenaustauschharzes in der Acetatform gegeben, um die schwach alkalische Protease zu isolieren.
Ein Verfahren zur Messung der Proteaseaktivität wird im folgenden erläutert.
Eine Mutterlösung, die 0,6 % Milchcasein enthält, wurde durch Erwärmen des Milchcaseins in eine 0,1 m Na2H PO4-KH2PO4-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 hergestellt Die 0,1 m Na2HPO4-KH2PO4-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 wurde auch zur Herstellung einer Enzymlösung, die schwach alkalische Protease enthält, verwendet.
5 ml der Mutterlösung wurden 5 Minuten lang in einen auf 37 "C eingestellten Thermostaten gestellt, und dann wurde 1 ml der Enzymlösung zu der Mutterlösung gegeben; die erhaltene Mischung wurde 10 Minuten lang auf 37 "C gehalten, um die Umsetzung zwischen der Protease und dem Milchcasein zu ermöglichen, dann wurde sie zur Ausfällung nicht umgesetzten Proteins mit 5 ml Trichloressigsäurelösung (hergestellt durch Vermischen von 0,11 Mol CCl3COOH, 0,22 Mol CH3COONa und 0,33 Mol CH3COOH mit 1000 ml Wasser) vermischt. Die erhaltene Mischung wurde durch ein Papierfilter filtriert, und 2 ml des Filtrats wurden zu 5 ml 0,55 m Lösung von Natriumcarbonat gegeben.
Dann wurde die erhaltene Mischung mit 1 ml Folins Reagens, das vorher mit Wasser auf das Dreifache seines Volumens verdünnt worden war, vermischt, wodurch eine Farbentwicklung der erhaltenen Mischung erfolgte. Die Dichte der Farbentwicklung wurde durch 30 Minuten langes Erwärmen der erhaltenen Mischung auf 37 OC konstant gemacht, und die Aktivität der schwach alkalischen Protease wurde durch Messen der Lichtabsorption der erhaltenen Mischung bei 660 nm bestimmt.
Die Aktivität wird in Einheiten (PU) angegeben, das ist die Menge an Enzym, die erforderlich ist, Peptid eine Minute zu isolieren, das in Trichloressigsäurelösung löslich ist und 10 um Tyrosin entspricht.
Es ist festzustellen, dass das Anionenaustauschharz in der Acetatform im Vergleich mit einem Anionenaustauschharz in der Sulfat-, Chlorid- oder Phosphatform eine ausgezeichnete Fähigkeit aufweist, die schwach alkalische Protease selektiv nicht zu adsorbieren und dass daher das Anionenaustauschharz in der Acetatform eine hohe Ausbeute an schwach alkalischer Protease ergibt. Die Eigenschaften der oben erwähnten Anionenaustauschharze werden auf folgende Weise miteinander verglichen.
200 ml eines Anionenaustauschharzes vom Hydroxyltyp, das unter dem eingetragenen Warenzeichen Amberlite IRA-93 von Röhm und Haas hergestellt und verkauft wird, werden in je eine der fünf mit den Nummern 1 bis 5 bezeich- neten Säulen der folgenden Tabelle gegeben. Die Säule besteht aus einem Acrylharz und hat einen Durchmesser von 2,04 cm. Durch die Säulen Nr. 1 bis 4 mit Anionenaustauschharz in der Hydroxylform werden 500 ml 0,2 n Essigsäure, 0,2 n Schwefelsäure, 0,2 n Salzsäure und 0,2 n Phosphorsäure mit einer Fliessgeschwindigkeit von 900 ml/Std. gegeben, und dann wird das Anionenaustauschharz mit 4 Litern destilliertem Wasser gewaschen.
Das Anionenaustauschharz in der Hydroxylform, das in die Säule Nr. 5 gegeben ist, wird mit keiner Säure behandelt, sondern mit Wasser gewaschen, daher bleibt das Harz unverändert
Die oben erwähnte Rohprotease wird in Wasser gelöst, und durch jede der 5 Säulen werden mit einer Fliessgeschwindigkeit von 900 mUStd. 2 Liter dieser wässrigen Lösung gegeben. Das ausfliessende Medium aus jeder der 5 Säulen wird auf den Proteasegehalt untersucht. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle I angegeben.
Tabelle I Nr. der Art pH-Wert der Proteasegehalt Säule des Harzes Lösung im Eluat(%) 1 Acetatform 5,1 100 2 Sulfatform 2,5 0 3 Chloridform 4,0 45 4 Phosphatform 2,8 0 5 Hydroxylform 9,8 76
Aus der Tabelle list ersichtlich, dass das Anionenaustauschharz in der Acetattyp ein Eluat liefert, das die Protease in hohem Prozentsatz enthält, und das Eluat wird mit einem Lösungsmittel wie Methanol und Acrinol, behandelt oder dem Ausfällungsverfahren unterworfen, und der Proteaseniederschlag wird in Wasser gelöst, und die kristallisierte Protease wird durch Zugabe eines Lösungsmittels, wie Aceton, zur wässrigen Lösung der Protease isoliert.
Tabelle II
Kennzeichnende Eigenschaften der kristallisierten, schwachalkalischen Protease Spezifische Aktivität 240 pH-Optimum 8,0 Temperatur-Optimum 45 "C pH-Stabilität 3,0-11,2 Hitzestabilität 40-65 "C Druckstabilität 70 % Hydrolyseverhältnis 80 % Isoelektrischer Punkt 6,5 Aktivitätszentrum serine Absorptionsmaximum 280 nm Absorptionsminimum 251 nm Extinktionskoeffizient 11,5 Isosbestischer Punkt 273 nm, 280 nm Sedimentationskoeffizient (So2o,w) 2,98 x 10-s3 sec.
Diffusionskoeffizient (D020.w) 8,75 x 10-7cm2!sec.
Partielles spezifisches Volumen 0,728 Molekulargewicht (Msd) 30 300
In Tabelle II wird die spezifische Aktivität unter Anwendung der Kjeldahl-Methode bestimmt; sie gibt die Aktivität der Protease pro 1 mg Protein an. Das pH-Optimum gibt den pH-Wert der Mutterlösung an, bei dem die Aktivität der Protease ein Maximum hat; die Messungen erfolgen durch Veränderung des pH-Wertes der Mutterlösung durch Zugabe von Britto-Robinson-Pufferlösung. Das Temperaturoptimum gibt die Reaktionstemperatur an, bei der die Protease die grösste Aktivität entwickelt; die Messungen erfolgen, indem die Aktivität der Protease bestimmt wird, wobei lediglich die Reaktionstemperatur verändert wird.
Die pH-Stabilität gibt den pH-Bereich an, in dem die Restaktivität der Protease zu mehr als 90 % beibehalten wird, nachdem die Enzymlösung, die 0,1 % der kristallisierten, schwach alkalischen Protease gelöst in der Britton-Robinson-Pufferlösung bei unterschiedlichen pH-Werten enthält, 30 Minuten lang bei 20 OC stehen gelassen worden ist. Die Hitzestabilität gibt den Temperaturbereich an, in dem die Restaktivität an Protease von 98 % auf 0 vermindert wird, nachdem die wässrige Lösung, die 0,1 /0 der kristallisierten, schwach alkalischen Protease enthält, 30 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen aufbewahrt worden ist.
Die Druckstabilität gibt die Restaktivität an Protease an, die verbleibt, nachdem die wässrige Lösung, die 4 % der kristallisierten, schwach alkalischen Protease enthält, 20 Minuten lang bei 20 "C unter Hochdruck von 9000 Atmosphären aufbewahrt worden ist. Der Extinktionskoeffizient gibt die Absorption der wässrigen Lösung, die 1 % der kristallisierten, schwach alkalischen Protease enthält, bei 280 nm an. Das Hydrolyseverhältnis wird aus den nach der Ninhydrinreaktion mittels den Aminoradikalen bestimmt, die sich aus Milchcasein bei der Durchführung des Verfahrens zur Messung der Aktivität von Protease nach 100 Stunden bei 37 "C unter Verwendung der kristallisierten, schwach alkalischen Protease mit einer Aktivität von 10 PU/ml bilden.
Tabelle III
Einfluss von Metallsalzen auf die Aktivität von Proteasen Salze Konzentration Relative (in Mol) Aktivität Keine (Vergleich) 100 Natriumchlorid 0,01 106 Calciumchlorid 0,01 105 Cobalt(IISchlorid 0,01 96 Nickelsulfat 0,01 92 Zinksulfat 0,01 98 Kupfer(IISsulfat 0,01 96 Eisen(IISsulfat 0,01 91 Manganchlorid 0,01 92 Bleiacetat 0,01 98 Cadmiumchlorid 0,01 96 Quecksilber(IIpchlorid 0,01 3 Silbernitrat 0,01 46
Zur Bestimmung der Proteaseaktivität gemäss Tabelle III wurde die Mutterlösung jeweils hergestellt, indem eine 0,1 m Tris(hydroxymethylaminomethan-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) anstelle der 0,1 m Na2HPO4-KH2PO4-Pufferlösung verwendet wurde.
Die 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-amino- methan-HC1-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) wurde auch zur Herstellung einer Enzymlösung, die 0,01 mg der kristallisierten, schwach alkalischen Protease pro ml Enzymlösung enthielt, verwendet. 5 ml der Mutterlösung wurden mit 1 ml einer wässrigen Lösung, die 0,07 Mol des in Tabelle III angegebenen Metallsalzes enthielt, vermischt, und die erhaltene Mischung wurde 5 Minuten lang bei 37 "C erhitzt und dann wurde 1 ml der Mutterlösung zugesetzt, um die Proteaseaktivität zu bestimmen. Die Proteaseaktivität ist als relative Ak Aktivität angegeben; sie ist im Vergleich zur Proteaseaktivität 100 angegeben; die erhalten wird, wenn 1 ml reines Wasser anstelle von 1 ml der wässrigen Lösung, die 0,07 Mol des jeweiligen Metallsalzes enthält, verwendet wird.
Tabelle IV
Einfluss einiger Inhibitoren auf die
Proteaseaktivität Inhibitoren Konzentration Rest (in Mol) aktivität Kein (Vergleich) 100 Dinatriumäthylendiamintetraessigsäure 0,011 96 Kaliumpermanganat 0,011 98 Jod 0,011 0 Natriumthioglykolat 0,011 103 Natriumthiosulfat 0,011 100 Natriumascorbat 0,011 98 LCystein 0,011 95 Kaliumcyanid 0,011 98 Natrium-pchlormercuri- benzoat 0,0011 97 Natriummonojodacetat 0,011 95 N-Bromsuccinimid 0,011 8 Natriumlaurylsulfat 0,011 96 Kartoffel-Trypsin-lnhibitor 0,1 010 2 Diisopropylfluorophosphat 0,0011 15
Für die Angaben in Tabelle IV wurden Enzymlösungen hergestellt, die 1 % kristallisierte schwach alkalische Protease enthielten,
indem die Protease in einer 0,1 m Tris(hy- droxymethylpaminomethan-HCI-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 aufgelöst wurde. Ausserdem wurden Inhibitorlösungen, die jeweils die in Tabelle IV angegebenen Inhibitoren in Molkonzentrationen enthielten, hergestellt, indem die entsprechenden Inhibitoren in 0,1 m Tris-(hydroxymethyl > aminomethan-HC1-Pufferlösung (pH-Wert 8,0) gelöst wurden.
Dann wurde 1 ml Enzymlösung zu 9 ml Inhibitorlösung gegeben, und die erhaltene Mischung wurde 10 Minuten bei 20 "C gehalten und dann mit reinem Wasser verdünnt, so dass das 100fache Volumen erhalten wurde. Die Restaktivität der verdünnten Enzymlösung wurde nach der in Punkt V angegebenen Methode zur Messung der Aktivität von Protease bestimmt.
Die Restaktivität der verdünnten Enzymlösung wurde zu 100 angenommen, wenn 9 ml der 0,1 m TrisChydroxymethylS aminomethan-Pufferlösung anstelle der Inhibitorlösung verwendet wurden.
Die kristallisierte schwach alkalische Protease wurde analysiert und es wurde eine Zusammensetzung festgestellt, die unten in Tabelle V als Molverhältnisse der Aminosäuren angegeben ist.
Tabelle V
Zusammensetzung der Schwach alkalischen Protease in Molverhältnissen der Aminosäuren l Asp. r36 Gly. 45 Glu. 18 Ala. 46 Arg. 2 Val. 33 His. 2 Ile. 15 Lys. 5 Leu. 21 Ser. 37 Pro. 9 Thr. 25 Halb-Cys. 0 Tyr. 11 Met. 0 Trp. 2 Amid-NH3 16 Phe. 7
Im folgenden werden an Hand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens näher erläutert. Die in den Beispielen verwendete Roh- protease wurde in gleicher Weise wie oben erwähnt gewonnen.
Beispiel 1
1 kg einer Rohprotease, die eine schwach alkalische Protease enthält und eine Aktivität von 95 000 PU/g hat und die unter dem eingetragenen Warenzeichen Prozym vom Patentinhaber hergestellt und verkauft wird, wurde in 20 Litern Wasser zu der zu reinigenden wässrigen Lösung gelöst.
5 Liter eines schwach basischen Anionenaustauschharzes, das unter dem eingetragenen Warenzeichen Amberlite IRA-93 von Röhm und Haas hergestellt und verkauft wird, wurden in eine Acrylharzsäule von 12 cm Durchmesser und 100 cm Länge gefüllt, und dann wurden 10 Liter einer 0,5 n Essigsäure durch die Säule laufen gelassen, um das Harz in die Acetatform zu überführen; anschliessend wurde das Harz mit 50 Liter Wasser gewaschen, bis die ausfliessende Flüssigkeit einen pH-Wert von mehr als 4,0 aufweist. Die wässrige Lösung der Rohprotease wurde mit einer Fliessgeschwindigkeit von 15 Litern pro Stunde durch die Harzsäule laufen gelassen.
Das erhaltene Eluat wurde mit 45 Litern Äthanol (9501zig) gemischt und zur Ausfällung des Proteaseniederschlags bei -15 "C gehalten; der Niederschlag wurde in 6 Litern Wasser gelöst, die erhaltene wässrige Lösung wurde auf 5 C abgekühlt, und 1,5 Liter Aceton wurden bei -15 "C zugegeben, bis eine leichte Trübung in der wässrigen Lösung auftrat, und die erhaltene Mischung wurde über Nacht bei -15 "C in einem Kühlraum aufbewahrt. Die Kristal lisation der Protease wurde durch langsame Zugabe von Aceton bei -15 "C beendet; die Zugabe des Acetons erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 0,2 Liter pro Tag, bis die Konzentration in der Mischung 30 /0 betrug.
Es wurden 300 g kristallisierte Protease mit einer Aktivität von 222 000 PU/g erhalten, was einer Ausbeute von 70 /0 entspricht. Die Eigenschaften der kristallisierten Protease sind aus den Tabellen I bis V ersichtlich.
Beispiel 2
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde zur Herstellung eines Eluats wiederholt. Dann wurde das Eluat mit Äthanol (9501zig) vermischt, um einen Proteaseniederschlag zu erhalten; anschliessend wurde der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein weisses Pulver mit einer Aktivität von 200 000 PU/g erhalten wurde. 100 g dieses weissen Pulvers wurden in 2 Liter Wasser gelöst, und die wässrige Lösung wurde auf 5 "C abgekühlt, woraufhin Aceton von einer Temperatur von -15 "C zu der wässrigen Lösung gegeben wurde, bis die Konzentration an Aceton 20 Vol.-% betrug; die erhaltene Mischung wurde 3 Tage lang bei 0 "C stehen gelassen. Nach mehreren Stunden begann die Kristallisation der Protease.
In Abständen von ca. 20 Stunden wurde Aceton von -15 "C zu der Mischung gegeben, bis die Gesamtkonzentration des Acetons in der Mischung ca. 30 Vol.-01o betrug.
Es wurden 63 g kristallisierte Protease mit einer Aktivität von 226 000 PU/g erhalten, was einer Ausbeute von 71 % entspricht. Es wurde festgestellt, dass die kristallisierte Protease die gleichen Eigenschaften hat wie die gemäss Beispiel 1 erhaltene.
Beispiel 3
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren zur Herstellung eines Eluats wurde wiederholt. Das Eluat wurde dann zur Ausfällung der Protease mit 95 /0igem Alkohol versetzt, und der Niederschlag wurde unter verminderten Druck getrocknet, wobei ein weisses Pulver mit einer Aktivität von 200 000 PU/g erhalten wurde. 100 g dieses weissen Pulvers wurden in 2 Liter Wasser gelöst, und 300 ml einer 1 /0igen Lösung von Acrinol wurde zu der wässrigen Lösung gegeben, wodurch ein brauner Niederschlag erhalten wurde, der in einer Zentrifuge abgetrennt wurde; dann wurden 1000 ml einer 1 /0igen Lösung von Acrinol zu der überstehenden Lösung gegeben.
Der erhaltene Niederschlag von schöner gelber Farbe wurde abzentrifugiert, und der Niederschlag wurde in einer kleinen Menge (ca. 1 Liter) einer 1 molaren Lösung von Natriumacetat (pH-Wert = 6,0) aufgelöst, und die Lösung wurde mit dem doppelten Volumen an 95 /0igem Äthanol vermischt und bei -15 "C gehalten, um einen weiteren Niederschlag auszufällen, der wiederum abzentrifugiert wurde. Der frische Niederschlag wurde in ca. 1 Liter einer 0,002 molaren Lösung von Calciumacetat aufgelöst und die Lösung wurde mit ca. 250 ml Aceton von -15 "C vermischt. Die Lösung wurde trübe, und die Protease kristallisierte aus.
In Abständen von mehreren Stunden wurden weitere Mengen an Aceton von -15 "C zu der Lösung gegeben, bis die Acetonkonzentration ca. 30 Vol.- /o betrug und die Kristallisation der Protease beendet war.
Es wurden 50 g kristallisierte Protease mit einer Aktivität von 224 000 PUlg erhalten, was einer Ausbeute von 56 /0 entspricht. Es wurde festgestellt, dass die kristallisierte Protease die gleichen Eigenschaften hat wie die in Beispiel 1 erhaltene.
Beispiel 4
2 kg Weizenkleie wurden durch Besprühen mit 1,5 Liter Wasser befeuchtet, und die angefeuchtete Weizenkleie wurde durch 60 Minuten dauerndes Erhitzen auf 123 "C sterilisiert, und die sterilisierte Weizenkleie wurde abgekühlt. Ein Stamm von Aspergillus melleus ATCC 16 889 wurde rein kultiviert, um Saatgut zu erhalten. 10 g des Saatguts wurden mit der sterilisierten Weizenkleie vermischt, und die erhaltene Mischung wurde 120 Stunden lang bei 25 "C gehalten, um Malz zu erhalten. Das Malz wurde bei 40 "C an der Luft getrocknet, bis der Feuchtigkeitsgehalt des Malzes auf 7 % oder weniger reduziert war. Das getrocknete Malz wurde in eine mit einem Mantel versehene Säule aus rostfreiem Stahl von 8 cm Durchmesser und 100 cm Länge gefüllt.
Dann wurde Leitungswasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 100 mllStd. durch die Säule laufen gelassen, indem es am Fuss der Säule eingeleitet wurde, bis 3000 ml ausfliessendes Wasser am Kopf der Säule erhalten wurde, während 20 "C warmes Wasser durch den Mantel geleitet wurde. Es wurde festgestellt, dass das ausfliessende Wasser eine Proteaseaktivi tät von 1250 PU/ml aufwies. Das ausfliessende Wasser wurde mit etwa 100 g gepulvertem Calciumhydroxyd vermischt, und der pH-Wert des ausfliessenden Wassers wurde auf 8,5 eingestellt. Dann wurde das ausfliessende Wasser auf 5 "C abgekühlt und mit 2000 ml Isopropanol (-10 "C) versetzt.
Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, und dann 10 Minuten lang mit 10 000 U/Min. zentrifugiert, wobei eine überstehende klare Flüssigkeit erhalten wurde. 7000 ml Isopropanol von -10 "C wurden mit der überstehenden klaren Flüssigkeit 10 Minuten lang unter Rühren vermischt, und dann wurde die Mischung 10 Minuten lang gerührt und anschliessend 2 Stunden lang zum Absetzenlassen eines rohen Enzyms stehen gelassen. Das rohe Enzym wurde in 1000 ml Wasser zu einer Enzymlösung aufgelöst. Es wurde festgestellt, dass die Enzymlösung eine Proteaseaktivität von 2940 PU/ml aufwies.
500 ml des Anionenaustauschharzes Amberlite IRA-93 mit tertiären Aminogruppen wurden in eine Säule von 4 cm Durchmesser und 100 cm Länge gefüllt. Eine Stunde lang wurden 1500 ml einer 1 n Natriumhydroxydlösung durch das Anionenaustauschharz fliessen gelassen, und dann wurde das Harz mit 10 000 ml Wasser gewaschen. Anschliessend wurden 1000 ml einer 1 n Essigsäurelösung eine Stunde lang durch das Anionenaustauschharz laufen gelassen, um das Anionenaustauschharz in die Acetatform überzuführen. Zum Schluss wurde das Anionenaustauschharz in der Acetatform mit 10 000 ml Wasser gewaschen, bis der pH-Wert der ausfliessenden Flüssigkeit über 4,0 lag.
Jetzt wurde eine Stunde lang 1000 ml der Enzymlösung durch eine Säule, die mit der so erhaltenen Acetatform des Anionenaustauschharzes beschickt war, laufen gelassen, indem die Enzymlösung am Kopf der Säule aufgegeben wurde. Dann wurde reines Wasser durch die Säule laufen gelassen, bis 2000 ml Eluat aufgefangen worden waren. Es wurde festgestellt, dass das Eluat eine Proteaseaktivität von 1210 rot50 PUlml aufwies.
Das Eluat wurde auf 5 "C abgekühlt, und 100 ml des gekühlten Eluats wurden unter Rühren mit 26 ml kaltem Aceton (-10 "C) vermischt, und die Mischung wurde dann etwa 25 Stunden bei 5 "C stehen gelassen, bei 300 mg einer nadelförmigen, kristallinen, schwach alkalischen Protease erhalten wurden. Es wurde festgestellt, dass die schwach alkalische Protease eine Aktivität von 225 000 PU/g aufwies.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung einer schwach alkalischen Pro tease in kristalliner Form, dadurch gekennzeichnet, dass Protease erzeugende Aspergillusstämme auf einem flüssigen oder festen Nährmedium gezüchtet werden, dass eine Lösung der Rohprotease zur Entfernung der neben der Protease vorhandenen Verunreinigungen durch eine Schicht eines Anionenaustauschharzes in der Acetatform, das eine tertiäre Amingruppe als austauschende Gruppe aufweist, gegeben wird, dass dem Eluat zur Ausfällung der Protease ein Lösungsmittel zugesetzt wird und dass die schwach alkalische Protease aus einer Lösung des Niederschlags kristallisiert wird.
PATENTANSPRUCH II
Schwach alkalische Protease in kristalliner Form, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
The invention relates to a method for producing a weakly alkaline protease in crystalline form, which is characterized in that protease-producing Aspergillus strains, preferably strains of Aspergillus melleus, Aspergillus oryzae or Aspergillus sojae, are grown on a liquid or solid culture medium that a solution of the crude protease to remove the impurities present in addition to the protease through a layer of an anion exchange resin in the acetate form, which has a tertiary amino group as an exchange group
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is given that a solvent is added to the eluate to precipitate the protease and that the weakly alkaline protease is crystallized from a solution of the precipitate.
The aim of the invention is an industrially applicable process for the production of crystallized protease, which makes it possible to produce the protease on a large scale and with high yield without deteriorating the activity by simply removing the impurities present in the crude protease.
Various methods such as salting out, dialysis, adsorption, chromatography, electrophoresis, gel filtration and precipitation with a solvent or a specific reagent are usually used in combination with each other to purify various kinds of enzymes. However, such methods cause great difficulty when used commercially for the production of crystallized protease because they are cumbersome, reduce the yield of protease and take a considerable amount of time.
A dialysis process is described below as an example of the known processes for purifying a weakly alkaline protease.
Taka diastase, an enzyme obtained through the activity of Aspergillus oryzae, is mixed with a 10% solution of calcium acetate to precipitate impurities and then treated successively with acetone and ammonium sulfate, subjected to the dialysis process and finally with a 2% own Solution of acrinol (or 2-ethoxy 6,9-diaminoacridine lactate) treated to remove other impurities, such as. B. an unwanted protease and amylase to remove.
Another example of the known methods for purifying a weakly alkaline protease using the dialysis method is explained below.
Taka diastase is treated with a solution of bleach acetate, precipitated with ammonium sulfate, and then subjected to the dialysis process to remove the ammonium sulfate, an acrinol precipitation process to remove impurities, an adsorption process using starch in 40% alcohol to remove impurities, and precipitation processes Subjected to use of alcohol and acetone to remove protease.
In addition, methods have been proposed for purifying and crystallizing various types of enzymes, such as adsorbing the enzymes on inorganic adsorbent materials such as e.g. B. bentonite, kaolin, acid clay and active clay to remove the impurities from the enzymes. They use different types of clays, which contain aluminum silicate as a main component and which vary in their acidity and ability to adsorb the protein-like substances. They can adsorb the enzymes in the acidic state, but set the adsorbed enzymes free again in the neutral or weakly basic state. They can be used in a powdered state and in batch processing.
Calcium phosphate gel can also be used as the inorganic adsorbent material, but it does not have the ability of selectively adsorbing the enzyme and is ineffective.
Furthermore, methods for crystallizing fungal protease by adsorbing the protease on organic adsorbents such as ion exchange resins and particularly cation exchange resins have been proposed. It is known, for example, a copolymer of methacrylic acid and divinylbenzene that is sold under the registered trademark Amberlite IRC-50 by Röhm and Haas and some cation exchange resins that are manufactured by the Science Institute, for the purification and crystallization of the alkaline protease, which is produced by cultivation produced by Aspergillus sojae strains.
Such methods using cation exchange resins, however, cannot be used for the commercial purification of proteases on a large scale because they are difficult to carry out, require a large amount of buffer solution for the ion exchange resins and are not suitable for the treatment of a large amount of crude protease.
In this connection, it has been found that the use of an anion exchange resin for the purification of the protease has not been suggested so far and that the protease is not adsorbed on the anion exchange resin.
For the process of the present invention, anion exchange resins having a tertiary amino group in the acetate form are used, for example one which has been prepared using Amberlite IRA-93 having a tertiary amino group. Such an anion exchange resin can be produced, for example, by styrene and divinylbenzene being polymerized to form a copolymer, by reacting this copolymer with chlorinated methyl ether to introduce a methylene chloride group and by reacting the reaction product obtained with dimethylamine to form an anion exchange resin containing a tertiary amino group becomes.
It should be noted that the anion exchange resins in the acetate form do not adsorb the weakly alkaline protease, but they do adsorb the impurities coexisting with the crude enzyme and therefore the crude protease can be purified and the crystallized weakly alkaline protease can be isolated from the solution .
Accordingly, the present invention provides a method for purifying and crystallizing a crude weakly alkaline protease obtained by culturing Aspergillus melleus strains on a liquid or solid culture medium. The method according to the invention consists in that a solution of the crude protease is passed through a layer of an anion exchange resin in the acetate form, whereby the impurities present in addition to the protease are removed from the outflowing medium, that a solvent is added to the outflowing medium to precipitate the protease and that the weakly alkaline protease is crystallized from a solution of the precipitate.
The inventive method has numerous advantages, which consist in the fact that the crystallized weakly alkaline protease can be produced commercially on a large scale by using a large amount of crude protease, the activity of which is not weakened because the adsorbed protease is not in the ion exchange resin Freedom must be set, other impurities than those that can be removed by solvent treatment and enzymes such as alkaline phosphatase, acidic protease, lipase and others, and it is also possible to use such technical process steps as salting out, dialysis, adsorption, To omit chromatography and precipitation with acrinol, which are essential when performing conventional methods of crystallizing the enzymes.
The protease used for carrying out the method according to the invention using the anion exchange resin contains a large amount of weakly alkaline protease and can be produced, for example, as follows.
A strain of Aspergillus melleus is used to prepare a bran, and the bran is extracted in an extraction tank with water, and the extract is then filtered using a filter press to obtain a clear extract. The clear extract is added to three times the volume of ethanol (95 vol / 0) with stirring, and the mixture is left to stand for 4-5 hours to complete the precipitation of the enzyme. The upper clear layer of the ethanol is poured off and the precipitated enzyme is washed with ethanol (95 vol. 01o). The washing is repeated 5-6 times and the ethanol is separated using a centrifuge to obtain a crude enzyme.
The crude protease is dissolved in water and the resulting solution is passed through a layer of an anion exchange resin in the acetate form to isolate the weakly alkaline protease.
A method of measuring protease activity is explained below.
A mother solution containing 0.6% milk casein was prepared by warming the milk casein in a 0.1 M Na2H PO4-KH2PO4 buffer solution with a pH of 8.0. The 0.1 M Na2HPO4-KH2PO4 buffer solution with a pH 8.0 was also used to prepare an enzyme solution containing weakly alkaline protease.
5 ml of the mother solution was placed in a thermostat set at 37 "C for 5 minutes, and then 1 ml of the enzyme solution was added to the mother solution; the resulting mixture was kept at 37" C for 10 minutes to allow the reaction between the protease and To allow the milk casein to precipitate unreacted protein, it was mixed with 5 ml of trichloroacetic acid solution (prepared by mixing 0.11 mol of CCl3COOH, 0.22 mol of CH3COONa and 0.33 mol of CH3COOH with 1000 ml of water). The resulting mixture was filtered through a paper filter, and 2 ml of the filtrate was added to 5 ml of 0.55 M solution of sodium carbonate.
Then, the resulting mixture was mixed with 1 ml of Folin's reagent previously diluted with water three times its volume, whereby the resulting mixture was color-developed. The density of color development was made constant by heating the obtained mixture at 37 ° C. for 30 minutes, and the activity of the weakly alkaline protease was determined by measuring the light absorption of the obtained mixture at 660 nm.
The activity is given in units (PU), that is the amount of enzyme which is required to isolate peptide in one minute which is soluble in trichloroacetic acid solution and corresponds to 10 µm tyrosine.
It is found that the anion exchange resin in the acetate form has an excellent ability not to selectively adsorb the weakly alkaline protease, compared with an anion exchange resin in the sulfate, chloride or phosphate form, and therefore the anion exchange resin in the acetate form has a high yield of weak alkaline protease results. The properties of the above-mentioned anion exchange resins are compared with each other in the following manner.
200 ml of an anion exchange resin of the hydroxyl type, manufactured and sold under the registered trademark Amberlite IRA-93 by Röhm and Haas, are placed in each of the five columns labeled with the numbers 1 to 5 in the following table. The column is made of an acrylic resin and has a diameter of 2.04 cm. Through columns no. 1 to 4 with anion exchange resin in the hydroxyl form, 500 ml of 0.2 N acetic acid, 0.2 N sulfuric acid, 0.2 N hydrochloric acid and 0.2 N phosphoric acid are transferred at a flow rate of 900 ml / hour. and then the anion exchange resin is washed with 4 liters of distilled water.
The anion exchange resin in the hydroxyl form put in the No. 5 column is not treated with acid but washed with water, so the resin is left unchanged
The above-mentioned crude protease is dissolved in water, and through each of the 5 columns at a flow rate of 900 mUStd. Add 2 liters of this aqueous solution. The medium flowing out from each of the 5 columns is examined for the protease content. The results are given in Table I below.
Table I No. of the type pH value of the protease content column of the resin solution in the eluate (%) 1 acetate form 5.1 100 2 sulfate form 2.5 0 3 chloride form 4.0 45 4 phosphate form 2.8 0 5 hydroxyl form 9.8 76
It can be seen from Table list that the anion exchange resin in the acetate type gives an eluate containing the protease in a high percentage, and the eluate is treated with a solvent such as methanol and acrinol or subjected to the precipitation process, and the protease precipitate is dissolved in water, and the crystallized protease is isolated by adding a solvent such as acetone to the aqueous solution of the protease.
Table II
Characteristic properties of the crystallized, weakly alkaline protease Specific activity 240 pH optimum 8.0 Temperature optimum 45 "C pH stability 3.0-11.2 Heat stability 40-65" C Pressure stability 70% hydrolysis ratio 80% Isoelectric point 6.5 Activity center serine absorption maximum 280 nm absorption minimum 251 nm extinction coefficient 11.5 isosbestic point 273 nm, 280 nm sedimentation coefficient (So2o, w) 2.98 x 10-s3 sec.
Diffusion coefficient (D020.w) 8.75 x 10-7cm2! Sec.
Partial Specific Volume 0.728 Molecular Weight (Msd) 30 300
In Table II the specific activity is determined using the Kjeldahl method; it indicates the activity of the protease per 1 mg of protein. The pH optimum indicates the pH of the mother solution at which the activity of the protease has a maximum; the measurements are made by changing the pH of the mother solution by adding Britto-Robinson buffer solution. The temperature optimum indicates the reaction temperature at which the protease develops the greatest activity; the measurements are made by determining the activity of the protease, only changing the reaction temperature.
The pH stability indicates the pH range in which the residual activity of the protease is retained to more than 90% after the enzyme solution, the 0.1% of the crystallized, weakly alkaline protease dissolved in the Britton-Robinson buffer solution at different pH values has been left to stand at 20 ° C for 30 minutes. The heat stability indicates the temperature range in which the residual activity of protease is reduced from 98% to 0 after the aqueous solution containing 0.1 / 0 of the crystallized, weakly alkaline protease has been stored for 30 minutes at various temperatures.
The pressure stability indicates the residual activity of protease which remains after the aqueous solution, which contains 4% of the crystallized, weakly alkaline protease, has been stored for 20 minutes at 20 ° C. under a high pressure of 9000 atmospheres. The extinction coefficient indicates the absorption of the aqueous solution containing 1% of the crystallized, weakly alkaline protease at 280 nm. The hydrolysis ratio is determined from the after the ninhydrin reaction by means of the amino radicals that result from milk casein when carrying out the method for measuring the activity of protease after 100 hours at 37 "C using the crystallized, weakly alkaline protease with an activity of 10 PU / ml.
Table III
Influence of metal salts on the activity of proteases Salts Concentration Relative (in mol) Activity None (comparison) 100 Sodium chloride 0.01 106 Calcium chloride 0.01 105 Cobalt (II chloride 0.01 96 Nickel sulphate 0.01 92 Zinc sulphate 0.01 98 Copper ( IIS sulfate 0.01 96 iron (IIS sulfate 0.01 91 manganese chloride 0.01 92 lead acetate 0.01 98 cadmium chloride 0.01 96 mercury (IIpchloride 0.01 3 silver nitrate 0.01 46
To determine the protease activity according to Table III, the mother solution was prepared by using a 0.1 M tris (hydroxymethylaminomethane-HCl buffer solution (pH 8.0) instead of the 0.1 M Na2HPO4-KH2PO4 buffer solution.
The 0.1 M tris (hydroxymethyl) amino methane HCl buffer solution (pH 8.0) was also used to prepare an enzyme solution which contained 0.01 mg of the crystallized, weakly alkaline protease per ml of enzyme solution . 5 ml of the mother liquor was mixed with 1 ml of an aqueous solution containing 0.07 mol of the metal salt shown in Table III, and the resulting mixture was heated at 37 "C for 5 minutes and then 1 ml of the mother liquor was added to The protease activity is given as the relative Ak activity; it is given in comparison to the protease activity 100; which is obtained when 1 ml of pure water instead of 1 ml of the aqueous solution containing 0.07 mol of the respective metal salt, is used.
Table IV
Influence of some inhibitors on the
Protease activity Inhibitors Concentration Residual (in mol) activity None (comparison) 100 Disodium ethylenediaminetetraacetic acid 0.011 96 Potassium permanganate 0.011 98 Iodine 0.011 0 Sodium thioglycolate 0.011 103 Sodium thiosulphate 0.011 100 Sodium ascorbate 0.011 98 L-cysteine 0.011 95 Potassium cyanide 0.011 97 Sodium monooyodiacetate 0.011 97 Sodium benzoacetate N-bromosuccinimide 0.011 8 sodium lauryl sulfate 0.011 96 potato trypsin inhibitor 0.1 010 2 diisopropyl fluorophosphate 0.0011 15
For the information in Table IV, enzyme solutions were prepared containing 1% crystallized weakly alkaline protease,
by dissolving the protease in a 0.1 M tris (hydroxymethylpaminomethane-HCl buffer solution with a pH value of 8.0. In addition, inhibitor solutions each containing the inhibitors given in Table IV in molar concentrations were prepared by using the corresponding inhibitors were dissolved in 0.1 M tris (hydroxymethyl> aminomethane-HCl buffer solution (pH 8.0).
Then, 1 ml of enzyme solution was added to 9 ml of inhibitor solution, and the resulting mixture was kept at 20 ° C for 10 minutes and then diluted with pure water so that the volume was 100 times Method for measuring the activity of protease determined.
The residual activity of the diluted enzyme solution was assumed to be 100 when 9 ml of the 0.1 M TrisChydroxymethylS aminomethane buffer solution were used in place of the inhibitor solution.
The crystallized weakly alkaline protease was analyzed and found to have a composition shown in Table V below as the molar ratios of amino acids.
Table V
Composition of the weakly alkaline protease in molar ratios of the amino acids l Asp. R36 Gly. 45 Glu. 18 Ala. 46 Arg. 2 Val. 33 His. 2 ile. 15 Lys. 5 leu. 21 Ser. 37 Pro. 9 Thr. 25 half-cys. 0 Tyr. 11 Met. 0 Trp. 2 Amide-NH3 16 Phe. 7th
In the following, preferred embodiments of the process according to the invention are explained in more detail by means of examples. The crude protease used in the examples was obtained in the same way as mentioned above.
example 1
1 kg of a crude protease which contains a weakly alkaline protease and has an activity of 95,000 PU / g and which is manufactured and sold by the patent holder under the registered trademark Prozym was dissolved in 20 liters of water to form the aqueous solution to be purified.
5 liters of a weak base anion exchange resin manufactured and sold under the registered trademark Amberlite IRA-93 by Röhm and Haas was placed in an acrylic resin column 12 cm in diameter and 100 cm in length, and then 10 liters of 0.5 N acetic acid was added passed through the column to convert the resin to the acetate form; the resin was then washed with 50 liters of water until the liquid flowing out had a pH of more than 4.0. The aqueous solution of the crude protease was allowed to flow through the resin column at a flow rate of 15 liters per hour.
The eluate obtained was mixed with 45 liters of ethanol (9501zig) and kept at -15 "C to precipitate the protease precipitate; the precipitate was dissolved in 6 liters of water, the aqueous solution obtained was cooled to 5 C, and 1.5 liters of acetone became at -15 "C until a slight cloudiness appeared in the aqueous solution, and the resulting mixture was stored overnight at -15" C in a refrigerator. The protease was crystallized by the slow addition of acetone at -15 "C completed; the acetone was added at a rate of 0.2 liters per day until the concentration in the mixture was 30/0.
300 g of crystallized protease with an activity of 222,000 PU / g were obtained, which corresponds to a yield of 70/0. The properties of the crystallized protease are shown in Tables I to V.
Example 2
The procedure described in Example 1 was repeated to produce an eluate. Then the eluate was mixed with ethanol (9501zig) to obtain a protease precipitate; the precipitate was then dried under reduced pressure, a white powder with an activity of 200,000 PU / g being obtained. 100 g of this white powder were dissolved in 2 liters of water, and the aqueous solution was cooled to 5 "C, whereupon acetone at a temperature of -15" C was added to the aqueous solution until the concentration of acetone was 20% by volume. amounted to; the mixture obtained was left to stand for 3 days at 0 ° C. After several hours, the protease began to crystallize.
Acetone at -15 "C was added to the mixture at intervals of about 20 hours until the total concentration of acetone in the mixture was about 30 vol.
63 g of crystallized protease with an activity of 226,000 PU / g were obtained, which corresponds to a yield of 71%. It was found that the crystallized protease has the same properties as that obtained in Example 1.
Example 3
The procedure described in Example 1 for the preparation of an eluate was repeated. The eluate was then treated with 95/0 alcohol to precipitate the protease, and the precipitate was dried under reduced pressure, a white powder with an activity of 200,000 PU / g being obtained. 100 g of this white powder was dissolved in 2 liters of water, and 300 ml of a 1/3 solution of acrinol was added to the aqueous solution, whereby a brown precipitate was obtained, which was separated in a centrifuge; then 1000 ml of a 1/0 solution of acrinol was added to the supernatant solution.
The resulting precipitate of beautiful yellow color was centrifuged off, and the precipitate was dissolved in a small amount (about 1 liter) of a 1 molar solution of sodium acetate (pH = 6.0), and the solution was made twice in volume 95/0 ethanol mixed and kept at -15 "C in order to separate out another precipitate, which was again centrifuged off. The fresh precipitate was dissolved in approx. 1 liter of a 0.002 molar solution of calcium acetate and the solution was mixed with approx. 250 ml of acetone from -15 "C mixed. The solution became cloudy and the protease crystallized out.
At intervals of several hours, further quantities of acetone at -15 ° C. were added to the solution until the acetone concentration was approx. 30 vol / o and the crystallization of the protease had ended.
50 g of crystallized protease with an activity of 224,000 PUlg were obtained, which corresponds to a yield of 56/0. The crystallized protease was found to have the same properties as that obtained in Example 1.
Example 4
2 kg of wheat bran were moistened by spraying with 1.5 liters of water, and the moistened wheat bran was sterilized by heating to 123 ° C. for 60 minutes and the sterilized wheat bran was cooled. A strain of Aspergillus melleus ATCC 16 889 was cultivated pure to 10 g of the seeds were mixed with the sterilized wheat bran, and the resulting mixture was kept at 25 ° C for 120 hours to obtain malt. The malt was air dried at 40 "C until the moisture content of the malt was reduced to 7% or less. The dried malt was placed in a jacketed stainless steel column 8 cm in diameter and 100 cm in length.
Then tap water with a flow rate of 100 mlh. allowed to flow through the column by introducing it at the foot of the column until 3000 ml of effluent water was obtained at the top of the column, while water at 20 "C was passed through the jacket. The effluent was found to have protease activity of 1250 PU / ml. The outflowing water was mixed with about 100 g of powdered calcium hydroxide, and the pH of the outflowing water was adjusted to 8.5. The outflowing water was then cooled to 5 ° C. and mixed with 2000 ml of isopropanol ( -10 "C) offset.
The mixture was stirred for 30 minutes and then at 10,000 rpm for 10 minutes. centrifuged to obtain a supernatant clear liquid. 7000 ml of -10 "C isopropanol was mixed with the supernatant clear liquid for 10 minutes with stirring, and then the mixture was stirred for 10 minutes and then allowed to stand for 2 hours to allow a crude enzyme to settle. The crude enzyme was dissolved in 1000 ml Water dissolved into an enzyme solution, and it was found that the enzyme solution had a protease activity of 2940 PU / ml.
500 ml of the anion exchange resin Amberlite IRA-93 with tertiary amino groups was placed in a column 4 cm in diameter and 100 cm in length. 1500 ml of a 1N sodium hydroxide solution was allowed to flow through the anion exchange resin for one hour, and then the resin was washed with 10,000 ml of water. Then 1000 ml of a 1N acetic acid solution was passed through the anion exchange resin for one hour to convert the anion exchange resin into the acetate form. Finally, the anion exchange resin in the acetate form was washed with 10,000 ml of water until the pH of the outflowing liquid was above 4.0.
1000 ml of the enzyme solution was then passed through a column charged with the acetate form of the anion exchange resin thus obtained for one hour by applying the enzyme solution to the top of the column. Then pure water was passed through the column until 2000 ml of eluate was collected. It was found that the eluate had a protease activity of 1210 rot50 PUlml.
The eluate was cooled to 5 "C, and 100 ml of the cooled eluate was mixed with 26 ml of cold acetone (-10" C) with stirring, and the mixture was then allowed to stand at 5 "C for about 25 hours, at 300 mg of one needle-shaped crystalline weakly alkaline protease was obtained, and it was found that the weakly alkaline protease had an activity of 225,000 PU / g.
PATENT CLAIM 1
Process for the production of a weakly alkaline protease in crystalline form, characterized in that protease-producing Aspergillus strains are grown on a liquid or solid nutrient medium, that a solution of the crude protease is used to remove the impurities present in addition to the protease by a layer of an anion exchange resin in the acetate form, which has a tertiary amine group as an exchanging group, is given that a solvent is added to the eluate to precipitate the protease and that the weakly alkaline protease is crystallized from a solution of the precipitate.
PATENT CLAIM II
Weakly alkaline protease in crystalline form, produced by the process according to claim 1.
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